中草药组合物、纳米乳剂和经皮贴剂、及其制备和用于治疗创伤性损伤的用途.pdf

本发明涉及一种中草药组合物及其制备方法，所述组合物包含红花、续断、三七和大黄的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物。本发明还涉及一种水包油或油包水型纳米乳剂及其制备方法，所述纳米乳剂包含水相、有机相和表面活性剂，其中所述水相包含中草药材料的水性溶剂提取物和/或所述有机相包含中草药材料的油性溶剂提取物。本发明另外涉及一种包含所述纳米乳剂的经皮纳米贴剂。本发明中草药组合物可有效治疗创伤性损伤，尤其是骨损伤。本发明纳米乳剂和贴剂能够显著促进中草药有效成分的透皮吸收，提高药物的生物利用度和疗效。

1.  一种中草药组合物，其包含红花、续断、三七和大黄的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物以及任选地，药学上可接受的载体，并且其中所述中草药组合物不包含来自栀子和接骨木的提取物。

2.  根据权利要求1的组合物，其由下列组成：红花、续断、三七和大黄的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物以及任选地，药学上可接受的载体。

3.  根据权利要求1或2的组合物，其中所述水性溶剂为水和/或所述油性溶剂为乙醇，优选95％的乙醇水溶液。

4.  根据前述权利要求任一项的组合物，其中红花、续断、三七和大黄的重量比为(0.8-1.2)∶(1-1.5)∶(0.8-1.2)∶(1-2)，优选1∶1∶1∶1至1∶1.5∶1∶2的范围；优选地，所述水性溶剂提取物和所述油性溶剂提取物的重量比为10∶1至7∶1，更优选地，所述水性溶剂提取物和所述油性溶剂提取物的重量比以占所述组合物的重量百分比计为30％∶3％至42％∶6％，优选35％∶4.3％至39.8％∶5％。

5.  根据前述权利要求任一项的组合物，其通过以下步骤制备：
a)准备红花、续断、三七和大黄，任选地将其切块；
b)将步骤a)的原料共同或分别在水性溶剂中浸泡和/或回流下加热足够长的时间，以获得水性溶剂提取物，任选地将所得水性溶剂提取物进行选自过滤、浓缩和冷冻干燥的处理；
c)将步骤a)的原料或步骤b)所得的提取残余物在油性溶剂中浸泡和/或回流加热足够长的时间，以获得油性溶剂提取物，任选地将所得油性溶剂提取物进行选自过滤、浓缩和冷冻干燥的处理；和
d)将获得的所述水性溶剂提取物和所述油性溶剂提取物配制为组合物，其中任选地将获得的所述水性溶剂提取物和所述油性溶剂提取物与至少一种药学可接受的载体组合。

6.  根据权利要求1-4任一项的组合物，其通过以下步骤制备：
a)准备红花、续断、三七和大黄，任选地将其切块；
b)将步骤a)的原料共同或分别在油性溶剂中浸泡和/或回流下加热足够长的时间，以获得油性溶剂提取物，任选地将所得油性溶剂提取物进行选自过滤、浓缩和冷冻干燥的处理；
c)将步骤a)的原料或步骤b)所得的提取残余物在水性溶剂中浸泡和/或回流加热足够长的时间，以获得水性溶剂提取物，任选地将所得水性溶剂提取物进行选自过滤、浓缩和冷冻干燥的处理；和
d)组合获得的所述水性溶剂提取物和所述油性溶剂提取物，其中任选地将获得的所述水性溶剂提取物和所述油性溶剂提取物与至少一种药学可接受的载体组合。

7.  根据前述权利要求任一项的组合物，其是糊剂、药膏、纳米乳剂或经皮贴剂的形式。

8.  一种水包油或油包水型纳米乳剂，其包含水相、有机相和表面活性剂，其中所述水相包含一种或多种中草药材料的水性溶剂提取物和/或所述有机相包含所述一种或多种中草药材料的油性溶剂提取物。

9.  根据权利要求8所述的纳米乳剂，其中所述水相或有机相具有10-200nm、优选10-50nm的液滴；和/或所述水相按重量计占所述纳米乳剂的60-90％、优选75-85％；和/或所述有机相按重量计占所述纳米乳剂的2-20％、优选2-8％；和/或所述表面活性剂按重量计占所述纳米乳剂的4-40％、优选10-22％。

10.  根据权利要求8或9所述的纳米乳剂，其中形成所述水相的水相溶剂为水；和/或其中形成所述油相的油相溶剂为Sefsol-218、Capryol-90、甘油三脂、Myritol-318、柠檬烯、液体石蜡、乙醇或其一种或多种的组合；和/或其中所述表面活性剂为具有范围在8至18的HLB值的非离子表面活性剂，例如Labrasol、氢化蓖麻油EL(Cremophor EL)、吐温20、吐温60和吐温80，优选为氢化蓖麻油EL和吐温20。

11.  根据权利要求8-10任一项所述的纳米乳剂，其中所述水性溶剂提 取物和所述油性溶剂提取物分别为根据权利要求1-6任一项所限定的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物。

12.  一种制备权利要求8-11任一项所述的水包油或油包水型纳米乳剂的方法，其包括以下步骤：
1)利用水性溶剂提取中草药材料以获得水性溶剂提取物，所述水性溶剂优选为水；
2)利用油性溶剂提取中草药材料以获得油性溶剂提取物，所述油性溶剂优选为醇，更优选为95％乙醇；
3)将步骤1)获得的水性溶剂提取物溶解于水相溶剂，以形成包含所述水性溶剂提取物的水相，并且将步骤2)获得的油性溶剂提取物溶解于油相溶剂，以形成包含所述油性溶剂提取物的有机相；
4)将所述水相和所述有机相与表面活性剂混合，形成均化前混合物；
5)以12,000-30,000rpm的速度将所述均化前混合物均化10-30分钟，形成所述纳米乳剂。

13.  一种经皮贴剂，其包含衬层、基质层和剥离层，所述基质层包含权利要求8-11任一项所述的水包油型或油包水型纳米乳剂和粘合剂，所述纳米乳剂优选以重量计占所述基质层的1-25％；其中所述粘合剂优选选自由卡波姆980、卡波普U20、卡波普HV-805EG、羧甲基纤维素钠、明胶、聚丙烯酸钠盐、聚丙烯酸钠盐NP700、聚乙烯吡咯烷酮10和聚乙烯吡咯烷酮K90及其组合组成的组，所述粘合剂更优选为聚丙烯酸钠盐、聚丙烯酸钠盐NP700、卡波普HV-805EG和聚乙烯吡咯烷酮的组合；并且所述粘合剂优选以重量计占所述基质层的10-15％。

14.  根据权利要求13所述的经皮贴剂，其中所述基质层进一步包含选自交联剂、湿润剂、支架材料或填充剂和pH控制剂组成的组的一种或多种成分。

15.  根据权利要求14所述的经皮贴剂，其中所述基质层以基质的重量计包含1-25％的纳米乳剂、10-15％的粘合剂、0.01-0.8％的交联剂、15-25％的湿润剂、1-10％的支架材料或填充剂、和将pH控制在5-6的pH控制剂。

16.  权利要求1-7任一项所述的组合物、权利要求8-11任一项所述的纳米乳剂或权利要求13-15任一项所述的经皮贴剂在制备用于治疗创伤性损伤的药物中的用途。

17.  根据权利要求16的用途，其中所述创伤性损伤为组织损伤或骨损伤，例如创伤性肌肉骨骼损伤，诸如软组织损伤或骨折。

中草药组合物、纳米乳剂和经皮贴剂、及其制备和用于治疗创伤性损伤的用途
技术领域
本发明涉及用于治疗骨损伤的中草药配方，以及一种可应用于所述中草药配方的纳米乳剂和可应用于所述纳米乳剂的经皮贴剂。本发明还涉及所述中草药配方、纳米乳剂和经皮贴剂的制备和用途。
背景技术
创伤性的损伤，例如肌肉骨骼损伤——骨折，是门诊常见症之一。成人骨折的全球发病率估计约为每年每1000人中有9.0至22.8人。鉴于骨折是老年人的常见症，可以预期由于老龄化，在不久的将来骨折病例数将持续增加。骨折的病人在康复出院前需要很长的一段住院时间。1997年到1998年间纽约髋骨骨折固定术的平均住院时间为5天，最长为33天；在1992年瑞士患的男性和女性骨折患者的平均住院时间分别为13.3天和19.6天，而总住院天数则超过100万天。骨折在降低社会生产力的同时，增加了卫生服务资源利用和社会经济负担。
尽管如今外科手术能有效的进行复位和固定，但是医院和临床工作人员很少关注术后的愈合过程。骨折复位后，骨骼被铸件或固定器所固定，此后的愈合主要依赖于自身的恢复。病人在住院期间除了疼痛和炎症治疗外常处于无人看护状态。尽管很多科研人员已经去寻找促进骨骼愈合的方法，包括生物材料支架、生长因子、骨形态发生蛋白以及生物物理刺激，但是这些干预措施还没有被常规的临床应用所接受。
促进骨折的愈合是中医的关键领域之一。几乎所有中医对骨折的处理都涉及中药糊剂(或药膏)的局部施用，这样的治疗方式已经被中国人使用了数千年。然而，这些草药的配方太多元化并且通常包含多种中草药例 如6种、更经常超过十种。这样的配方使得中草药复方由于严重缺乏基于相关证据的科学支持和临床数据的良好系统证明而难以在世界范围内被接受。因此，本领域存在这样的需求：经验证具有良好疗效、较低毒副作用的简化中草药配方。
中草药配方的局部应用在各种疾病治疗例如骨损伤治疗中有着广泛的应用。在局部药物递送中，中草药有效成分的经皮运输是药物充分发挥治疗效果的关键因素。然而，在传统的局部用药剂中，某些中草药活性成分例如由于水溶性差等原因难以通过皮肤扩散，从而限制了中草药的生物利用度和局部用药的有效性。由此，本领域也需要一种可有效经皮递送中草药活性成分的给药系统，以提高局部施用的中草药配方的生物利用率和效用。
发明内容
为满足上述大量需求中的一个或多个，本申请提供了一种包含中草药的水性和油性提取物的中草药组合物、可用于分散或溶解该中草药组合物的纳米乳剂、可用于递送该中草药组合物的基质型经皮贴剂、和它们的制备方法以及在治疗创伤性组织或骨骼损伤中的用途。
在一个方面，本发明涉及一种中草药组合物，其包含红花(Carthami Flos)、续断(Dipsaci Radix)、三七(Notoginseng Rhizoma)和大黄(Rhei Rhizoma)的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物以及任选地，药学上可接受的载体，并且其中所述中草药组合物不包含来自栀子(Fructus Gardeniae)和接骨木(Sambucus Williamsii)的提取物。
在一个实施方案中，本发明的组合物由下列组成：红花、续断、三七和大黄的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物以及任选地，药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，所述水性溶剂为水和/或所述油性溶剂为醇、优选乙醇，诸如95％的乙醇水溶液。
在一个实施方案中，红花、续断、三七和大黄的重量比为(0.8-1.2)∶(1-1.5)∶(0.8-1.2)∶(1-2)，优选1∶1∶1∶1至1∶1.5∶1∶2的范围。优选地，所述水 性溶剂提取物和所述油性溶剂提取物的重量比为10∶1至7∶1。更优选地，所述水性溶剂提取物和所述油性溶剂提取物的重量比以占所述组合物的重量百分比计为30％∶3％至42％∶6％，更优选35％∶4.3％至39.8％∶5％。
在一个实施方案中，本发明的组合物可通过以下步骤制备：
a)准备红花、续断、三七和大黄，任选地将其切块；
b)将步骤a)的原料共同或分别在水性溶剂中浸泡和/或回流下加热足够长的时间，以获得水性溶剂提取物，任选地将所得水性溶剂提取物进行选自过滤、浓缩和冷冻干燥的处理；
c)将步骤a)的原料或步骤b)所得的提取残余物在油性溶剂中浸泡和/或回流加热足够长的时间，以获得油性溶剂提取物，任选地将所得油性溶剂提取物进行选自过滤、浓缩和冷冻干燥的处理；和
d)将获得的所述水性溶剂提取物和所述油性溶剂提取物配制为组合物，其中任选地将获得的所述水性溶剂提取物和所述油性溶剂提取物与至少一种药学可接受的载体组合。
在一个实施方案中，本发明的组合物可通过以下步骤制备：
a)准备红花、续断、三七和大黄，任选地将其切块；
b)将步骤a)的原料共同或分别在油性溶剂中浸泡和/或回流下加热足够长的时间，以获得油性溶剂提取物，任选地将所得油性溶剂提取物进行选自过滤、浓缩和冷冻干燥的处理；
c)将步骤a)的原料或步骤b)所得的提取残余物在水性溶剂中浸泡和/或回流加热足够长的时间，以获得水性溶剂提取物，任选地将所得水性溶剂提取物进行选自过滤、浓缩和冷冻干燥的处理；和
d)组合获得的所述水性溶剂提取物和所述油性溶剂提取物，其中任选地将获得的所述水性溶剂提取物和所述油性溶剂提取物与至少一种药学可接受的载体组合。
在一个实施方案中，本发明的组合物可以是糊剂、药膏、纳米乳剂或经皮贴剂的形式。
在一个方面，本发明涉及一种水包油或油包水型纳米乳剂，其包含水相、有机相和表面活性剂，其中所述水相包含一种或多种中草药材料的水性溶剂提取物和/或所述有机相包含所述一种或多种中草药材料的油性溶剂提取物。
在一个实施方案中，本发明的纳米乳剂是水包油型纳米乳剂。
在一个实施方案中，所述水相或有机相具有10-200nm、优选10-50nm的液滴；和/或所述水相按重量计占所述纳米乳剂的60-90％、优选75-85％；和/或所述有机相按重量计占所述纳米乳剂的2-20％、优选2-8％；和/或所述表面活性剂按重量计占所述纳米乳剂的4-40％、优选10-22％。
取决于纳米乳剂的类型，即取决于所述分散相为水相或有机相，所述分散相为10-200nm、优选10-50nm的水滴或油滴。
在一个实施方案中，在本发明的纳米乳剂中，形成所述水相的水相溶剂为水；和/或其中形成所述油相的油相溶剂为Sefsol-218、Capryol-90、甘油三脂、Myritol-318、柠檬烯、液体石蜡、乙醇或其一种或多种的组合；和/或其中所述表面活性剂为具有范围在8至18的HLB值的非离子表面活性剂，例如Labrasol、氢化蓖麻油EL(Cremophor EL)、吐温20、吐温60和吐温80，优选为氢化蓖麻油EL和吐温20。
在一个实施方案中，在本发明的纳米乳剂中，所述水性溶剂提取物和所述油性溶剂提取物分别为上文所描述的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物。
在一个实施方案中，所述水性提取物在纳米乳剂中的含量以重量计(W/W)为5-10％；所述油性提取物在纳米乳剂中的含量以重量计(W/W)为22-30％。
在一个方面，本发明涉及一种制备本发明的水包油或油包水型纳米乳剂的方法，其可包括以下步骤：
1)利用水性溶剂提取中草药材料以获得水性溶剂提取物，所述水性溶剂优选为水；
2)利用油性溶剂提取中草药材料以获得油性溶剂提取物，所述油性溶 剂优选为醇，更优选为95％乙醇；
3)将步骤1)获得的水性溶剂提取物溶解于水相溶剂，以形成包含所述水性溶剂提取物的水相，并且将步骤2)获得的油性溶剂提取物溶解于油相溶剂，以形成包含所述油性溶剂提取物的有机相；
4)将所述水相和所述有机相与表面活性剂混合，形成均化前混合物；
5)以12,000-30,000rpm的速度将所述均化前混合物均化10-30分钟，形成所述纳米乳剂。
在一个方面，本发明涉及一种经皮贴剂，其包含衬层、基质层和剥离层，所述基质层包含本发明的水包油型或油包水型纳米乳剂和粘合剂，所述纳米乳剂优选以重量计占所述基质层的1-25％；其中所述粘合剂优选选自由卡波姆980、卡波普U20、卡波普HV-805EG、羧甲基纤维素钠、明胶、聚丙烯酸钠盐、聚丙烯酸钠盐NP700、聚乙烯吡咯烷酮10和聚乙烯吡咯烷酮K90及其组合组成的组，所述粘合剂更优选为聚丙烯酸钠盐、聚丙烯酸钠盐NP700、卡波普HV-805EG和聚乙烯吡咯烷酮的组合；并且所述粘合剂优选以重量计占所述基质层的10-15％。
在一个实施方案中，所述基质层进一步包含选自交联剂、湿润剂、支架材料或填充剂、和pH控制剂组成的组的一种或多种成分。
在一个实施方案中，其中所述基质层以基质层的重量计包含1-25％的纳米乳剂、10-15％的粘合剂、0.01-0.8％的交联剂、15-25％的湿润剂、1-10％的支架材料或填充剂、和将pH控制在5-6的pH控制剂。
在一个方面，本申请提供了本发明的中草药组合物、纳米乳剂或经皮贴剂在制备用于治疗创伤性损伤的药物中的用途。
在一个实施方案中，所述创伤性损伤为组织损伤或骨损伤，例如创伤性肌肉骨骼损伤，诸如软组织损伤或骨折。
附图说明
图1a显示根据本发明制备的红花、续断、三七和大黄的水性提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO产生的影响。
图1b显示根据本发明制备的红花、续断、三七和大黄的油性提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO产生的影响。
图2a显示根据本发明制备的红花、续断、三七和大黄的水性提取物对UMR-106成骨细胞活力和增殖的作用。
图2b显示本发明制备的红花、续断、三七和大黄的油性提取物对UMR-106成骨细胞活力和增殖的作用。
图3a-3f显示损伤的骨组织经根据本发明的中草药组合物治疗6周后，屈服强度、屈服强度做功、极限强度、极限强度做功、破坏强度、破坏强度做功得以显著改善。
图4a显示在接收隔室中测定的基于重量百分比的中草药糊剂和纳米贴剂的扩散性能的比较。
图4b显示在猪皮肤中测定的基于重量百分比的中草药糊剂和纳米贴剂的扩散性能的比较。
图5为根据本发明制备的基质型经皮贴剂的示意图。
具体实施方式
下述具体实施方式更全面地阐述本发明及其多种附加的优势，以便本发明及本发明的多种附加的优势都更加清晰。
本发明一方面提供了一种中草药组合物，其包含红花、续断、三七和大黄的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物以及任选地，药学上可接受的载体，并且所述组合物不包含来自栀子和接骨木的提取物。进一步，本发明的中草药组合物由下列组成：红花、续断、三七和大黄的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物以及任选地，药学上可接受的载体。
上述水性溶剂和油性溶剂可以是本领域分别适合提取红花、续断、三七和大黄中所含有的亲水部分和疏水部分的药学可接受的任何水性溶剂和任何油性溶剂，使得中草药的水性和油性成分，包括特别是有效成分，被充分的提取出来。
至少对于上述中草药，即红花、续断、三七和大黄，优选的水性溶剂 是水、更优选蒸馏水；优选的油性溶剂是95％的乙醇水溶液。
优选地，红花、续断、三七和大黄中草药材料的重量比可以为(0.8-1.2)∶(1-1.5)∶(0.8-1.2)∶(1-2)，更优选1∶1∶1∶1至1∶1.5∶1∶2；优选地，所述中草药组合物中的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物的重量比为10∶1至7∶1，更优选地，所述水性溶剂提取物和所述油性溶剂提取物的重量比以占所述组合物的重量百分比计为40％∶4％至35％∶5％，优选为35％∶4.3％至39.8％∶5％。
可局部施用所述中草药组合物，以有效治疗治疗创伤性损伤。所述创伤性损伤可包括组织(例如软组织)损伤或骨损伤，例如创伤性肌肉骨骼损伤，诸如骨折。
所述治疗基于所述中草药组合物促进骨愈合的作用，如由下文实施例所证实，其中所述组合物的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物协同互补作用，在骨折发生后，有效调控和协调炎症的发展以及骨再生，促进皮质骨修复，促进损伤的骨组织的愈合。本发明所使用的中草药成分在经过充分提取后(例如实施例1)，其水性溶剂提取物和油性溶剂提取物分别包含中草药成分的亲水活性成分和疏水活性成分。两种类型的活性成分协同作用，显著促进创伤性骨组织损伤的愈合(如实施例2所验证)。本申请令人惊讶地发现，本发明所选择的中草药复方不仅没有随着配方的简化而在骨愈合效应上受到影响，而且进一步显著提高了骨骼生物力学强度，如图3所示。同时，本发明的中草药组合物的原料红花、续断、三七和大黄的提取物对于生物体例如人体的毒副作用大大降低，可在有效治疗疾病的同时，降低对生物体造成不利影响的风险。此外，本发明所选择的中草药成分其在本领域中均具有明确的化学指标，这使得可以对其进行质量控制和透皮研究。
本发明另一方面提供了上述中草药组合物的制备方法，其包括：
a)准备红花、续断、三七和大黄，任选地将其切块；
b)将步骤a)的原料共同或分别在水性溶剂中浸泡和/或回流下加热足够长的时间，以获得水性溶剂提取物，任选地将所得水性溶剂提取物进行 选自过滤、浓缩和冷冻干燥的处理；
c)将步骤a)的原料或步骤b)所得的提取残余物在油性溶剂中浸泡和/或回流加热足够长的时间，以获得油性溶剂提取物，任选地将所得油性溶剂提取物进行选自过滤、浓缩和冷冻干燥的处理；和
d)合并获得的所述水性溶剂提取物和所述油性溶剂提取物，其中任选地将获得的所述水性溶剂提取物和所述油性溶剂提取物与至少一种药学可接受的赋形剂组合；
其中步骤b)和步骤c)的顺序可交换，即可先进行中草药的油性溶剂提取，再进行水性溶剂提取。然而，优选的步骤是先进行水性溶剂提取。过滤步骤可用来除去固体残渣。
在溶剂中浸泡和/或回流下加热的时间应该足够长，以充分提取中草药成分。上述四种中草药原料可以在水性溶剂例如蒸馏水中浸泡例如至少1小时；在蒸馏水中回流加热，例如至少约2小时/次，优选2次，可充分提取水性提取物。水性提取的残余物一般可在油性溶剂例如95％乙醇溶液中回流加热例如至少2小时可充分提取油性提取物。确定不同中草药原料所需要的提取条件在本领域技术人员的能力范围之内。
其中将获得的所述水性溶剂提取物和所述油性溶剂提取物配制为组合物的步骤可依据预期的不同的药物施用方式。例如，所获得的水性提取物和油性提取物可简单地混合在一起，或者与任何适用的药学可接受的赋形剂组合配制为适合不同途径施用的剂型。针对局部施用的剂型，获得的所述水性溶剂提取物和所述油性溶剂提取物还可如下文所述配制成局部施用纳米乳剂，以改善药物活性成分的经皮递送，从而提高药物的生物利用度和治疗效果。
在一个实施方案中，所述提取物可分别经过滤、浓缩、冷冻干燥之后，与50％的乙醇溶液混合，获得用于局部施用的糊剂。
本发明另一方面提供了一种纳米乳剂，其包含水相、有机相和表面活性剂，其中所述水相包含中草药材料的水性溶剂提取物和/或所述有机相包含中草药材料的油性溶剂提取物。取决于例如药物活性成分的种类、含量 等，所述纳米乳剂可采用水包油型或油包水型，即分散连相可以为水相或油相。根据激光散射测定，本发明纳米乳剂的分散相可具有10nm到200nm的液滴(水滴或油滴，取决于纳米乳剂的类型)，优选10-50nm。
本领域技术人员能够依据例如乳剂的类型，确定纳米乳剂中水相、油相等成分的含量。例如，水相按重量计可以占所述纳米乳剂的60-90％、优选75-85％；和/或有机相按重量计可以占所述纳米乳剂的2-20％、优选2-8％；和/或表面活性剂按重量计可以占所述纳米乳剂的4-40％、优选10-22％。形成所述水相的水相溶剂可以为本领域任何适合的药学可接受的水相溶剂，例如水。
形成所述油相的油相溶剂可以为本领域任何适合的药学可接受的油相溶剂，例如Sefsol-218、Capryol-90、甘油三脂、Myritol-318、柠檬烯(limonene)、液体石蜡(liquid paraffin)、乙醇或其组合。
可以加入表面活性剂以降低连续相和分散相之间的界面张力，从而形成乳剂。可根据期望形成的纳米乳剂的类型(即水包油型或油包水型)选择合适的表面活性剂。有利于形成水包油型乳剂的表面活性剂为具有范围在8至18的HLB值(即亲水-亲油平衡值)的非离子表面活性剂。此类表面活性剂的实例包括Labrasol、氢化蓖麻油EL(Cremophor EL)、吐温20、吐温60和吐温80，其中氢化蓖麻油EL和吐温20更为优选；所述表面活性剂优选按重量计占所述纳米乳剂的4-40％，更优选10-22％。
重要的是，中草药的提取物成分完全溶解在水相溶剂或油相溶剂中，以保证充分的均化。中草药的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物可采用如上文所述的以及其他任何适用的方法提取获得。所述提取物以及溶剂的用量可依据具体中草药的用途、其所针对的疾病、所述提取物的类型、提取率、提取物在水相溶剂和油相溶剂中的溶解度等由本领域技术人员容易地确定。
在一个实施方案中，当采用油性溶剂例如醇诸如乙醇进行提取时，基于所采用的油性溶剂的特性，所得到的油性溶剂提取物包含水溶部分和油溶部分。在进一步的实施方案中，在本发明的提取方法中，中草药先进行水提取，然后进行油性溶剂提取，从而在油性溶剂提取过程中，中草药中 剩余的水溶部分和全部油溶部分被一并提取，这导致油性溶剂提取物一部分是亲水性，一部分是亲油性的。所获得的油性提取物中的水溶部分将由于其亲水性而包含在最终形成的纳米乳剂的水相中。在一个实施方案中，水性提取物在纳米乳剂中的含量为5-10wt.％；油性提取物在纳米乳剂中的含量为22-30wt.％。
在一个实施方案中，本发明纳米乳剂为在其水相中包含上述中草药组合物(红花、续断、三七和大黄)的水性溶剂提取物，在其油相中包含上述中草药组合物的油性溶剂提取物的水包油型纳米乳剂。在进一步的实施方案中，形成所述水相的溶剂可为水；和/或形成所述油相的溶剂可为Capryol-90。该纳米乳剂的组成，例如水相、油相、水性溶剂提取物和油性溶剂提取物等，均可采用上文所提及的技术方案。
在一个实施方案中，本发明纳米乳剂包含74.4-84.8wt.％水相、3.8-3.9wt.％有机相以及11.4-21.7wt.％表面活性剂。
在进一步的一个实施方案中，本发明纳米乳剂包含74.4-84.8wt.％水相，其中所述水相溶剂为水；3.8-3.9wt.％有机相，其中所述有机相溶剂为Capryol-90；以及11.4-21.7wt.％吐温20作为表面活性剂。在进一步的实施方案中，所述水相所包含的水性提取物在所述纳米乳剂中的含量为5-10％，所述油相中所包含的油性提取物在所述纳米乳剂中的含量为22-30％。所述纳米乳剂提供了递送中草药水性提取物和油性提取物的特别益处，显著提高了中草药活性成分的经皮透过率。
本发明另一方面提供了一种制备上述纳米乳剂的方法，其包括：
1)利用水性溶剂提取中草药材料以获得水性溶剂提取物，所述水性溶剂优选为水；
2)利用油性溶剂提取中草药材料以获得油性溶剂提取物，所述油性溶剂优选为醇，更优选为95％乙醇；
3)将步骤1)获得的水性溶剂提取物溶解于水相溶剂，以形成包含所述水性溶剂提取物的水相，并且将步骤2)获得的油性溶剂提取物溶解于油相溶剂，以形成包含所述油性溶剂提取物的有机相；
4)将所述水相和所述有机相与表面活性剂混合，形成均化前混合物；
5)以12,000-30,000rpm的速度将所述均化前混合物均化10-30分钟，形成所述纳米乳剂。
在一个实施方案中，将中草药材料的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物(即所述中草药材料的亲水部分和疏水部分)分别(充分)溶解在形成所述水相的水相溶剂和形成所述油相的油相溶剂中，以获得包含所述水性溶剂提取物的水相和包含所述油性溶剂提取物的有机相。
可选的，所述水性溶剂提取物和油性溶剂提取物为进行了过滤、浓缩和/或冷冻干燥处理的提取物，可选的，所述提取物为经过冷冻干燥处理的粉末。
在一个实施方案中，所述中草药材料的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物分别为上文所述的中草药组合物中的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物，即红花、续断、三七和大黄的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物。所述提取物可选的经过滤、浓缩例如减压浓缩和冷冻干燥的处理为粉末形态。
在一个制备纳米乳剂的实施方案中，将表面活性剂先与所获得的水相均匀混合，接着与均匀的油相(即有机相)混合，获得均化前混合物。之后的均化可采用机械均质器进行，例如以12,000-30,000rpm的速度进行10-30分钟，优选以24,000-30,000rpm的速度进行20-30分钟。
均化处理后所获得的纳米乳剂可进行进一步的高压均化工艺，以进一步提高其均质度。对于该高压均化工艺，压力可设置在200-800巴，均化循环数可设置为2-10次。
本发明纳米乳剂与传统的中草药剂型相比，如由下文实施例部分所验证，可显著地全面提高药物活性成分的经皮扩散，从而提高药物的生物利用率，改善创伤性损伤的治疗效果。并且本发明的纳米乳剂可分别在水相和有机相中包含多种药物活性成分。
本发明纳米乳剂可适用于含有亲水性有效活性成分和/或疏水性有效活性成分的任何中草药配方，尤其是本发明的中草药组合物。
本发明另一方面提供了一种经皮贴剂，其包含衬层、基质层和剥离层。
其中，所述基质层包含如上文所述的水包油型或油包水型纳米乳剂和粘合剂；其中所述纳米乳剂优选以重量计占所述基质层的1-25％；其中所述粘合剂选自由卡波姆980、卡波普U20、卡波普HV-805EG、羧甲基纤维素钠、明胶、聚丙烯酸钠盐、聚丙烯酸钠盐NP700、聚乙烯吡咯烷酮10和聚乙烯吡咯烷酮K90及其组合组成的组，所述粘合剂优选为聚丙烯酸钠盐、聚丙烯酸钠盐NP700、卡波普HV-805EG和聚乙烯吡咯烷酮的组合；并且所述粘合剂优选以重量计占所述基质层的10-15％。
在一个实施方案中，所述基质层进一步包含选自交联剂、湿润剂、支架材料或填充剂、和pH控制剂的一种或多种成分。
在所述基质层的基质网络形成中，往往会使用交联剂。交联剂的实例包括氯化铝、柠檬酸、氨基乙酸二羟铝(dihydroxyaluminum aminoacetate)和聚乙烯醇。对于包含聚丙烯酸钠盐的基质层，优选使用氨基乙酸二羟铝。所述交联剂优选以重量计占所述基质层的0.01-0.8％。
为了全面支持所述基质网络，还往往使用支架材料或填充剂。所述支架材料或填充剂的实例包括碳酸铝、高岭土、二氧化硅和氧化锌。其中，优选使用高岭土。优选地，所述支架材料以重量计占所述基质层的1-10％。
此外，所述基质层还可包含湿润剂以保持贴剂的湿润。所述湿润剂的实例包括甘油、丙二醇、PEG-400、D-山梨醇、吐温80及其组合。其中优选的是甘油和D-山梨醇的组合。优选地，所述湿润剂以重量计占所述基质层的10-40％，优选15-25％。
所述基质层还可进一步补充pH控制剂，例如酒石酸。优选所述基质层的pH被控制在5-6。
在一个实施方案中，所述基质层以基质的重量计包含1-25％的纳米乳剂、10-15％的粘合剂、0.01-0.8％的交联剂、15-25％的湿润剂、1-10％的支架材料或填充剂、和将pH控制在5-6的pH控制剂。
在一个实施方案中，本发明基质层包含17.4-18.4wt％的纳米乳剂、12.4-12.7wt％的粘合剂、0.4wt％的交联剂、19-19.7wt％的湿润剂、4.6wt％ 的支架材料或填充剂、0.2wt％的将pH控制在5-6的pH控制剂和余量的水。
在进一步的实施方案中，本发明基质层包含17.4-18.4wt％的纳米乳剂；8.1wt％聚丙烯酸钠盐、2.9wt％聚乙烯吡咯烷酮10和1.4wt％卡波普U20作为粘合剂或者8.1wt％聚丙烯酸钠盐、0.3wt％聚丙烯酸钠盐NP-700、2.9wt％聚乙烯吡咯烷酮10和1.4wt％卡波普HV-805EG作为粘合剂；0.4wt％氯化铝或者0.4wt％氨基乙酸二羟铝作为交联剂；5.8wt％甘油和13.9wt％D-山梨醇作为湿润剂；4.6wt％高岭土作为支架材料；0.2wt％酒石酸作为pH控制在5-6的pH控制剂和余量的水。在一个方面中，可包含在本发明的基质层中的纳米乳剂是本申请中所定义的纳米乳剂。本发明的包含基质层的经皮贴剂提供了递送中草药水性提取物和油性提取物的特别益处，显著提高了中草药(例如红花、续断、三七和大黄及其组合)活性成分的经皮透过率。上述衬层是为本发明的贴剂提供支持的惰性衬层。所述剥离层覆盖并保护所述基质层。
衬层可以是基于聚乙烯的膜或允许不同的层结合为单独网织物的基于聚酯的层压材料(laminate)。衬层的实例包括CoTran9720、CoTran9722、Scotchpak1109、Scotehpak9723、Scotchpak9730和Scotchpak9735。在本发明中优选的是不与所述基质层发生反应的基于聚酯的膜。
所述剥离层优选具有低的透湿性，并且与所述基质层相容，以保护所述基质层。
本发明经皮贴剂可通过以下工艺制备：将构成所述基质层的基质或基质网络均匀地涂在所述衬层上，在65-100℃下在烤箱中干燥6-24小时，优选在70-80℃下干燥10-16小时；冷却后，将剥离层置于所述基质层上以保护所述基质层，获得经皮贴剂。
本发明在一方面涉及如上文所述的中草药组合物、包含其的纳米乳剂或包含其的经皮贴剂(即包含含有所述中草药组合物的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物的水包油或油包水型纳米乳剂的经皮贴剂)在制备用于治疗创伤性损伤的药物中的用途。所述用途基于上文所述的本发明中草药组合物促进骨愈合的作用。
在一个实施方案中，所述创伤性损伤包括组织(例如软组织)损伤或骨损伤；例如创伤性肌肉骨骼损伤，诸如骨折。
优选局部施用所述中草药组合物和包含其的所述纳米乳剂。
基于本发明纳米乳剂促进药物活性成分的经皮扩散运输的效果，本发明所述中草药组合物的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物的水包油或油包水型纳米乳剂以及包含所述纳米乳剂的经皮贴剂在局部施用时，将促进所述提取物中药物活性成分的经皮扩散，可提高药物的生物利用率，从而进一步提高创伤性损伤的治疗效果。
以下将结合具体实施例对本发明进行详细的说明。然而，本领域技术人员了解，所述具体实施例仅为了更加清楚地解释本发明，无论如何都不应视为对本发明的任何限制。除非特别说明，所有试剂和设备均可商购获得并且所有含量均以重量计算。
实施例
实施例中所使用的四味中草药红花、续断、三七和大黄可根据中国药典2010版中推荐的方法，采用薄层色谱层析来鉴定。下文采用的红花、续断、三七和大黄均购自香港当地的中药供应商，且已经根据上述方法加以鉴定。
实施例1制备包含红花、续断、三七和大黄的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物的中草药组合物
准备四种草药原材料(红花、续断、三七和大黄的重量比为1∶1∶1∶1)共250克，切成小段，在1.0L蒸馏水中浸泡1小时。回流加热煮沸2次，每次2小时，收集水提取物，通过一片脱脂纱布过滤。残余物以95％乙醇进一步回流加热煮沸2小时。收集乙醇提取物并再次脱脂纱布过滤。水和乙醇的滤液分别在50℃下减压浓缩，然后在冷冻干燥系统(Freezone12，Labconco，Missouri，美国)中冻干成为粉末。
水提取物[CDNR(aq)]和乙醇提取物[CDNR(e)]的提取率分别为39.8％ w/w和5.0％w/w。
取19.5g CDNR(aq)和3.0g CDNR(e)与17ml50％乙醇混合制备用于局部施用的中草药糊剂。
实施例2包含红花、续断、三七和大黄的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物的中草药组合物对于促进骨愈合的效果
小鼠单核细胞/巨噬细胞RAW254.7和大鼠成骨细胞UMR-106均购自美国模式培养物保藏中心(ATCC，美国)。采用实施例1中制备的红花、续断、三七和大黄水性提取物(CDNR(aq))和油性提取物(CDNR(e))分别作为待测样品。
红花、续断、三七和大黄的油性溶剂提取物抑制LPS诱导的RAW254.7细胞中一氧化氮的产生
为了体外测定本发明中草药组合物的抗炎性(即脂多糖(LPS)诱导的一氧化氮抑制)，采用含有10％的胎牛血清(Life Technologies，USA)、100U/ml青霉素和100mg/L链霉素(Life Technologies，USA)的高糖DMEM(3500mg/L；购自Life Technologies，USA)培养基，在37℃、5％CＯ₂的细胞培养箱中培养小鼠RAW264.7巨噬细胞。培养期间定期传代。
根据溶解度性质的不同，分别采用上述DMEM培养基或DMSO水溶液(1％，v/v)溶解CDNR(aq)至0、50、100、200和400μg/mL，溶解CDNR(e)至0、25、50、100和200μg/mL；在此试验中，1％的DMSO水溶液对于细胞生长以及NO产生和检测均无影响。
以4×10⁶细胞/孔将RAW264.7细胞接种于24孔板中，培养至细胞贴壁后，分别采用不同浓度的CDNR(aq)和CDNR(e)处理培养细胞24h；每个处理浓度设置三个平行。之后各孔加入1μg/ml LPS，继续培养24h。收集上清，加入相同体积的Griess试剂，放置15min。540nm下测定各孔吸光度，根据吸光度计算一氧化氮的生成量。
如图1a和图1b所示，在LPS诱导的RAW264.7细胞中，CDNR(aq)没有影响一氧化氮产量(图1a)；相比之下，在LPS诱导的RAW264.7细胞中，与基准对照组(即0浓度组)相比，100μg/ml和200μg/ml的CDNR(e) 分别显著抑制一氧化氮产量的51％和77％(p＜0.05)(图1b)。因此，红花、续断、三七和大黄的油性溶剂提取物在抗炎方面具有强效作用。
采用上述方法，以实施例1制备的中草药糊剂测试水性提取物和油性提取物的混合物对于一氧化氮产量的抑制，得到类似的抑制结果。这表明水性提取物不影响油性溶剂提取物的抗炎效应。
红花、续断、三七和大黄的水性溶剂提取物促进UMR-106细胞的活力和增殖
采用含10％的胎牛血清(Life Technologies，USA)、100U/ml青霉素和100mg/L链霉素(Life Technologies，USA)的高糖DMEM(3500mg/L；Life Technologies，USA)培养基，在37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养大鼠骨肉瘤UMR-106细胞，培养期间定期传代。
根据溶解度性质的不同，分别采用培养基或DMSO(1％，v/v)溶解将待测药物(即CDNR(aq)和CDNR(e))分别溶解至0、6.25、12.5、25、50和100μg/mL的浓度。
待测药物对细胞增殖的影响采用BrdU-ELISA试剂盒(Roches，USA)进行测定。以1000细胞/孔将UMR-106细胞接种于96孔板中，培养至细胞贴壁后，分别采用不同浓度的待测药物与培养细胞共同孵育处理24h；每个处理浓度设置三个平行。之后每孔加入10μL的BrdU工作液(用5mg/ml的储存液以6μL/mL稀释而成)标记细胞，继续孵育2h。之后去上清并用洗涤缓冲液洗涤，加入抗-BrdU抗体，孵育120分钟。按照试剂盒所附说明书中的提供的步骤测定细胞增殖的结果。
不同浓度的待测药物对细胞增殖的作用采用给药组与空白溶剂对照组(即0浓度组)的细胞增殖结果的比值来表示(空白溶剂对照组的细胞增殖结果计为100％)。
如图2a和图2b所示，UMR-106成骨细胞经6.25-100μg/ml(p＜0.01)的CDNR(aq)处理24小时，可观察到显著的活力增强和增殖效果，二者分别从11％增长至20％(图2a)，以及从6％增长至22％(图2b)。然而，UMR-106成骨细胞在经CDNR(e)处理24小时后，活力和增殖并没有出现 显著提高，因此该CDNR(e)成分没有发挥作用。可见，红花、续断、三七和大黄的水性溶剂提取物在促进骨骼形成中具有强效的作用。
采用上述方法，以实施例1制备的中草药糊剂测试水性提取物和油性提取物的混合物对于UMR-106细胞的活力和增殖的作用，得到类似的促进结果。这表明油性提取物不影响水性溶剂提取物的促进骨骼形成的效应。
体内评估中草药组合物糊剂对促进骨愈合的效果
20只月龄为15.2±1.41(均值±标准差)的雌性Sprague-Dawley大鼠购自香港中文大学(CUHK)的实验动物服务中心。所有大鼠被饲养在温控(25℃)和光控(12小时白天/黑夜循环)环境中。
首先大鼠被肌注氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物(80mg/kg氯胺酮和8mg/kg甲苯噻嗪)麻醉。然后在左侧股骨上，用电钻在股骨的中段通过前-后的方式钻出相邻的两个双侧孔(每个孔直径为2mm)。用牙科铣钻将两个孔桥接成2mm×4mm的缺损。在右侧胫骨上，用电钻在近侧干骺端通过内-外的方式钻出直径为2.4mm的双侧骨缺损。所有的钻孔过程都经过0.9％无菌生理盐水灌注消毒，钻孔在切口闭合前以大量的盐水冲洗去除残留的骨碎片。
大鼠按每组10只分成两组。在对照组中，在大鼠的左侧股骨和右侧胫骨上覆盖不干胶薄膜而不做任何治疗；在中草药糊剂治疗组中，在大鼠的左侧股骨和右侧胫骨上局部施用0.5ml的实施例1中制备的糊剂，用不干胶薄膜覆盖所述糊精以防止其脱落和变干。整个治疗周期时间为6周，期间每2天更换所有的薄膜和糊剂。在第42天对大鼠实施安乐死。收集大鼠的左侧和右侧的大腿骨，去除多余的软组织但保留骨膜。使用Hounsfield材料测试仪(KM25，Redhill，英国)进行四点弯曲实验。装载最大2500N的负载单元，上部和下部支承件的跨度分别为8.0和20mm。将位于股骨中段的钻孔骨缺损放置于两个上支撑件的中间，然后以从后向前的方式5mm/min的恒定速度向样品施压直至断裂。记录加载屈服(load at yield)用于分析。将钻孔股骨(左)的所有数据都以正常股骨(右)进行归一化。其结果表示为以正常股骨为基准的归一化的比例。
如图3a-3f所示，本发明中草药糊剂组合物在骨愈合过程中显著促进了骨的生物力学特性。在钻孔的皮质股骨中，与对照组相比，经过42天治疗后，糊剂治疗组表现出增加15％的归一化的屈服强度和增加13％的屈服功(P＜0.05)(图3a和3b)。糊剂治疗组在极限强度(图3c和3d)和破坏强度(图3e和3f)上也显示了有益作用。四点弯曲实验表明，本发明的中草药组合物能够显著改善愈合中的钻孔骨缺损的生物力学性能(骨骼强度)。
根据上述结果，可见，包含红花、续断、三七和大黄的乙醇提取物的本发明中草药组合物能够显著抑制LPS诱导的一氧化氮产生，从而抑制炎症。“抗炎”是中医理论中治疗骨折的一个关键性治疗原则，它旨在控制和减轻骨折部位及周围软组织的肿胀和疼痛。另一方面，包含红花、续断、三七和大黄的水提取物的本发明中草药组合物能够显著促进UMR-106细胞的活力以及增殖，从而促进成骨细胞再生，而成骨细胞再生是骨修复过程的重要机制。这在骨折愈合修复阶段，当软骨内成骨发生并且造骨细胞开始在软骨愈伤组织形成新的层状骨时尤其有效。
上述体内试验的生物力学测试结果提供了局部施用本发明中草药组合物对促进骨愈合的有力证据。与对照相比，本发明中草药组合物所产生的更高的股骨抗弯曲能力表明，应用其的治疗能够在发生永久变形(可能由微骨折引起的)之前提高骨骼强度以承受更多压力。上述实验结果证明，本发明包含红花、续断、三七和大黄的水性溶剂提取物和油性溶剂的中草药组合物能够通过体外途径有效调控炎性和骨再生，且体内实验也证实了其在促进皮质骨修复方面的功效。直接施用所述本实施例的糊剂于骨折处的皮肤上时获得了类似的功效。
采用其它比例(即0.8∶1∶0.8∶1、1.2∶1.5∶1.2∶2和1∶1.5∶1∶2)的红花、续断、三七和大黄组合物的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物配制的中草药糊剂，其中水性溶剂提取物和油性溶剂提取物分别占中草药糊剂的重量百分比在30％∶3％至42％∶6％之间变化，包括35％∶4.3％至39.8％∶5％)，重复上述试验，获得类似的调控炎性和骨再生、促进皮质骨修复等显著的促进创伤性骨愈合和组织愈合的效果(数据未示出)。
毒性试验表明，本发明的红花、续断、三七和大黄中草药配方对生物体的毒性也大大降低(数据未示出)。
实施例3.1包含中草药水性提取物和油性提取物的水包油型纳米乳剂的制备
根据实施例1的方法分别制备获得中草药材料红花、续断、三七和大黄的水性提取物粉末和油性提取物粉末。
分别称取所获得的水性提取物粉末约1g、油性提取物粉末约4g、Capryol-90约1g和水约7g；混合均匀；超声处理以使得全部的提取物粉末充分溶解。室温下静置使得相分离；收集上层获得有机相，底层为水相。
取1.71g表面活性剂吐温20首先与12.73g水相混合，在磁力搅拌器下温和搅拌，混合均匀。之后与0.56g有机相混合，超声处理5min，获得预均化混合物。
采用机械均化器以24000rpm的旋转速度将所述预均化混合物均化20min，形成本发明的纳米乳剂。
经激光散射(90Plus/BI-MAS，布鲁克海文仪器公司(90Plus/BI-MAS，Brookhaven Instruments Corporation)，美国)测定，所形成的纳米乳液中所含油滴的平均直径为200nm，其含有3.8wt.％有机相、84.8wt.％水相以及11.4wt.％表面活性剂。
实施例3.2包含中草药水性提取物和油性提取物的水包油型纳米乳剂的制备
根据实施例3.1的方法获得分别包含红花、续断、三七和大黄的水性提取物和油性提取物的水相和油相。
将吐温20 3.48g首先与11.9g水相混合，在磁力搅拌器下温和搅拌，混合均匀。之后与0.62g有机相混合，超声处理5min，获得预均化混合物。
采用机械均化器以30000rpm的旋转速度将所述预均化混合物均化30min，形成本发明的纳米乳剂。
经激光散射测定，所形成的纳米乳液中所含油滴的平均直径为40nm，其含有3.9wt.％有机相、74.4wt.％水相以及21.7wt.％表面活性剂(吐温20)。
实施例4.1包含本发明纳米乳剂的经皮贴剂的制备。
混合7g聚丙烯酸钠盐、4g高岭土、0.35g氯化铝、5g甘油和12g D-山梨醇得到A相。将0.15g酒石酸加入15g水中获得0.1wt.％酒石酸溶液；然后将2.5g聚乙烯吡咯烷酮10溶解在该酒石酸溶液中得到B相。在磁力搅拌子的高速搅拌下将1.2g卡波普U20在24g水中溶胀，获得胶状液体，即C相。
首先将B相和C相混合，在1400rpm速度下搅拌3min，之后与A相混合。将获得的混合物溶液(即A相、B相和C相的混合物)通过0.5mm筛过滤，与15g的实施例3.1获得的纳米乳剂混合，在800rpm下搅拌10min，获得混合物，即用于形成基质层的基质。
所获得的基质含有8.1wt％聚丙烯酸钠盐、4.6wt％高岭土、0.4wt％氯化铝、5.8wt％甘油、13.9wt％D-山梨醇、0.2wt％酒石酸、2.9wt％聚乙烯吡咯烷酮10、1.4wt％卡波普U20、17.4wt％纳米乳剂和余量的水。
将所获得的基质以本领域任何适用的操作均匀地涂在Scotchpak9735衬层上，在75℃下烘烤12小时。冷却后，将Scotchpak1022剥离层放置在所获得的贴上，置于基质层上以保护该基质层，最终获得贴剂。
该贴剂的厚度为1.1mm，粘合附着力为0.33N。
实施例4.2包含本发明纳米乳剂的经皮贴剂的制备。
混合7g聚丙烯酸钠盐、0.25g聚丙烯酸钠盐NP-700、4g高岭土、0.35g氨基乙酸二羟铝和12g D-山梨醇得到A相。将0.15g酒石酸加入15g水中获得0.1wt.％酒石酸溶液；然后将2.5g聚乙烯吡咯烷酮10溶解在该酒石酸溶液中得到B相。在磁力搅拌子的高速搅拌下将1.2g卡波普HV-805EG在24g水中溶胀，获得胶状液体，即C相。
首先将B相和C相混合，在1400rpm速度下搅拌3min，之后与A相混合。将获得的混合物溶液(即A相、B相和C相的混合物)通过0.5mm筛过滤，与4.5g甘油和16g的实施例3.2获得的纳米乳剂混合，在800rpm 下搅拌10min，获得混合物，即用于形成基质层的基质。
所获得的基质含有8.1wt％聚丙烯酸钠盐、0.3wt％聚丙烯酸钠盐NP-700、4.6wt％高岭土、0.4wt％氨基乙酸二羟铝、13.8wt％D-山梨醇、0.2wt％酒石酸、2.9wt％聚乙烯吡咯烷酮10、1.4wt％卡波普HV-805EG、5.2wt％甘油、18.4wt％纳米乳剂和余量的水。
将所获得的基质以本领域任何适用的操作均匀地涂在Scotchpak9735衬层上，在75℃下烘烤12小时。冷却后，将Scotchpak1022剥离层放置在所获得的贴上，置于基质层上以保护该基质层，最终获得贴剂。
该贴剂的厚度为1.2mm，粘合附着力为0.62N。
实施例5本发明纳米乳剂促进药物活性成分的透皮吸收
使用垂直式的Franz扩散池(Hanson Research，美国)进行体外皮肤扩散研究。所述扩散池带有7mL的接收池，具有3.8cm²的扩散面积。将约1.1mm厚的猪皮肤样品切成4.5-5cm²的片，夹在扩散池的两个隔室之间，其中角质层面向供体隔室，真皮面向受体隔室。接收相由生理盐水溶液(0.9％NaCl)组成。在供体隔室中填充待测样品和相应的对照样品：待测样品采用上文实施例4.2制备的本发明包含含有中草药水性和油性提取物的纳米乳剂的透皮贴剂，其表面积被控制在约4cm²；对照样品采用上文实施例1中所制备的含有中草药水性和油性提取物的中草药糊剂。通过外部水循环器，将整个扩散池维持在37℃以模拟生物体的体温，并维持600rpm的搅拌。在第24h时，收集来自接收隔室和猪皮肤样品的样品，通过检测接收溶液(接收相)和猪皮肤内标记物的含量来分析待测和对照样品的透过性能。上述实验重复三次。
红花、续断、三七和大黄的代表性活性成分(即化学标记)列于下表：


采用HPLC-ESI-MS检测所透过的标记物及对照样品。使用Agilent1290Infinity LC系统(购自Aglient Technologies)，其配置真空除气机、二元液相泵、自动进样器、Aglient6410三重四级杆(Triple Quad)LC/MS，并与Agilent MassHunter计算机终端(Workstation)软件相连。使用Acquity UPLC HSS T31.8μm(2.1mm×150mm)柱，并使其保持在40℃的温度。
采用由水(A)和乙腈(B)组成的梯度流动相分离检测样品中的9个化学标记物。梯度条件为0-3min，10-27％B；3-5min，27-33％B；5-12min，33-33％B；12-13min，33-80％B；13-16min，80-90％B；16-20min，90-90％B。流速控制在0.5mL/min，注射体积为20uL。
MS分析利用配置有ESI源的Aglient6410三重四级杆LC/MS进行，其在负离子模式和多重反应监测模式下被监测，对于羟基红花黄色素(HYA)应用m/z611.2-＞325.0的目标离子；对于人参皂苷Rg1(Rg1)应用m/z799.5-＞637.4；对于川续断皂苷VI(ASP6)应用m/z927.5-＞603.3；对于人参皂苷Rb1(Rb1)应用m/z1107.6-＞119.0；对于山柰素(Kae)应用m/z285.0-＞117.0；对于大黄素(Emo)应用m/z269.0-＞241.0；对于大黄酸(Rhe)应用m/z283.0-＞239.0；对于齐墩果酸(OA)应用m/z455.3-＞407.4。
检测结果
以下表1显示了待测样品(纳米乳剂的透皮贴剂)和对照样品(中草药糊剂)透过皮肤扩散至接收池的标记物的重量百分比
表1.扩散至接收池的标记物的重量百分比

以下表2显示了待测样品(纳米乳剂的透皮贴剂)和对照样品(中草药糊剂)扩散至皮肤内或皮肤真皮侧的标记物的重量百分比
表2.标记物扩散至皮肤的重量百分比


分别根据表1和表2的结果绘制图4a和图4b；其中横坐标表示标记物，纵坐标表示利用中草药糊剂的透皮测试数据作为基数，计算获得的中草药糊剂和纳米乳剂/贴剂中标记物透皮扩散的提高率，从而方便地比较中草药糊剂和纳米乳剂/贴剂中标记物的扩散性能。
从图4a可见，在上述透过性试验中，齐墩果酸(OA)由于其低水溶性而没有在接收溶液中检测到。对于其他的七种标记，纳米贴剂中的羟基红花黄色素(HYA)的扩散性能被提高了8倍、人参皂苷Rg1 14倍、人参皂苷Rb1 472倍、川续断皂苷VI32倍、大黄素203倍、大黄酸21倍和山柰素11倍。采用单独的红花、续断、三七和大黄提取物进行透过性，获得类似的结果(数据未示出)。
通过测定保留在猪皮肤上的所有标记的扩散性能，从图4b可见，纳米贴剂中的HYA的扩散性能被提高了41倍、Rg1 21倍、Rb1 17倍、ASP6 33倍、Emo5倍、Rhe11倍、OA47倍和Kae12倍。采用单独的红花、续断、三七和大黄提取物进行透过性，获得类似的结果(数据未示出)。可见，与中草药糊剂相比，本发明的纳米乳剂以及包含其的贴剂广泛提高了药物活性成分的透皮扩散和吸收，并且对于某些活性成分，该提高特别显著。
进一步的实验表明，实施例4.2所制备的贴剂应用于皮肤时，促进红花、续断、三七和大黄的水性溶剂提取物和油性溶剂提取物的经皮吸收， 增强了对于骨折的治疗效果(数据未示出)。
如前所述，虽然本发明在此处描述了一个或多个实施例，本领域普通技术人员会理解，可以对本发明进行修改而不背离本发明的精神和实质。