含有巯基蛋白酶抑制剂的发酵营养组合物技术领域
本领域涉及包含蛋白质和蛋白酶抑制剂活性的营养组合物。
背景技术
巯基蛋白酶(亦称为半胱氨酸蛋白酶)的特征在于它们在其活性中
心具有巯基基团。与丝氨酸蛋白酶不同，这些蛋白酶通常不是哺乳动物
消化系统的蛋白酶的一部分。已知的巯基蛋白酶是组织蛋白酶
(cathepsin)(L、B、K)、钙依赖性中性蛋白酶(CAMP)、木瓜蛋白
酶和菠萝蛋白酶。
在胃肠道中，通常是通过由巨噬细胞和上皮细胞表达的组织蛋白酶
和通过细菌或病毒的巯基蛋白酶显示这样的活性。过高的肠内巯基蛋白
酶活性和组织损伤及胃肠炎症有关，并在感染中起作用。
人乳包含多种蛋白酶抑制剂，如乳铁蛋白、β-酪蛋白、胱蛋白、α1-
抗-胰蛋白酶和α1-抗-糜蛋白酶。蛋白酶抑制剂限制消化和细菌诱导的
蛋白酶活性，从而预防蛋白酶-诱导的组织损伤。在本领域中已知乳成
分对巯基蛋白酶活性的抑制作用。EP1568377公开酪蛋白或酪蛋白水
解产物作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂的用途。EP1576964公开乳铁蛋白
或乳铁蛋白水解产物作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂的用途。WO
2012/078038公开发酵婴儿配方减少肠道中消化性蛋白酶活性的量。
Turronietal.,2010,AEM76:3206-3219公开短双歧杆菌
(Bifidobacteriumbreve)菌株中丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的特征。
发明内容
本发明人发现，与具有相似的大量营养素和微量营养素组成并处于
相似pH条件下的未发酵的乳源性营养组合物相比，具体地，乳源性营
养组合物的巯基蛋白酶活性的抑制能力是在乳酸细菌的发酵步骤后提
高。
特别是，链球菌(Streptococcus)进行的发酵促进这种效果。由于
嗜热链球菌(Streptoccoccusthermophilus)的发酵不会导致较大蛋白质
的水解，这种效果不能归因于乳蛋白中存在的酪蛋白或乳铁蛋白的水
解。
使用木瓜蛋白酶作为模型巯基蛋白酶。由于巯基蛋白酶对于蛋白质
消化作用来说不是十分重要，但在炎症中起着重要作用，所以食用发酵
的乳源性营养组合物可有益地降低胃肠道中的巯基蛋白酶活性，从而有
助于胃肠健康。胃肠道中巯基蛋白酶活性的降低会导致治疗或预防轻度
胃肠炎症、IBD、IBS以及减少绞痛(colics)、肠痉挛(intestinalcramps)
和腹痛及胃肠感染。
这对于婴儿和年幼儿童来说是十分重要的，因为其胃肠道仍在发
育，并且其具有发育中的微生物群(microbiota)，通常伴随以下状况：
轻度胃炎症、降低的胃肠屏障功能和肠道不适。
具体实施方式
本发明涉及抑制巯基蛋白酶活性的方法，包括将巯基蛋白酶与包含
乳源性发酵产品的组合物接触，所述乳源性发酵产品由产乳酸细菌发
酵，所述乳源性发酵产品包含i)乳酸和/或乳酸盐，ii)选自以下的至少
一种：乳清、乳清蛋白和酪蛋白。
换句话说，本发明涉及包含由产乳酸细菌发酵的乳源性发酵产品的
组合物用于抑制巯基蛋白酶活性的用途，所述乳源性发酵产品包含i)
乳酸和/或乳酸盐，ii)选自以下的至少一种：乳清、乳清蛋白和酪蛋白。
本发明还涉及通过降低巯基蛋白酶活性，优选地通过降低胃肠道中
巯基蛋白酶活性来治疗和/或预防人类受试者中的巯基蛋白酶介导的疾
病的方法，所述疾病选自：胃肠炎症、炎性肠病、肠易激综合征、绞痛、
肠痉挛、腹痛和胃肠感染，包括向人类受试者给予包含由产乳酸细菌发
酵的乳源性发酵产品的营养组合物，所述乳源性发酵产品包含i)乳酸
和/或乳酸盐，ii)选自以下的至少一种：乳清、乳清蛋白和酪蛋白。
还可将本发明描述为由产乳酸细菌发酵的乳源性发酵产品用于制
备营养组合物的用途，所述发酵的乳源性产品包含i)乳酸和/或乳酸盐，
ii)选自以下的至少一种：乳清、乳清蛋白和酪蛋白，所述营养组合物
用于通过降低巯基蛋白酶活性，优选地通过降低胃肠道中巯基蛋白酶活
性，来治疗和/或预防巯基蛋白酶介导的疾病，所述疾病选自：胃肠炎
症、炎性肠病、肠易激综合征、绞痛、肠痉挛、腹痛和胃肠感染。
还可将本发明描述为包含由产乳酸细菌发酵的乳源性发酵产品的
营养组合物，用于通过降低巯基蛋白酶活性，优选地通过降低胃肠道中
巯基蛋白酶活性，来治疗和/或预防巯基蛋白酶介导的疾病，所述乳源
性发酵产品包含i)乳酸和/或乳酸盐，ii)选自以下的至少一种：乳清、
乳清蛋白和酪蛋白，所述疾病选自：胃肠炎症、炎性肠病、肠易激综合
征、绞痛、肠痉挛、腹痛和胃肠感染。
在一个方面，本发明还涉及提高营养组合物中巯基蛋白酶抑制剂活
性的方法，其中，所述营养组合物包含如乳或包含乳糖以及选自以下的
至少一种：乳清、乳清蛋白和酪蛋白，所述方法包括由产乳酸细菌对所
述营养组合物的发酵。
需要注意的是，不管在本说明书中任何地方使用如“本营养组合物”
或“根据(本)发明的营养组合物”的表述，其也指根据本发明的方法
和用途。
巯基蛋白酶抑制剂
本文使用的术语“蛋白酶”指的是能够通过裂解肽键来水解蛋白质
和/或肽的酶。本文使用的术语“巯基蛋白酶”指的是在活性中心具有巯
基基团的蛋白酶。这些酶的活性巯基基团是源自所存在的半胱氨酸残
基。本发明中使用的术语巯基蛋白酶抑制剂指的是能够抑制所述巯基蛋
白酶的作用的化合物、物质和/或组合物。更优选地，被抑制的巯基蛋
白酶活性是木瓜蛋白酶和组织蛋白酶如组织蛋白酶B、D和L的活性。
可如本领域中已知地测量巯基蛋白酶活性，如木瓜蛋白酶(也可参
见实施例)。木瓜蛋白酶活性的一个单位定义为在pH6.2、25℃下每分
钟水解1.0μmole的N-α-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)(根据供应
商Sigma-Aldrich的产品信息表)。木瓜蛋白酶也被称作番木瓜蛋白酶
(papainase)或木瓜肽酶I(EC3.4.22.2)。
巯基蛋白酶抑制剂的一个单位(TIU)定义为抑制具有2个单位的
活性的巯基蛋白酶制剂的50％的抑制剂的量。木瓜蛋白酶抑制剂的一
个单位(PIU)定义为抑制具有2个单位的活性的木瓜蛋白酶制剂的50％
的抑制剂的量。在根据本发明的方法或用途的一个实施方案中，所述营
养组合物的巯基蛋白酶抑制剂活性为至少40个木瓜蛋白酶抑制剂单位
(PIU)/g营养组合物干重。
发酵产品
发酵是使用内源性的电子受体从碳水化合物(如乳中存在的乳糖)
的氧化中取得能量的过程，所述电子受体通常为有机化合物。这与细胞
呼吸相反，在细胞呼吸中，电子是通过电子传递链被供给外源性电子受
体，如氧。在本发明中，产乳酸细菌对乳源性产品(milk-derivedproduct)
的发酵具有将乳源性产品中存在的碳水化合物转化成有机酸的通常含
义。除乳酸外，所形成的这些有机酸还可包含其它有机酸如乙酸。乳酸
细菌也被称为产乳酸细菌，并且包括链球菌属(Streptococcus)、乳球
菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属
(Leuconostoc)、肠球菌属(Enterococcus)、酒球菌属(Oenococcus)、
片球菌属(Pediococcus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的细菌。优
选地，所述乳源性产品不是由保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)
发酵。保加利亚乳杆菌发酵的产品被认为不适合于婴儿，因为在婴儿中
将D-乳酸盐转化为丙酮酸盐的特定的脱氢酶的活性远不如转化L-乳酸
盐的脱氢酶。
根据本发明，所述营养组合物包含由产乳酸细菌发酵的乳源性产
品。所述发酵的乳源性产品包含乳酸和/或乳酸盐。优选地，所述发酵
的乳源性产品还包含选自如下的一种或多种：乳清、乳清蛋白、乳清蛋
白水解产物、酪蛋白和酪蛋白水解产物。任选地，所述发酵的乳源性产
品可以包含选自如下的一种或多种：乳清蛋白水解产物和酪蛋白水解产
物。术语“发酵的乳源性产品”包括发酵乳。所述发酵的乳源性产品是
通过以下方式获得：通过将乳(如脱脂乳)的结合物，或者通过将包含
乳糖以及优选的选自乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解产物、酪蛋白和酪
蛋白水解产物中的一种或多种的组合物的结合物，与至少一种产乳酸细
菌(优选嗜热链球菌)孵育。优选地，将所述结合物孵育10分钟至约
6小时。孵育期间的温度优选地为20至50℃。孵育后，优选地对经孵
育的产品进行热处理。优选地，经过此热处理，至少90％的活乳酸细
菌被灭活。因此，在本发明的一个实施方案中，所述营养组合物中的产
乳酸细菌是灭活的和/或不能复制的。优选地在80℃至180℃的温度下
进行热处理。制备适合于本发明目的的发酵的乳源性产品的方法本身是
已知的。EP778885，其通过引用的方式纳入本文，在实施例7中特别
公开了制备发酵的乳源性产品的适宜的方法。FR2723960，其通过引用
的方式纳入本文，在实施例6中特别公开了制备发酵的乳源性产品的适
宜的方法。
简单来说，乳源性产品，优选地经巴氏消毒的、包含乳糖和任选的
另外大量营养素(如(植物)脂肪、酪蛋白、乳清蛋白、维生素和/或
矿物质等)，被浓缩至例如15-50％干物质(avalue15of50％dry
matter)，然后用嗜热链球菌接种，例如用5％的含有106至1010细菌
/ml的培养基。发酵的温度和持续时间如上所述。适当地，在发酵后，
对发酵的乳源性产品进行巴士消毒或灭菌，并进行例如喷雾干燥或冻干
以提供适合于被制剂成最终产品的形式。
对于本发明，优选地用于制备所述发酵的乳源性产品的嗜热链球菌
的细菌菌株在底物的发酵过程中产生β-半乳糖苷酶活性。优选地，β-
半乳糖苷酶活性与酸度一起产生。优选地，产生β-半乳糖苷酶活性，该
活性足以允许随后的低聚半乳糖在所述发酵的乳源性产品中的富集。因
此，优选地，合适的嗜热链球菌菌株，当在含乳糖的培养基上培养时(特
别是基于乳浓缩物的培养基)，实现伴随高低聚半乳糖产量的培养基的
发酵。EP778885的实施例2和FR2723960的实施例1中记载了合适
的嗜热链球菌菌株的选择。对于本发明，制备所述发酵的乳源性产品的
嗜热链球菌的优选菌株已由CompagnieGervaisDanone于1995年8月
23日以登录号I-1620和1994年8月25日以登录号I-1470保藏于由巴
斯德研究所管理的法国国家培养物和微生物保藏中心(CNCM，
CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes)，其位于25rue
duDocteurRoux，巴黎，法国。优选地，在所述发酵的乳源性产品的
制品中，存在额外的其它乳酸细菌的菌株，或者，同时地或者依次地，
所述发酵的乳源性产品额外地由其它乳酸细菌的菌株发酵。乳酸细菌的
其他菌株优选地选自：乳杆菌属和双歧杆菌属，更优选短双歧杆菌，最
优选由CompagnieGervaisDanone于1999年5月31日以编号I-2219
保藏于CNCM的双歧杆菌属短双歧杆菌(B.breve)菌株。优选地，所
述乳源性产品是由嗜热链球菌和/或短双歧杆菌发酵。优选地，所述营
养组合物包含嗜热链球菌和/或短双歧杆菌。优选地，所述营养组合物
中的产乳酸细菌是以灭活和/或不能复制的形式存在，因为其防止产品
中存在的大量乳糖的进一步降解。
基于总产品的干重计，本组合物优选地包含至少5重量％的所述发
酵的乳源性产品。优选地，基于总产品的干重计，所述组合物包含至少
10重量％、更优选至少25重量％、甚至更优选至少40重量％的所述发
酵的乳源性产品。基于总产品的干重计，本组合物包含最多达100重
量％的所述发酵的乳源性产品。优选地，基于总产品的干重计，所述组
合物包含最多达90重量％、更优选最多70重量％、甚至更优选最多
50重量％的所述发酵的乳源性产品。
本发明人发现，与具有相似的大量营养素和微量营养素组成并处于
相似pH条件下的未发酵的乳源性营养组合物相比，具体地，乳源性营
养组合物的巯基蛋白酶活性的抑制能力是通过由乳酸细菌进行的发酵
提高。特别是，链球菌进行的发酵促进这种效果。因为在嗜热链球菌进
行的发酵时，用常规分析(如凝胶电泳或柱层析法)没有发现蛋白质降
解产物，并且由于存在足够的游离氨基酸来预防蛋白酶的表达，所述提
高的巯基蛋白酶活性的抑制效果不能归因于乳蛋白中存在的酪蛋白或
乳铁蛋白的水解。并不希望囿于理论，本发明人相信，在发酵条件下孵
育乳源性成分(从而缓慢地降低pH和/或形成乳酸)，所述成分被稍微
修饰并天然存在的抑制巯基蛋白酶活性的能力被增强。或者，乳酸的存
在和/或降低的pH对于导致抑制巯基蛋白酶活性的成分的效果是提高
该能力。需要注意的是，木瓜蛋白酶活性和抑制的测量是用具有恒定
pH的测定法进行。
因此，本发明还涉及乳源性营养组合物，基于该营养组合物干重计，
所述营养组合物包含乳酸和乳酸盐的总和为0.10-1.5重量％，其中基于
总乳酸和乳酸盐的总和计，L-乳酸与L-乳酸盐的总和超过50重量％，
并且所述营养组合物具有的pH值为5.0-6.5。更优选地，本乳源性营养
组合物包含乳酸的总和为0.20-1.0重量％。更优选地，基于总乳酸和乳
酸盐的总和计，L-乳酸与L-乳酸盐的总和超过90重量％。更优选地，
所述乳源性营养组合物具有的pH为5.5-6.3。
已观察到，发酵的乳源性营养组合物对消化酶——主要为丝氨酸蛋
白酶——的抑制程度更低，这是有利的，因为对丝氨酸蛋白酶活性的过
多抑制会干扰正常的蛋白质消化。
营养组合物
本营养组合物优选地特别适用于向婴儿或年幼儿童，或换言之向年
龄为0-36个月的人类受试者提供完整的每日营养需求，更优选婴儿或
换言之向年龄为0-12个月的人类受试者。本营养组合物优选地不是酸
乳(yogurt)，因为酸乳通常包含保加利亚乳杆菌(CodexStandardfor
fermentedMilksCodexStan243-2003)。
本营养组合物包含可消化的碳水化合物，特别是乳糖。因此，本文
中，乳糖被认为是可消化的碳水化合物。然而，也可能存在其它可消化
的碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、淀粉和麦
芽糖糊精。优选地，本营养组合物不包含大量非乳糖的可消化的碳水化
合物。当为液体形式时，如即喂液体(ready-to-feedliquid)，所述营
养组合物优选地包含6.0-30g可消化的碳水化合物/100ml，更优选
6.0-20，甚至更优选7.0-10.0g/100ml。基于干重计，本营养组合物优选
地包含40-80重量％，更优选40-65重量％可消化的碳水化合物。基于
总热量计，所述营养组合物包含9-20g可消化的碳水化合物/100kcal，
更优选9-15g。
本营养组合物优选地包含脂质。本营养组合物的脂质提供3-7g/100
kcal所述营养组合物，优选地，脂质提供4-6g/100kcal。当为液体形式
时，如作为即喂液体，所述营养组合物优选地包含2.1-6.5g脂质/100ml，
更优选3.0-4.0g/100ml。基于干重计，本营养组合物优选地包含12.5-40
重量％脂质，更优选19-30重量％。优选地，脂质包含必需脂肪酸α-
亚麻酸(ALA)、亚油酸(LA)和/或长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)。
可以游离脂肪酸形式、甘油三酯形式、甘油二酯形式、甘油单酯形式、
磷脂形式、或作为上述一种或多种的混合物的形式提供所述LC-PUFA、
LA和/或ALA。优选地，本营养组合物包含至少一种、优选至少两者
脂质来源，所述脂质来源选自菜籽油(rapeseedoil)(如菜籽油(colza
oil)、低芥酸菜籽油(lowerucicacidrapeseedoil)及芥花油(canola
oil))、高油酸葵花籽油、高油酸红花籽油、橄榄油、海洋油(marine
oil)、微生物油(microbialoil)、椰子油、棕榈仁油和乳脂(milkfat)。
优选地，本营养组合物包含蛋白质。所述蛋白质优选地选自非人的
动物蛋白质，优选乳蛋白质。优选地，本营养组合物包含选自以下的一
种或多种：乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解产物、酪蛋白和酪蛋白水解
产物。所述营养组合物优选地包含酪蛋白和/或乳清蛋白，更优选牛乳
清蛋白和/或牛酪蛋白。所述营养组合物优选地包含酪蛋白和乳清蛋白
的酪蛋白:乳清蛋白的重量比为10:90-90:10，更优选20:80-80:20，甚至
更优选35:65-55:45。
本发明的营养组合物优选地提供蛋白质的量为1.25-4g/100kcal，
优选地提供1.5-3g，甚至更优选1.7-2.5g/100kcal。当为液体形式时，
所述营养组合物优选地包含0.5-6.0g，更优选1.0-3.0g，甚至更优选
1.0-1.5g蛋白质/100ml，最优选1.0-1.3g蛋白质/100ml。基于干重计，
本营养组合物优选地包含5-20重量％蛋白质，优选至少8重量％，更
优选8-14重量％蛋白质，甚至更优选8-9.5重量％，基于所述营养组合
物的干重计。
在一个实施方案中，所述营养组合物优选地包含酪蛋白和乳清蛋
白，其酪蛋白:乳清蛋白重量比为10:90-90:10，更优选20:80-80:20，甚
至更优选35:65-55:45，并且包含5-20重量％蛋白质，优选至少8重量％，
更优选8-14重量％蛋白质，甚至更优选8-9.5重量％，基于该营养组合
物的干重计。
本发明的营养组合物优选地提供脂质的量为3-7g/100kcal，优选
4-6g/100kcal；蛋白质的量为1.25-4g/100kcal，优选1.5或1.6-3g/100
kcal，优选1.7-2.5g/100kcal；以及可消化的碳水化合物的量为5-20
g/100kcal，优选8-15g/100kcal所述营养组合物。优选地，本营养组合
物包含提供4-6g/100kcal的脂质，提供1.6-1.9g/100kcal的蛋白质，
更优选1.75-1.85g/100kcal，以及提供8-15g/100kcal最终营养组合物
的可消化的碳水化合物。
总热量含量是通过来自蛋白质、脂质、可消化的碳水化合物和不可
消化的寡糖的热量的总和来确定。认为蛋白质和碳水化合物具有的热量
密度为4kcal/g，脂肪为9kcal/g，且不可消化的寡糖为2kcal/g。
本发明的营养组合物不是人的母乳。根据本发明的营养组合物或根
据本发明使用的营养组合物优选地包含其他级分，例如维生素、矿物质、
微量元素及其他微量营养素，以使其成为完整的营养组合物。优选地，
所述营养组合物选自婴儿配方、后续配方、幼儿乳(toddlermilk)或
配方以及成长乳，更优选地选自婴儿配方。婴儿配方被定义为一种用于
婴儿的配方并且可作为例如起始配方(starterformula)，用于年龄为
0至4-6个月的婴儿，或后续配方，用于年龄为4-6个月至12个月的婴
儿。幼儿乳或成长乳或配方意欲用于年龄为12至36个月的儿童。在一
个实施方案中，所述营养组合物是婴儿配方。根据国际标准(directive)，
婴儿配方包含微生物、矿物质、微量元素及其他微量营养素。
在一个实施方案中，所述营养组合物处于液体形式。在另一个实施
方案中，所述营养组合物是适合于在用水性溶液(优选地用水)复原后
形成液体营养组合物的粉末。优选地，所述营养组合物是粉末，适用于
用水复原成液体。优选地，所述婴儿或幼儿配方是待用水复原的粉末。
优选地，当用Brookfield粘度计在20℃下以剪切率100s-1测量时，所
述液体组合物具有的粘度低于100mPa.s，更优选低于60mPa.s，更优
选低于35mPa.s，甚至更优选低于6mPa.s。低粘度对婴儿或后续配方
来说是重要的，因为它模拟了母乳的粘度并可以通过奶嘴给予(teat)。
当为即饮液体形式时，本营养组合物的pH优选地为5.0-7.5，更优
选5.0-6.5，最优选为5.5-6.3。
在一个实施方案中，根据本发明的营养组合物是pH为5.0-6.5的液
体，或可用水复原成pH为5.0-6.5的液体的粉末。
为了满足婴儿或幼儿的热量需求，所述营养组合物优选地包含
45-200kcal/100ml液体。对于婴儿来说，所述营养组合物更优选地具
有60-90kcal/100ml液体，甚至更优选65-75kcal/100ml液体。此热量
密度确保水与热量消耗之间的最佳比例。对于幼儿来说，年龄为12-36
个月的人类受试者，所述营养组合物具有的热量密度更优选地为45-65，
甚至更优选50-60kcal/100ml。优选地，本组合物的克分子渗透压浓度
(osmolarity)为150至420mOsmol/l，更优选260至320mOsmol/l。
低的克分子渗透压浓度的目的是进一步降低胃肠压力。
当所述营养组合物处于液体形式时，每天给予的优选体积为在约
80至2500ml的范围内，更优选约200至1200ml每天。优选地，每天
的喂养次数为1至10次，优选3至8次。在一个实施方案中，以液体
的形式每天给予所述营养组合物，持续至少2天的时间，优选地持续至
少4周的时间，优选地持续至少8周的时间，更优选地持续至少12周
的时间，其中每天给予的总体积为200ml至1200ml，且其中每天喂养
次数为1至10次。
应用
优选地，本营养组合物适合于或适合于给予人类受试者。在一个实
施方案中，本营养组合物适用于婴儿和/或年幼儿童。在一个实施方案
中，本营养组合物适用于向年龄为0-36个月的人类受试者提供营养。
年幼儿童或幼儿被定义为年龄为12至36个月的人类受试者。婴儿被定
义为年龄小于12个月的人类受试者。因此，换言之，本营养组合物适
合于年龄为0至36个月的人类受试者。在此说明书的任何地方中使用
术语“婴儿和/或年幼儿童”时，可用“年龄为0至36个月的人类受试者”
代替。
本营养组合物优选地是通过肠内给予，更优选通过口服给予。
本营养组合物优选地是用于通过降低巯基蛋白酶活性来治疗和/或
预防轻度胃肠炎症、IBD、IBS以及减少绞痛、肠痉挛和腹痛及胃肠感
染，优选地在肠胃道中。
本营养组合物优选地用于通过减少巯基蛋白酶活性来治疗和/或预
防巯基蛋白酶介导的疾病，所述疾病选自胃肠炎症、炎性肠病、肠易激
综合征、绞痛、肠痉挛、腹痛和胃肠感染，优选地在胃肠道中，更优选
地用于通过减少胃肠道中的巯基蛋白酶活性来治疗和/或预防胃肠炎
症，甚至更优选轻度肠炎症。
实施例
实施例1：具有木瓜蛋白酶抑制效果的发酵的婴儿乳配方
制备一种浓缩的乳源性产品，包括制备具有脱脂乳、乳清蛋白、乳
糖、微量成分(micro-ingredients)的水相，以及具有植物脂肪的脂肪
相，其量为使其适合于婴儿配方。将所述两相混合并匀质化。总固体含
量为约41重量％。将此产品保存在约45℃下，用预培养的嗜热链球菌
065和短双歧杆菌C50接种，两者具有约相同量的cfu。由脱脂乳和1
重量％酵母提取物制备所使用的接种物的预生长和生长培养基。进行发
酵，直到pH降到约5.2。然后，基于所述组合物的干重计，乳酸和乳
酸盐的含量约为1重量％。
使用具有41重量％的总固体的相同乳源性产品作为对照，但是其
不用所述两种产乳酸细菌接种。此pH为中性的，并且不存在乳酸和乳
酸盐。
将两种产品冷却并喷雾干燥为粉末。在临测定前将粉末状配方用水
复原至浓度分别为1.07和1.05g/ml，pH为约5.4-5.8。
基于Ivanovetal.,2006,JBC281:17246-17252，用荧光法测定巯基
蛋白酶抑制能力。将木瓜蛋白酶(来自Papayalatex，SigmaAldrich
P4762，10U/mg蛋白质，96％蛋白质粉末)用作参照。所有反应都是
在50mM磷酸钠、pH7.2、100mMNaCl缓冲液中进行。在Me2SO中
制备荧光肽底物(N-Suc-AAPF-AMC)的储备溶液并储存于-20℃下。
将所述Me2SO底物储备溶液稀释75倍为反应缓冲液，从而制备2X底
物缓冲液(400μMMeOSuc-AAPF-AMC)。然后将木瓜蛋白酶(5U/ml)
与配方样品的不同稀释物(未稀释的、1:1和1:10稀释的)孵育。随后，
通过在96孔白板中快速混合50μl底物缓冲液与50μl酶/配方溶液，并
在FLUOstar(BMGLabTech，Ortenberg，Germany)上记录荧光变
化，来测定酶活性。在360nm激发波长和460nm发射波长下从t＝0
至t＝20分钟测量荧光素强度。确定每种样品和标准品的Vmax。
根据生产商的方案，用酪蛋白水解活性的标准测定试剂盒
(EnzCheck)来用荧光法测定消化性蛋白酶抑制能力，并且使用猪胰
酶(pancreatin)(SigmaP175，4＊USP)作为参照。简单来说，用10mM
TrispH7.8稀释样品。每孔50μl未稀释的、1:2、1:4和1:10稀释的样
品及50μl胰酶，并在37℃下混合和孵育30分钟。随后，每孔加入100
μl荧光素标记的酪蛋白-底物，使用FLUOstar在485nm激发波长和
510nm发射波长下从t＝0至t＝20分钟测量荧光素强度。以参照的Vmax
的百分数表示每种样品的残留的蛋白酶活性。
表1示出了经过发酵，木瓜蛋白酶活性从16.37降低到3.40，说明
通过发酵，抑制活性提高了4.8倍。
表1:发酵的或未发酵的乳源性营养组合物的蛋白酶活性抑制。
![]()
![]()
*与对照相比p<0.05
实施例2：具有木瓜蛋白酶抑制效果的嗜热链球菌发酵的乳
使用脱脂乳和1重量％酵母提取液制备生长培养基。此培养基是未
发酵的(对照)，或在与实施例1相似的条件下用嗜热链球菌065发酵
的，也达到约5.2的最终pH。然后，用实施例1中所述的方案分析木
瓜蛋白酶活性。然后将木瓜蛋白酶(5U/ml和2.5U/ml)与配方样品的
不同稀释物(未稀释的、1:1和1:5稀释的)孵育30分钟。随后，通过
在96孔白板中快速混合50μl底物缓冲液和50μl酶/配方溶液，并且在
FLUOstar(BMGLabTech，Ortenberg，Germany)上记录荧光变化，
测定酶活性。
结果如表2中所示。从表2可以推导出，仅由链球菌对乳源性产品
的发酵已经导致木瓜蛋白酶抑制的提高。
表2：脱脂乳或嗜热链球菌发酵的脱脂乳的木瓜蛋白酶活性抑制
![]()