两性固醇及其应用 【技术领域】
本发明涉及一种基于固醇骨架的两性化合物，环的3-位被一个或多个等电点在4和9之间的两性基团所取代，本发明还涉及包含此类化合物的脂质体。
背景技术
术语”脂质”概括了三类能从生物膜中分离出来的天然物质：磷脂、鞘脂和胆固醇，包括其衍生物。
这些物质在脂质体的制备中有着重要的技术意义。特别是，这类脂质体可用作药物制备中的活性物质的封装物(container)。在此类用途中，希望实现有效和稳定的封装以及包容物的可控释放。然而这两种要求难以同时实现：封装越稳定和紧密，其内部的活性物质释放就越困难。因此，人们已着手开发响应外界促进因素而改变其性质的脂质体。热敏性和pH-敏感性脂质体是公知的。PH-敏感性脂质体尤其重要，原因在于即使是在生理条件下，该参数也会发生改变，例如，脂质体被内吞接受于细胞内时，或经过胃肠道时都发生PH值的变化。依据现有技术，pH-敏感性脂质体特别包括胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS)。
胆固醇半琥珀酸酯与磷脂酰乙醇胺混合后可用于制造PH-敏感性脂质体(Tachibana et al.(1998)；BBRC 251，538-544，US 4,891,208)。此类脂质体通过细胞内吞作用进入细胞，并能延此路径将包容物分子运载至细胞内部，而不会损坏细胞膜的完整性。
CHEMS的阴离子特征使其具有很不利因素。由其制备的脂质体带全部负电荷，其被细胞吸收的效率则低。因此，无论上面描述的转运机理怎样，这些脂质体很难将大分子转运到细胞内。
现有技术WO 00/59474描述了具有膜支架，以及阳离子和阴离子为头基团(head group)地化合物，其中阴离子基团通过二硫桥连接到基本结构上。在生理条件下，例如，与细胞溶质接触，则该二硫桥可被还原，阴离子头基团就被释放出来，整个分子呈现出正电荷，因而能和细胞膜融合。由于二硫桥的断裂带来了游离的阳离子脂质，因而WO 00/59474所公开的化合物具有不利的毒性和储藏稳定性。这些化合物所具有的细胞毒作用是一大缺点。
【发明内容】
为了将活性物质运载到细胞内(转染)，本发明使用具有优选高的电荷量和恒定的表面电荷的阳离子脂质体。此类粒子的整体正电荷导致了粒子静电附着在细胞上，并随后被有效运载到细胞内。这些化合物和使用该化合物制造的脂质体的用途仅限于在体外(in vitro)或来自体内(ex vivo)的应用，原因在于此类正电性的脂质体导致与血清成分形成了缺少控制的聚集物。
本发明的目的在于制备新的化合物，
i)通过该化合物，活性物质能被封装入脂质体内，而改变pH值时，该活性物质能从脂质体中释放出来；
ii)该化合物的存在有利于实现两性脂质体的制备，在生理条件下，该两性脂质体能与血清混合而不发生聚集现象；以及
iii)通过该化合物能制备一类脂质体，该类脂质体可将被封装的活性物质运载到细胞内部。
本发明的另一个目的是找到一种易于制备所述化合物且造价低廉的方法，该化合物以较高的量结合到脂质体膜中。
本发明的目的是通过具有等电点在4.5到8.5之间的固醇衍生物来实现，该固醇衍生物为下列的通式化合物
两性物质—Y—间隔基—X—固醇
其中，Y和X代表连接基。
本发明的目的是通过使两性基团连接至固醇骨架的3-位上而实现。依据所采用的两性物质，得到的化合物在特定的pH值下改变其电荷，并以高得惊人的量结合到脂质体膜中。可采用普通的和廉价的胆固醇和其衍生物作为起始化合物。
位于两性物质和固醇骨架之间的分子片段是：—Y—间隔基—X。例如，间隔基为直链的低级烷基残基，其具有0到8个C原子，并包括2个乙烯基不饱和键。该间隔基可包括羟基以增强分子的极性。
在本发明的上下文中，将使用以下的简称：
CHEMS 胆固醇半琥珀酸酯
PC 磷脂酰胆碱
PE 磷脂酰乙醇胺
PS 磷脂酰丝氨酸
Hist-Chol 组氨酰胆固醇半琥珀酸酯
在生物双层膜的成膜或与膜结合的基团中，固醇特别重要，原因在于这些化合物可以低廉的价格获得，只涉及普通化学，并能以很高的量结合到膜中而没有增加膜的渗透性或甚至完全破坏膜特性。然而，采用一极性分子取代固醇的3-位对于保持后一特性是很重要的。
由于“两性物质”分子部分中同时存在阳离子和阴离子基团，使整个分子呈现出pH-依赖性的电荷特征。更明确地，两性物质的特征在于以下事实：电荷的总和在一特定的pH值下精确地为0。这点称之为等电点。在PI值以上，化合物具有一负电荷，而在PI值以下则被看作是正阳离子，本发明的化合物或固醇衍生物的PI值的范围在4.5到8.5之间。
在介质特定的pH值下分子的整体电荷可由下式计算而得：
z＝∑ni.((qi-1)+(10(pK-pH)/(1+10(pK-pH))))
qi：低于其pK值的离子基团的绝对电荷(例如，羧基＝0，含单-氮的碱＝1(single-nitrogen base＝1)
ni：分子中此类基团的数目
例如，本发明的一种化合物由组氨酸的氨基和胆固醇半琥珀酸酯连接得到。在pH为7的中性条件下，产物具有负电荷，原因在于其中的羧基官能团为完全离解的形式，而咪唑官能团则只具有较低的电荷。而当酸性pH值为约4时，情况刚好相反：羧基官能团所载的电荷大量地失去，而咪唑基则完全被质子化，使得分子的整体电荷呈正电荷。
在本发明的一种优选实施方式中，固醇衍生物的等电点为5到7之间。
在本发明的另一种优选实施方式中，两性物质具有一个或多个pK值为4到8之间的阳离子，并且，同时还具有pKa值在3到7之间的一个或多个阴离子。参照上述公式对官能团类型和数目进行优选。
特别是，采用官能团或分子片断作为电荷载体是非常方便的，该电荷载体在pH为4到9之间为离解形式。例如，电荷载体包括磷酸基，磺酸基或其它强阴离子。然而，除上述的情况之外，电荷载体也可包括伯氨、仲氨或叔氨基团，还包括季铵盐、脒鎓盐、吡啶盐和胍基基团。
可通过上述可变电荷对固定电荷进行过渡代偿，例如使用过量的可变电荷。使用完全离解基团的一个优点在于它们的强极性。从该类基团优选出的结构片断有磺酸，磷酸，伯氨、仲氨或叔氨，铵盐化合物，胍盐化合物，脒鎓盐化合物或吡啶盐化合物，它们通过一个上述的间隔基或连接基连接到分子上。
在一个特别优选的方式中，两性物质可为完整结构部分的形式，例如，邻—，间—，对—氨基苯甲酸，咪唑羧酸，咪唑乙酰乙酸，以及烟酸或吡啶甲酸。特别是，两性物质还可以包括两个电荷载体，这两个电荷载体在上述4到9之间的pH值范围内都会改变自身电荷。同时发生的阴离子电荷丢失和阳离子电荷的获得导致了分子整个电荷的变化。
在本发明的另一种优选实施方式中，阳离子包括咪唑，哌嗪，吗啉，嘌呤和/或嘧啶。其它具有此类性质的优选阳离子基本上包括了所有其它的含氮碱。特别当氮基存在于环系统中时，存在优选的位置异构体，其中连接的间隔基取代在有机阳离子的不同位置上。有机阳离子的pKa值容易受到所述位置异构的影响。相关的基本规则是本领域的技术人员所公知的。作为一种选择，这些影响可通过列表汇编估算出来(Handbook ofChemistry and Physics，Vol.73，pp.8-37ff)。有利的连接得到了两性分子的有机阳离子，例如从以下种类的物质中衍生而得：
邻—，间—，对—苯胺；2-，3-或4-取代的甲氧基苯胺，甲苯胺或乙氧基苯胺；2-，3-，5-，6-，7-或8-取代的苯并咪唑，2-，3-，4-或5-取代的咪唑，1-或5-取代的异喹啉，2-，3-或4-取代的吗啉，2-，3-或4-取代的皮考啉(甲基吡啶)，1-，2-或3-取代的哌嗪，2-，5-或6-修饰的蝶呤，3-，4-，5-，6-或9-取代的嘌呤，2-或3-取代的吡嗪，3-或4-取代的哒嗪，2-，3-或4-修饰的吡啶，2-，4-，5-或6-取代的嘧啶，1-，2-，3-，4-，5-，6-或8-取代的喹啉，2-，4-或5-取代的噻唑，2-，4-或6-取代的三嗪，或酪氨酸衍生物。特别优选的是上述的哌嗪，咪唑和吗啉，嘌呤或嘧啶。非常优选的分子片断如生物系统中出现的，即例如：4-咪唑(组胺，组氨酸本身)，2-，6-或9-嘌呤(腺嘌呤，鸟嘌呤，腺苷或鸟苷)，1-，2-或4-嘧啶(尿嘧啶，胸腺嘧啶，胞嘧啶，尿苷，腺苷，胞苷)，或吡啶-3-羧酸。上述的结构片断也可以具有另外的取代基，例如，甲基，乙基，丙基或异丙基残基，更优选为包括一到二个羟基的羟基化形式，且可为环系上的羟基或酮官能团。
例如，具有优选pKa值的含氮碱也可通过氮原子与低级烷羟基例如羟甲基或羟乙基的一次或多次取代而形成。此类适宜的有机碱有，例如氨基丙二醇，三乙醇胺，三(羟甲基)甲基氨，二(羟甲基)甲基氨，三(羟乙基)甲基氨，二(羟乙基)甲基氨，或相应的取代乙基氨。
在另一个优选的实施方式中，阴离子电荷载体为羧基基团。任何羧酸自然都可用作电荷载体，特别是那些具有最多8个C原子以及0，1或2个乙烯基不饱和键的脂肪族直链或支链羧酸。化合物中的典型成分为羧基本身，乙酸，溴乙酸，氯乙酸，乙酰乙酸，丙酸，丙烯酸，丁酸，丁烯酸，或与脂肪族链相连接的更高级的羧酸，二羧酸例如草酸，丙二酸，琥珀酸，马来酸，富马酸，苹果酸，酒石酸，戊二酸，己二酸，辛酸，庚二酸，辛二酸，环己烷二羧酸或环戊烷二羧酸，它们被单—酯化或酰胺化或与脂肪族链相连接，低级羧酸(oligocarboxylic acids)如柠檬酸，异柠檬酸或，乙二氨四乙酸，它们被单—酯化或酰胺化或与脂肪族链相连接。
其它优选的化合物的成分为乙醇酸，乳酸，羟基丁酸，苹果酸，酒石酸，天门冬氨酸，或谷氨酸，丙氨酸，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，天冬酰胺酸，谷氨酰胺，脯氨酸，酪氨酸，或半胱氨酸，或其它氨基酸或通过—杂原子连接到侧链上的羟基酸。
具有合适性质的羧酸也能作为芳香族的取代基，例如，苯甲酸，对甲氧基苯甲酸，邻—，间—或对—羟基苯甲酸，二羟基苯甲酸，没食子酸，肉桂酸，苯乙酸，马尿酸，邻苯二甲酸，对苯二甲酸，2-，3-或4-吡啶羧酸，呋喃羧酸。其它阴离子基团为易解离的羟基或硫醇基，例如其存在于抗坏血酸，N-取代四氧嘧啶，N-取代巴比妥酸、佛罗那，苯酚中，或者硫醇基团(or as a thiol group)。
在本发明的一种优选实施方式中，两性物质为包括1至10个氨基酸的肽。在另一种实施方式中，氨基酸如组氨酸，精氨酸，赖氨酸，谷氨酸或天门冬氨酸以一种特别的优选方式用于形成两性物质，并决定了该两性物质的电荷特性。其它优选的氨基酸为甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，谷氨酰胺，天门冬酰胺，还有半胱氨酸，其有利于增加极性并因此提高两性物质的溶解性。
在本发明的一种优选实施方式中，固醇为胆固醇，谷甾醇，菜油固醇，链甾醇，岩藻甾醇，22-酮甾醇(ketosterol)，20-羟甾醇(hydroxysterol)，豆甾醇，22-羟基-胆固醇，25-羟基胆固醇，羊毛甾醇，7-脱氢胆固醇，二氢胆固醇，19-羟基-胆固醇，5α-胆甾基-7-烯-3β-醇，7-羟基胆固醇，表胆固醇，麦角甾醇，和/或脱氢麦角甾醇，以及其它相关的化合物。使用固醇作为起始物质的优点在于可在3-位上带有各种不同的基团，这些基团能够容易和稳定的进行连接或任选承担间隔基的功能。特别合适于直接连接的是天然存在的羟基，以及固醇氯化物中的氯，或者是固醇胺(sterolamine)中的氨基，或者是硫代固醇(thiocholesterol)中的硫醇基。
在本发明的一种优选实施方式中，连接基X包括结构-(C＝O)-O-；-(C＝O)-NH-；-NH-(C＝O)-O-；-(C＝O)-S-；-O-；-NH-；-S-；或-CH＝N-。优选地，连接基Y的结构可与X相对应，并还可包括结构-O-(O＝C)-；-S-(O＝C)-；-NH-(O＝C)-；-O-(O＝C)-NH-或-N＝CH-。例如，在两性物质可直接与固醇骨架连接时，Y基团可被省略，如在咪唑-4，5-二羧酸和胆固醇酯化的情况下。
在本发明的一种优选实施方式下，间隔基为直链，支链或环状结构的低级烷基残基，其具有0到8个碳原子且包括0，1或2个乙烯基不饱和键。间隔基可具有羟基基团，以增加分子的极性。特别地，间隔基可为糖，并优选为可包括至多20个单体单元的聚乙二醇。
实现此类连接反应的方法为本领域技术人员所公知，并可根据起始物质和所使用的连接成分而有所不同。典型的反应为酯化，酰胺化，在双键上加入氨基，醚化，或者是还原性氨化反应。
特别优选的分子可通过以下方法获得：通过对胆固醇半琥珀酸酯的酰胺化反应，或通过从胆固醇氯甲酸酯形成氨甲酰基，以及通过和胆固醇的直接酯化反应。特别优选的两性物质包括，例如表1中的以下化合物，其中R1或R2代表两性固醇中的亲脂性部分，且( )n代表上述间隔基意义下的分子中的其它部分。
表1
本发明还涉及脂质体，其包括本发明的固醇衍生物。本发明的化合物可以较高的量结合到脂质体膜中，使得只有在介质的pH值降至两性物质的等电点以下时，整个粒子才表现出正电性。包括本发明组分的脂质体可在合适的条件下以聚合物涂覆，表面可能会沉积此类物质的单一或多重沉积物。在多重沉积物中，任选在交联剂的存在下，脂质体纳米胶囊可由WO 00/28972或WO 01/64330中描述的方法形成。使用此处所描述物质的一个优点在于可中断与聚合电解质的静电作用。正如公知的，聚电介质和脂质体膜的电荷载体之间的相互作用导致膜中各成分的分开，并使类脂聚集群形成。在许多情况下，这种分开伴随着脂质体的通透化作用。本发明的物质能够消除涂覆过程后的这种相互作用。此时增大pH值时，脂质体将只以空间排列(steric)的形式被包入纳米胶囊中，膜与聚电介质之间的相互作用将不再存在。通过这种方法，可避免类脂聚集群的形成和与此相关的膜通透化作用。
我们惊奇地发现，在物质的等电点以下，膜中包括有本发明物质的脂质体很容易和其它膜，特别是细胞膜融合。一般来说，这一步骤要求膜中存在大量的PE。在形成六方相的(hexagonal phases)趋势下，所述的PE承担辅助脂质(helper lipid)的功能。然而，此类膜的低稳定性是不利的，常常观察到被封装的活性物质逐渐被释放出来。
采用本发明的物质制备得到的脂质体在不存在辅助脂质的条件下能够有效融合。因此，当使用本发明的物质时，制备能稳定封装活性物质，而在低pH值条件下能和细胞膜融合以释放出活性物质的脂质体成为可能。
两种性质的结合对于将所运载的分子并入细胞内是一个重要的条件。在脂质体和细胞包膜或成分的融合过程中，两者的水性部分合并，且并未产生对介质的膜结构开口。因此避免了难以控制的其它物质的流入或流出。
在本发明的一种优选实施方式中，固醇衍生物的量最多为50mol％，特别优选包括至少2mol％，但至多50mol％的固醇衍生物的组合物。也优选包括至少10mol％，但至多40mol％的固醇衍生物的组合物。包含本发明物质的脂质体的制备可根据本领域技术人员公知的技术进行。
在本发明的另一种实施方式中，脂质体包括磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，二酰甘油，四醚脂，和/或PEG脂。胆固醇本身不能形成脂质体，因此，进一步加入类脂是有利的。类脂可为任何磷脂。显然，类脂也可为神经酰胺或鞘脂。通过聚乙二醇可方便地改变类脂的极性部分。
在本发明的一种优选实施方式中，脂质体的平均大小在50到1000nm之间，优选在50到300nm之间，更优选在60到130nm之间。
便利地，活性物质被封装在脂质体之中，该活性物质可用于治疗癌症或治疗严重感染。为此，脂质体分散剂可以被注射、灌注或植入。然后，它们分散于血液或淋巴中，或者作为储库可控地释放活性物质。后者可通过凝胶形式的高浓度分散剂实现。脂质体也可以在皮肤上局部施用。特别地，它们有利于提高各种活性物质进入皮肤，甚至是通过皮肤进入体内的渗透性。进一步地，脂质体也可以用于基因的转运。由于大小和电荷的影响，遗传物质在没有酸存在的情况下通常不能进入细胞。因而，需要有合适的载体例如脂质体或类脂复合物，它们与DNA一起被各个细胞以有效的和可良好控制的方式吸收。最后，使用了细胞固有的运载机制例如细胞内吞作用。显然，本发明的脂质体可用作膜模型。脂质体和细胞膜的基本结构高度相象。因此，脂质体可用膜模型以量化活性物质通过膜的渗透率，或量化结合活性物质的膜。更优选的是，活性物质为蛋白质，肽，DNA，RNA，反义核苷酸和/或诱饵核苷酸(decoynucleotide)。
在本发明的另一种实施方式中，至少80％的活性物质被封入脂质体中。如有必要的话，通过简单地增加pH值，可除去粘在外表上的未封入的分子。当未结合的分子会引起脂质体的聚集时，实施该步骤是必要的。当使用本发明的成分时，一个优点在于只在实际封装期间，才会处于与脂质体层发生相互作用的情况，此时必定使封入的活性物质得到维持。一旦脂质体层自身保持封闭状态，则可能会改变成其它情况，因此能减少可能发生的活性物质失活，特别是蛋白质失活。
本发明还涉及以脂质体装载活性物质的方法，采用一结合pH值用于封装，而使用第二pH值除去未结合的活性物质。
进一步地，本发明涉及以脂质体装载活性物质的方法，其中脂质体在一特定的pH值下具有渗透性，而随后被密封起来。特别是，优选以可良好控制的方式改变渗透性，从而实现活性物质装载到脂质体中。为此，在高渗透性的条件下，在介质中加入将被封装的活性物质，然后调节到低渗透性的情况。通过这种方式，使得活性物质保留在脂质体内。然后，如果必要的话，可除去未封入的活性物质。可在脂质体上或脂质体的纳米胶囊上诱导产生这种渗透性变化。
本发明还涉及脂质体在诊断学中和在释放系统中的应用。显然，脂质体也可用于检测系统中。特别是，脂质体中可载入金属离子，通过形成鳌合物增强了该金属离子的荧光，例如铽或铕离子。此类用途的脂质体当然包括决定特异性的成分，如抗体、外源凝集素、选择素、受体或荷尔蒙或RNA适配子(aptamers)。在本发明应用的一个特别优选的方式中，这些金属离子的存在被限制在脂质体的体积范围内，从而避免粘在外表的缓释金属离子带来的非特异性信号。脂质体应用于纳米胶囊生产中也是非常方便的。脂质体有个有利条件是用于诊断学上的释放系统中。用于运载和/或释放活性物质也是很方便的。优选地，脂质体可用作储库制剂和/或循环性储库(circulative depot)。使用脂质体作为体内(invivo)、体外(in vitro)和/或来自于体内(ex vivo)的细胞转染的载体也是有利的。例如，脂质体可用于静脉内和/或腹膜内给药。
本发明的固醇衍生物和脂质体具有几个优点。令人惊奇的是，发明的脂质体的渗透性取决于pH值，且因此取决于固醇衍生物的电荷状态。当使用Hist-Chol时，例如，包括磷脂酰乙醇胺的脂质体在pH值为5-6的情况下是可渗透的，因此被包裹的活性物质或标记物将在几分钟至几个小时内释放出来。然而在其它pH值范围内，这些膜本身是稳定的，表现出低的初始渗透性。采用本发明结构的脂质体因此特别适合于构建释放系统，其中活性物质的释放取决于介质的pH值。令人惊奇的是，还发现了大量的上述蛋白质或DNA通常可被封入其膜内具有固醇衍生物的脂质体中。这种封入的效率取决于所使用溶液的pH值。因此，在脂质体内有效封装蛋白质或DNA的方法可通过开始时调节pH值，使被运载的分子能很好地结合到脂质层上来实现。对作为聚阴离子的DNA，采用4到5的低pH值。对于蛋白质，采用的pH值取决于蛋白质的等电点，应低于本发明物质的等电点。特别有效的是，在介质的pH选择在蛋白质的等电点和固醇等电点之间时进行封装。此时蛋白质具有负电荷而脂质层具有正电荷。
令人惊奇的是，已发现膜内具有例如Hist-Chol的物质的脂质体能鳌合金属离子。这一性质使得脂质体的正电荷增加。在中性pH值的条件下，这种作用特别突出，原因在于这种情况下化合物的固有电荷特别低。由于具有鳌合性质，此类脂质体可用于生化诊断和药物治疗中。
为实验和治疗目的使用脂质体的一个基本前提是脂质体与细胞和组织的兼容性。许多公知的用于在细胞内结合DNA或蛋白质的化合物都具有细胞毒性(例如，阳离子脂质DOTAP)。令人惊奇的是，已发现本发明的一些化合物表现出减弱的细胞毒性，特别是应用其中两性物质为氨基酸或肽的化合物。这些化合物因此满足了转染系统的这一前提条件。
构建将基因或蛋白质运载到细胞内的载体的另一前提条件是它们与血清或血液的相容性。由于强阳离子电性，目前公知的载体形成了无法控制的大型聚集物，导致了在有机体内形成血栓症。因此在实践中将目前公知的载体运用于体内是不可能的，只能用于体外(in vitro)或来自体内(ex vivo)的情况下。令人惊奇的是，已发现用本发明的成分构建的脂质体在血清或血液中不会形成任何聚集物，特别是等电点低于7.5的脂质体。
构建用于蛋白或基因转移的载体的另一前提条件是它们在生理条件下的稳定性。当应用于血液循环中时，脂质体遭到补体系统中成分的攻击并很快分解。反应在几分钟内进行完毕。结果，在膜内形成了孔，而使大分子例如蛋白质通过膜上的孔扩散出来。目前，只有通过将胆固醇结合到脂质层中，才可能实现与此机理相关的脂质体的稳定性。当该类脂质体特别稳定时，它们不再与细胞发生相互作用，也不易于释放活性物质。令人惊奇的是，已发现用本发明的成分构建的脂质体能在血清或血液中稳定存在数小时。即使是在此条件下，活性物质的释放仍很低。运载活性物质的脂质体载体必须满足至少三个条件：具有低毒性，稳固并稳定地封装活性物质，且和血清或血液相容。
有利的是，用本发明中选出的物质所制造的脂质体能满足以上三个条件。因此这些脂质体特别适合应用于治疗中。支持此类用途的其它性质为装载活性物质的良好能力以及通过改变pH值或通过使膜可渗透化而进行可良好控制的释放。用本发明的物质制备的脂质体表现出与细胞表面的低的非特异性结合。这种低的非特异性结合性质是使其与靶细胞的特异性结合的必要前提条件。当向上述的脂质体提供附加的配体时，可对载体进行靶向控制。因此，活性物质可在这样的病理性细胞或组织内得到特定的积累。
本发明物质的一个重要应用在于构建于存活有机体内转运活性物质的载体。该载体特别适合于运载治疗性大分子例如蛋白质或DNA等自身不能穿过细胞膜或者在血流中快速降解的物质。
本发明将参照以下的实施例对本发明展开更详细的、非限定性的说明。
【具体实施方式】
实施例1
胆固醇基-L-组氨酰琥珀酸酯(Hist-Chol)的合成
步骤I胆固醇半琥珀酸酯的活化：
在100ml烧瓶中加入二环己基碳二亚胺(11.3mmol；2.3g)和40ml的THF，冷却至-10℃后，加入胆固醇半琥珀酸酯(10.3mmol，5g)和N-羟基琥珀酰亚胺(11.3mmol，1.3g)。混合物在室温下(RT)下融解并搅拌5小时。然后，除去形成的沉淀物(脲)，浓缩滤液，残留物在乙酸乙酯中重结晶，得到无色针状晶体，m.p.：145-146℃，93％。
步骤II胆固醇基-L-组氨酰琥珀酸酯：在40mlDMF中加入活化的酯(5.1mmol，3g，步骤I)。于10ml水中溶解碳酸氢钠(7.6mmol，0.6g)和组氨酸(7.6mmol，1.2g)。将该溶液缓慢滴加到DMF悬浮液中，搅拌20个小时，然后用2N盐酸调节pH值到4-5之间。浓缩反应混合物至干，热乙醇提取该产物，除去乙醇，得到纯产物，无色固体，78％。
实施例2
两性脂质体的制备
在4ml氯仿/甲醇(1∶1v/v)中溶解5mg Hist-Chol和9.8mg POPC，然后用旋转蒸发仪旋干。用4.3ml相应的缓冲液(10mM Kac，10mM HEPES，150mM NaCl，pH7.5)水化所得的脂质膜，使脂质浓度为5mM，超声处理5分钟。最后，冻结悬浮液，随后融化，然后进行多次过滤(AvestineLiposoFast，聚碳酸酯过滤器，孔径200nm)。下表2中列出了不同pH值下的zeta电位(mv)。
表2
pH值 0mM NaCl 100mM NaCl
4.0 +42 -20
5.0 +28 +2
6.0 -5 -6
7.0 -32 -15
8.0 -45 -25
实施例3
渗透性
采用与实施例2类似的方法制备组成为DMPE/Hist-Chol 60∶40mol％的脂质膜。用100mM 6-羧基荧光素(CF)，50mM NaCl，10mM HEPES，Ph8水化脂质膜，使脂质浓度达到25mM，通过凝胶过滤除去未封入的CF。为测定依赖于pH和时间的渗透性，在各个pH值的缓冲液中将脂质体稀释到0.2mM，分别在30和60分钟后测定荧光。然后，升温至37℃，在同样的时间间隔(30，60min)下进行测定。接着，温度升至60℃，再次在30和60分钟后分别测定。下面的表3概括了CF的释放百分比。在pH为6.5时，明显地观察到了渗透，该pH值非常接近Hist-Chol的等电点。而在该pH值之上或之下，膜令人惊讶地稳定。
表3
0min 30min 60min 30min 60min 30min 60min
(37℃) (37℃) (60℃) (60℃)
pH8.0 29％ 29％ 28％ 30％ 30％ 36％ 41％
pH7.0 32％ 36％ 46％ 39％ 44％ 52％ 60％
pH6.5 53％ 70％ 81％ 110％ 132％ 185％ 180％
pH6.0 29％ 25％ 26％ 26％ 27％ 30％ 33％
pH5.5 28％ 26％ 27％ 26％ 27％ 30％ 32％
pH5.0 39％ 41％ 43％ 52％ 61％ 98％ 115％
实施例4
DNA与两性脂质体的结合
为结合DNA，根据实施例2的方法在Kac10HEP10NaCl100，pH8的条件下制备脂质体，该脂质体包括POPC/Hist-Chol 60∶40(mol％)，并用该缓冲液稀释至0.2mM，用于测定。提供合适量的DNA(鲱鱼DNA，浓度为1mg/ml的标准水溶液)，并加入0.2mM脂质体(1ml)。快速搅拌混合物，15分钟后通过动力学光散射测定颗粒的大小及其zeta电位。对于合适选择量的DNA，颗粒的大小几乎保持不变。
在pH值为7到8之间时，含POPC/Hist-Chol为60∶40的脂质体具有负电荷，其大小和zeta电位保持不变，因此并未结合DNA。在pH值为4到5之间时，该脂质体具有强正电荷，DNA的结合导致了颗粒的电荷交换。在pH为6时，脂质体只具有弱电荷，而DNA的加入带来了强负电荷。为使电荷发生交换，必须加入相当多的DNA。下表4中列出了zeta电位和被吸收DNA的关联量。
表4
pH值 zeta电位 无/有 DNA的吸收量
DNA(mV) (μg/mg脂质)
4 41.3 -37.7 15
5 19.6 -44.7 15
6 -4.2 -36.7 40
7 -36.8 -35 --
8 -52.2 -52.9 --
正如可从结合特性所推知的，可通过增加pH值除去粘附在外表的未封入的DNA。
实施例5
在人血清中的稳定性
用实施例2的类似方法制备组成POPC/Hist-Chol为60∶40的脂质体，使其为5mM的悬浮液。对一系列的稀释液进行血清检测。在37℃下，将不同量的脂质体(50-250μl)用等体积的人血清(250μl)培养达5分钟(在每一例中加入150mM NaCl调节总体积至500μl)。为采用动力学光散射测定颗粒大小，以1∶9的比例用缓冲液(KAc10 Hep10 NaCl100；pH8)稀释混合物。数据列于下表。随着血清浓度的增加，所测定的颗粒大小越接近血清的大小。未观察到有大型聚集物(＞1μm)形成(表5)。
表5
样品 颗粒大小 多分散性
血清250μl+脂质体xμl (nm)
250 94 0.574
125 89 0.584
50 81 0.589
只存在血清 70 0.613
只存在脂质体 119 0.155
实施例6
血液中的药代动力学
在雄性Wistar大鼠尾静脉注射入500μl包含POPC/Chol和POPC/Hist-Chol的脂质体。
用2ml溶液(10mM HEPES，150mM NaCl，pH8，中含1mg 3H-旋覆花粉)水化各配方的脂质体膜(加入0.03mol％的14C-DPPC)，制备得到50mM的脂质体悬浮液。经过3个冷冻/融解周期之后，悬浮液通过400nm的膜(LiposoFast，Avestin)过滤数次。通过G-75 Sephadex凝胶柱过滤除去未封入的3H-旋覆花粉(inulin)，然后在CENTRIPREP(微孔过滤器)离心超滤器上进行浓缩。将0.5ml的每种配方的脂质体悬浮液对四个实验动物给药，在5分钟，15分钟，60分钟，3小时，12小时和24小时后分别取血样。50℃下，于1至3个小时内将50到100mg的血样溶解在1ml的SOLVABLE组织溶解器中(PACKARD)，然后用0.1-0.5ml，30％的过氧化氢溶液脱色。接下来，加入10ml的闪烁物，并测定3H和14C的活性。未观察到化合物的直接毒性。
血液中的消除半衰期：
POPC/Chol ＞120min
POPC/Hist-Chol ＞90min