谷氨酰胺酶 本发明涉及来自乳杆菌属(Lactobacillus)的新的抗盐、耐热的谷氨酰胺酶和生产这种来自乳杆菌属的抗盐、耐热的谷氨酰胺酶的方法。
已知水解的蛋白可用作酱油形式的调料，通常通过长时间的酶水解来制备酱油。生产酱油时，将含有蛋白的植物材料与曲霉孵育并将固体培养物发酵2天以得到曲。在此期间，在酱醪期产生能够将蛋白水解成肽和氨基酸的酶。所述曲与普通盐和水的溶液混合得到酱醪，其被微生物如好盐乳酸细菌和酵母发酵4周到8个月，从发酵过的酱醪中除去固体部分得到酱油。这种发酵是在高浓度盐存在下通过酶降解蛋白物质生产富含谷氨酸的调味品的一种方法。在这种情况下，盐的存在是为了防止微生物污染导致的分解和腐败。
已知谷氨酰胺酶在这些过程中、尤其是在酱曲阶段起着重要的作用，通过脱氨基作用将谷氨酰胺酶促地转化成谷氨酸(或者谷氨酸盐)。该酶被认为是控制这种发酵产品如酱油的风味和鲜味地关键酶。传统的酱油或生物水解产物的制造方法中，谷氨酰胺酶来自在曲中接种的曲霉菌株。然而，据报道来自这些霉的谷氨酰胺酶被浓度高于10-15％(w/v)的盐所抑制，而该盐浓度是在酱醪阶段中生产酱油的实际条件。这样，有必要使用抗盐的谷氨酰胺酶以便有效的生产谷氨酸。
此外，一方面，高温的酶促降解对提高蛋白的降解率非常有效，另一方面，还可防止微生物的污染。由于无谷氨酰胺酶时，在温度升高的条件下谷氨酰胺可被转化成无味的焦谷氨酸，所以需要耐热的谷氨酰胺酶。
酶促降解方法中低谷氨酸含量的主要原因是谷氨酰胺酶被高浓度盐或者高温严重地抑制。
所以，非常需要有抗盐、耐热的谷氨酰胺酶。
已经公开来自无名假丝酵母(candida famate)(日本专利公开N°38748/1994)和浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)(日本专利公开N°48759/1974)的谷氨酰胺酶具有盐抗性和热稳定性。然而，在18％的盐存在下，两种酶的相对活性降低至无盐存在时100％活性的50％到60％。
US 6063409公开了一种来自cryptococcus nodaensis的谷氨酰胺酶，其显示出更高的盐耐受性和更好的温度抗性。
除了所有这些谷氨酰胺酶都具有或多或少的人们所需的盐抗性和热耐受性特征这一事实，它们都源自通常是人致病原的微生物，因此认为其是不安全的，并且不是食品级的。如果不进一步进行纯化以回收酶，那么这些微生物培养物是不可能使用的。而这些纯化操作是繁琐的，并且将使得在食品生产中或者食品生产过程中的任何步骤中都不可能直接使用微生物(死的或者活的)。
所以，本发明的目的是提供具有盐抗性和热耐受性、来自食品加工中长期使用的微生物并且因此是食品等级的谷氨酰胺酶。
为此，本发明提供了一种来自乳杆菌属的新的抗盐、耐热的谷氨酰胺酶，其具有温度依赖性，在45℃到55℃之间时其保留大于80％的活性，其具有盐依赖性，在存在高达15％的NaCl时其活性为没有NaCl时活性的80到180％，并且其具有热稳定性，其活化能为约80到150 KJ.mol-1，优选90到120 KJ.mol-1，更优选100到110 KJ.mol-1。
附图说明：
图1显示了谷氨酰胺酶的pH依赖性，其中纵轴为相对活性(R.A.)，以在所示pH范围内相对于最大活性的百分数表示。
图2显示了谷氨酰胺酶的温度依赖性，其中纵轴为相对活性(R.A.)，以在温度范围T(℃)内相对于最大活性的百分数表示。
图3显示了谷氨酰胺酶的盐依赖性，其中纵轴为相对活性(R.A.)，以在NaCl浓度范围(NaCl w/v百分数)内相对于最大活性的百分数表示。
图4显示了谷氨酰胺酶的热稳定性，其中：
A图表示在(+)45℃、(○)55℃、(△)60℃、(■)65℃和(●)75℃下，相对活性(R.A.)随着孵育时间t(min.)变化的函数，
B图表示热失活速率常数k(分钟-1)的自然对数(neperian logarithm)随着温度的倒数(1/K)的变化的函数的阿累尼乌斯(Arrhenius)图。
下面将更详细地描述本发明。
可以通过下列方法生产本发明的抗盐、耐热的谷氨酰胺酶，该方法包括培养能够产生抗盐、耐热的谷氨酰胺酶的属于乳杆菌属、优选鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的微生物以便产生抗盐、耐热的谷氨酰胺酶，然后将其回收。
例如，一种具有所需要的性质的鼠李糖乳杆菌菌株已根据布达佩斯条约的规定于2000年4月5日保藏在法国的国立微生物保藏中心(CNCM)，保藏号为CNCM I-2433，该中心的地址为Institut Pasteur，28 rue duDocteur Roux，75724 Paris Cedex 15，France。
通常，培养过程优选在例如广口瓶、烧瓶或生物反应器的液体培养基中进行。培养温度为35℃到55℃，培养时间可以是6小时或更多。
培养基中可以包含下列物质作为碳源：单糖和寡糖，如葡萄糖、麦芽糖、糊精和其他来自植物来源如小麦、玉米、麦麸或大豆的碳源。培养基可以包含下列物质作为氮源：例如来自植物来源如小麦、玉米、麦麸或大豆的肽、蛋白和氨基酸。
培养后所得培养基本身可以用于酶活性鉴定，但是也可进行固体/液体分离和纯化。还可以将培养基加入含有蛋白的培养基以便谷氨酰胺酶对含有的谷氨酰胺进行脱氨基作用。然而，由于根据本发明的抗盐、耐热的谷氨酰胺酶是与膜结合的，所以可能需要另外的步骤以将酶从细胞释放出来，从而可以进一步鉴定和/或增加其活性。为此，可以应用传统的酶提取方法。例如，可以使用机械碾磨和破裂、声波破碎或超声破碎、使用去污剂、用溶菌酶裂解细胞或其他将酶从膜中释放出来的方法。由此，通过这些技术，可以制备抗盐、耐热的谷氨酰胺酶的粗酶溶液。为了得到更纯的溶液，可以将粗酶制剂经历使用各种离子交换剂(例如DEAE纤维素、TEAE纤维素、QAE Sephadex或羟基磷灰石)进行的层析吸附-洗脱技术和使用Sephadex或Superdex的凝胶过滤的适当组合，以便得到纯化的酶制剂。
本发明的另一个方面涉及来自乳杆菌的抗盐、耐热的谷氨酰胺酶混合物在生产生物水解产物的方法中的用途。具体的说，可以将含有根据本发明的抗盐、耐热的谷氨酰胺酶的培养基可以在生产生物水解产物的方法的混合步骤或者发酵和/或陈酿步骤加入，该生产生物水解产物的生产采用含有蛋白的材料如酱油或麦麸水解产物作为原料。这些培养基可以是培养鼠李糖乳杆菌(CNCM I-2433)后所得含有细胞的培养基。也可以通过固体-液体分离手段浓缩该含有细胞的培养基或含有细胞碎片的培养基以便回收含有细胞的残渣。优选地，所用培养基也可以是混合物，其中通过声波破碎、溶胞或任何合适的方法将酶从细胞中释放出来。
在实际操作中，将热变性的含蛋白材料(大豆、麦麸等)与热变性的含淀粉材料(米、小麦、玉米等)混合，然后将混合物的水含量调节到30-45％，对其接种曲霉并以通常的方式培养以得到固体曲，然后将固体曲与盐水混合并进行发酵和陈酿。然而，可以使用来自曲的内源性酶或者人工加入的酶在提供谷氨酰胺酶活性的乳杆菌属、优选鼠李糖乳杆菌、更优选鼠李糖乳杆菌(CNCM I-2433)的存在下进行含蛋白材料的水解步骤。
本发明的另一个方面涉及含有来自乳杆菌属的抗盐、耐热的谷氨酰胺酶的混合物在生产生物水解产物的方法中的用途。优选地，该生物水解产物是酱油或麦麸水解产物。根据本发明的抗盐、耐热的谷氨酰胺酶可以在生物水解产物加工生产的水解和/或陈酿步骤中使用。因此，可以在生产含有作为部分或主要增味成分的肽和/或氨基酸的食品和饮料的过程中加入该根据本发明的新的抗盐、耐热的谷氨酰胺酶(纯化的或结合于细胞的)。在这种过程中，用至少一种蛋白水解酶或含有蛋白水解酶的材料如曲来水解蛋白材料或含有蛋白的材料。由于该酶具有高的盐抗性和耐热性，所以当其用在包括高温、高盐浓度下的蛋白水解过程中以生产例如富含谷氨酸的调味品时，可以有效地得到用作为增味成分的谷氨酸显著强化的食品。
谷氨酰胺酶活性的检测
用比色法通过测定L-谷氨酰胺转化形成L-谷氨酸盐的反应来检测谷氨酰胺酶活性(试剂盒由Boehringer Mannheim提供，n°139092，Darmstadt，德国)。将含有0.5ml 60mM L-谷氨酰胺(溶于50mM磷酸钠缓冲液，pH7.0)的反应混合物在37℃下预孵育3分钟，通过加入0.5ml含待测酶的制剂开始反应。在37℃下孵育20到30min。通过将样品在冰上冷却中止反应。随后用酶法测定所产生的谷氨酸的量。
1单位(U)谷氨酰胺酶活性定义为在上面的条件下每分钟释放1μmol谷氨酸盐的酶量。
pH依赖性的测量
在pH4-9的范围内测定谷氨酰胺酶对pH的依赖性。谷氨酰胺酶活性用各种pH的100mM缓冲液测定并且在图1中示出。在将含有谷氨酰胺终浓度为30mM(溶于100mM缓冲液)的酶溶液在37℃下孵育30min后，按照“谷氨酰胺酶活性的检测”部分所描述的方法测定谷氨酰胺酶活性。所用缓冲液：pH 4到6.5∶100mM柠檬酸盐/200mM磷酸钠
pH 7和7.5∶100mM磷酸钠
pH 8和9∶100mM Tris/HCl
每个实验点是两次测量的平均值，并且活性表示为pH4-9的范围内所观察到的最大活性的百分数。
根据本发明的谷氨酰胺酶的最适pH值约为7.0。因为在pH约6.0时，约丧失62％的活性，所以该酶在更低的pH值时活性较低。相反，该酶在碱性pH中比酸性pH中有更大的活性，分别在pH8和9时仍然保留约74％和69％的活性。
温度依赖性
通过将酶和底物在25到80℃的不同温度下孵育30min来测定谷氨酰胺酶活性对温度的依赖性，如图2所示。按照“谷氨酰胺酶测定”中描述的方法测定谷氨酰胺酶活性。谷氨酰胺酶活性的最适温度约为50℃，在相应于培养条件下，温度为约45℃时该酶保持大于90％的活性。可以观察到，在70℃时仍然保持约50％的活性。
盐依赖性
通过向反应介质中加入0-20％(w/v)NaCl来测定谷氨酰胺酶的盐依赖性。计算酶的相对活性，并以在无盐时观察到的活性的百分比表示(图3)。在低于10％的NaCl存在下，谷氨酰胺酶活性增加，具体而言，在2.5％的NaCl存在时，活性提高1.8倍。而且，在15％的盐存在时，酶活性为无盐时的约90％。
热稳定性
在45和75℃之间测定谷氨酰胺酶的热稳定性(图4)。
在45℃下热处理后没有热失活。在T≥55℃温度下进行处理，导致酶的进行性失活，并且在75℃下孵育约15min后，谷氨酰胺酶完全失活(图4A)。
将热失活的表观失活速率常数k对绝对温度的倒数作图(图4B)。可以看出，失活常数的温度依赖性符合阿累尼乌斯方程。从阿累尼乌斯图的斜率计算的活化能Ea为约90到110KJ.mol-1。其与大多数耐热性酶所得的活化能相符。
结果清楚地表明谷氨酰胺酶的热稳定性随着温度从55到75℃的增加而线性地降低。
催化参数
用0.5到80mM的12种不同浓度的谷氨酰胺，于37℃下在50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中检测谷氨酰胺的谷氨酰胺酶催化的脱氨基作用。在所用的谷氨酰胺浓度范围内，底物抑制不显著。可通过米-曼氏方程(2)描述谷氨酰胺酶对谷氨酰胺的催化模式。用Lineweaver-Burk转换通过加权线性回归和米-曼氏方程(2)的非线性回归计算催化参数。
v=Vmax*[S]Km+[S]---(2)]]>
其中，v和Vmax是反应的起始和最大速率，[S]是底物浓度，Km是米-曼氏常数。
结果符合米-曼氏动力学。从Lineweaver-Burk图的横坐标截距估计催化反应的Km值为5.7mM，Vmax＝108U/l水解产物。方程(2)的非线性回归得到Km和Vmax值分别为4.8±0.4mM和101±2U/l。
因此，申请人可以得出本发明的谷氨酰胺酶的Km值为约4到6mM，Vm为约100到110U/l水解产物。
实施例I
乳杆菌的培养
在45℃下，使含有5×108cfu/ml鼠李糖乳杆菌(CNCM I-2433)的培养物生长在含有22％(w/w)麦麸(Roquette，Lestern，法国)、0.1％碱性蛋白酶(alcalase)(Novozymes，Bagsvaerd，丹麦)、4％(w/w)Flavorzyme L1000(Novozymes，Bagsvaerd，丹麦)和30mM乙酸钠缓冲液(pH5.8)的培养基中12小时。然后将培养液在4℃冷却并立刻进行分析。
实施例II
酶的制备
培养后，用50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗涤培养基三次，最后重新溶于含有10％(w/v)蔗糖和1mM PMSF的相同缓冲液中。因为谷氨酰胺酶是膜结合的，所以将水解产物在37℃下经1mg/ml溶菌酶裂解1小时。该溶液在4℃下保存并用于酶分析。
实施例III
改进的酱油的生产方法
根据生产酱油曲的传统方法，将0.2kg曲霉接种到1.2kg脱脂并碾碎的大豆、0.3kg麦麸、1.2kg盐和3.4kg水的混合物中以形成酱醪。在一个单独的步骤中，将根据实施例I所得的培养基在2000×g离心10min。抛弃所得上清液并将含有细胞的残渣加到上面的酱醪中。将所得的混合物进行传统的酱醪发酵过程，以此在需要得到谷氨酰胺的满意的产量和产生成熟酱油的时间内，在实施例I的含细胞残渣的培养基中积聚的抗盐、耐热谷氨酰胺酶对酱醪中存在的谷氨酰胺进行脱氨基作用。