从一种印度蚯蚓体腔液中得到的引起精子不能游动的蛋白 本发明涉及一种新颖的、从属于节肢动物门的蚯蚓Pheretima posthuma中分离到的、引起精子不能游动的蛋白，该蛋白可以作为抗致育因子。本发明还提供了从蚯蚓成熟样本的体腔分离活性因子的方法，可以由普通方式从属于节肢动物门的蚯蚓Pheretima posthuma获得成熟样本，该因子可以作为抗致育因子。
控制人口爆炸是与发展中国家(如印度、中国)的进步密切相关的重要项目。市场上有一些避孕工具和试剂，这无疑有助于控制生育和控制人口，但大多数避孕工具和试剂或存在成功避孕问题，或存在毒副作用问题，因为避孕药丸含有类固醇。因此，我们确实需要非常成功的装置或产品，既可保证成功避孕，又不会引起毒副作用。
因此，各个国家都在尝试得到这样的产品，但迄今为止，还没有一个国家获得成功。在日本有这样一个有趣的故事，东京大学的一位前名誉教授和一个调查小组开展了一项研究项目，研究从Eisenia foetida的体腔液中得到避孕物质。取自日本蚯蚓Eisenia foetida体腔液中的一种添加因子立即引起了包括人类在内的许多脊椎动物的精子游动停止。研究小组非常激动，继续纯化这种因子。他们发现该因子为一种蛋白质，并且是41kDa的单体蛋白质。此后，当他们又克隆出这种蛋白质的基因时，他们突然发现这种蛋白质具有很高的毒性(Sekizawa et al.，1996，Biomed.Res.，17(3)，197-203；Sekizawa et al.，1997，Gene，191，97-102；Yamaji et al.，1998，J.Biol.Chem.，273(9)，5300-5306；Kobayashi et al.，2000，J.Expl.Zool.，286，538-549)。将这些蛋白质注入老鼠的血液中，它们立即就死亡。在红细胞的制备过程中添加这种蛋白质后，瞬间即导致细胞溶解。这次事故虽然未能使达到他们地目的，但是他们却发现了这种蛋白质的另一面：即它具有抑制神经鞘磷脂的功效，神经鞘磷脂是存在于大多数脊椎动物细胞膜中的油脂。正是这种抑制力导致了细胞的溶解。不过，他们发现有一种像这些蛋白质一样重要的高效神经鞘磷脂抑制蛋白质，但目前还无法获取。这种蛋白质取名为“Lysenin”，因其所具有的神经鞘磷脂抑制功能而拥有极高的市场价值。该研究小组还发表了许多有关“Lysenin”的论文。
显然，他们未能实现自己的主要目标，即将其用作抗致育因子从而获得较高的商业利润。
本发明的主要目的是从一种蚯蚓的体腔液中鉴别出一种因子，该因子能引起精子立即停止运动，并能用作抗致育因子。
本发明的另一个目的是提供一种与当前市售的其它表现出严重副作用的避孕剂相比较，完全无毒的混合物。
发明人的工作始于印度蚯蚓Pheretima posthuma，抽提体腔液，并检测它们对精子活动性的作用，发现它能够与lysenin一样有效，同样立刻使精子停止运动。但二者存在着明显的差异。印度蚯蚓体内的抽提物并不会造成小鼠、老鼠及兔子死亡。针对该种毒性进行的详细、认真的试验表明其对肝脏及其他组织并无有害影响。此外，在RBC准备中添加它们后并没有像观察“lysenin”时出现细胞菌溶解现象。因此，该抽提物能够造成精子永久性地停止活动，而不至于产生任何副作用。在控制生育时使用这种优势可以带来巨大的商业利润。
这种因子同样也是蛋白质。申请人通过分子排斥色谱法(SG-100)将其加以净化。由此可以得出：它是从一种印度蚯蚓体内提取的产品，并且应该得到保护。
附图的简要说明
图1：体腔液经过SG100凝胶过滤柱的洗脱图，得到PI、PII、PIII三个峰。检测收集自每个峰的蛋白对精子活动性的作用。
图2：PIII(凝胶色谱的活性峰)经过HPLC DEAE柱的洗脱图。得到一个不连续的小峰(DI)、和三个连续的峰(DII、DIII、DIV)，检测收集自每个峰的蛋白对精子活动性的作用。
图3：离子交换层析步骤这的活性部分的SDS-PAGE电泳，12％的分离胶和3.5％的浓缩胶。约3μg的蛋白溶于20μl样品缓冲液中，样品缓冲液含有0.01MTris，10％SDS，5％β巯基乙醇和0.1％溴酚蓝(pH6.8)。100℃加热5分钟，加入凝胶，在50伏电压下电泳。7μl预先染色的标准参照物(GIBCO-BRL)用于确定分子量。得到20千道尔顿(kDa)的单体蛋白(图3)。
表格的简要描述
表1：每个蛋白峰加入精子悬液检测其引起停止运动的数据。每个蛋白峰取15μg，加入精子悬液，分别在30秒、2分钟、5分钟和10分钟检测它们引起精子停止运动的效果。只有PIII引起100％的停止运动，PI和PII没有效果。
表2：每个蛋白峰加入精子悬液检测其引起停止运动的数据。每个蛋白峰取5μg，加入精子悬液，分别在30秒、2分钟、5分钟和10分钟检测它们引起精子停止运动的效果。第一个bound峰的蛋白引起精子百分之百地停止运动，表明这一部分存在活性因子。
相应地，本发明提供了一种新颖的、从蚯蚓Pheretima posthuma中分离的精子不能游动蛋白，该蛋白具有如下性质：
a.阴离子蛋白，
b.分子量20kDa，
c.无毒且无溶血活性，而且
d.在2分钟之内引起精子不能游动。
在本发明的一个实施例中，当该蛋白以10-15毫克/千克体重的剂量注射入于大鼠和小鼠一个月时，没有任何不良作用。
在本发明的另一个实施例中，该蛋白能够在哺乳动物(包括人)的内部和外部施用。
在本发明的另一个实施例中，该精子不能游动物也可以用作抗致育因子，它含有从属于环节动物门的蚯蚓Pheretima posthuma得到的体腔液抽提物。
在本发明的另一个实施例中，这种新颖的精子不能游动试剂还包含传统的药学上可接受的添加剂。
在本发明的另一个实施例中，这种新颖的精子不能游动试剂有溶液、凝胶、粉末、胶囊、药片和乳膏状形式。
在本发明的另一个实施例中，这种新颖的精子不能游动试剂是无毒的，而且当注射入哺乳动物时，不表现出任何溶血活性。
在本发明的另一个实施例中，这种新颖的精子不能游动试剂在两分钟之内引起精子百分之百地停止运动。
在本发明的另一个实施例中，这种新颖的精子不能游动试剂是非固醇类的，并且能够外用。
本发明更多的实施例与分离CF(体腔液)中的活性因子有关，用一般的方式从蚯蚓Pheretima posthuma的成熟标本得到体腔液，其中所述方法包括如下步骤：
a.提供从蚯蚓Pheretima posthuma的成熟标本得到的体腔液(CF)，将CF超声处理后离心，
b.得到上清作为CF的粗抽提物，
c.将CF的粗抽提物进行凝集过滤层析，
d.在280nm处测定蛋白部分，
e.得到三个蛋白峰并分析每个峰的活性
f.收集活性峰III，冻干，透析，用DEAE柱进行HPLC以进一步纯化，
g.洗脱bound和unbound的蛋白，
h.研究每个蛋白峰在280nm的吸收，
i.汇集，冻干，透析每个峰，检测它们对精子游动性的活性，并且
j.鉴定出具有引起精子不能游动的第一个受束缚的峰，进行SDS-PAGE电泳以检测其纯度及分子量。
在本发明的另一个实施例中，以10-15毫克/千克体重的剂量，将所述CF注入大鼠和小鼠体内，进行不能游动测验。即使在注射后一个月后，动物仍然没有死亡。
本发明的另一个实施例与一种方法有关。其中，将10μl粗抽提物加入制备的250μl RBC中，在温育30分钟后，红细胞仍然保持完整的。该结果表明该蛋白没有溶血活性。
本发明的另一个实施例提供了一种从雄性大鼠和小鼠制备精子悬浮液、用于生物分析的方法，所述方法包括下列步骤：
a.收集有生育能力的雄性大鼠和小鼠的精子，用BWW培养基稀释，培养基用油覆盖，在CO2恒温箱37℃平衡，空气中CO25％，
b.再次培育精子悬浮液，使精子能够游动，
c.收集有高运动活力的精子悬浮液，其具有至少70％的向前游动活力。
d.精子悬浮液离心5-10分钟，稀释球状精子，得到40-50μl具有所需浓度(2.0×105-2.5×105个精子)的溶液。
在本发明的另一个实施例中，抗生育复合物是从属于节肢动物门的蚯蚓Pheretima posthuma中分离到的，该复合物能够在哺乳动物外部和内部使用。
I.活性原理的生物分析
(a)精子的收集及精子悬浮液的准备
用于试验的精液取自于繁殖力较强的雄性鼠的尾部，并用BWW培养基稀释((94mM NaCl，4.7mM KCl，1.7mM CaCl2，1.2mM KH2PO4，1.2mM MgSO4，7H2O，25mM NaHCO3，0.5mM Na-pyruvate，19mM Na-lactate，5mM glucose，0.4％BSA，0.1％antibiotic solution，pH 7.2))，用油覆盖，在二氧化碳恒温箱内37℃培养，空气中的二氧化碳浓度5％，以使培养基达到平衡。再次培育精子悬浮液，以使精子漂浮起来。半个小时以后，收集漂浮在悬浮液上部的精子。精子的浓度在Maclar’s chamber中可以测定出来。精子的性质及运动能力也同样能够得到检验。认为具有至少70％向前游动力、高游动性的精子悬浮液适于做试验。从精子悬浮液上部采集的漂浮的精子；1000rpm离心五分钟，稀释球状精子达到要求的浓度。将50ul精子悬浮液(2.5×105精子)置于35mm有盖培养皿并用矿物油(Sigma)覆盖，该矿物油已经在二氧化碳孵化器中，空气中含5％的二氧化碳，预先平衡过夜。
(b)各种蛋白质分馏物对精子游动性的影响
所有用于测试精子不游动性的部分都用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释。将50ul测试材料加入精子悬浮液滴中，对照加入相同体积的PBS，用以代替被测试的溶液。加入测试材料后，以30秒、2分钟、5分钟、10分钟的间隔在显微镜下观察精子的活跃性。在这一阶段，培养皿被保存在二氧化碳恒温箱中。最后的观察结束后，记录所有测试滴剂的pH值，以确认被测悬浮液的PH值是否有任何变化。
II.游动性原理的提取及净化：
用消过毒的针挑取成熟的蚯蚓标本。大约100只这样的蚯蚓被放入容器，并用超声处理45分钟。用这种方法得到提取15ml体腔液(CF)。10,000rpm离心分离20分钟，悬浮液于-20℃贮存，并作为体腔液的粗提取物以备进一步净化。
(a)分子排斥层析
体腔液用Sephadex G100柱进行凝胶过滤色谱层析，柱子预先用0.05M PBS(pH 7.2)平衡过。0.5ml的体腔液从柱子上加入。用同样的缓冲液，以20ml/h的低速率洗脱，收集到2.0ml的洗脱组分。在280nm处检测洗脱组分的光吸收。得到3个蛋白峰(见图一)，分析每个峰的活性(见表一)。汇集有活性峰(PIII)的洗脱组分、冻干、透析(4℃，0.005M磷酸盐缓冲液中24小时，其间更换缓冲液两次)，用HPLC DEAE柱子进行离子交换层析。
(B)离子交换层析分子交换层析步骤中的活性成分进一步用HPLC DEAE(7.5×750nm)柱纯化，该柱用缓冲液A(0.005磷酸盐缓冲液)平衡。用同样的缓冲液以0.8ml/mim的速率洗脱柱子洗脱unbound蛋白，bound蛋白用缓冲液B(缓冲液A加2.0 NaCl)280nm测定蛋白的吸收。观察到一个unbound小峰和三个bound(图2)，分别收集每个峰，冻干，透析每个峰(0.005M磷酸盐缓冲液透析24小时，其间换液2次)检测他们对精子活动性的影响(表2)。第一个峰表现出精子不游动活性，用其进行SDS-PAGE
(c)SDS-PAGE
离子交换层析步骤中的活性部分进行SDS-PAGE电泳，12％的分离胶和3.5％的浓缩胶。约3μg的蛋白溶于20μl样品缓冲液中，样品缓冲液含有0.01M Tris，10％SDS，5％β巯基乙醇和0.1％溴酚蓝(pH6.8)。100℃加热5分钟，加入凝胶，在50伏电压下电泳。7μl预先染色的标准参照物(GIBCO-BRL)用于确定分子量。得到20千道尔顿(kDa)的单体蛋白(图3)。
III.毒性测验：
(a)死亡率测验：
为了检测体腔液是否具有毒性效果，按照15毫克/千克体重的剂量，将粗提取物注射入(i.v和i.p)大鼠和小鼠(每种5只)。对照动物注射等体积0.9％的盐水。即使是注射后一个月，没有任何动物死亡。
(b)溶血测验
将血液收集到肝素化的试管后，立即制备大鼠的红细胞(RBCs)。用等渗透盐液将血液稀释三倍，1000rpm离心5分钟。用盐液清洗球化的红细胞五次，稀释至约2×105细胞/毫升。将10μl粗提取物(0.19mg)加入制备的50μl红细胞中，在显微镜下观察。即使是在培育30分钟后红细胞仍然保持完整，表明该蛋白没有任何溶血活性。
完成所有的体外和体内实验后，申请人无疑有资格要求保护对Pheretimaposthuma体腔液中因子的分离，该因子具有强烈的引起精子不能游动的作用，同时完全无毒。这个20kDa的蛋白是一个强的、引起精子不能游动的因子。当培养皿上的精子数恒定时，该蛋白对大鼠、小鼠和人具有相似的浓度作用。因此，该蛋白具有作为抗致育因子的巨大潜能，它无副作用，而大多数目前市场上可得到的、含有类固醇的避孕剂均有副作用。它将成为市场上第一个非甾族的、外用的试剂(置于阴道)。
初步的实验清楚地表明它有希望作为外用试剂。
表1.SG 100不同洗脱峰的精子不能游动作用 S1.No 30秒 2分钟 5分钟 10分钟 PI没有不能游动没有不能游动没有不能游动没有不能游动 PII没有不能游动没有不能游动没有不能游动没有不能游动 PIII80％不能游动100％不能游动------------每次测试取50μl(2.5×105个精子)，加入15μg每个峰的蛋白。结果得自五次观察的数据。表2.HPLC DEAE离子交换层析不同峰的精子不能游动作用 S1.No 30秒 2分钟 5分钟 10分钟 DI没有不能游动没有不能游动没有不能游动没有不能游动 DII70％不能游动100％不能游动------------ DIII10％不能游动15％不能游动15％不能游动15％不能游动 DIV没有不能游动没有不能游动没有不能游动没有不能游动
每次测试取50μl(2.5×105个精子)，加入5μg每个峰的蛋白。结果得自五次观察的数据。