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1、10申请公布号CN104034798A43申请公布日20140910CN104034798A21申请号201310072595722申请日20130307G01N29/036200601H03H9/2520060171申请人浙江工商大学地址310035浙江省杭州市下沙高教园区学正街18号72发明人惠国华姜燕曾小燕74专利代理机构杭州裕阳专利事务所普通合伙33221代理人应圣义54发明名称细胞悬液浓度检测系统及其检测方法57摘要本发明提供一种细胞悬液浓度检测系统及其检测方法。细胞悬液浓度检测系统包括细胞悬液浓度传感器、负载电路、电源、频率计数器和处理单元。细胞悬液浓度传感器包括金属外壳、声表面波。
2、谐振器和丝网印刷碳电极。声表面波谐振器真空封装于金属外壳中，声表面波谐振器采用ST切型石英作为压电基底材料，通过光刻工艺制备，发出的声表面波频率为433MHZ。负载电路与细胞悬液浓度传感器相串联。电源电性连接负载电路以提供稳定电压的直流电。频率计数器电性连接负载电路。处理单元电性连接频率计数器以获得检测结果。本发明的细胞悬液浓度的检测系统及其检测方法具有较高的灵敏度和稳定性，操作简单，能够实现待测细胞悬液浓度的实时、快速检测。51INTCL权利要求书2页说明书6页附图8页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页附图8页10申请公布号CN104034798ACN1。
3、04034798A1/2页21一种细胞悬液浓度的检测系统，其特征在于，包括细胞悬液浓度传感器，包括金属外壳；声表面波谐振器，真空封装于所述金属外壳中，所述声表面波谐振器采用ST切型石英作为压电基底材料，通过光刻工艺制备，发出的声表面波频率为433MHZ；丝网印刷碳电极，与所述声表面波谐振器相串联；负载电路，与所述细胞悬液浓度传感器相串联；电源，电性连接所述负载电路以提供稳定电压的直流电；频率计数器，电性连接所述负载电路；处理单元，电性连接所述频率计数器以获得检测结果。2根据权利要求1所述的细胞悬液浓度的检测系统，其特征在于，所述声表面波谐振器包括压电基片，为ST切型石英；叉指换能器，刻蚀于所述。
4、压电基片，叉指换能器发出433MHZ的中心频率，周期节长度M72M，叉指宽度A19M，叉指间距B17M，指条对数N100，声孔径W720M，叉指指条的铝条厚度H200NM；两个反射栅，分别刻蚀于所述叉指换能器的两侧，每侧的反射栅指条数目NREF200，两侧的反射栅与叉指换能器之间的距离S90M；两个吸声件，分别设置于所述两个反射栅远离所述叉指换能器的一侧。3一种利用如权利要求1所述的检测系统检测细胞悬液浓度的方法，其特征在于，包括启动检测系统进行检测，声表面波谐振器发出433MHZ的声表面波，一段检测时间后，得出丝网印刷碳电极在空白状态下的时间频率曲线，确定空白频率，建立平衡点；取待测细胞悬液。
5、滴涂于丝网印刷电极表面，启动检测系统进行检测，经过相同的检测时间，扣除空白频率后，处理单元得出丝网印刷碳电极在待测细胞悬液的湿润下的时间频率曲线，确定待测细胞悬液的检测频率；处理单元中存有预设的待测细胞悬液浓度与声表面波频率的关系，根据检测频率在细胞悬液浓度与声表面波频率的关系中找出对应的待测细胞悬液的浓度。4根据权利要求3所述的检测细胞悬液浓度的方法，其特征在于，处理单元中存有预设的待测细胞悬液浓度与声表面波频率的关系这一步骤包括准备1105细胞/ML、125105细胞/ML、25105细胞/ML、5105细胞/ML和1106细胞/ML浓度的与待测细胞种类相同的细胞悬液；将上述这些不同浓度的。
6、细胞悬液100L分别滴涂于丝网印刷电极表面，启动检测系统分别进行检测，经过相同的检测时间，扣除空白频率后，处理单元得出丝网印刷碳电极在不同浓度的细胞悬液的湿润下的时间频率曲线，确定不同浓度的细胞悬液对应的声表面波频率；以细胞悬液的浓度为横坐标，对应的声表面波频率为纵坐标，处理单元绘制细胞悬液浓度声表面波频率曲线。5根据权利要求4所述的检测细胞悬液浓度的方法，其特征在于，准备1105细胞/权利要求书CN104034798A2/2页3ML、125105细胞/ML、25105细胞/ML、5105细胞/ML和1106细胞/ML浓度的与待测细胞种类相同的细胞悬液这一步骤包括采集原始待测细胞，细胞培养液采。
7、用向DMEM高糖培养基中加入质量浓度为10的胎牛血清FBS、质量浓度为2的L谷氨酰胺溶液和质量浓度为1双抗，然后用022微米的滤膜过滤除菌，分装备用，采用显微镜观察原始待测细胞悬液浓度为1106细胞/ML，采用细胞培养液将原始细胞悬液稀释为5105细胞/ML、25105细胞/ML、125105细胞/ML和1105细胞/ML。6根据权利要求3所述的检测细胞悬液浓度的方法，其特征在于，所述待测细胞种类为小鼠肠道内分泌细胞系STC1。7根据权利要求3所述的检测细胞悬液浓度的方法，其特征在于，所述检测时间为300S。权利要求书CN104034798A1/6页4细胞悬液浓度检测系统及其检测方法技术领域0。
8、001本发明涉及一种检测系统及方法，尤其涉及一种细胞悬液浓度检测系统及其检测方法。背景技术0002细胞悬液是指把贴壁细胞用胰蛋白酶等消化吹打以后，使细胞彼此分离，从而使细胞悬浮在培养液中。目前并无直接检测细胞悬液浓度的方法。通常是取出一定数量的细胞，然后通过显微镜观察细胞数目，接着通过计算加入适量溶剂，制备一定浓度的细胞悬液。若要获得其它浓度的细胞悬液，则需将高浓度悬液稀释成低浓度，或者将相应的低浓度悬液浓缩成高浓度。当获得一未知浓度的细胞悬液时，现有的检测方法无法直接得知其浓度。发明内容0003本发明为了克服现有技术的不足，提供一种稳定性和灵敏度高的细胞悬液浓度检测系统及其检测方法。0004。
9、为了实现本发明的一目的，本发明还提供一种细胞悬液浓度的检测系统，包括细胞悬液浓度传感器、负载电路、电源、频率计数器和处理单元。细胞悬液浓度传感器包括金属外壳、声表面波谐振器和丝网印刷碳电极。声表面波谐振器真空封装于金属外壳中，声表面波谐振器采用ST切型石英作为压电基底材料，通过光刻工艺制备，发出的声表面波频率为433MHZ。负载电路与细胞悬液浓度传感器相串联。电源电性连接负载电路以提供稳定电压的直流电。频率计数器电性连接负载电路。处理单元电性连接频率计数器以获得检测结果。0005于本发明的一实施例中，声表面波谐振器包括压电基片、叉指换能器、两个反射栅和两个吸声件。压电基片为ST切型石英。叉指换。
10、能器刻蚀于压电基片。叉指换能器发出433MHZ的中心频率，周期节长度M72M，叉指宽度A19M，叉指间距B17M，指条对数N100，声孔径W720M，叉指指条的铝条厚度H200NM。两个反射栅分别刻蚀于叉指换能器的两侧，每侧的反射栅指条数目NREF200，两侧的反射栅与叉指换能器之间的距离S90M。两个吸声件分别设置于两个反射栅远离叉指换能器的一侧。0006为了实现本发明的另一目的，本发明还提供一种检测细胞悬液浓度的方法，包括如下步骤。启动检测系统进行检测，声表面波谐振器发出433MHZ的声表面波，一段检测时间后，得出丝网印刷碳电极在空白状态下的时间频率曲线，确定空白频率，建立平衡点。取待测细。
11、胞悬液滴涂于丝网印刷电极表面，启动检测系统进行检测，经过相同的检测时间，扣除空白频率后，处理单元得出丝网印刷碳电极在待测细胞悬液的湿润下的时间频率曲线，确定待测细胞悬液的检测频率。处理单元中存有预设的待测细胞悬液浓度与声表面波频率的关系，根据检测频率在细胞悬液浓度与声表面波频率的关系中找出对应的待测细胞悬液的浓度。说明书CN104034798A2/6页50007于本发明的一实施例中，处理单元中存有预设的待测细胞悬液浓度与声表面波频率的关系这一步骤包括如下步骤。准备1105细胞/ML、125105细胞/ML、25105细胞/ML、5105细胞/ML和1106细胞/ML浓度的与待测细胞种类相同的细。
12、胞悬液。将上述这些不同浓度的细胞悬液100L分别滴涂于丝网印刷电极表面，启动检测系统分别进行检测，经过相同的检测时间，扣除空白频率后，处理单元得出丝网印刷碳电极在不同浓度的细胞悬液的湿润下的时间频率曲线，确定不同浓度的细胞悬液对应的声表面波频率。以细胞悬液的浓度为横坐标，对应的声表面波频率为纵坐标，处理单元绘制细胞悬液浓度声表面波频率曲线。0008于本发明的一实施例中，准备1105细胞/ML、125105细胞/ML、25105细胞/ML、5105细胞/ML和1106细胞/ML浓度的与待测细胞种类相同的细胞悬液这一步骤包括采集原始待测细胞，细胞培养液采用向DMEM高糖培养基中加入质量浓度为10的。
13、胎牛血清FBS、质量浓度为2的L谷氨酰胺溶液和质量浓度为1双抗，然后用022微米的滤膜过滤除菌，分装备用，采用显微镜观察原始待测细胞悬液浓度为1106细胞/ML，采用细胞培养液将原始细胞悬液稀释为5105细胞/ML、25105细胞/ML、125105细胞/ML和1105细胞/ML。0009于本发明的一实施例中，待测细胞种类为小鼠肠道内分泌细胞系STC1。0010于本发明的一实施例中，检测时间为300S。0011综上所述，本发明提供的细胞悬液浓度传感器体积小巧，实用方便，电极响应快、灵敏度高，具有批量重复性好、成本低廉等优势，而且可以达到很高的频率。细胞悬液浓度传感器采用的声表面波谐振器具有更高。
14、的品质因数Q及频率稳定性，不易受环境影响，且可由IC工艺加工设计，具备体积小、重量轻等优点。本发明提供的细胞悬液浓度的检测系统及其检测方法，具有较高的灵敏度和稳定性，操作简单，能够实现待测细胞悬液浓度的实时、快速检测。0012为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。附图说明0013图1所示为本发明提供的金属外壳、声表面波谐振器和丝网印刷碳电极的分解示意图。0014图2所示为本发明提供的声表面波谐振器的电极设计示意图。0015图3所示为本发明提供的细胞悬液浓度的检测系统的示意图。0016图4所示为丝网印刷碳电极在空白状态下的时间频率曲线。
15、。0017图5A至图5E所示为丝网印刷碳电极在不同浓度的STC1细胞悬液的湿润下的时间频率曲线。0018图6所示为STC1细胞悬液浓度频率曲线。具体实施方式0019图1所示为本发明提供的金属外壳、声表面波谐振器和丝网印刷碳电极的分解示意图。图2所示为本发明提供的声表面波谐振器的电极设计示意图。请一并参考图1和图说明书CN104034798A3/6页62。0020细胞悬液浓度传感器包括金属外壳12、声表面波谐振器（SAWR）11和丝网印刷碳电极13。声表面波谐振器11真空封装于金属外壳12中，声表面波谐振器11采用ST切型石英作为压电基底材料，通过光刻工艺制备，发出的声表面波频率为433MHZ。。
16、于本发明中，首先声表面波谐振器11封装于金属外壳12中，然后金属外壳12内部抽成真空，这样会消除声表面波谐振器11表面空气所形成的干扰。0021采用ST切型石英作为基底材料而非其它石英晶体切型（譬如AT切、SC切）是因为其更容易在高频率端工作。ST切型STSTABLETEMPERATURE其欧拉角度为0,13275,0。有时此切型也称为“X轴方向传播的Y切石英晶体”。通过将声表面波谐振器11的频率设定为高频433MHZ，这样声表面波谐振器11工作在较高的频率下，有利于提高传感器的稳定性和灵敏度。0022如图2所示，于本实施例中，声表面波谐振器11是单端口谐振器，包括压电基片1111、叉指换能器。
17、1112（INTERDIGITALTRANSDUCERS，IDT）、两个反射栅1113和两个吸声件1114。压电基片1111为ST切型石英。叉指换能器1112刻蚀于压电基片1111，叉指换能器1112发出43392MHZ的中心频率，周期节长度M72M，叉指宽度A19M，叉指间距B17M，指条对数N100，声孔径W720M，叉指指条的铝条厚度H200NM。两个反射栅1113分别刻蚀于叉指换能器1112的两侧，每侧的反射栅1113的指条数目NREF200，两侧的反射栅1113与叉指换能器1112之间的距离S90M。两个吸声件1114分别设置于两个反射栅1113远离叉指换能器1112的一侧。0023。
18、IDT1112为叉指状电极，电信号加于IDT1112两端时，在压电基片1111上激励的声表面波（SURFACEACOUSTICWAVE，SAW）向两侧传播在左右两反射栅1113栅极之间和左右反射栅1113之间发生多次反射，反射波仍由IDT1112接收。本发明通过设置IDT金属叉指宽度、叉指间距、反射栅栅极宽度和IDT与栅极间距使得声表面波的谐振频率为433MHZ。0024于本实施例中，丝网印刷碳电极13包括PVC电极基片，基片上印制有碳工作电极、碳对电极和AG/AGCL参比电极，各电极分别对应连接有一根电极引线。然而，本发明对丝网印刷碳电极13的具体类型和型号不作任何限定。电化学性质稳定的丝网。
19、印刷碳电极都可以作为本发明中的丝网印刷碳电极使用。0025图3所示为本发明提供的细胞悬液浓度的检测系统的示意图。如图3所示，本发明还提供一种细胞悬液浓度的检测系统，包括细胞悬液浓度传感器11、负载电路12、电源13、频率计数器14和处理单元15。负载电路12与细胞悬液浓度传感器11相串联。电源13电性连接负载电路12以提供稳定电压的直流电。频率计数器14电性连接负载电路12。处理单元15电性连接频率计数器14以获得检测结果。0026于实际应用中，负载电路12包括放大器、谐振电感线圈、电容、谐振器接口和检测电极连接端等部分，负载电路12将模拟信号转换为数字信号进行输出。电源13稳定提供电压为35。
20、V的直流电。频率计数器14是实时测量声表面波谐振器输出频率值的一台数字化仪器。处理单元15为电脑。0027图4所示为丝网印刷碳电极在空白状态下的时间频率曲线（其中横坐标为时间，单位为S，纵坐标为频率，单位为MHZ）。图5A至图5E所示为丝网印刷碳电极在不同浓度的STC1细胞悬液的湿润下的时间频率曲线（其中横坐标为时间，单位为S，纵坐标为频率，说明书CN104034798A4/6页7单位为MHZ）。图6所示为STC1细胞悬液浓度频率曲线（其中横坐标为细胞悬液浓度，单位为每毫升细胞数CELLS/ML，纵坐标为频率，单位为MHZ）。请一并参考图4至图6。本发明还提供一种检测细胞悬液浓度的方法，包括如。
21、下步骤。0028启动检测系统进行检测，声表面波谐振器发出433MHZ的声表面波，一段检测时间后，得出丝网印刷碳电极在空白状态下的时间频率曲线，确定空白频率，建立平衡点。于本实施例中，检测时间为300S。然而，本发明对此不作任何限定。因为每种细胞的性质会不一样，检测时间根据待测细胞种类的不同而不同。于其它实施例中，检测时间可为350S。如图3所示，于本实施例中，空白频率为31225MHZ，调节负载电路上的频率平衡旋钮，重新在31225MHZ建立新的平衡点。0029取待测细胞悬液滴涂于丝网印刷电极表面，启动检测系统进行检测，经过相同的检测时间，扣除空白频率31225MHZ后，处理单元得出丝网印刷碳。
22、电极在待测细胞悬液的湿润下的时间频率曲线，确定待测细胞悬液的检测频率。于本实施，可取待测细胞悬液100L滴涂于丝网印刷电极表面。0030处理单元中存有预设的待测细胞悬液浓度与声表面波频率的关系，根据检测频率在细胞悬液浓度与声表面波频率的关系中找出对应的待测细胞悬液的浓度。具体而言，每一个细胞悬液浓度都对应一个声表面波频率。检测出声表面波频率，又知道细胞悬液浓度与声表面波频率的关系，从而可知待测细胞悬液的浓度。0031于本实施例中，处理单元中储存的细胞悬液浓度与声表面波频率的关系为细胞悬液浓度声表面波频率曲线。然而，本发明对此不作任何限定。于其它实施例中，细胞悬液浓度与声表面波频率的关系可以表格。
23、形式储存于处理单元中。0032以下将详细介绍如何在处理单元中预存待测细胞悬液浓度与声表面波频率的关系。0033首先，准备1105细胞/ML、125105细胞/ML、25105细胞/ML、5105细胞/ML和1106细胞/ML浓度的与待测细胞种类相同的细胞悬液。于本实施例中，采集原始待测细胞，细胞培养液采用向DMEM高糖培养基中加入质量浓度为10的胎牛血清FBS、质量浓度为2的L谷氨酰胺溶液和质量浓度为1双抗，然后用022微米的滤膜过滤除菌，分装备用，采用显微镜观察原始待测细胞悬液浓度为1106细胞/ML，采用细胞培养液将原始细胞悬液稀释为5105细胞/ML、25105细胞/ML、125105细。
24、胞/ML和1105细胞/ML。0034于本实施例中，待测细胞种类为小鼠肠道内分泌细胞系STC1，则准备这五种浓度的STC1细胞悬液。然而，本发明对此不作任何限定。于其它实施例中，若待测细胞种类为某一肿瘤细胞，则准备这五种浓度的肿瘤细胞悬液。本发明对上述浓度的具体数值和细胞悬液的数量亦不作任何限定。于其它实施例中，可准备六种不同细胞浓度的细胞悬液，分别为1105细胞/ML、125105细胞/ML、25105细胞/ML、4105细胞/ML、5105细胞/ML和1106细胞/ML浓度的细胞悬液。0035然后，将上述这些不同浓度的细胞悬液100L分别滴涂于丝网印刷电极表面，启动检测系统分别进行检测，经。
25、过300S后，扣除空白频率31225MHZ，处理单元得出丝网印刷碳电极在不同浓度的细胞悬液的湿润下的时间频率曲线，确定不同浓度的细胞悬液对应的声表面波频率。将所测得的声表面波频率取平均值。如图5A至图5E所示，发现说明书CN104034798A5/6页810105细胞/ML、125105细胞/ML、25105细胞/ML、50105细胞/ML、10106细胞/ML的声表面波谐振频率分别在12816MHZ、12922MHZ、12952MHZ、12964MHZ、13085MHZ附近波动。0036以细胞悬液的浓度为横坐标，对应的声表面波频率为纵坐标，处理单元绘制细胞悬液浓度声表面波频率曲线，如图6所示。
26、。0037以上完成在处理单元中预存待测细胞悬液浓度与声表面波频率的关系步骤。于实际应用中，可先在处理单元中预存多种常测细胞种类的细胞悬液浓度声表面波频率曲线。这样在实际操作中，无需每次检测前都预先标订曲线，可直接检测细胞悬液浓度。0038以下简要介绍本发明的细胞悬液浓度检测系统及检测方法的工作原理。声表面波谐振器负载丝网印刷电极的等效电路如以下公式（1）所示。当丝网印刷碳电极与谐振器串联之后，CE与RE分别是丝网印刷碳电极的等效电容与等效电阻。声表面波谐振器负载丝网印刷电极的频率计算为0039式中，CO为静态电容，LS、CS与RS分别为声表面波谐振器的动态电感、动态电容与动态电阻，谐振器的空载。
27、频率Y是放大电路的相参数，丝网印刷电极的表面电导率为GE1/RE，极间电容CECP，其中为介电常数，CP为导线间的寄生电容。谐振器采用真空封装，其自身参数在检测过程中可以保持较高的稳定性，因此振荡频率主要取决于丝网印刷电极极间电容CE和介电常数。0040滴涂在碳电极上的不同浓度细胞悬液改变了极间电容CE和介电常数，从而对声表面波谐振器的工作频率产生影响，这是该传感器的工作原理。当细胞悬液滴凃于丝网印刷电极的工作电极时，由于活细胞的介电特性，工作电极和对电极之间的电流由于细胞的存在而受到较大影响。细胞悬液浓度越大，极间电流影响就越大，丝网印刷电极的极间电阻RE就越大，丝网印刷电极的电导率GE1/。
28、RE显著减小。根据式（1）可知，最终声表面波谐振器频率上升。此外，丝网印刷碳电极的动态电容CE参数在这个过程中也出现变化，但相比丝网印刷电极极间电阻RE来说影响较小。0041不同种类细胞的形状和物化性质都是不同的，因此制备成相同浓度的细胞悬液的检测频率也是不相同的，每一种细胞的悬液浓度曲线都是唯一的。因此，本发明提供的传感器、检测系统及检测方法可用于精确地检测不同种类的细胞悬液浓度。0042综上所述，本发明提供的细胞悬液浓度传感器体积小巧，实用方便，电极响应快、灵敏度高，具有批量重复性好、成本低廉等优势，而且可以达到很高的频率。细胞悬液浓度传感器采用的声表面波谐振器具有更高的品质因数Q及频率稳。
29、定性，不易受环境影响，且可由IC工艺加工设计，具备体积小、重量轻等优点。本发明提供的细胞悬液浓度的检测系统及其检测方法，具有较高的灵敏度和稳定性，操作简单，能够实现待测细胞悬液浓度的实时、快速检测。0043虽然本发明已由较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟知此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，可作些许的更动与润饰，因此本发明的保护范围当说明书CN104034798A6/6页9视权利要求书所要求保护的范围为准。说明书CN104034798A1/8页10图1图2说明书附图CN104034798A102/8页11图3图4说明书附图CN104034798A113/8页12图5A说明书附图CN104034798A124/8页13图5B说明书附图CN104034798A135/8页14图5C说明书附图CN104034798A146/8页15图5D说明书附图CN104034798A157/8页16图5E说明书附图CN104034798A168/8页17图6说明书附图CN104034798A17。