二倍体细胞乙型脑炎疫苗及纯化乙型脑炎疫苗，剂型冻干及水针.pdf

本发明涉及二倍体细胞乙型脑炎疫苗及纯化乙型脑炎疫苗，其剂型为冻干及水针，该疫苗是在人用二倍体细胞上接种乙脑病毒毒种得到的乙型脑炎纯化疫苗。

1、  一种人用二倍体细胞乙型脑炎纯化疫苗，其特征在于，该疫苗是在人用二倍体细胞上接种乙脑病毒毒种，经分离纯化得到的乙型脑炎疫苗。

2、  权利要求1的纯化疫苗，其特征在于，所述乙脑病毒毒种选自乙脑鼠脑毒种P3株或AS14-14-2株。

3、  权利要求1的纯化疫苗，其特征在于，是冻干注射剂或水针剂。

4、  权利要求1的纯化疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、人用二倍体细胞的复苏；
(2)、人用二倍体细胞的培养扩增；
(3)、在人用二倍体细胞上接种乙脑病毒毒种；
(4)、收获病毒液；
(5)、病毒液的灭活；
(6)、澄清超滤；
(7)、纯化；
(8)、稀释分装。

5、  根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述纯化包括以下步骤：病毒液先经过超滤纯化除去部分杂蛋白，再经过DEAE-SepharoseFF阴离子交换或区带超速离心，然后经过Sepharose4FF柱或其他凝胶柱层析。

6、  根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述人用二倍体细胞的培养扩增是在细胞营养液中进行的，细胞营养液由199培养液加入2-10％牛血清配制而成。

7、  根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，细胞营养液中还加入适量的卡那霉素和庆大霉素。

8、  根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述人用二倍体细胞的培养扩增是在转瓶内培养。

9、  根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，还包括佐剂吸附步骤或/和加保护剂人血白蛋白的步骤。

10、  根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，加入人血白蛋白使其浓度为0.2-0.5％。

二倍体细胞乙型脑炎疫苗及纯化乙型脑炎疫苗，剂型冻干及水针
技术领域：
本发明涉及一种乙型脑炎的纯化疫苗，特别是在人用二倍体细胞上接种乙脑病毒毒种得到的乙型脑炎纯化疫苗。
背景技术：
目前世界上大量生产的乙脑疫苗有三种，第一种是以日本为代表的用感染乙脑病毒的小白鼠脑组织经过研磨、乳化、浓缩、超速离心制备的纯化乙脑疫苗；第二种是中国生产的原代地鼠肾细胞培养的乙脑灭活疫苗和原代地鼠肾乙脑活疫苗，这两种疫苗的细胞基质均来源于普通级动物，无法保证不携带外源因子；第三种是北京生物制品研究所以Vero细胞为培养基质生产的冻干乙脑纯化灭活疫苗，但不能保证细胞基质的致肿瘤和细胞的DNA。
鼠脑纯化乙脑疫苗是用脑组织制造的，而脑组织疫苗在历史上曾发生过严重的过敏反应，因而用脑组织制备的疫苗虽经纯化处理仍不免有此忧虑；其次鼠脑纯化乙脑疫苗的制备必须经过一只一只的小白鼠的脑腔接种，一个一个感染鼠脑的收获，其操作过程繁琐，无法形成工业化生产规模。所以若制成大批量的均质疫苗，成本很高，价格昂贵，对于一些主要靠进口乙脑疫苗的国家，由于价格的原因，很难满足供应。
据美国CDC发起的一项调查研究表明鼠脑提纯乙脑灭活疫苗二针注射后的抗体阳转阳率(≥1∶8)为77％，6-12个月加强一针后阳转率(1∶16)为100％，但是副反应发生率较高，包括局部反应和全身反应达41％。丹麦和澳大利亚使用日本鼠脑提纯乙脑疫苗后也有发生严重过敏性反应的报导，在印度使用这种疫苗测定抗体反应，结果并不理想。
中国当前生产的地鼠肾乙脑灭活疫苗对于降低乙脑发病率确实起了明显作用，使乙脑发病率稳步下降。但是其血清中和抗体阳转率并不理想，在非流行区学龄儿童基流行区1岁内儿童的中和抗体阳转率只有60％左右，加强一针后达到90％左右，并且，疫苗注射后的副反应主要是过敏反应，虽然普遍来说比较轻微尚可接受，但据调查统计的结果，在北京市，副反应发生率在几种儿童普遍接种的疫苗中位居第二，仅次于百白破。还有一种AS14-14-2株乙脑减毒活疫苗，由于只需注射一针就有较好的血清抗体反应，而且生产工艺简单成本低廉，故受到了生产厂家和使用者的欢迎，但是仍不能排除原代地鼠肾细胞外源污染因子的可能，而且有研究表明乙脑活病毒接种免疫抑制动物皮下可引起病毒入脑繁殖，所以在活疫苗的推广应用中也需予以适当注意，安全之策可以采取1岁之内活疫苗初次免疫，之后用活疫苗加强的办法。
中国生产的地鼠肾细胞乙脑疫苗所用的生产毒种仍是用感染普通小白鼠脑制备的，虽经多年使用证明是安全有效的，但抗原含量较低，其脑组织不仅是过敏源之一，而且，饲养管理动物和制备毒种及其作用等均较麻烦，其生工艺也不利于控制外源因子的污染，更不适合大规模工业化生产。
另外，近几年来我国疫苗也有些进展，Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗也相继问世，但Vero细胞制瘤性和DNA不能很好的去除，导致Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗的安全性和免疫原性不理想。
为了制备更好的乙脑疫苗，从80年代开始有关于基因工程乙脑疫苗的研究报导，其载体多种多样，表达蛋白多数是E蛋白，PrM和NSI，经过实验检定和诱生抗体反应均比较满意，但是经病毒攻击的保护试验均不及全病毒疫苗的理想.目前，国内正在研制用二倍体来研究各种疫苗，其中有二倍体脊髓灰质炎疫苗，甲肝疫苗等.接种后免效果好，比其它基质的疫苗效果好，而且更安全。
这种疫苗为美国Wistar研究所首创，用人二倍体WI-38株适应和培养病毒，以后法国Merierx研究所用MRC-5人二倍体细胞生产疫苗。疫苗经不同单位人体接种观察后证实接种后副反应轻，免疫效果好，可以减针注射，目前认为可以作为一种新发展疫苗的标准对照疫苗。但用该方法制备乙型脑炎疫苗未见报道。
由于乙型脑炎疫苗的特殊性和复杂性，制备该疫苗具有相当的难度，特别是在分离和纯化方面。
本发明经研究，开发了人用二倍体细胞-WJ-38来研究乙型脑炎纯化疫苗。
发明内容：
本发明提供一种人用二倍体细胞乙脑纯化疫苗，该疫苗是在人用二倍体细胞上接种乙脑病毒毒种得到的乙型脑炎纯化疫苗。
本发明还提供本发明的乙脑纯化疫苗的制备方法及其应用。
本发明采用人用二倍体细胞-WJ-38来制备乙型脑炎纯化疫苗，经过全面的研究鉴定，WI-38细胞具有胞核学稳定，没有外源因子污染和致瘤性对病毒敏感的优点，完全符合中国药典2000版关于生物制品的传代细胞的规程要求，并已被WHO批准可用作疫苗生产的基质。
本发明提供一种人用二倍体细胞乙型脑炎纯化疫苗，该疫苗是在人用二倍体细胞上接种乙脑病毒毒种，经分离纯化得到的乙型脑炎疫苗。所述乙脑病毒毒种选自乙脑鼠脑毒种P₃株或AS14-14-2株。本发明的疫苗是冻干注射剂或水针剂。
本发明的纯化疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)、人用二倍体细胞的复苏；
(2)、人用二倍体细胞的培养扩增；
(3)、在人用二倍体细胞上接种乙脑病毒毒种；
(4)、收获病毒液；
(5)、病毒液的灭活；
(6)、澄清超滤；
(7)、纯化；
(8)、稀释分装。
所述纯化可以包括以下步骤：病毒液先经过超滤纯化除去部分杂蛋白，再经过DEAE-SepharoseFF阴离子交换或区带超速离心，然后经过Sepharose4FF柱或其他凝胶柱层析。所述人用二倍体细胞的培养扩增是在细胞营养液中进行的，细胞营养液由199培养液加入2-10％牛血清配制而成。细胞营养液中必要时还可加入适量的卡那霉素和庆大霉素。所述人用二倍体细胞的培养扩增是在转瓶内培养。本发明的制备方法，还包括佐剂吸附步骤或/和加保护剂人血白蛋白的步骤。其中加入人血白蛋白的量优选的是使其浓度为0.2-0.5％。
在本发明的乙脑纯化疫苗的制备工艺中，细胞培养所用的培养基是199培养基，采用超滤纯化初步纯化，蔗糖密度梯度离心法和Sepharose 4FF凝胶过滤层析进行更纯提纯。测试结果表明，经过本发明的三步提纯后，可使疫苗总蛋白含量减少约99％以上，牛血清残余量均符合中国药典2000版关于生物制品规程地要求，加入氢氧化铝佐剂后使疫苗的效价提高20％，稳定性同时大大提高，接种时减缓病毒释放的速度，保持良好的抗体水平。通过纯化疫苗加入佐剂能增加疫苗的持久性，疫苗能够持久刺激机体产生抗体。
本工艺提供的人用二倍体乙型脑炎纯化疫苗，是指在人用二倍体细胞上接种乙脑病毒毒种得到的乙型脑炎纯化疫苗。本工艺具体的制备方法包括以下步骤：
(1)、人用二倍体细胞的复苏；
(2)人用二倍体细胞的培养扩增；
(3)、在人用二倍体细胞上接种乙脑病毒毒种；
(4)、收获病毒；
(5)、灭活病毒制成粗疫苗；
(6)澄清过滤；
(7)、超滤纯化；
(8)、蔗糖密度梯度离心；(或DEAE-SepharoseFF阴离子交换)
(9)、Sepharose4FF柱层析纯化；
(10)、佐剂吸附加保护剂人血白蛋白(或不加佐剂吸附)
(11)、稀释分装。
本工艺使用的人用二倍体细胞种来源于中国疾病预防控制中心，首先建立细人用二倍体细胞种子库和人用二倍体细胞工作库，并对细胞库细胞进行系统的检定。在制备疫苗之前，需先进行细胞的复苏、培养和扩增，以达到生产批量的需要。可使用动物细胞培养液加入牛血清配制而成的细胞营养液，所说的培养液可以选择199培养液、平恒盐培养液等，其中以使用199培养液效果较为理想，细胞营养液中最好含有2-10％的牛血清，PH7.0-7.6在37±0.5℃进行培养扩增。
各种用于制备疫苗的哺乳动物细胞均为附着依赖性细胞，细胞在一定的载体上生长，本工艺中细胞的培养方式为转瓶培养。
为防止细菌污染，在配制细胞营养液的同时可加入适量的卡那霉素和庆大霉素。
培养过程中，细胞分种率根据生产批量的需要确定，一般可以是1∶2-1∶4当细胞长成致密单层后，即可接种乙脑病毒，细胞维持液中最好加入0.4-0.55％(w/w)的人血白蛋白，同时调整PH7.2-7.8，培养温度32-37℃，并可加入适量的氨基酸和抗生素，可供使用的培液包括199液、平恒盐液等，接种过程包括先用培养液如Earle氏液等冲洗细胞表面，去除残留的牛血清，然后在已经生长成致密单层的人用二倍体细胞上接种乙脑病毒毒种MOL0.1-0.00001及上述细胞维持液，培养72小时左右，即可收获病毒。
本工艺在人用二倍体细胞上接种的乙脑病毒为在传代的人用二倍体乙脑病毒种，有实验结果显示，乙脑病毒在人用二倍体细胞上能够很好地生长繁殖，在人用二倍体细胞传代乙脑病毒10代以内很稳定，并且制备人用二倍体细胞乙脑疫苗方面，10代以内的细胞传代毒种的免疫原性没有明显改变，而10代以后的毒种的免疫原性则有明显的下降，也就是说，制备疫苗最好选用10代以内的传代毒种，10代以后的毒种不宜用于制备纯化疫苗。至于毒种则优选乙脑鼠毒种P3株在人用二倍体细胞的传代毒种。
乙脑病毒在人用二倍体细胞上的生长繁殖可维持较长时间，因此病毒的收获可采取多次收取的方式，最好是第3-4天收获一次，对收获的病毒液及时测定病毒滴度，要求每批所收获病毒液病毒滴度均应在10⁷LD50/ml以上，因为只有高滴度的病毒液才能保证疫苗的高效力。
收获的病毒液用福尔马林液灭活病毒得到的是粗疫苗。
灭活后的粗疫苗需要进行浓缩提纯制备成纯疫苗制品，本工艺选用超滤浓缩的方法对得到的粗疫苗进行浓缩，一般是用截留10万-30万分子量的超滤器浓缩疫苗，浓缩至20倍以上，然后纯化疫苗。
以人用二倍体细胞制备生物制品安全性的关键是残余牛血清残留量的含量。按中国药典2000版有关生物制品的规程要求，疫苗的牛血清残留量必须小于50ng/ml。有关疫苗的纯化方法包括化学法和物理方法等可以有多种，经反复试验和研究，本工艺提出纯化方法：超滤纯化、超离纯化和Sepharose 4FF柱层析纯化。
超滤纯化疫苗即把疫苗超滤浓缩到一定倍数，然后加入适量的PBS冲洗，再深缩到原倍数，再加入适量的PBS冲洗如此反复5-6次，牛血清残留量可以去除93％以上，再经过蔗糖密度梯度离心法参考石慧颖1998年发表的大规模区带离心纯化的方法纯化Vero细胞乙脑疫苗的方法，用36％和45％(W/W)的蔗糖密度梯度，23000rpm超速离心4小时，经过对紫外吸收峰的抗原含量，蛋白浓度的分析，确定了病毒所在的位置。然后再经过Sepharose 4FF纯化，而凝胶过滤层析是层析技术中最简单，条件最温和，对保持生物大分子的活性最有利的方法，适合分离分子量悬殊的物质，乙脑病毒的分子量在400万以上，与疫苗中的杂蛋白分子量相差较大，故使用凝胶柱层析可以非常方便有效地去除浓缩疫苗中残留的小分子杂质，该凝胶过滤柱可以是Sepharose 4FF柱或其他凝胶，而检测结果表明，经三步层析柱纯化后，疫苗总蛋白含量减少约99％以上，牛血清的残余量均符合中华人民共和国药典的有关规程要求，而且比规程所要求的含量更低。纯化疫苗制成成品(即水针剂型)，加入保护剂人血白蛋和氢氧化铝佐剂。用人用二倍体细胞作为疫苗的生产基质，并且以人用二倍体细胞的传代毒种代替现有的鼠脑组织毒种，通过相应的工艺方法生产制备出高质量的乙脑疫苗。用本工艺制备的乙型脑炎纯化疫苗中不含鼠脑组织，纯度高，免疫效果大大提高，使用安全性高，并能实现乙脑疫苗的大规模工业化生产。
本工艺与目前使用的来自鼠脑组织病毒的乙脑疫苗相比，最主要的优点如下：(1)人用二倍体细胞已被证明不含任何污染因子和致瘤性，作为生产疫苗的基质，明显优于现行疫苗的地鼠肾细胞和鼠脑组织；(2)人用二倍体细胞乙脑疫苗的毒种是细胞培养的毒种，从根本上更新了鼠脑提纯疫苗和地鼠肾乙脑疫苗使用的鼠脑组织；(3)用人用二倍体细胞生产疫苗工艺，适用于工业化生产批量的均质疫苗，这是现行的地鼠肾细胞疫苗和鼠脑提纯疫苗办不到的，(4)本工艺制备的疫苗经提纯后抗原活性明显提高，杂蛋白减少99％以上，疫苗的纯度大大提高。
附图说明：
图1为本发明制备方法的方框流程图。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1
二倍体细胞来自中国疾病预防控制中心，使用38-50代，细胞营养液为199培养基中含有2-10％牛血清和25IU/ml庆大霉素和25IU/ml卡那霉素，并调整PH到7.2，用3L转瓶37℃培养成致密单层后按照1∶2分种率扩增，扩增到生产批量时，经过4天左右，当细胞长成致密单层，弃去细胞营养液，用PH7.2的Earl＇s液冲洗细胞面，接种二倍体细胞乙脑病毒，使用乙脑鼠脑毒种P₃株在二倍体细胞上传代的第二代工作毒种(P_3-2)，毒种浓度MOI0.05，细胞维持液为含0.4-0.5％(W/W)人白蛋白的199培养液，PH7.6，35℃下培养，24小时后换以新鲜细胞维持液继续培养2天，开始收获病毒，每3-4天收获一次，共收5次，每批病毒液均取样进行病毒滴定和无菌试验，要求收获病毒液的病毒滴度达到10⁷LD50/ml以上；合并病毒液加入福尔马林(终浓度1/2000)置于26±1℃，8天灭活病毒，得到粗疫苗，用截留30万分子量的超滤器浓缩成20倍浓缩疫苗。
超滤纯化的浓缩疫苗过蔗糖密度梯度离心法和凝胶过滤柱Sepharose 4FF，经三步纯化，得到纯化疫苗，加入人血蛋白保护剂和氢氧化铝佐剂制成纯化疫苗成品，分装，制成乙型脑炎纯化疫苗为水针剂型5ml规格。
检定疫苗效力达到了中国乙脑疫苗参考品和日本乙脑疫苗参考品要求，其他各项检定均合中华人民共和国药典标准2000版生物制品规程的疫苗要求。
实施例2
二倍体细胞来自中国疾病预防控制中心，使用38-50代，细胞营养液为199培养基中含有2-10％牛血清和25IU/ml庆大霉素和25IU/ml卡那霉素，并调整PH到7.2，用3L转瓶37℃培养成致密单层后按照1∶2分种率扩增，扩增到生产批量时，经过4天左右，当细胞长成致密单层，弃去细胞营养液，用PH7.2的Earl＇s液冲洗细胞面，接种二倍体细胞乙脑病毒，使用乙脑鼠脑毒种AS14-14-2株在二倍体细胞上传代的第二代工作毒种(P_3-2)，毒种浓度MOI0.05，细胞维持液为含0.4-0.5％(W/W)人白蛋白的199培养液，PH7.6，35℃下培养，24小时后换以新鲜细胞维持液继续培养2天，开始收获病毒，每3-4天收获一次，共收5次，每批病毒液均取样进行病毒滴定和无菌试验，要求收获病毒液的病毒滴度达到10⁷LD50/ml以上；合并病毒液加入福尔马林(终浓度1/2000)置于26±1℃，8天灭活病毒，得到粗疫苗，用截留30万分子量的超滤器浓缩成20倍浓缩疫苗。
超滤纯化的浓缩疫苗过蔗糖密度梯度离心法和凝胶过滤柱Sepharose 4FF，经三步纯化，得到纯化疫苗，加入人血蛋白保护剂和氢氧化铝佐剂制成纯化疫苗成品，分装，制成乙型脑炎纯化疫苗为水针剂型2ml规格。
检定疫苗效力达到了中国乙脑疫苗参考品和日本乙脑疫苗参考品要求，其他各项检定均合中华人民共和国药典标准2000版生物制品规程的疫苗要求。
实施例3
用权利要求1方法制备的乙脑灭活疫苗经实验(包括给12名4-6岁儿童注射，未接种过乙脑疫苗者，接种2针乙脑灭活疫苗，两针间隔7-10天。)证明中和抗体阳转率为91.7％，无副反应发生。