人甲状旁腺激素基因突变体合成、表达、制备及应用 本发明属生物技术领域，涉及人甲状旁腺激素的全基因合成、基因工程和含有甲状旁腺激素的制剂作为治疗人类骨代谢病、骨质疏松及由骨质疏松所引起的疾病的治疗药物。
甲状旁腺激素是由84个氨基酸组成的小分子蛋白，是人体内重要的钙磷调节因子。它的生理功能主要是刺激蛋白激酶C等的作用，刺激肾对钙的重吸收、磷的分泌和骨的重建，导致合成和分解作用。在临床上，甲状旁腺激素与降钙素共同控制着血钙浓度，甲状旁腺激素在适量的浓度下长时间作用于骨，则会刺激骨的形成，可有效地治疗骨质疏松症。
以前甲状旁腺激素的基因克隆，都是通过PCR的方法，从其cDNA文库中扩增基因，由于其DNA序列中GC含量较高，因而表达水平一般偏低。我们利用密码子地兼并性降低了其DNA中的GC含量，选择了大肠杆菌偏爱的密码子，进行了全基因合成，利用基因工程方法制备人甲状旁腺激素取得了成功。
本发明采用下述技术方案：
(1)鉴于遗传密码有兼并性和大肠杆菌对氨基酸密码子的偏爱与人体细胞的差异，本发明专门设计合成了人甲状旁腺激素基因大肠杆菌偏爱密码子的全DNA片段，它可以在不改变产物人甲状旁腺激素的氨基酸组成与排列顺序的基础上，提高甲状旁腺激素基因在大肠杆菌中的表达水平。其步骤为首先设计DNA序列，将全基因和起始、终止密码子、酶切位点等分成12个片段合成正、反两链，然后再以正、反两条链的5′端第1段序列为正、反向引物，进行PCR扩增，得到PCR产物与pUC19连接，测序正确后将PCR扩增产物插入国内已广泛采用的高效表达载体pET22b中，构建成甲状旁腺激素表达质粒pPTH。它能在大肠杆菌JM109和BL21中高表达，使甲状旁腺激素占菌体总蛋白的30％左右，表达率经100次以上传代不降低。
(2)通过发酵工程菌，用2YT作为基础培养基，适当增加碳源和氮源，通过优化溶氧、搅拌速度、发酵pH值等工艺参数，最终培养物OD600值可达2 5左右，生物量为每升培养物30-35g，产物表达率在25-30％之间。产物表达量可达每升培养物200mg以上。
(3)在此基础上建立了纯化工艺，其中包括菌体的破碎和产物抽提、酸处理去除杂蛋白、阳阴离子交换层析和凝胶排阻层析精制等。
所建立的工艺稳定、回收率高、活性好。本工艺具有以下特点：①通过酸处理去除了70％以上的可溶性蛋白，而目标蛋白甲状旁腺激素无损失；②第二步用阳阴离子交换层析可去除几乎所有的杂蛋白；③最后一步凝胶排阻层析可以去除大小分子量的酸性杂质。本工艺对三批各22.5L发酵产物纯化后每批可得纯品3-5g。
(4)纯品加入药用甘露醇以及磷酸盐缓冲液等稳定剂和助溶剂后，用微孔滤膜过滤除菌，冷冻干燥成粉状成品。注射用水溶解后应用，可用于骨质疏松及由骨质疏松所导致的疾病的治疗。
本品在体外能明显刺激SAOS-2细胞产生的cAMP，据此可以测定人甲状旁腺激素的生物活性。
本发明运用重组DNA技术，采用分段合成技术再拼接形成甲状旁腺激素全基因，在不改变编码氨基酸的前提下，改变基因部分核苷酸，从而提高了产物的表达，且产物以可溶性形式存在于大肠杆菌胞浆内，产物活性高。下游纯化方式简便，收率高，达到临床用药的质量要求。本产品用于骨质疏松及由骨质疏松引起的疾病的治疗，能得到显著的疗效。
本发明用下述实例进行说明：
实施例1、基因编码序列设计
采用大肠杆菌偏爱密码子，并在5′端加入ATG起始密码子和NdeI酶切位点，3′端引入BamHI酶切位点，全序列长270bp，分成12个片段合成，示意图如下：
P1 P2 P3 P4 P5 P65′——————————————————————————————3′3′——————————————————————————————5′
N6 N5 N4 N3 N2 N1P1： CAT ATG TCT GTG TCC GAG ATT CAG T 25merP2： TA ATG CAT AAC CTT GGC AAA CAT TTG AACTCC ATG GAG CGT GTA GAA TG 49merP3： G CTG CGT AAG AAG TTG CAG GAT GTG CACAAT TTT GTT GCC TTA GGT GCC 49merP4： CCA TTG GCT CCT CGT GAT GCT GGT TCC CAAAGA CCA CGT AAA AAG GAA G 49merP5： AC AAT GTC TTA GTT GAG AGC CAT GAA AAATCC CTA GGC GAG GCA GAC AA 49merP6： G GCC GAT GTG AAT GTA TTA ACT AAA GCTAAA TCC CAG TAA TGA GGA TCC 49mer N1： GGA TCC TCA TTA CTG GGA TTT AGC T25merN2： TT AGT TAA TAC ATT CAC ATC GGC CTT GTCTGC CTC GCC TAG GGA TTT TT 49merN5： C ATG GCT CTC AAC TAA GAC ATT GTC TTCCTT TTT ACG TGG TCT TTG GGA 49merN4： ACC AGC ATC ACG AGG AGC CAA TGG GGCACC TAA GGC AAC AAA ATT GTG C49merN5： AC ATC CTG CAA CTT CTT ACG CAG CCA TTCTAC ACG CTC CAT GGA GTT CA 49merN6： A ATG TTT GCC AAG GTT ATG CAT TAA CTGAAT CTC GGA CAC AGA CAT ATG 49mer
实施例2、全长片段的克隆、测序鉴定
1)5′端磷酸化：将合成的12个片段用水溶解各取50pmol，40微升反应体积，用T4多核苷酸激酶将ATP的γ-磷酸基转移到各片段的5′端，具体反应条件为37℃，60min。然后70℃，5min灭活。
2)退火连接：上述反应产物，95℃，5min，于保温杯中缓慢降温(过夜)。次日加T4DNA连接酶，12℃过夜(12h以上)。
3)PCR扩增：以连接产物为模板，N1，P1为引物，63℃退火，72℃延伸40s，30个循环。
4)回收PCR产物，双酶切后与同样酶切的质粒pUC19连接，转化到JM109或BL21受体菌，蓝白斑筛选获得阳性转化子，挑选10个转化子测序。
5)测序结果表明，上述10个转化子克隆只有一个序列与设计序列完全一致(测得的核苷酸序列及相应的氨基酸序列见表1)。
实施例3、表达载体的构建
从pUC19/PTH酶切获得目的基因片段，回收后连接已双酶切的pET22b表达载体，转化后用PCR方法筛选阳性克隆，且酶切正确。含有以上表达质粒(pPTH)的BL21工程菌经扩增培养、温度诱导，在12kd左右多出一条蛋白条带。
实施例4、人甲状旁腺激素的发酵生产
工程菌30℃过夜培养后，按5％比例接种于2YT培养基中，30℃培养到0D600为2.0时，加入IPTG诱导产生人甲状旁腺激素，4h后收集菌体。在表达的不同时机加氮源、碳源等营养素。最终发酵产物密度可达0D600为25，生物量为每升培养物30-35g。电泳鉴定甲状旁腺激素表达水平，薄层扫描显示甲状旁腺激素占菌体总蛋白的25-30％之间。
实施例5、工程菌的保存及稳定性
工程菌加30％甘油，-20℃保存。短期保存菌种可用琼脂LB平板。为检查工程菌的稳定性，将原始菌种、50代和100代菌分别抽提质粒进行酶切鉴定，结果三者相同。同时三个菌扩增培养物的产物表达水平相当，证明本发明中的工程菌是十分稳定的。
实施例6、人甲状旁腺激素的分离纯化
人甲状旁腺激素在菌体内以可溶性形式存在于菌体胞浆内，菌体破碎后离心回收上清，上清用稀盐酸调pH2.0离心收集上清，产物得到初步纯化。上清再经CM-Sepharose柱层析可以得到电泳纯的人甲状旁腺激素。最后用Sephacryl S-100精制得到9kd的人甲状旁腺激素。
实施例7、人甲状旁腺激素产物的鉴定
SDS-PAGE和HPLC检定纯度均在98％以上，SAOS细胞实验表明其具有明显的生物活性。N末端蛋白质序列分析与体内天然蛋白相同，顺序是Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu。
实施例8、无菌过滤、分装、冻干
根据蛋白含量和活性，按以下比例加辅料和稳定剂
重组人甲状旁腺激素每支含100μg，缓冲体系为10mM PB，pH6.8，5％甘露醇，以上辅料必须符合注射用药的要求。
无菌过滤：在环境洁净度达到100级的条件下，用0.22μM微孔滤膜过滤，分装、冻干、封口、贴签、装箱。保存于2～8℃的冷藏环境中。1 CAT ATG TCT GTG TCC GAG ATT CAG TTA ATG CAT AAC CTT GGC AAA CAT TTG2 Met Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu
1 5 10 151 AAC TCC ATG GAG CGT GTA GAA TGG CTG CGT AAG AAG TTG CAG GAT2 Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp
20 25 301 GAG CAC AAT TTT GTT GCC TTA GGT GCC CCA TTG GCT CCT CGT GAT2 Val His Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp
35 40 451 GCT GGT TCC CAA AGA CCA CGT AAA AAG GAA GAC AAT GTC TTA GTT2 Ala Gly Ser Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val
50 55 601 GAG AGC CAT GAA AAA TCC CTA GGC GAG GCA GAC AAG GCC GAT GTG2 Glu Ser His Glu Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val
65 70 751 AAT GTA TTA ACT AAA GCT AAA TCC CAG TAA TGA GGATCC2 Asn Val Leu Thr Lys Ala Lys Ser Gln stop stop
表1.人甲状旁腺激素cDNA及氨基酸序列(1.核苷酸序列 2.氨基酸序列一代表根据密码子的兼并性、改动之处)