用于流感病毒M2离子通道阻断剂筛选的稳定的细胞模型及其应用方法.pdf

本发明提供了一种用于流感病毒M2离子通道阻断剂筛选的稳定的细胞模型，该细胞模型是克隆了A型流感M2离子通道基因、B型流感M2离子通道基因或金刚烷胺耐药型M2离子通道基因的293Trex或CHO Trex细胞。同时，本发明还提供了利用该细胞模型筛选流感病毒M2离子通道阻断剂的方法。在上述细胞模型中通过四环素诱导表达M2离子通道蛋白，酸性条件处理后，测定M2离子通道蛋白表达细胞的细胞活力，筛选M2离子通道阻断剂。本发明提供的细胞模型稳定，利用该细胞模型建立的M2离子通道阻断剂筛选方法药物作用机制明确，方法简便、快速、直接，适合M2离子通道阻断剂的高通量准确筛选。

1、  一种用于流感病毒M2离子通道阻断剂筛选的稳定的细胞模型，其特征在于，该细胞模型是克隆了M2离子通道基因的哺乳动物细胞，所述的M2离子通道基因克隆于pCDNA4/TO表达质粒上。

2、  根据权利要求1所述的细胞模型，其特征在于：所述的M2离子通道基因包括A型流感M2离子通道基因、B型流感M2离子通道基因或金刚烷胺耐药型M2离子通道基因。

3、  根据权利要求1所述的细胞模型，其特征在于：所述的哺乳动物细胞为293Trex或CHO Trex细胞。

4、  权利要求1-3之一所述的细胞模型应用于流感病毒M2离子通道阻断剂的筛选方法，其特征在于：在所述细胞模型中诱导表达M2离子通道蛋白，酸性条件处理后，测定所述M2离子通道蛋白表达细胞的细胞活力，筛选M2离子通道阻断剂。

用于流感病毒M2离子通道阻断剂筛选的稳定的细胞模型及其应用方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及抗流感药物的筛选，更具体涉及流感病毒M2离子通道的稳定的细胞模型的建立及利用该细胞模型筛选M2离子通道阻断剂的方法。
背景技术
流感是由流行性感冒病毒引起的严重危害人类健康的一种急性病毒性呼吸道传染病。依据流感病毒抗原性的差异可分为A、B、C三型。A型常以流行的形式出现，B型常造成局部爆发，C型则多散发。三型流感病毒均可感染人类。
M2离子通道蛋白分布于流感病毒表面，是由97氨基酸组成的跨膜蛋白，四个M2离子通道蛋白单体通过二硫键形成一个离子通道，是抗流感药物的重要靶点。M2离子通道功能在病毒感染的早、晚期有重要的作用：在病毒感染早期，当(禽)流感病毒被细胞内吞后，M2离子通道打开，内涵体中的氢离子流入病毒颗粒中。病毒颗粒中pH值下降使M1蛋白容易与病毒核糖体蛋白分离，促使病毒脱颗粒。在病毒感染晚期，大量的M2蛋白表达、定位于细胞膜和细胞内的内质网、高尔基体中，是维持HA天然构象的关键。大量体内、外研究表明阻断M2离子通道的功能可以有效地抑制病毒在被感染细胞中的存活和复制，阻断病毒感染的扩散。目前临床上使用的金刚胺和金刚乙胺是M2离子通道阻断剂，在治疗流感中发挥了重要作用，但流感病毒对金刚胺和金刚乙胺产生了严重的抗药性。为了应对可能的金刚胺和金刚乙胺类药物抗药性病毒株的大疫情，迫切需要开发新一代M2离子通道阻断剂——对已有的抗药性病毒株都有效的药物。
从化合物库中随机筛选是发现新药物的重要途径，而建立药物筛选模型是发现新药物的关键。目前研究M2离子通道的方法主要通过在细胞中转染瞬时表达M2离子通道或合成M2蛋白在人工膜上进行，通过电生理(膜片钳)测定M2离子通道的活性。这种方法不稳定，操作复杂，技术要求高，特别是膜片钳还需要昂贵的仪器设备，不适合M2离子通道阻断剂的高通量筛选。为探索新的安全、有效的抗流感药物，为了进一步抗击耐药型流感病毒，急需建立M2离子通道阻断剂的高通量筛选方法。
发明内容
为了克服上述技术缺陷，本发明提供了一种用于流感病毒M2离子通道阻断剂筛选的稳定的细胞模型。同时，本发明还提供了利用该细胞模型筛选流感病毒M2离子通道阻断剂的方法。
本发明采用如下技术方案以实现该目的：
本发明的用于流感病毒M2离子通道阻断剂筛选的稳定的细胞模型是克隆了M2离子通道基因的哺乳动物细胞，M2离子通道基因克隆于pCDNA4/TO表达质粒上。
优选的，M2离子通道基因包括A型流感M2离子通道基因、B型流感M2离子通道基因或金刚烷胺耐药型M2离子通道基因。
优选的，哺乳动物细胞为293Trex或CHO Trex细胞。
本发明中所用的pCDNA4/TO表达质粒、293Trex和CHOTrex细胞均为Invitrogen公司的商业化产品。
上述细胞模型应用于流感病毒M2离子通道阻断剂的筛选方法为：在上述细胞模型中诱导表达M2离子通道蛋白，酸性条件处理后，测定M2离子通道蛋白表达细胞的细胞活力，筛选M2离子通道阻断剂。其中，诱导表达M2离子通道蛋白可以通过加入四环素进行。
本发明的有益效果是：M2离子通道的表达对细胞有损伤作用，因而无法构建持续稳定表达的细胞，而本发明提供的稳定细胞，其M2离子通道必须在四环素诱导的条件下才表达，这为M2稳定细胞的维持培养及M2离子通道的研究提供方便。M2离子通道蛋白在四环素诱导下表达，并在细胞膜上形成离子通道。在低于pH5.8的酸性环境中M2离子通道打开，细胞外的H+内流，导致细胞受损。如果存在M2离子通道阻断剂，在酸性环境中H+的内流收到抑制，细胞受损程度减轻。通过检测细胞活力，建立M2离子通道阻断剂筛选的方法。利用该细胞模型建立的M2离子通道阻断剂筛选方法药物作用机制明确，方法简便、快速、直接，适合M2离子通道阻断剂的高通量准确筛选。
附图说明
图1为A型流感病毒及金刚烷胺耐药型M2离子通道的表达Western Blot检测的一个优选实施例的实验结果图；
图2为B型流感病毒M2离子通道的表达Western Blot检测的一个优选实施例的实验结果图；
图3为A型流感病毒M2离子通道的电生理检测的一个优选实施例的实验结果图；
图4为酸性条件下诱导M2离子通道表达细胞死亡的一个优选实施例的实验结果图；
图5为本发明的细胞模型测得金刚烷胺的IC50值的一个优选实施例的实验结果图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例一：H5N1A型流感病毒M2及其耐药型M2离子通道基因的获得及M2离子通道稳定细胞的建立
1、H5N1流感病毒M2离子通道基因的获得及稳定细胞的建立：
为了使流感病毒M2离子通道的基因适合于在哺乳动物细胞中表达，对H5N1A型流感病毒M2及其耐药型M2离子通道基因进行人源化优化。H5N1A型流感病毒M2离子通道基因序列如下(GenBank：AY627887)：
ATG AGT CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG CCT ACC AGA AAC GAATGG GAG TGC AGA TGC AGC GAT TCA AGT GAT CCT ATT GTT GTT GCCGCA AAT ATC ATT GGG ATC TTG CAC TTG ATA TTG TGG ATT CTT GATCGT CTT TTC TTC AAA TGC ATT TAT CGT CGC CTT AAA TAC GGT TTGAAA AGA GGG CCT GCT ACG GCA GGG GTA CCT GAG TCT ATG AGGGAA GAG TAC CGG CAG GAA CAG CAG AGT GCT GTG GAT GTT GACGAT GGT CAT TTT GTC AAC ATA GAA TTG GAG TAA
合成的优化后的野生型H5M2基因序列为：ATG CT CT AC GAGGT GA AC CC ACC AG AA GA TGG GAG TGC AG TGCGA TC GA CC  GT GT GC GC  ATC ATT GG ATCTG CA TG AT TG TGG ATT CT GA  CT TTC TTC AA TGCAT TA G GCT AA TA GG TG AA AG GG CCT GCAC GC GG GT CCT GAG TC ATG AGG GA GAG TAC GG CAGGA CAG CAGT GCT GTG GAT GT GA GAT GG CA TTT GT AACAT GA TG GAG TAA(阴影部分为优化后的碱基)。耐药突变M2离子通道基因通过点突变完成(包括S31N，L26I的单位点突变，及S31N和L26I的双位点突变)。M2离子通道基因通过BamH I和Xba I酶切克隆于pcDNA4/TO质粒，该质粒在293Trex或CHO Trex细胞中需在四环素的诱导下才能表达目的基因。
采用Lipofectamine 2000(Invitrogene)将含M2离子通道基因的质粒载体及其空载体质粒分别转染293Trex细胞，48小时后将细胞按1:12传代并加入200μg/ml的博来霉素(Zeocin)进行克隆筛选。维持200μg/ml的博来霉素(Zeocin)培养3周，待单细胞克隆形成进行扩大培养鉴定。鉴定为表达M2离子通道的细胞扩大培养，冻存。细胞在37℃，5％的CO₂下培养，培养基为含10％胎牛血清DMEM。
2、稳定细胞Western blot鉴定：
结果表明H5N1的M2离子通道在细胞中的表达以四聚体、二聚体、单体形式存在，结果见图1。图中a，b，c，d分别为四环素诱导表达的野生型M2、耐药型突变体S31N、双突变S31N-L26I、突变体L26I，e，f，g，h为相应的未诱导表达的细胞株。而B型流感病毒的M2离子通道在293Trex细胞中以二聚体和单体的形式存在，由于存在修饰，单体中出现多条蛋白带，结果见图2。
3、H5N1流感病毒野生型及耐药型M2离子通道活性的电生理鉴定：
结果表明，H5N1流感病毒野生型及耐药型M2离子通道在293Trex细胞中表达均具有H+离子通道活性。而且，金刚烷胺能阻断野生型M2离子通道活性，不能阻断耐药型M2离子通道活性。结果见图3，图中A、B、C、D分别为野生型M2、耐药型突变体L26I、突变体S31N、双突变S31N-L26I。耐药型突变体L26I M2离子通道的电流比其他的三个小。图中E是金刚烷胺抑制野生型M2离子通道的剂量反应曲线。
4、酸性缓冲液诱导M2离子通道表达细胞死亡
结果表明，在pH低于5.8的缓冲液中M2离子通道打开，大量H+离子通过M2离子通道流入细胞，导致细胞死亡。金刚烷胺只能阻断野生型M2离子通道，因而抑制酸性缓冲液诱导野生型M2离子通道表达细胞的死亡，而不能抑制耐药型M2离子通道表达细胞的死亡。图4显示野生型M2表达细胞和不表达细胞在pH5.4的PBS处理3小时后的光镜图像，结果表明10μmol/L的金刚烷胺就能抑制野生型M2离子通道表达细胞的死亡。对照是M2表达细胞在完全培养基中的图片。因此可以通过测定M2离子通道表达细胞的死亡来反映化合物的阻断活性，从而该模型可以用于阻断剂化合物的筛选。
实施例二：M2离子通道阻断剂筛选方法
将生长状态良好的稳定表达M2(野生型M2和耐药突变型M2)蛋白的293Trex
细胞和pCDNA4/TO空载体稳定细胞按每孔1 X 10⁴接种96孔板，用1μg/ml的四环素诱导，对照孔不诱导。做化合物对细胞的毒性作用研究时不诱导。初筛时一般做两个复孔，设四个浓度梯度。复筛和测定化合物的IC50时根据需要增加复孔数和浓度梯度数。
配制不同浓度的抑制剂化合物：用pH5.4或7.4的PBS配制。
化合物筛选：将孔中的培养基吸尽去掉，加入50μl的PBS(含化合物，pH5.4或7.4；不含化合物的PBS作为对照；金刚烷胺或金刚乙胺作为阳性对照)，处理3小时，37℃，5％CO₂孵育。
补充完全培养基50μl/孔，37℃，5％CO2孵育24小时。
细胞活力测定：补充完全培养基24小时后，加入细胞活力检测试剂，测定细胞活力。常用细胞活力检测试剂如非放射性细胞增殖检测(MTT)(Promega)，XTT(Roche)，细胞计数试剂盒(CCK-8)(Dojindo)，CELL-TiterGLO(Promega)。最后进行数据分析。图5是通过该方法测得的金刚烷胺阻断野生型M2离子通道的IC50值，结果为6.37μmol/L，与文献报道的结果一致，表明该模型可以用于M2离子通道阻断剂的筛选。
由于各实验室条件不同，药物筛选时最好确定本实验室的最佳实验条件：如确定M2离子通道最佳的诱导表达时间，最佳的接种细胞浓度，酸性缓冲液处理时间，酸性缓冲液处理后的最佳培养时间等。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。