叉头样转录因子FOXA2在制备治疗慢性肝病药物中的应用技术领域
本发明涉及分子生物学、细胞生物学、基因工程以及临床医学如疾病治
疗领域。具体地，本发明涉及利用叉头样转录因子FOXA2(HNF3β)治疗人
慢性肝病、肝硬化。
背景技术
由于肝炎病毒感染、药物损伤、免疫损伤、酒精、代谢等因素导致的慢
性肝病若迁延不愈，可进展为肝硬化、肝癌，甚至肝功能衰竭，从而危及生
命。而在此病程中，目前认为肝纤维化是唯一可逆的病理过程。因此，治疗
肝纤维化成为预防慢性肝病进展为终末期肝病的关键环节。
肝纤维化，是肝脏对病毒感染等慢性损伤的修复反应，其特征是胶原等
细胞外基质(ECM)在肝脏过度沉积。肝星状细胞(HSC)位于肝窦间隙，
约占肝脏细胞总数的15％，与肝细胞及肝窦内皮细胞直接接触，是肝脏产生
胶原的主要细胞。现在普遍认为，HSC的活化和增殖是肝纤维化发生发展的
中心环节。因此，抑制HSC活化和增殖或诱导其凋亡是目前治疗肝纤维化的
主要策略。近30多年的研究发现，利用基因调控等各种手段可抑制HSC的激
活和增殖，在动物实验中大多显示出很好的治疗肝纤维化效果。遗憾的是，
迄今为止仍没有药物被批准用于治疗肝纤维化，肝纤维化的治疗仍是临床的
难点，亟需探索新的治疗策略和方法。
近年来不断有研究发现，HSC的功能远较我们想象的复杂。大量证据说
明，HSC在肝细胞再生和肝脏损伤修复中起重要作用。传统的以HSC为靶点
的肝纤维化治疗方法在抑制HSC活化、减少ECM产生的同时，也会抑制
肝细胞再生，影响肝脏损失修复，可能不是理想的治疗策略。
肝细胞约占肝脏细胞总数的65％和肝容量的80％，是维持肝脏功能的主
要细胞，亦是乙肝病毒、丙肝病毒、酒精等各种外源损伤的主要靶细胞。完
整肝细胞对维持肝脏稳态起至关重要的作用，而肝细胞在肝纤维化中的作用
尚未得到足够重视。
肝细胞核因子(hepatocytenuclearfactor,HNF)家族包括HNF1、HNF3、
HNF4、HNF6以及CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)，是一组在肝脏中优势
表达并相互调控的转录因子，对肝脏发育和功能维持发挥关键作用。我们的
前期研究发现，HNF4α可通过抑制肝细胞和肝星状细胞EMT而明显减轻
肝纤维化程度(YueHY,YinC,XieWF,etal.Hepatocytenuclearfactor4alpha
attenuateshepaticfibrosisinrats.Gut.2010；59:236-46.)，逆转早期肝硬化(Fan
TT,HuPF,XieWF,etal.Regressioneffectofhepatocytenuclearfactor4αon
livercirrhosisinrats.JDigDis.2013；14(6):318-27.)。而上调HNF1α可通过直接
结合肝细胞中磷酸酶SHP1启动子，从而调控磷酸酶SHP1的转录表达以改善肝
纤维化(QianH,DengX,HuangZW,etal.AnHNF1α-regulatedfeedbackcircuit
modulateshepaticfibrogenesisviathecrosstalkbetweenhepatocytesandhepatic
stellatecells.CellRes.2015；25(8):930-45.)。藉此率先提出利用细胞分化相关转
录因子治疗肝纤维化的新策略，相关研究成果已申请国家发明专利并获得授
权(专利号：CN201110043321.6，授权公布号：CN102552935B，发明名称：
肝细胞核因子1α治疗慢性肝病的用途)。
FOXA2(ForkheadboxA2，FOXA2)，又名HNF3β，属于叉头样转录因子
超家族，是HNF家族的重要成员，在肝脏内主要表达于肝细胞、星状细胞及
胆管上皮细胞。与HNF4α和HNF1α等肝细胞核因子相比，FOXA2在胚胎发育
过程中最先表达，对早期胚胎肝脏的形成具有重要作用。近年来多项研究表
明，FOXA2在肝脏发育及功能调控中发挥重要作用。上调胚胎干细胞中
FOXA2表达，可诱导其向肝细胞分化，增强合成尿素、甘油三脂等肝细胞特
有生物学功能(GoldmanO.Endodermgeneratesendothelialcellsduringliver
development.StemCellRep.2014；3(4):556-65.)；FOXA2联合HNF3α和
HNF4α可将成纤维细胞转分化成具有生物学功能的肝细胞(SekiyaS.Direct
conversionofmousefibroblaststohepatocyte-likecellsbydefinedfactors.Nature.
2011；475(7356):390-3.)。在小鼠肝细胞中敲除FOXA2基因可引起肝内胆汁淤
积(BochkisIM.Hepatocyte-specificablationofFoxa2altersbileacidhomeostasis
andresultsinendoplasmicreticulumstress.NatMed.2008；14(8):828-36)，在早期
小鼠胚胎敲除肝母细胞FOXA2及其同源基因FOXA1可引起成年小鼠肝脏
胆管增生(LiZ.Foxa1andFoxa2regulatebileductdevelopmentinmice.JClin
Invest.2009；119(6):1537-45.)，FOAX2及其同源基因FOXA1还是影响肝癌发
生性别差异的关键基因(LiZ.Foxa1andFoxa2areessentialforsexual
dimorphisminlivercancer.Cell.2012；148,72–83)。此外，FOXA2对维持上皮
细胞形态结构及调控上皮间质转型(EMT)也发挥着至关重要作用。
本发明人前期研究发现FOXA2与肝癌细胞的上皮细胞表型呈正相关
而与间质细胞表型呈负相关，上调FOXA2可明显抑制肝癌细胞EMT及其全
身转移(WangJ.FOXA2suppressesthemetastasisofhepatocellularcarcinoma
partiallythroughmatrixmetalloproteinase-9inhibition.Carcinogenesis.
2014；35(11):2576-83.)。这些研究提示FOXA2是维持肝细胞分化、功能及上皮
表型的重要调控因子，但迄今FOXA2在肝纤维化发生发展中的作用尚未报
道。
发明内容
本发明的目的在于提供叉头样转录因子FOXA2的新用途，具体是人类
FOXA2基因及其产物FOXA2蛋白在制备治疗慢性肝病药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种治疗慢性肝病的方法。
本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：
本发明涉及人转录因子FOXA2的功能研究，还包括FOXA2基因和蛋
白导入肝细胞的方法并提高FOXA2表达的手段。FOXA2是调控肝脏分化和
功能的重要转录蛋白，在转录水平实现对基因表达的调控。我们在mRNA及
蛋白水平检测了大鼠DMN和BDL模型及小鼠CCl4模型肝纤维化组织中
FOXA2的表达水平，证实了肝纤维化发展过程中，FOXA2表达下调。利用
慢病毒质粒pSin-EF2-hFOXA2(h代表human)，通过包装慢病毒Lv-hFOXA2
并浓缩纯化后通过尾静脉导入DMN大鼠体内，上调肝脏FOXA2表达，发
现FOXA2组肝纤维化明显改善；通过委托百恩维生物科技有限公司制备肝
细胞特异表达FOXA2的腺相关病毒pAAV8-TBG-hFOXA2，尾静脉注射
AAV8-TBG-hFOXA2上调CCl4模型小鼠肝细胞FOXA2表达可明显改善肝纤
维化。因此，我们认为，FOXA2可能在肝纤维化发展进程中发挥重要作用，
可能成为慢性肝病、肝纤维化治疗的重要靶点。
本发明的具体技术方案为：
1.测定大鼠DMN模型及BDL模型造模过程中肝组织FOXA2表达情况。
2.慢病毒Lv-hFOXA2经尾静脉注射至DMN模型大鼠体内，研究上调肝
组织FOXA2表达对肝纤维化的影响。
3.测定小鼠CCl4肝纤维化模型造模过程中肝组织中FOXA2的表达情
况。
4.利用腺相关病毒AAV8-TBG-hFOXA2经尾静脉导入CCl4模型小鼠体
内，研究特异性上调肝细胞FOXA2对肝纤维化的作用。
本发明的第一方面，提供了叉头样转录因子FOXA2在制备治疗慢性肝
病药物中的应用。
本发明所述的慢性肝病，包括肝纤维化和肝硬化。
进一步的，本发明提供了叉头样转录因子FOXA2在制备治疗肝纤维化
药物中的应用，以及在制备治疗肝硬化药物中的应用。
本发明的叉头样转录因子FOXA2，来自：人、大鼠、小鼠、犬、马、
牛、兔或猴等。
优选的，为人类FOXA2基因或其编码蛋白，GeneID:3170。
所述的治疗慢性肝病药物，具体是指提高FOXA2表达量的试剂。
所述的提高FOXA2表达量的试剂，包括但不限于：FOXA2基因或其编
码蛋白、FOXA2基因或其编码蛋白作为活性物质的组合物、含有FOXA2基
因的载体(如质粒、慢病毒、腺病毒)等。
所述的提高FOXA2表达量的试剂，具体的给药方式可采取直接裸DNA
注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺
陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、PEG修饰蛋白
药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法、蛋白微球制剂皮下注射法等
(HickmanMA.等，GeneexpressionfollowingdirectinjectionofDNAintoliver.
HumGeneTher.1994；12:1477-1483；SiddheshD.等，DNA-basedtherapeutics
andDNAdeliverysystems:Acomprehensivereview.TheAAPSJournal.
2005；7(1):61-77；BoulikasT.等，Nuclearlocalizationsignalpeptidesforthe
importofplasmidDNAingenetherapy.InternationalJournalofOncology。
1997；1:301-309)。
含有FOXA2基因的载体构建方法为：由于FOXA2基因的序列在本领域
中是已知的，本领域普通技术人员可基于常规手段制备或通过市售获得扩增
FOXA2cDNA的引物。使用限制性内切酶获得线性化载体。通过PCR扩增
获得FOXA2cDNA，通过酶切获得与表达载体相同的粘性末端。在连接酶的
作用下，将cDNA与载体相连接，筛选连接成功的重组载体并进行测序鉴定。
鉴定正确的重组载体即可用于后续的应用。
在本发明的一个优选实施例中，提高FOXA2表达量的试剂具体为：含
有FOXA2基因的慢病毒载体。
本发明的第二方面，还提供了一种慢性肝病基因治疗的方法，包括将
FOXA2基因导入肝脏实质细胞和间质细胞，使之表达，所述将FOXA2基因
导入肝脏实质细胞和间质细胞的方法包括用质粒转染、慢病毒或腺相关病毒
介导。
本发明的第三方面，还提供了一种用于治疗慢性肝病的药物组合物，所
述的药物组合物是以FOXA2基因或其编码蛋白作为活性物质的。
所述的药物组合物是以FOXA2基因或其编码蛋白作为唯一活性成份。
所述的药物组合物，包括人类FOXA2基因和/或其编码蛋白，和/或
药用载体或赋形剂，和/或其他已知的治疗慢性肝病药物。
本发明还提供了一种治疗慢性肝病的方法，包括将有效量的上述药物组
合物给药于需要这种治疗的患者。上述药物组合物通过口服，肌内，静脉内，
皮下等途径来传送。
附图说明
图1为Real-timePCR检测大鼠DMN肝损伤模型(A)和BDL肝损伤模型
(B)中FOXA2基因的表达情况。
图2为Westernblot法检测慢病毒Lv-hFOXA2治疗DMN模型大鼠肝组织中
FOXA2及肝纤维化相关基因表达情况。
图3为HE、天狼星红染色及免疫组化法检测慢病毒Lv-hFOXA2治疗DMN
模型大鼠肝组织中胶原沉积、α-SMA及FOXA2蛋白的表达情况。
图4为HE、天狼星红染色及免疫组化法检测小鼠CCl4肝纤维化模型肝组织
中FOXA2蛋白的表达及肝纤维化进展。
图5为尾静脉注射腺相关病毒AAV8-TBG-hFOXA2治疗CCl4小鼠肝纤维化
动物实验示意图。
图6为Real-timePCR(A)、Western-blot(B)检测AAV8-TBG-hFOXA2治疗CCl4
模型小鼠肝组织中相关基因和蛋白表达。
图7为HE、天狼星红染色及免疫组化法检测小鼠CCl4模型肝组织中胶原沉
积和FOXA2、α-SMA蛋白表达(A)，及天狼猩红胶原染色的半定量分析(B)。
图8为碱水解法检测腺相关病毒AAV8-TBG-hFOXA2治疗CCl4小鼠肝纤维
化肝组织中羟脯氨酸含量。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明关于FOXA2治疗慢性肝病的应用作进
一步说明，但本发明的实施并不仅限于下列实验所公开的范围。
实施例1：Real-timePCR检测肝组织中FOXA2mRNA变化
Trizol法(RNAiso,Takara)抽提大鼠DMN模型及BDL模型(制备方法
见YueHY,YinC,XieWF,etal.Hepatocytenuclearfactor4alphaattenuates
hepaticfibrosisinrats.Gut.2010；59:236-46.)肝组织RNA，以分光光度计测定
其OD260值，配成工作浓度(1μg/μl)，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整
性。
取1μgRNA加入4μl5×PrimeScriptRTmastermix(逆转录试剂盒)，
另加入DEPC水补足体积至20μl，37℃反应15min；85℃反应5s灭活逆转
录酶，即可得到逆转录产物。将逆转录产物稀释后取1μl为模板进行FOXA2
扩增，同时以β-actin作为内参照在相同反应条件下进行PCR反应，反应体
系如下：
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反应条件为：94℃预变性30s，之后94℃10s，60℃30s，共进行40个
循环后进行溶解曲线的检测。荧光本底信号和阈值一般采用仪器默认数值，
每次运行结束以后自动生成，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所
经历的循环数定义为Ct值；每对引物(基因)在每个模板中做3个重复
管，得到的Ct值取平均值；每个目的基因的Ct平均值减去对应模板的内
参基因(ACTB)的Ct平均值，得到ΔCt。实验组的ΔCt减去对照组的ΔCt，
得到ΔΔCt值，对照组和实验组中的待测基因的倍数关系用2-ΔΔCt表示。
Real-timePCR引物见表1，SEQIDNO:1-2。结果如图1所示，结果说明：
随着肝纤维化的进展，FOXA2表达逐渐下调。**P<0.05,***P<0.01。
表1.引物序列
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实施例2：上调肝脏FOXA2对大鼠肝纤维化进程的抑制作用
将雄性SD大鼠随机分为4组，各组10只。普通饲料喂养，自由饮水，
昼夜交替照明。第1组予生理盐水腹腔注射作为阴性对照组；第2～4组
为肝纤维化模型组，予DMN按照10mg/ml的剂量腹腔注射，每周连续注
射3次，共注射4周，制备DMN诱导的大鼠肝纤维化模型。其中第2组
设为模型对照组；第3组对照慢病毒Lv-GFP组(制备方法见WangJ,ZhuCP,
HuPF.FOXA2suppressesthemetastasisofhepatocellularcarcinomapartially
throughmatrixmetalloproteinase-9inhibition.Carcinogenesis.
2014；35(11):2576-83.)；第4组设为慢病毒Lv-hFOXA2治疗组(制备方法见
WangJ,ZhuCP,HuPF.FOXA2suppressesthemetastasisofhepatocellular
carcinomapartiallythroughmatrixmetalloproteinase-9inhibition.Carcinogenesis.
2014；35(11):2576-83.)；第3、4组于DMN注射2周后经尾静脉分别射2×108
TU/只对照慢病毒Lv-GFP或2×108TU/只慢病毒Lv-FOXA2；处死小鼠后，
取相同部位肝组织中性甲醛固定，备做石蜡切片。
免疫印迹法(MahmoodT,YangPC.Westernblot:technique,theory,and
troubleshooting.NAmJMedSci.2012；4(9):429-34.)检测各组FOXA2及
α-SMA的表达情况，结果如图2所示，结果表明：Lv-hFOXA2上调大鼠肝
脏FOXA2表达，过表达肝组织FOXA2后可下调α-SMA表达。
肝组织石蜡切片分别进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色)
(HE染色试剂盒,上海信帆生物科技有限公司)、苦味酸-天狼星红染色
(SiriusRed)染色(天狼星红染色试剂盒,南京森贝伽生物科技有限公司)测
定肝脏ECM沉积情况，结果见图3，显示Lv-hFOXA2治疗组大鼠肝脏ECM
量较对照组明显减少。
实施例3：免疫组织化学方法检测小鼠CCl4模型肝组织中FOXA2蛋白变表
达变化。
制备CCl4损伤肝纤维化模型：雄性C57小鼠普通饲料喂养，自由饮水，
昼夜交替照明。予CCl4按照1ml/kg的剂量腹腔注射，每周连续注射2次，
共注射5周，制备CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型(如图4所示)。
正常小鼠及CCl4模型小鼠肝组织蜡块4μm连续切片，60℃烤箱中烘烤
30min固定，脱蜡至水后，3％H2O2室温放置10min清除内源性过氧化物
酶，柠檬酸缓冲液煮沸进行抗原修复，加1：20正常兔血清室温封闭30min，
滴加FOXA2抗体(1：1000)4℃过夜；次日PBS(pH7.4)洗涤3次，每
次5min；加二抗室温孵育60min；PBS洗涤后，DAB显色，常规树脂封片，
光镜下观察。实验结果表明：随着肝纤维化进展，肝组织FOXA2表达逐渐
下调(如图5所示)。
实施例4：特异性上调肝细胞FOXA2对小鼠肝纤维化进程的抑制作用
将雄性C57小鼠随机分为4组，各组10只。第1组予生理盐水腹腔
注射作为阴性对照组；第2～4组为肝纤维化模型组，制备CCl4诱导的
小鼠肝纤维化模型(方法同实施例3)。其中第2组设为肝纤维化模型对照
组；第3组为空白病毒AAV-TBG对照组；第4组设为
AAV-TBG-hFOXA2导入组；第3组和第4在小鼠于造模CCl4注射1周后
经尾静脉分别注入4×1011VgAA-TBG和4×1011VgAAV-TBG-hFOXA2，
造模5周后处死小鼠，留取小鼠血清病本，同时取相同部位肝组织中性甲醛
固定，备做石蜡切片。
RealtimeRT-PCR检测FOXA2、CollagenI及α-SMA，引物序列如表1
中的SEQIDNO:3-10，方法同实施例1。实验结果表明特异性过表达肝细胞
FOXA2可下调CollagenI及α-SMAmRNA表达(如图6A所示)。**P<0.05,
***P<0.01。
免疫印迹法检测各组FOXA2、CollagenI及α-SMA蛋白表达，方法同实
施例2。实验结果表明：特异性过表达肝细胞FOXA2可下调纤维化肝脏中
CollagenI及α-SMA蛋白表达(如图6B所示)。
肝组织石蜡切片分别进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色、
苦味酸-天狼星红染色(SiriusRed)染色及免疫组织化学染色测定肝脏ECM
沉积情况及α-SMA表达。方法同实施案例2。实验结果表明：
AAV8-TBG-hFOXA2治疗组小鼠肝脏ECM量较对照组明显减少，α-SMA
表达明显下降(如图7A、7B所示)。***P<0.01。
随机选取各组肝组织各6例，碱水解法测肝组织中羟脯氨酸含量(实
验方法具体见南京凯基生物公司羟脯氨酸测定试剂盒说明书，CATnumber：
KGT030-2)。实验结果表明：AAV8-TBG-hFOXA2治疗组小鼠肝脏羟脯氨酸
含量较对照组明显减少(如图8所示)。**P<0.05,***P<0.01。
这些结果表明在肝细胞中特异性上调FOXA2表达对小鼠肝纤维化具有
明显的治疗作用。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不
限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下
还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请
权利要求所限定的范围内。
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