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1、10申请公布号CN104152474A43申请公布日20141119CN104152474A21申请号201410405713622申请日20140818C12N15/61200601C12N15/84200601A01H5/0020060171申请人中国烟草总公司郑州烟草研究院地址450001河南省郑州市高新技术产业开发区枫杨街2号72发明人王燃史艳梅罗朝鹏李锋刘萍萍武明珠金立锋魏春阳魏攀陈霞郑庆霞林福呈杨军屈凌波74专利代理机构郑州优盾知识产权代理有限公司41125代理人郑园张真真54发明名称烟草番茄红素环化酶基因及其应用57摘要本发明公开了一种烟草番茄红素环化酶基因，其碱基序列如SEQI。
2、DNO1所示。本发明研究了NTLCY基因在烟草不同时期不同器官中的转录水平表达模式，发现该基因主要表达在幼叶中；利用OE和RNAI两种方法研究了NTLCY基因在表达量变化情况下对烟草植株生长发育情况及色素含量的影响，分析了NTLCY基因在烟草中的重要功能。首先是先得到基因，可以明确而有针对性地对该基因开展研究；其次是采用稳定的转基因技术分析基因功能。51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表2页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表2页附图5页10申请公布号CN104152474ACN104152474A1/1页21烟草番茄红素环化酶基因，其碱。
3、基序列如SEQIDNO1所示。2烟草番茄红素环化酶基因，其RNAI序列如SEQIDNO2所示。3如权利要求1所述的烟草番茄红素环化酶基因的应用，其特征在于所述烟草番茄红素环化酶基因提高烟草类胡萝卜素含量。4一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，其特征在于通过过表达和RNA干涉技术研究了该基因功能，获得类胡萝卜素含量提高的烟草转化植株。5如权利要求4所述的提高烟草类胡萝卜素含量的方法，其特征在于以所述烟草番茄红素环化酶基因的编码核酸片段作为功能序列，将该序列插入到含有35S启动子的表达框下，该表达框属于植物双源表达载体的一部分，构建烟草番茄红素环化酶基因的过表达载体。权利要求书CN104152474。
4、A1/5页3烟草番茄红素环化酶基因及其应用技术领域0001本发明属于植物基因工程领域，具体地，本发明涉及烟草类胡萝卜素合成关键基因，涉及番茄红素环化酶基因NTLCY在类胡萝卜素合成及植物生长发育中的重要作用。背景技术0002类胡萝卜素是生物体内通过类异戊二烯途径合成而呈现黄色、橙红色和红色的一类萜类物质。类胡萝卜素在植物光合作用中承担着光吸收的重要功能，主要存在于植物叶片的叶绿体及许多花和果实的有色体中，具有吸收和传递电子的能力，并在清除光合作用中产生的叶绿素三线态和单线态及超氧阴离子等自由基方面起着重要的作用。另一方面，类胡萝卜素在光抑制条件下能通过叶黄素循环，以非光化学辐射的方式耗散光系统。
5、IIPSII的过剩能量，保护叶绿素免受氧化损伤的破坏。此外，类胡萝卜素也是植物激素脱落酸ABA合成的前体物，ABA广泛地参与植物生长周期发育的各个环节和抗逆过程。所以类胡萝卜素在植物生长发育过程中具有重要的作用。0003番茄红素环化是植物体内类胡萝卜素生物合成途径的一个重要分枝点。植物体中存在两种环化酶，一种是番茄红素环化酶LCY，在其催化下，番茄红素转化为胡萝卜素，进而生成玉米黄质、紫黄质、新黄质等叶黄素，另一种是番茄红素环化酶LCY，与LCY共同作用下生成胡萝卜素，进而生成黄体素等。LCY和LCY两个酶的活性在一定程度上决定了两个分枝产物胡萝卜素、紫黄质、玉米黄质和黄体素等类胡萝卜素物质的。
6、比例及类胡萝卜素的总量。0004烟草是重要的经济作物，在发展地方经济、增加国家财政积累方面有突出作用。烟叶中类胡萝卜素含量与烟叶品质之间存在正相关关系，一方面烟叶外观品质与类胡萝卜素成分含量直接相关，另一方面类胡萝卜素是烟草香气成分的重要前提物质，对烟草的香气量和香气质有直接作用。研究表明类胡萝卜素是影响烤烟香气质量重要的萜烯类化合物，其降解产物占烟叶总挥发性香气成分的812。类胡萝卜素的降解和热裂解产物可生成近百种香气化合物，如巨豆三烯酮、大马酮等，这些香味物质阈值相对较低，刺激性较小，对烟叶香气贡献率大，是形成烤烟细腻、高雅和清新香气的主要成分。因此，在烟草中寻找类胡萝卜素合成过程中起关键。
7、作用的基因并探索其应用将具有重要的意义。发明内容0005本发明的目的是通过同源克隆的方式，从栽培烟草红花大金元体内克隆获得NTLCY基因编码区序列，并且进行了表达模式分析。利用稳定的转基因技术过量表达OVEREXPRESSION,OE和RNA干涉RNAINTERFERENCE,RNAI方法研究了NTLCY基因在表达量变化情况下对烟草植株的生长发育情况的影响及类胡萝卜素含量的影响。本发明旨在探索NTLCY基因在烟草中的功能，是否直接控制着类胡萝卜素的含量，该研究结果能够为利用基因工程技术培育优良品种提供理论依据和基因资源。说明书CN104152474A2/5页40006本发明的技术方案是烟草番茄。
8、红素环化酶基因，其碱基序列如SEQIDNO1所示。0007烟草番茄红素环化酶基因，其RNAI序列如SEQIDNO2所示。0008所述的烟草番茄红素环化酶基因的应用，所述烟草番茄红素环化酶基因提高烟草类胡萝卜素含量。0009一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，通过过表达和RNA干涉技术研究了该基因功能，获得类胡萝卜素含量提高的烟草转化植株。0010所述的提高烟草类胡萝卜素含量的方法，以所述烟草番茄红素环化酶基因的编码核酸片段作为功能序列，将该序列插入到含有35S启动子的表达框下，该表达框属于植物双源表达载体的一部分，构建烟草番茄红素环化酶基因的过表达载体。0011首先，研究了NTLCY基因在烟草不。
9、同时期不同器官中的转录水平表达模式，发现该基因主要表达在幼叶中；利用OE和RNAI两种方法研究了NTLCY基因在表达量变化情况下对烟草植株生长发育情况及色素含量的影响，分析了NTLCY基因在烟草中的重要功能。首先是先得到基因，可以明确而有针对性地对该基因开展研究；其次是采用稳定的转基因技术分析基因功能。附图说明0012图1定量PCR分析普通烟草中不同时期、STAGE1STAGE4分别为还苗期、打顶期、盛花期和成熟期的各类器官根R、茎S、叶L5叶位5L，10叶位10L，15叶位15L、花F，中NTLCY基因的转录表达模式；0013图2定量PCR分析低温弱光胁迫下NTLCY基因表达模式，CON为正。
10、常条件下基因相对表达量；LL为低温弱光下基因相对表达量；0014图3NTLCY转基因表型，CON为烟草未转基因对照植株；OE为NTLCY过表达植株；RNAI为NTLCYRNAI转基因植株；0015图4NTLCYRNAI转基因沉默效果，NT为未转基因对照植株；NTLCYRNAI为转基因植株；0016图5NTLCYRNAI转基因株系中色素含量，NT为未转基因对照植株；NTLCYRNAI为转基因植株；0017图6NTLCYOE转基因植株筛选；0018图7NTLCYOE转基因植株LCY基因表达量分析，NT为未转基因对照植株；NTLCYOE为转基因植株；0019图8NTLCYOE转基因株系中色素含量，N。
11、T为未转基因对照植株；NTLCYOE为转基因植株。具体实施方式0020烟草番茄红素环化酶基因，其碱基序列如SEQIDNO1所示。0021烟草番茄红素环化酶基因，其RNAI序列如SEQIDNO2所示。0022所述的烟草番茄红素环化酶基因的应用，所述烟草番茄红素环化酶基因提高烟草类胡萝卜素含量。说明书CN104152474A3/5页50023一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，通过过表达和RNA干涉技术研究了该基因功能，获得类胡萝卜素含量提高的烟草转化植株。0024所述的提高烟草类胡萝卜素含量的方法，以所述烟草番茄红素环化酶基因的编码核酸片段作为功能序列，将该序列插入到含有35S启动子的表达框下，该。
12、表达框属于植物双源表达载体的一部分，构建烟草番茄红素环化酶基因的过表达载体。00251、NTLCY基因的同源克隆0026通过NCBIBLASTN搜索到NTLCY基因所有的EST序列，在ATG和TGA处设计保守引物。分别以普通烟草CDNA和基因组DNA为模板进行PCR扩增，回收目的片段，TA连接，转化大肠杆菌DH5感受态，37培养，菌落PCR鉴定得到阳性克隆。阳性质粒提取，最后进行质粒酶切鉴定和测序得到普通烟草NTLCY编码区全长及基因全长序列。获得NTLCY编码区CDS全长序列1503BP，共编码500个氨基酸，NTLCY基因全长1503BP，所以NTLCY基因在烟草中不存在内含子。0027具。
13、体步骤如下所述0028所用引物为5ATGGATACATTGTTGAAAACCCCAAAT3和5TTCTGTATCCTGTAACAAATTGTTGATC3。作为模板的CDNA和DNA都来自栽培烟草红花大金元旺长期幼叶片RNA和DNA提取按照QIAGEN公司RNA或DNA提取试剂盒说明书进行。按照REVERSETRANSCRIPTIONSYSTEM试剂盒说明书，以OLIGODT18TAKARA公司为引物合成CDNA第一链。PCR反应条件为94，3MIN；94，30S，58，30S，72，15MIN，35CYCLES；72，10MIN；4，PAUSE。反应体系50LCDNA或DNA模板2L，上下游引。
14、物各25L10M，DNTPS4L10M，10BUFFER5L，HIFI酶北京全式金生物技术有限公司05L，无菌水335L。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶提取试剂盒GELEXTRACTIONKIT，购自QIAGENE从琼脂糖凝胶上纯化目标NTLCYDNA片段方法参照试剂盒说明书，用EPPENDORF公司BIOPHOTOMETER测定浓度后用于酶切、连接或存20备用。纯化的NTLCYDNA片段与PMD19T载体TAKARA公司，氨苄霉素抗性连接SOLUTIONI，TAKARA公司，按照试剂盒说明书操作，热激转化4290S入大肠杆菌DH5TAKARA公司。从得到的克隆转化子中用菌落PCR引物为。
15、上述扩增引物鉴定阳性克隆，提取阳性克隆质粒小提质粒试剂盒，QIAGENE，方法参照试剂盒说明书进行。00292、NTLCY表达模式分析0030采集栽培烟草的各个时期还苗期、打顶期、盛花期和成熟期的各类器官根、茎、5叶位，10叶位，15叶位、花样品，并提取它们的总RNA，反转录成为CDNA方法如1所述。定量PCRBIORAD,USA分析NTLCY时空表达模式及低温弱光胁迫条件下的表达模式。如附图1中所示，NTLCY在盛花期表达量较高，且多表达在幼叶中表达水平10叶位15叶位5叶位花茎根。在低温弱光胁迫下，NTLCY表达量有显著变化，说明该基因是受低温弱光胁迫条件诱导表达基因。NTLCY表达量在6。
16、H时呈下升趋势，12H以后表达量逐渐提高，在24H达到最大见图2。转录水平表达模式的研究结果表明，该基因与植物的生理状态密切相关，在烟株光合生理较为强盛的幼嫩组织表达量较高，且能够被光抑制条件诱导，参与烟株抵御光抑制的过程，其生物学功能应该与光合生理过程存在密切的关系。0031表达模式分析所用烟草器官样品均在云南大田采样，所用的定说明书CN104152474A4/5页6量引物为NTLCYQF/R，5GATGACAATACAACTAAAGATCTTGATAG3和5CATAAGCTACTTGATATCCAGGAT3。采用26SRNA作为内参。PCR扩增反应条件95预变性3MIN；9520S,602。
17、0S,40个循环。反应体系1LCDNA，10LSYBRGREEN，上下游引物各1L10MOL/L，补DDH2O至20L。低温弱光处理条件100MOLM2S1，4。00323、烟草中RNAI介导的基因沉默研究NTLCY基因功能0033为了更确切的了解NTLCY基因在烟草中的功能，我们利用稳定的转基因技术采用RNAI方法对该基因进行体内功能研究。构建NTLCY基因RNAI载体转化农杆菌GV3101，利用农杆菌介导的遗传转化技术转化SR1普通烟草，采用卡那抗性基因进行阳性植株筛选，得到转化成功的烟草植株。转基因烟草植株叶片出现明显的光漂白或黄化现象，植株严重矮化图3，生长的进行，叶片越发漂白，部分植。
18、株逐渐的死掉。并对生存下来的烟株样品进行培养，直至接种子，然后用T2代烟株烟叶进行NTLCY基因转录表达分析及代谢物分析。定量PCR结果显示，在RNAI转基因烟株中NTLCY基因表达量显著降低图4，沉默效率高达90。利用HPLC对类胡萝卜含量进行分析，发现胡萝卜素、紫黄质、新黄质及黄体素LUTEIN类胡萝卜素及叶绿素A和B含量明显下降图5。转基因RNAI结果表明，NTLCY基因对烟株的双环叶黄素的生成有重要影响，而双环叶黄素对植株生长发育起着至关重要的作用，是生物体不可或缺的重要组成部分，主要控制着植物类胡萝卜素等色素物质合成，进而影响着植物的光合作用。0034具体方法如下所述0035采用GA。
19、TEWAY重组技术，利用PHELLSGATE2壮观霉素抗性载体构建转化烟草的RNAI载体。引物是5GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACGAGGAAGCTAAATCTATGC3带有ATTB1接头和5GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATACGTAATCCAGGACGAGCAAC3带有ATTB2接头。PCR反应以1中NTLCYT为模板进行扩增，产物胶回收纯化。然后进行BP重组实验。体系如下ATTBPCR产物100NG/L25L，PHELLSGATE2VECTOR400NG/L04L，BPCLONASEIIENZYMEMIX2L，补充TEBUFF。
20、ERPH8051L至10L体系，25反应3H，加入1LK蛋白，37温浴10MIN，然后取1L反应液热激转化大肠杆菌DH5，经菌落PCR鉴定阳性克隆，并提质粒进行酶切验证，确认正确后，得到PHELLSGATE2NTLCYRNAI质粒。然后转入农杆菌感受态GV3101中，挑取适量的转化菌斑PCR鉴定无误后摇菌转化烟草植株。0036质粒转化农杆菌取PHELLSGATE2NTLCYRNAI质粒1L，加入含01ML的GV3101农杆菌感受态的EP管中，冰上放置30MIN；将含有该质粒的农杆菌感受态放入液氮速冻1MIN，然后37温育5MIN；加入1MLLB液体培养基，28震荡培养3H；5,000RPM离心。
21、1MIN，弃去上清，加入200LLB液体培养基，重悬沉淀；取200L重悬液即转化产物均匀地涂于含25MG/ML利福平RIF,SIGMA和50MG/ML壮观霉素SPE,SIGMA的LB平板上，28培养23天；挑取适量的转化菌斑PCR鉴定无误后，摇菌转化SR1普通烟苗。0037农杆菌转化烟草将鉴定无误的农杆菌接种于5MLLB液体培养基中含25MG/ML利福平和50MG/ML壮观霉素，28震荡培养过夜，次日以1100的比例转移至50MLLB液体培养基中含25MG/ML利福平和50MG/ML壮观霉素，28震荡培养至OD600为08左右；离心收集菌体，用50ML转化培养基MS0PH59，MURASHIG。
22、ESHOOGMEDIUM，购自DUCHEFABIOCHEMIA悬浮该农杆菌，采用浸泡法转化烟草叶片，即将切成片状的叶片浸泡在含有目说明书CN104152474A5/5页7标载体的农杆菌培养基中2MIN。然后取出叶片贴在不含抗生素的MS固体培养基上28暗培养2天，2天后移到含有卡那霉素和头孢霉素购自SIGMA的MS分化培养基上等待分化，710天换一次培养基。分化后转移到生根培养基上直至长出根后，移栽在土中，按正常的方法培育植株至结实，收获成熟种子。0038烟草正常培养条件培养条件为281，光照16H，黑暗8H，602的相对湿度。00394、烟草中过量表达NTLCY基因，能够增加类胡萝卜素含量00。
23、40类胡萝卜素不但对植物的生长发育有重要影响，而且对烟草的香味品质有重要的贡献，为了更全面的了解NTLCY基因在烟草中的功能，探索如何增加烟草中类胡萝卜素含量，利用稳定的转基因技术采用过量表达的方法对NTLCY的功能进行了进一步的研究。首先构建NTLCY基因OE载体转化农杆菌GV3101，利用农杆菌介导的遗传转化技术转化SR1普通烟草，采用跨目标基因和标签蛋白FLAG基因引物进行阳性植株筛选图6，并对LCY表达量进行定量PCR分析，发现转基因烟株LCY表达量显著升高图7，得到转化成功的烟草植株。对T2代NTLCY基因过量表达转基因烟株烟叶样品进行代谢分析，发现胡萝卜素、紫黄质、新黄质及黄体素类。
24、胡萝卜素及叶绿素A和B含量明显增加图8，烟草植株生长状态良好图3。转基因RNAI和OE结果表明，NTLCY基因对烟株类胡萝卜素合成及生长发育至关重要，是类胡萝卜素合成通路上的关键基因，其表达水平直接关系到烟草的生长状况，进而影响着烟草烟叶的产量及质量。在烟草中开展NTLCY基因的功能研究为其它植物的研究工作打下了很好的基础，同时该研究结果可以从源头上提高烟叶品质，为烟草利用基因工程技术培育优良品种提供理论依据和基因资源。0041NTLCYOE载体构建具体方法如下所述0042构建NTLCYOE所用引物是NTLCYSP1300SPEIF5GCACTAGTATGGATACATTGTTGAAAACCC。
25、CAAATAAG3带有SPEI酶切位点和NTLCYSP1300KPNIR5TAGGTACCTTCTGTATCCTGTAACAAATTGTTGATCAT3带有KPNI酶切位点。PCR反应以1中NTLCYT为模板进行扩增，产物胶回收纯化，使用SPEI和KPNI酶切PCR回收片段和SPCAMBIA1300载体由PCAMBIA1300，载体改造而来，在多克隆酶切位点后加入FLAG标签蛋白，回收目的片段并连接，转化细菌DH5，TAKARA公司，菌落PCR鉴定阳性克隆，提质粒得到目的载体NTLCYOE，酶切验证并测序确认序列正确并无移码情况。然后转入农杆菌感受态GV3101中，菌落PCR鉴定阳性后，摇菌，。
26、按照3中步骤转化烟草植株。跨目标基因和标签蛋白FLAG基因引物序列为NTLCYOEJCF5CGGTATGGATATTCTTCTGAAGCTTG3和FLAGR5CTTATCGTCATCGTCCTTGTAATCG3。0043质粒转化农杆菌将NTLCYOE质粒按照3中步骤转入农杆菌，然后将转化产物均匀地涂于含25MG/ML利福平RIF,SIGMA和50MG/ML卡那霉素KANA,SIGMA的LB平板上，28培养23天；挑取适量的转化菌斑PCR鉴定无误后，摇菌转化SR1普通烟苗。0044农杆菌转化烟草将鉴定无误含有NTLCYOE质粒的农杆菌按照3中方法转化烟草，培养菌所用培养基中含25MG/ML利福平和50MG/ML卡那霉素。说明书CN104152474A1/2页800010002序列表CN104152474A2/2页9序列表CN104152474A1/5页10图1图2说明书附图CN104152474A102/5页11图3说明书附图CN104152474A113/5页12图4图5说明书附图CN104152474A124/5页13图6图7说明书附图CN104152474A135/5页14图8说明书附图CN104152474A14。