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1、10申请公布号CN104286014A43申请公布日20150121CN104286014A21申请号201410428956122申请日20140827A01N57/16200601A01N47/44200601A01P7/04200601C12N15/84200601A01H1/02200601A01H5/00200601A01H5/1020060171申请人北京大北农科技集团股份有限公司地址100080北京市海淀区中关村大街27号14层申请人北京大北农科技集团股份有限公司生物技术中心72发明人李建勇杨旭张爱红张欣馨李梅54发明名称杀虫蛋白的用途57摘要本发明涉及一种杀虫蛋白的用途，所述控。
2、制大螟害虫的方法包括将大螟害虫与CRY2AB蛋白接触。本发明通过转基因植物体内产生能够杀死大螟的CRY2AB蛋白来控制大螟害虫。与现有技术使用的农业防治方法、化学防治方法和生物防治方法相比，本发明对植物进行全生育期、全植株的保护以防治大螟害虫的侵害，且无污染、无残留，效果稳定、彻底，简单、方便、经济。51INTCL权利要求书2页说明书16页序列表10页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书16页序列表10页附图3页10申请公布号CN104286014ACN104286014A1/2页21一种控制大螟害虫的方法，其特征在于，包括将大螟害虫与CRY2AB蛋白接。
3、触。2根据权利要求1所述的控制大螟害虫的方法，其特征在于，所述CRY2AB蛋白存在于产生所述CRY2AB蛋白的植物细胞中，所述大螟害虫通过摄食所述植物细胞与所述CRY2AB蛋白接触。3根据权利要求2所述的控制大螟害虫的方法，其特征在于，所述CRY2AB蛋白存在于产生所述CRY2AB蛋白的转基因植物中，所述大螟害虫通过摄食所述转基因植物的组织与所述CRY2AB蛋白接触，接触后所述大螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡，以实现对大螟危害植物的控制。4根据权利要求3所述的控制大螟害虫的方法，其特征在于，所述转基因植物处于任意生育期。5根据权利要求3所述的控制大螟害虫的方法，其特征在于，所述转基因植物的组。
4、织为叶片、茎秆、雄穗、雌穗、花药或花丝。6根据权利要求3所述的控制大螟害虫的方法，其特征在于，所述对大螟危害植物的控制不因种植地点和/或种植时间的改变而改变。7根据权利要求2至6任一项所述的控制大螟害虫的方法，其特征在于，所述植物为玉米、水稻、高粱、麦、粟、棉花、芦苇、甘蔗、茭白、蚕豆或油菜。8根据权利要求2至7任一项所述的控制大螟害虫的方法，其特征在于，所述接触步骤之前的步骤为种植含有编码所述CRY2AB蛋白的多核苷酸的植物。9根据权利要求1至8任一项所述的控制大螟害虫的方法，其特征在于，所述CRY2AB蛋白的氨基酸序列具有SEQIDNO1所示的氨基酸序列。10根据权利要求9所述的控制大螟害。
5、虫的方法，其特征在于，所述CRY2AB蛋白的核苷酸序列具有SEQIDNO2所示的核苷酸序列。11根据权利要求2至10任一项所述的控制大螟害虫的方法，其特征在于，所述植物还可以包括至少一种不同于编码所述CRY2AB蛋白的核苷酸的第二种核苷酸。12根据权利要求11所述的控制大螟害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷酸编码CRY类杀虫蛋白质、VIP类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、淀粉酶或过氧化物酶。13根据权利要求12所述的控制大螟害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷酸编码CRY1A105蛋白。14根据权利要求13所述的控制大螟害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷酸具有SEQIDNO3所示的。
6、核苷酸序列。15根据权利要求11所述的控制大螟害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的DSRNA。16一种CRY2AB蛋白质控制大螟害虫的用途。17一种产生控制大螟害虫的植物的方法，其特征在于，包括向所述植物的基因组中引入编码CRY2AB蛋白的多核苷酸序列。18一种产生控制大螟害虫的植物种子的方法，其特征在于，包括将由权利要求17所述方法获得的第一植株与第二植株杂交，从而产生含有编码CRY2AB蛋白的多核苷酸序列的种子。19一种培养控制大螟害虫的植物的方法，其特征在于，包括权利要求书CN104286014A2/2页3种植至少一粒植物种子，所述植物种子的基因组中包括。
7、编码CRY2AB蛋白的多核苷酸序列；使所述植物种子长成植株；使所述植株在人工接种大螟害虫和/或大螟害虫自然发生危害的条件下生长，收获与其他不具有编码CRY2AB蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量的植株。权利要求书CN104286014A1/16页4杀虫蛋白的用途技术领域0001本发明涉及一种杀虫蛋白的用途，特别是涉及一种CRY2AB蛋白质通过在植物中表达来控制大螟为害植物的用途。背景技术0002大螟SESAMIAINFERENS属鳞翅目夜蛾科，为杂食性害虫，除为害玉米外，还为害水稻、甘蔗、小麦、高梁等禾本科作物，广泛分布于我国中部与东南部，特别是陕西、河南以。
8、南的大部稻区。大螟幼虫蛀入作物茎内为害，可造成枯心苗或整株死亡，其蛀孔一般较大，并有大量虫粪排出茎外，以低洼地及麦套玉米地发生重，且夏玉米发生重于春玉米。0003玉米和高粱是中国重要的粮食作物，每年因大螟造成的粮食损失巨大，更甚者影响到当地人口的生存状况。为了防治大螟，人们通常采用的主要防治方法有农业防治、化学防治和生物防治。0004农业防治是把整个农田生态系统多因素的综合协调管理，调控作物、害虫、环境因素、创造一个有利于作物生长而不利于大螟发生的农田生态环境。如利用处理大螟越冬寄主、改革耕作制度、种植抗大螟品种、种植诱集田和间作等措施降低大螟的为害。因农业防治必须服从作物布局和增产的要求，应。
9、用有一定的局限性，不能作为应急措施，在大螟爆发时就显得无能为力。0005化学防治即农药防治，是利用化学杀虫剂来杀灭害虫，是大螟综合治理的重要组成部分，它具有快速、方便、简单和高经济效益的特点，特别是大螟大发生的情况下，是必不可少的应急措施，它可以在大螟造成为害前将其消灭。目前化学防治方法主要有颗粒剂、撒毒土、药液喷雾、封垛熏蒸秸秆垛内越冬成虫等。但化学防治也有其局限性，如使用不当往往会导致农作物发生药害、害虫产生抗药性，以及杀伤天敌、污染环境，使农田生态系统遭到破坏和农药残留对人、畜的安全构成威胁等不良后果。0006生物防治是利用某些有益生物或生物代谢产物来控制害虫种群数量，以达到降低或消灭害。
10、虫的目的。其特点是对人、畜安全，对环境污染少，对某些害虫可达到长期控制的目的；但是效果常不稳定，并且不论大螟发生轻重均需同样投资进行。0007为了解决农业防治、化学防治和生物防治在实际应用中的局限性，科学家们经过研究发现将编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗虫转基因植物以防治植物虫害。CRY2AB杀虫蛋白是众多杀虫蛋白中的一种，是由苏云金芽孢杆菌产生的不溶性伴孢结晶蛋白。0008CRY2AB蛋白被昆虫摄入进入中肠，毒蛋白原毒素被溶解在昆虫中肠的碱性PH环境下。蛋白N和C末端被碱性蛋白酶消化，将原毒素转变成活性片段；活性片段和昆虫中肠上皮细胞膜上表面上受体结合，插入肠膜，导致细胞膜出现。
11、穿孔病灶，破坏细胞膜内外的渗透压变化及PH平衡等，扰乱昆虫的消化过程，最终导致其死亡。0009已证明转CRY2AB基因的植株可以抵抗玉米螟、棉铃虫等鳞翅目LEPIDOPTERA害虫的侵害，然而，至今尚无关于通过产生表达CRY2AB蛋白的转基因植株来控制大螟对植物说明书CN104286014A2/16页5危害的报道。发明内容0010本发明的目的是提供一种杀虫蛋白的用途，首次提供了通过产生表达CRY2AB蛋白的转基因植株来控制大螟对植物危害的方法，且有效克服现有技术农业防治、化学防治和生物防治等技术缺陷。0011为实现上述目的，本发明提供了一种控制大螟害虫的方法，包括将大螟害虫与CRY2AB蛋白接。
12、触。0012进一步地，所述CRY2AB蛋白存在于产生所述CRY2AB蛋白的植物细胞中，所述大螟害虫通过摄食所述植物细胞与所述CRY2AB蛋白接触。0013更进一步地，所述CRY2AB蛋白存在于产生所述CRY2AB蛋白的转基因植物中，所述大螟害虫通过摄食所述转基因植物的组织与所述CRY2AB蛋白接触，接触后所述大螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡，以实现对大螟危害植物的控制。0014所述转基因植物处于任意生育期。0015所述转基因植物的组织为叶片、茎秆、雄穗、雌穗、花药或花丝。0016所述对大螟危害植物的控制不因种植地点和/或种植时间的改变而改变。0017所述植物为玉米、水稻、高粱、麦、粟、棉花、。
13、芦苇、甘蔗、茭白、蚕豆或油菜。0018所述接触步骤之前的步骤为种植含有编码所述CRY2AB蛋白的多核苷酸的植物。0019优选地，所述CRY2AB蛋白的氨基酸序列具有SEQIDNO1所示的氨基酸序列。所述CRY2AB蛋白的核苷酸序列具有SEQIDNO2所示的核苷酸序列。0020在上述技术方案的基础上，所述植物还可以包含至少一种不同于编码所述CRY2AB蛋白的核苷酸的第二种核苷酸。0021进一步地，所述第二种核苷酸编码CRY类杀虫蛋白质、VIP类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、淀粉酶或过氧化物酶。0022优选地，所述第二种核苷酸编码CRY1A105蛋白。0023更进一步地，所述第二种核苷酸具有S。
14、EQIDNO3所示的核苷酸序列。0024可选择地，所述第二种核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的DSRNA。0025为实现上述目的，本发明还提供了一种CRY2AB蛋白质控制大螟害虫的用途。0026为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制大螟害虫的植物的方法，包括向所述植物的基因组中引入编码CRY2AB蛋白的多核苷酸序列。0027为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制大螟害虫的植物种子的方法，包括将由所述方法获得的第一植株与第二植株杂交，从而产生含有编码CRY2AB蛋白的多核苷酸序列的种子。0028为实现上述目的，本发明还提供了一种培养控制大螟害虫的植物的方法，包括0029种植至少一粒植物。
15、种子，所述植物种子的基因组中包括编码CRY2AB蛋白的多核苷酸序列；0030使所述植物种子长成植株；0031使所述植株在人工接种大螟害虫和/或大螟害虫自然发生危害的条件下生长，收获与其他不具有编码CRY2AB蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤的植说明书CN104286014A3/16页6株。0032本发明中所述的“接触”，是指昆虫和/或害虫触碰、停留和/或摄食植物、植物器官、植物组织或植物细胞，所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞既可以是其体内表达杀虫蛋白，还可以是所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞的表面具有杀虫蛋白和/或具有产生杀虫蛋白的微生物。0033本发明术语“控制”和。
16、/或“防治”是指大螟害虫与CRY2AB蛋白接触，接触后大螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡。进一步地，大螟害虫通过摄食植物组织与CRY2AB蛋白接触，接触后全部或部分大螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡。抑制是指亚致死，即尚未致死但能引起生长发育、行为、生理、生化和组织等方面的某种效应，如生长发育缓慢和/或停止。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成。此外，含有编码CRY2AB蛋白的多核苷酸序列的控制大螟害虫的植物和/或植物种子，在人工接种大螟害虫和/或大螟害虫自然发生危害的条件下，与非转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤，具体表现包括但不限于改善的茎秆抗。
17、性、和/或提高的籽粒重量、和/或增产等。CRY2AB蛋白对大螟的“控制”和/或“防治”作用是可以独立存在的，不因其它可“控制”和/或“防治”大螟害虫的物质的存在而减弱和/或消失。具体地，转基因植物含有编码CRY2AB蛋白的多核苷酸序列的任何组织同时和/或不同步地，存在和/或产生，CRY2AB蛋白和/或可控制大螟害虫的另一种物质，则所述另一种物质的存在既不影响CRY2AB蛋白对大螟的“控制”和/或“防治”作用，也不能导致所述“控制”和/或“防治”作用完全由所述另一种物质实现，而与CRY2AB蛋白无关。通常情况下，在大田，大螟害虫摄食植物组织的过程短暂且很难用肉眼观察到，因此，在人工接种大螟害虫和。
18、/或大螟害虫自然发生危害的条件下，如转基因植物含有编码CRY2AB蛋白的多核苷酸序列的任何组织存在死亡的大螟害虫、和/或在其上停留生长受到抑制的大螟害虫、和/或与非转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤，即为实现了本发明的方法和/或用途，即通过大螟害虫与CRY2AB蛋白接触以实现控制大螟害虫的方法和/或用途。0034在本发明中，CRY2AB蛋白在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个CRY类杀虫蛋白质和/或VIP类杀虫蛋白质的表达。这种超过一种的杀虫毒素在同一株转基因植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种植物第1亲本可以通过遗传工程操作表达CRY2AB。
19、蛋白质，第二种植物第2亲本可以通过遗传工程操作表达CRY类杀虫蛋白质和/或VIP类杀虫蛋白质。通过第1亲本和第2亲本杂交获得表达引入第1亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。0035RNA干扰RNAINTERFERENCE，RNAI是指在进化过程中高度保守的、由双链RNADOUBLESTRANDEDRNA，DSRNA诱发的、同源MRNA高效特异性降解的现象。因此在本发明中可以使用RNAI技术特异性剔除或关闭目标昆虫害虫中特定基因的表达。0036大螟SESAMIAINFERENS与棉铃虫HELICOVERPAARMIGERAHUBNER虽然同属鳞翅目夜蛾科，但是大螟与棉铃虫在生物学上是清晰的、截然。
20、不同的两个物种，至少存在以下主要区别00371、食性不同。大螟为杂食性害虫，但明显嗜好禾本科，最常为害玉米、水稻、高粱、甘蔗等；而棉铃虫是棉花蕾铃期重要钻蛀性害虫，主要蛀食蕾、花、铃，也取食嫩叶。00382、分布区域不同。大螟广泛分布于我国中部与东南部，特别是陕西、河南以南的大说明书CN104286014A4/16页7部稻区及西南玉米产区；除中国外，大螟在东南亚种植水稻、玉米及甘蔗的国家也有分布，包括越南、老挝、印度等；而棉铃虫广泛分布在中国及世界各地，中国棉区和蔬菜种植区均有发生，黄河流域棉区、长江流域棉区受害较重；近年来，新疆棉区也时有发生。00393、为害习性不同。大螟属钻蛀性害虫，幼虫。
21、蛀入作物茎内为害，可造成枯心苗或整株死亡，其蛀孔一般较大，并有大量虫粪排出茎外，多夹在叶鞘和茎秆之间，受害后的叶片、叶鞘部都变为黄色；刚孵化出的幼虫，不分散，群集叶鞘内侧，蛀食叶鞘和幼茎；幼虫3龄以后，分散迁害邻株，可转害56株不等，此时是大螟的严重为害期，早春10以上的温度来得早，则大螟发生早；靠近村庄的低洼地及麦套玉米地发生重；春玉米发生偏轻，夏玉米发生较重。而棉铃虫初龄幼虫取食嫩叶，其后为害蕾、花、铃，多从基部蛀入蕾、铃，在内取食，并能转移为害，转移时间多在夜间和清晨；受害幼蕾苞叶张开、脱落，被蛀青铃易受污染而腐烂；老熟幼虫吐丝下垂，多数入土作土室化蛹，以蛹越冬。00404、形态特征不同。
22、。00411卵的形态不同大螟的卵扁圆形，初白色后变灰黄色，表面具细纵纹和横线，聚生或散生，常排成23行；而棉铃虫的卵呈半球形，约05毫米，顶部微隆起，表面布满纵横纹，纵纹从顶部看有12条，中部2纵纹间夹有12条短纹且多23岔，所以从中部看有2629条纵纹，乳白色。00422幼虫的形态不同大螟末龄幼虫体长约30MM，粗4头红褐色至暗褐色，腹部背面淡紫红色，共57龄；而棉铃虫幼虫共有6龄，有时5龄取食豌豆苗，向日葵花盘的，老熟6龄虫长约4050MM，头黄褐色有不明显的斑纹，幼虫体色多变，分4个类型A体色淡红，背线、亚背线褐色，气门线白色，毛突黑色；B体色黄白，背线、亚背线淡绿，气门线白色，毛突与体。
23、色相同；C体色淡绿，背线、亚背线不明显，气门线白色，毛突与体色相同；D体色深绿，背线、亚背线不太明显，气门淡黄色；气门上方有一褐色纵带，是由尖锐微刺排列而成；幼虫腹部第1、2、5节各有2个毛突特别明显。00433蛹的形态不同大螟的蛹长1318MM，粗壮，红褐色，腹部具灰白色粉状物，臀棘有3根钩棘；而棉铃虫的蛹长1720MM，纺锤形，赤褐至黑褐色，腹末有一对臀刺，刺的基部分开；气门较大，围孔片呈筒状突起较高，腹部第57节的点刻半圆形，较粗而稀；入土515CM化蛹，外被土茧。00444成虫的形态不同大螟成虫雌蛾体长15MM，翅展约30MM，头部、胸部浅黄褐色，腹部浅黄色至灰白色；触角丝状，前翅近长。
24、方形，浅灰褐色，中间具小黑点4个排成四角形；雄蛾体长约12MM，翅展27MM，触角栉齿状；而棉铃虫成虫为灰褐色中型蛾，体长1520MM，翅展3140MM，复眼球形，绿色；雌蛾赤褐色至灰褐色，雄蛾青灰色，棉铃虫的前后翅，可作为夜蛾科成虫的模式，其前翅外横线外有深灰色宽带，带上有7个小白点，肾纹，环纹暗褐色，后翅灰白，沿外缘有黑褐色宽带，宽带中央有2个相连的白斑，后翅前缘有1个月牙形褐色斑。00455、生长习性和发生规律不同。大螟一年发生24代，随海拔的升高而减少，随温度的升高而增加。如云贵高原年生23代，江苏、浙江年生34代，江西、湖南、湖北、四川年生4代，福建、广西及云南开远年生45代，广东南。
25、部、台湾年生68代。在温带以老熟幼虫在寄生残体如茭白、水稻等作物茎秆或根茬内或近地面的土壤中越冬，次年3月中旬气温高于10开始化蛹，15时羽化，4月上旬交尾产卵，35天达高峰期，4月下旬为孵化高说明书CN104286014A5/16页8峰期。成虫白天潜伏，常栖息在株间，傍晚开始活动，趋光性较弱，寿命5天左右。雌蛾交尾后23天开始产卵，35天达高峰期，喜在玉米苗上和地边产卵，多集中在玉米茎秆较细、叶鞘抱合不紧的植株靠近地面的第2节和第3节叶鞘的内侧，可占产卵量的80以上。每雌可产卵240粒，卵历期一代为12天，2、3代为56天；幼虫期一代约30天，二代约28天，三代约32天；蛹期为1015天。雌。
26、蛾飞翔力弱，产卵较集中，靠近虫源的地方，虫口密度大，为害重。而棉铃虫发生的代数因年份因地区而异，在山东省莱州市每年发生4代，九月下旬成长幼虫陆续下树入土，在苗木附近或杂草下510CM深的土中化蛹越冬；立春气温回升15以上时开始羽化，4月下旬至5月上旬为羽化盛期，成虫出现第一代在6月中下旬，第二代在7月中下旬，第三代在8月中下旬至9月上旬至10月上旬尚有棉铃虫出现，成虫有趋光性，羽化后即在夜间闪配产卵，卵散产，较分散，一头雌蛾一生可产卵5001000粒，最高可达2700粒，卵多产在叶背面，也有产在正面、顶芯、叶柄、嫩茎上或农作的、杂草等其它植物上；幼虫孵化后有取食卵壳习性，初孵幼虫有群集限食习性。
27、，二三头、三五头在叶片正面或背面，头向叶缘排列、自叶缘向内取食，结果叶片被吃光，只剩主脉和叶柄，或成网状枯萎，造成干叶；12龄幼虫沿柄下行至银杏苗顶芽处自一侧蛀食或沿顶芽处下蛀入嫩枝，造成顶梢或顶部簇生叶死亡，危害十分严重；3龄前的幼虫食量较少，较集中，随着幼虫生长而逐渐分散，进入4龄食量大增，可食光叶片，只剩叶柄；幼虫78月份为害最盛；棉铃虫有转移危害的习性，一只幼虫可危害多株苗木；各龄幼虫均有食掉蜕下旧皮留头壳的习性，给鉴别虫龄造成一定困难，虫龄不整齐；棉铃虫发生的最适宜温度为2528，相对湿度7090；第二代、第三代为害最为严重，严重地片虫口密度达98头/百叶，虫株率6070，个别地片达。
28、100，受害叶片达1/3以上，影响叶产量20，质量下降至少1个等级，苗木生长量影响很大。0046综合上述，大螟与棉铃虫虽然同属鳞翅目夜蛾科，但是仅在外部形态和为害习性上就存在诸多方面的不同，且二者亲缘关系较远，无法交配产生后代。因此，可确定大螟与棉铃虫是两种不同的害虫，从而说明二者中肠上皮细胞膜上表面上与BT毒素结合的受体也是不同的，但是某一类杀虫晶体蛋白只能与特定的受体蛋白结合，即BT毒素对靶标害虫专一性强，可见将CRY2AB蛋白用于控制大螟害虫的方法是非显而易见的。0047本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒。
29、体基因组。0048本发明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主细胞中编码蛋白质或多肽。本领域技术人员很容易认识到，可以将本发明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的调控序列控制下。0049本领域技术人员所熟知的，DNA典型的以双链形式存在。在这种排列中，一条链与另一条链互补，反之亦然。由于DNA在植物中复制产生了DNA的其它互补链。这样，本发明包括对序列表中示例的多核苷酸及其互补链的使用。本领域常使用的“编码链”指与反义链结合的链。为了在体内表达蛋白质，典型将DNA的一条链转录为一条MRNA的互补链，它作为模板翻译出蛋白质。MRNA实际上是从DNA的“反义”链转录的。“有义”。
30、或“编码”链有一系列密码子密码子是三个核苷酸，一次读三个可以产生特定氨基酸，其可作为开放阅读框ORF阅读来形成目的蛋白质或肽。本发明还包括与示例的DNA有相当功能的RNA和PNA肽核酸。说明书CN104286014A6/16页90050本发明中核酸分子或其片段在严格条件下与本发明CRY2AB基因杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定本发明CRY2AB基因的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。本发明中，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一。
31、个核酸分子的“互补物”。本发明中，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形。
32、成稳定的双链结构。0051本发明中，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，大约在45条件下用60氯化钠/柠檬酸钠SSC处理，然后在50条件下用20SSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约20SSC、50到高度严格条件的约02SSC、50。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22，升高到高度严格条件的约65。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明所述严格条件可为在6S。
33、SC、05SDS溶液中，在65下与SEQIDNO2发生特异性杂交，然后用2SSC、01SDS和1SSC、01SDS各洗膜1次。0052因此，具有抗虫活性并在严格条件下与本发明SEQIDNO2杂交的序列包括在本发明中。这些序列与本发明序列至少大约4050同源，大约60、65或70同源，甚至至少大约75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更大的序列同源性。0053本发明中所述的基因和蛋白质不但包括特定的示例序列，还包括保存了所述特定示例的蛋白质的杀虫活性特征的部分和/片段包括与全长蛋白质相比在内和/或末端缺失、变体、突变体、取代物有替代氨基酸的蛋白质、嵌合体和。
34、融合蛋白。所述“变体”或“变异”是指编码同一蛋白或编码有杀虫活性的等价蛋白的核苷酸序列。所述“等价蛋白”是指与权利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗大螟害虫的生物活性的蛋白。0054本发明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列核苷酸或氨基酸的一部分或其人工改造形式例如适合植物表达的序列，前述序列的长度可存在变化，但长度足以确保编码蛋白质为昆虫毒素。0055使用标准技术可以修饰基因和容易的构建基因变异体。例如，本领域熟知制造点突变的技术。又例如美国专利号5605793描述了在随机断裂后使用DNA重装配产生其它分子多样性的方法。可以使用商业化核酸内切酶制造全长。
35、基因的片段，并且可以按照标准程序使用核酸外切酶。例如，可以使用酶诸如BAL31或定点诱变从这些基因的末端系统地切除核苷酸。还可以使用多种限制性内切酶获取编码活性片段的基因。可以使用蛋白酶直接说明书CN104286014A7/16页10获得这些毒素的活性片段。0056本发明可以从BT分离物和/或DNA文库衍生出等价蛋白和/或编码这些等价蛋白的基因。有多种方法获取本发明的杀虫蛋白。例如，可以使用本发明公开和要求保护的杀虫蛋白的抗体从蛋白质混合物鉴定和分离其它蛋白。特别地，抗体可能是由蛋白最恒定和与其它BT蛋白最不同的蛋白部分引起的。然后可以通过免疫沉淀、酶联免疫吸附测定ELISA或WESTERN印。
36、迹方法使用这些抗体专一地鉴定有特征活性的等价蛋白。可使用本领域标准程序容易的制备本发明中公开的蛋白或等价蛋白或这类蛋白的片段的抗体。然后可以从微生物中获得编码这些蛋白的基因。0057由于遗传密码子的丰余性，多种不同的DNA序列可以编码相同的氨基酸序列。产生这些编码相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本领域技术人员的技术水平内。这些不同的DNA序列包括在本发明的范围内。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但实质上不影响杀虫活性的序列，亦包括保留杀虫活性的片段。0058本发明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本领域的常规技术，优选这种氨基酸变化为小的特性改变，即不显著影响。
37、蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常约130个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一个甲硫氨酸残基；小的连接肽，例如约2025个残基长。0059保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代碱性氨基酸如精氨酸、赖氨酸和组氨酸、酸性氨基酸如谷氨酸和天冬氨酸、极性氨基酸如谷氨酰胺、天冬酰胺、疏水性氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸、芳香氨基酸如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，以及小分子氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸。通常不改变特定活性的那些氨基酸取代在本领域内是众所周知的，并且已由，例如，NNEURATH和RLHILL在1979年纽约学术出版社ACADEMICP。
38、RESS出版的PROTEIN中进行了描述。最常见的互换有ALA/SER，VAL/ILE，ASP/GLU，THU/SER，ALA/THR，SER/ASN，ALA/VAL，SER/GLY，TYR/PHE，ALA/PRO，LYS/ARG，ASP/ASN，LEU/ILE，LEU/VAL，ALA/GLU和ASP/GLY，以及它们相反的互换。0060对于本领域的技术人员而言显而易见地，这种取代可以在对分子功能起重要作用的区域之外发生，而且仍产生活性多肽。对于由本发明的多肽，其活性必需的并因此选择不被取代的氨基酸残基，可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变进行鉴定如参见，CUNNINGHAM和。
39、WELLS，1989，SCIENCE24410811085。后一技术是在分子中每一个带正电荷的残基处引入突变，检测所得突变分子的抗虫活性，从而确定对该分子活性而言重要的氨基酸残基。底物酶相互作用位点也可以通过其三维结构的分析来测定，这种三维结构可由核磁共振分析、结晶学或光亲和标记等技术测定参见，如DEVOS等，1992，SCIENCE255306312；SMITH等，1992，JMOLBIOL224899904；WLODAVER等，1992，FEBSLETTERS3095964。0061在本发明中，CRY2AB蛋白包括但不限于CRY2AB蛋白，或者与上述蛋白的氨基酸序列具有至少70同源性且对大。
40、螟具有杀虫活性的杀虫片段或功能区域。0062因此，与序列1所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本发明中。这些序列与本发明序列类似性/相同性典型的大于60，优选的大于75，更优选的大于80，甚至更优选的大于90，并且可以大于95。也可以根据更特定的相同性和/说明书CN104286014A108/16页11或类似性范围定义本发明的优选的多核苷酸和蛋白质。例如与本发明示例的序列有49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、。
41、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99的相同性和/或类似性。0063本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肽、终止子，增强子，前导序列，内含子以及其它可操作地连接到所述CRY2AB蛋白的调节序列。0064所述启动子为植物中可表达的启动子，所述的“植物中可表达的启动子”是指确保与其连接的编码序列在植物细胞内进行表达的启动子。植物中可表达的启动子可为组成型启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例包括但不限于，来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子、玉米UBI启动子、水稻GOS2基因的启动子等。备选地，植物中可表达的启动子可为组织特异的启动。
42、子，即该启动子在植物的一些组织内如在绿色组织中指导编码序列的表达水平高于植物的其他组织可通过常规RNA试验进行测定，如PEP羧化酶启动子。备选地，植物中可表达的启动子可为创伤诱导启动子。创伤诱导启动子或指导创伤诱导的表达模式的启动子是指当植物经受机械或由昆虫啃食引起的创伤时，启动子调控下的编码序列的表达较正常生长条件下有显著提高。创伤诱导启动子的示例包括但不限于，马铃薯和西红柿的蛋白酶抑制基因PIN和PIN和玉米蛋白酶抑制基因MPI的启动子。0065所述转运肽又称分泌信号序列或导向序列是指导转基因产物到特定的细胞器或细胞区室，对受体蛋白质来说，所述转运肽可以是异源的，例如，利用编码叶绿体转运肽。
43、序列靶向叶绿体，或者利用KDEL保留序列靶向内质网，或者利用大麦植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。0066所述前导序列包含但不限于，小RNA病毒前导序列，如EMCV前导序列脑心肌炎病毒5非编码区；马铃薯Y病毒组前导序列，如MDMV玉米矮缩花叶病毒前导序列；人类免疫球蛋白质重链结合蛋白质BIP；苜蓿花叶病毒的外壳蛋白质MRNA的不翻译前导序列AMVRNA4；烟草花叶病毒TMV前导序列。0067所述增强子包含但不限于，花椰菜花叶病毒CAMV增强子、玄参花叶病毒FMV增强子、康乃馨风化环病毒CERV增强子、木薯脉花叶病毒CSVMV增强子、紫茉莉花叶病毒MMV增强子、夜香树黄化曲叶病毒CMYLCV增强。
44、子、木尔坦棉花曲叶病毒CLCUMV、鸭跖草黄斑驳病毒COYMV和花生褪绿线条花叶病毒PCLSV增强子。0068对于单子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，玉米HSP70内含子、玉米泛素内含子、ADH内含子1、蔗糖合酶内含子或水稻ACT1内含子。对于双子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，CAT1内含子、PKANNIBAL内含子、PIV2内含子和“超级泛素”内含子。0069所述终止子可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，包括但不限于，来源于农杆菌AGROBACTERIUMTUMEFACIENS胭脂碱合成酶NOS基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于蛋白酶抑制剂PIN基因的多聚腺苷酸。
45、化信号序列、来源于豌豆SSRUBISCOE9基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于微管蛋白TUBULIN基因的多聚腺苷酸化信号序列。0070本发明中所述“有效连接”表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对说明书CN104286014A119/16页12相连序列来说需要的功能。在本发明中所述“有效连接”可以为将启动子与感兴趣的序列相连，使得该感兴趣的序列的转录受到该启动子控制和调控。当感兴趣的序列编码蛋白并且想要获得该蛋白的表达时“有效连接”表示启动子与所述序列相连，相连的方式使得得到的转录物高效翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录物融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得。
46、得到的转录物中第一翻译起始密码子是编码序列的起始密码子。备选地，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得5非翻译序列中含有的第一翻译起始密码子与启动子相连结，并且连接方式使得得到的翻译产物与编码想要的蛋白的翻译开放读码框的关系是符合读码框的。可以“有效连接”的核酸序列包括但不限于提供基因表达功能的序列即基因表达元件，例如启动子、5非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3非翻译区域、聚腺苷化位点和/或转录终止子、提供DNA转移和/或整合功能的序列即TDNA边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点、提供选择性功能的序列即抗生素抗性标记物、生物合。
47、成基因、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列即多接头序列、位点特异性重组序列和提供复制功能的序列即细菌的复制起点、自主复制序列、着丝粒序列。0071本发明中所述的“杀虫”是指对农作物害虫是有毒的。更具体地，目标昆虫是大螟害虫。0072本发明中CRY2AB蛋白对大螟害虫具有毒性。本发明中的植物，特别是玉米和高粱，在其基因组中含有外源DNA，所述外源DNA包含编码CRY2AB蛋白的核苷酸序列，大螟害虫通过摄食植物组织与该蛋白接触，接触后大螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成。此外，该植物可基本消除对化学或。
48、生物杀虫剂的需要所述化学或生物杀虫剂为针对CRY2AB蛋白所靶向的大螟害虫的杀虫剂。0073植物材料中杀虫晶体蛋白ICP的表达水平可通过本领域内所描述的多种方法进行检测，例如通过应用特异引物对组织内产生的编码杀虫蛋白质的MRNA进行定量，或直接特异性检测产生的杀虫蛋白质的量。0074可以应用不同的试验测定植物中ICP的杀虫效果。本发明中目标昆虫主要为大螟。0075本发明中，所述CRY2AB蛋白可以具有序列表中SEQIDNO1所示的氨基酸序列。除了包含CRY2AB蛋白的编码区外，也可包含其他元件，例如编码第二种杀虫核苷酸、编码选择性标记的蛋白质或赋予除草剂抗性的蛋白质的编码区。0076此外，包含。
49、编码本发明CRY2AB蛋白的核苷酸序列的表达盒在植物中还可以与至少一种编码除草剂抗性基因的蛋白质一起表达，所述除草剂抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因如BAR基因、PAT基因、苯敌草抗性基因如PMPH基因、草甘膦抗性基因如EPSPS基因、溴苯腈BROMOXYNIL抗性基因、磺酰脲抗性基因、对除草剂茅草枯的抗性基因、对氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制剂如PPT的抗性基因，从而获得既具有高杀虫活性、又具有除草剂抗性的转基因植物。0077本发明中，将外源DNA导入引入植物，如将编码所述CRY2AB蛋白的基因或表达盒或重组载体导入植物细胞，常规的转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发说明书CN104286014A1210/16页13射轰击、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。0078本发明提供了一种杀虫蛋白的用途，具有以下优点00791、内因防治。现有技术主要是通过外部作用即外因来控制大螟害虫的危害，如农业防治、化学防治和生物防治；而本发明是通过植物体内产生能够杀死大螟的CRY2AB蛋白来控制大螟害虫的，即通过内因来防治。00802、无污染、。