一种猪胸主动脉中提取水不溶性胶原蛋白的方法.pdf

本发明涉及一种以猪胸主动脉为原料，通过脱脂、除杂、酶解、盐析、透析等工艺步骤制备水不溶性胶原蛋白的方法。该方法工艺步骤简单安全并易于操作，成本低，所得到产品纯度高。与水溶性胶原蛋白相比较，本发明所得到的水不溶性胶原蛋白体内降解速率降低，凝血速度更快，可用于伤口止血或制备其它医用生物材料。

1.  一种猪胸主动脉中提取水不溶性胶原蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)预处理：采用检疫合格的猪，无菌开腔，取胸主动脉，剔除表面结缔组织后，用无菌水漂洗干净后，冷冻干燥，粉碎至30～100目；
(2)脱脂：将步骤(1)粉碎的胸主动脉，置于丙酮试剂中，于-20℃条件下搅拌12h后，5000r/min的转速下，离心30min，去除乳白色上清液，更换新丙酮试剂重复上述脱脂操作，直至上清液呈清亮透明状，去除上清液，将下层产品置于真空干燥箱风干；
(3)除杂：在步骤(2)所得下层产品中，加入产品重量10～15倍体积的4M盐酸胍溶液，于4℃条件下搅拌72h后，8000r/min的转速下，离心30min，去除上清液后，下层产品经蒸馏水漂洗2～3次至上清液为中性，8000r/min的转速下，离心30min，去除上清液，保留下层产品；
(4)酶解：在步骤(3)所得下层产品中，加入液料比为50～100mL/g的0.5M醋酸溶液，再加入产品重量0.03～0.05倍的胃蛋白酶，于37℃条件下反应24～36h后，8000r/min的转速下，离心30min，去除下层沉淀，保留上清液；
(5)盐析：常温搅拌状态下在步骤(4)制得的上清液中，加入粉末状NaCl至饱和，8000r/min的转速下，离心20min，去除上清液，保留沉淀物；
(6)重溶：将步骤(5)离心所得的沉淀物用0.5M醋酸溶液溶解，8000r/min的转速下，离心20min，去除不溶物，保留上清液；
(7)透析：将步骤(6)制得的上清液，在0.5M醋酸溶液中透析2～3d后，再在0.1M醋酸溶液中透析2～3d，最后在蒸馏水中透析至置换液为中性；
(8)冷冻干燥：将步骤(7)所得的透析产物，在8000r/min的转速下，离心30min，去除上清液，收集沉淀物并冷冻干燥，即得水不溶性胶原蛋白。

2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述猪的月龄大于10。

3.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中胸主动脉由其他部位的动脉代替。

4.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中盐酸胍溶液由pH为4.5～5.8的50mM醋酸钠缓冲液配制而成。

5.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中盐酸胍溶液由尿素溶液代替，尿素溶液的浓度为8M，由pH为4.5～5.8的50mM醋酸钠缓冲液配制而成。

6.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(7)中透析所用的透析袋截留分子量为14000Da。

一种猪胸主动脉中提取水不溶性胶原蛋白的方法
技术领域
本发明涉及生物制品领域，尤其是涉及一种以猪胸主动脉为原料，通过脱脂、除杂、酶解、盐析、透析等工艺步骤制备水不溶性胶原蛋白的方法。
背景技术
胶原蛋白主要存在于动物结缔组织中，是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，对机体和脏器起着支撑、保护、结合和界隔等作用，在关节润滑、组织形成及成熟、凝血作用、伤口愈合、细胞间信号传递、运载生物因子和衰老等方面都起着举足轻重的作用。
胶原蛋白在工业中广泛应用于化妆品、食品、保健品中，此外，由于胶原蛋白的低免疫源性、止血作用、可促进细胞增殖和细胞生长、可生物降解且降解产物无毒副作用等诸多优点，被越来越多的应用到组织工程中，例如人工皮肤、伤口敷料、人工骨骼、人造腱以及人造血管等多种生物材料。
目前获得胶原蛋白的主要途径是从畜禽类动物组织以及海洋生物中提取分离，且主要产物为水溶性胶原蛋白。该类胶原不能在水体系中成型，并且在体内环境中，极易被降解。尽管可通过化学交联来改性胶原材料，却降低了胶原材料使用的安全性。此外，常规提取对原料的碱处理或高温处理，会对原料中胶原蛋白成分造成破坏，并且水溶性这一特性使得纯化过程繁琐。
我国是养猪大户，除了供应日常食用需求，目前猪皮已被回收提取胶原，小肠用来提取具有抗凝血活性的肝素钠以外，其余成分均被遗弃，没有得到更好的利用，浪费资源又污染环境。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种猪胸主动脉中提取水不溶性胶原蛋白的方法。本发明方法充分利用了工业废料猪血管，实现了变废为宝，且工艺步骤简单安全并易于操作、产品纯度高。
本发明的技术方案如下：取检疫合格的猪，无菌开腔取胸主动脉，冷冻干燥粉碎。经丙酮低温脱脂、盐酸胍或尿素低温去除蛋白聚糖等杂质后，再经胃蛋白酶酶解后，继续用盐析法获得水不溶性胶原蛋白粗品沉淀。沉淀用醋酸溶液重新溶解后，逐步对醋酸溶液和蒸馏水透析，所得沉淀冷冻干燥后既得水不溶性胶原蛋白产品。
本发明有益的技术效果在于：
1、本发明方法中猪胸主动脉预处理后经低温有机熔剂脱脂、表面活性剂去除蛋白聚糖的 步骤，达到了初步脱脂去除杂质的效果。
2、本发明方法所得胶原蛋白不溶于水，与现有技术生产出的产品相比，纯化过程简单，且产品纯度高。
3、本发明方法整个生产工艺中的酸性条件，避免了碱性环境对胶原蛋白的变性作用，不改变原料中胶原蛋白的性质，保持了其原有的生物活性，因此本发明制得的胶原蛋白具有很好的生物活性，安全可靠，无毒副作用。且与现有技术生产出的水溶性胶原蛋白产品相比较，降解速率大幅度降低，延长了作用时间，凝血速度更快，可满足机体自修复要求。
4、本发明方法以猪胸主动脉为原料，成本低，所需设备简单，提取剩余残渣还可作为生产饲料继续使用，充分利用了资源，又降低了环境污染，生产过程中用有机试剂低温脱脂，有效去除脂类成分，蛋白变性剂去除蛋白聚糖后，酶降解法提取胶原蛋白，再用盐析法沉淀胶原蛋白，最后经逐步透析冷冻干燥得到水不溶性胶原蛋白。
6、本发明方法包括预处理、脱脂、除杂、酶解、盐析、重溶、透析、冷冻干燥的工艺步骤，按照工艺顺序进行，各步骤相辅相承，共同配合完成胶原蛋白的提取，缺一不可。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1
一种猪胸主动脉中提取水不溶性胶原蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)预处理：采用检疫合格的猪，无菌开腔，取胸主动脉，剔除表面结缔组织后，用无菌水漂洗干净后，冷冻干燥，粉碎至100目；
(2)脱脂：将步骤(1)粉碎的胸主动脉，置于丙酮试剂中，于-20℃条件下搅拌12h后，5000r/min的转速下，离心30min，去除乳白色上清液，更换新丙酮试剂重复上述脱脂操作，直至上清液呈清亮透明状，去除上清液，将下层产品置于真空干燥箱风干；
(3)除杂：在步骤(2)所得下层产品中，加入产品重量10倍体积的4M盐酸胍溶液，于4℃条件下搅拌72h后，8000r/min的转速下，离心30min，去除上清液后，下层产品经蒸馏水漂洗2次至上清液为中性，8000r/min的转速下，离心30min，去除上清液，保留下层产品；
(4)酶解：在步骤(3)所得下层产品中，加入液料比为50mL/g的0.5M醋酸溶液，再加入产品重量0.05倍的胃蛋白酶，于37℃条件下反应30h后，8000r/min的转速下，离心30min，去除下层沉淀，保留上清液；
(5)盐析：常温搅拌状态下在步骤(4)制得的上清液中，加入粉末状NaCl至饱和，8000r/min的转速下，离心20min，去除上清液，保留沉淀物；
(6)重溶：将步骤(5)离心所得的沉淀物用0.5M醋酸溶液溶解，8000r/min的转速下，离心20min，去除不溶物，保留上清液；
(7)透析：将步骤(6)制得的上清液，在0.5M醋酸溶液中对截留分子量为14000Da的透析袋透析3d后，再在0.1M醋酸溶液中透析3d，最后在蒸馏水中透析至置换液为中性；
(8)冷冻干燥：将步骤(7)所得的透析产物，在8000r/min的转速下，离心30min，去除上清液，收集沉淀物并冷冻干燥，即得水不溶性胶原蛋白。
实施例2
一种猪胸主动脉中提取水不溶性胶原蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)预处理：采用检疫合格的猪，无菌开腔，取胸主动脉，剔除表面结缔组织后，用无菌水漂洗干净后，冷冻干燥，粉碎至70目；
(2)脱脂：将步骤(1)粉碎的胸主动脉，置于丙酮试剂中，于-20℃条件下搅拌12h后，5000r/min的转速下，离心30min，去除乳白色上清液，更换新丙酮试剂重复上述脱脂操作，直至上清液呈清亮透明状，去除上清液，将下层产品置于真空干燥箱风干；
(3)除杂：在步骤(2)所得下层产品中，加入产品重量12倍体积的4M盐酸胍溶液，于4℃条件下搅拌72h后，8000r/min的转速下，离心30min，去除上清液后，下层产品经蒸馏水漂洗3次至上清液为中性，8000r/min的转速下，离心30min，去除上清液，保留下层产品；
(4)酶解：在步骤(3)所得下层产品中，加入液料比为80mL/g的0.5M醋酸溶液，再加入产品重量0.05倍的胃蛋白酶，于37℃条件下反应24h后，8000r/min的转速下，离心30min，去除下层沉淀，保留上清液；
(5)盐析：常温搅拌状态下在步骤(4)制得的上清液中，加入粉末状NaCl至饱和，8000r/min的转速下，离心20min，去除上清液，保留沉淀物；
(6)重溶：将步骤(5)离心所得的沉淀物用0.5M醋酸溶液溶解，8000r/min的转速下，离心20min，去除不溶物，保留上清液；
(7)透析：将步骤(6)制得的上清液，在0.5M醋酸溶液中对截留分子量为14000Da的透析袋透析3d后，再在0.1M醋酸溶液中透析2d，最后在蒸馏水中透析至置换液为中性；
(8)冷冻干燥：将步骤(7)所得的透析产物，在8000r/min的转速下，离心30min，去除上清液，收集沉淀物并冷冻干燥，即得水不溶性胶原蛋白。
实施例3
一种猪胸主动脉中提取水不溶性胶原蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)预处理：采用检疫合格的猪，无菌开腔，取胸主动脉，剔除表面结缔组织后，用无 菌水漂洗干净后，冷冻干燥，粉碎至30目；
(2)脱脂：将步骤(1)粉碎的胸主动脉，置于丙酮试剂中，于-20℃条件下搅拌12h后，5000r/min的转速下，离心30min，去除乳白色上清液，更换新丙酮试剂重复上述脱脂操作，直至上清液呈清亮透明状，去除上清液，将下层产品置于真空干燥箱风干；
(3)除杂：在步骤(2)所得下层产品中，加入产品重量15倍体积的4M盐酸胍溶液，于4℃条件下搅拌72h后，8000r/min的转速下，离心30min，去除上清液后，下层产品经蒸馏水漂洗3次至上清液为中性，8000r/min的转速下，离心30min，去除上清液，保留下层产品；
(4)酶解：在步骤(3)所得下层产品中，加入液料比为100mL/g的0.5M醋酸溶液，再加入产品重量0.03倍的胃蛋白酶，于37℃条件下反应36h后，8000r/min的转速下，离心30min，去除下层沉淀，保留上清液；
(5)盐析：常温搅拌状态下在步骤(4)制得的上清液中，加入粉末状NaCl至饱和，8000r/min的转速下，离心20min，去除上清液，保留沉淀物；
(6)重溶：将步骤(5)离心所得的沉淀物用0.5M醋酸溶液溶解，8000r/min的转速下，离心20min，去除不溶物，保留上清液；
(7)透析：将步骤(6)制得的上清液，在0.5M醋酸溶液中对截留分子量为14000Da的透析袋透析2d后，再在0.1M醋酸溶液中透析3d，最后在蒸馏水中透析至置换液为中性；
(8)冷冻干燥：将步骤(7)所得的透析产物，在8000r/min的转速下，离心30min，去除上清液，收集沉淀物并冷冻干燥，即得水不溶性胶原蛋白。
实施例4
本发明实施例2得到的水不溶性胶原蛋白的止血效果实验：
以本发明实施例2的猪胸主动脉水不溶性胶原蛋白为实验材料，进行了新西兰兔肝脏创伤模型的止血效果实验，以猪皮水溶性胶原蛋白作为阴性对照组，医用纱布作为空白对照组。将健康新西兰兔麻醉固定后，无菌条件下开腹腔，肝表面切除1cm×1cm肝组织，造成出血创面。随机敷上50mg猪胸主动脉水不溶性胶原蛋白和猪皮水溶性胶原蛋白，空白对照组给予医用纱布止血。敷压伤口，观察止血情况，记录完全止血时间。结果如表1所示，采用单因素方差分析方法，与医用纱布相比较，猪皮水溶性胶原蛋白和猪胸主动脉水不溶性胶原蛋白均能够显著促进止血，猪胸主动脉水不溶性胶原蛋白止血效果明显优于猪皮水溶性胶原蛋白。
表1 水不溶性胶原在新西兰兔肝脏创伤模型中的止血效果表

本发明的实施例1、3初步实验表明，与实施例2具有相似效果。
实施例5
本发明实施例2得到的水不溶性胶原蛋白的体内降解实验：
以本发明实施例2的猪胸主动脉水不溶性胶原蛋白为实验组，以市售猪皮水溶性胶原蛋白作为对照组。称取等量猪胸主动脉水不溶性胶原蛋白和猪皮水溶性胶原蛋白分别溶于等体积0.1M醋酸溶液和蒸馏水中，倒入模具后冷冻干燥成型。选体重为28～32g的健康成年雄性ICR小鼠，随机分为对照组和对照组，麻醉固定。无菌条件下，背部脱毛后，沿脊柱中央剪开约1cm切口，钝器分离至筋膜层，将成型后的猪胸主动脉水不溶性胶原蛋白和猪皮水溶性胶原蛋白分别植入切口，缝合。于术后第3天开始观察小鼠切口内植入材料降解情况，记录完全降解时间。采用单因素方差分析方法，猪胸主动脉水不溶性胶原在体内降解时间明显延长，统计学分析具有显著性差异。结果如表2所示。
表2 水不溶性胶原在小鼠体内完全降解时间

本发明的实施例1、3初步实验表明，与实施例2具有相似效果。