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1、10申请公布号CN104147009A43申请公布日20141119CN104147009A21申请号201410310334922申请日20140701A61K31/454200601A61P3/0420060171申请人天津科技大学地址300457天津市滨海新区经济技术开发区十三大街29号72发明人樊振川郁彭王小花74专利代理机构天津盛理知识产权代理有限公司12209代理人赵瑶瑶54发明名称IPSEN17作为制备治疗由黑素皮质素受体4突变体引起的肥胖症药物的应用57摘要本发明涉及一种IPSEN17作为制备治疗由黑素皮质素受体4突变体引起的肥胖症药物的应用，所述肥胖症为早发性肥胖症。本发明利。
2、用IPSEN17在人肾胚胎细胞HEK293中功能拯救10种不同细胞膜表达缺陷的人黑素皮质素受体4，该小分子药学伴侣分子拯救黑素皮质素受体4突变体细胞膜表达的EC50小于107M，其中2种突变受体的EC50达到小于108M的水平。被拯救的黑素皮质素受体4突变体的信号分子产生能力的EC50小于107M，其中1种突变受体的EC50已达到小于108M的水平。51INTCL权利要求书1页说明书10页序列表6页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书10页序列表6页附图1页10申请公布号CN104147009ACN104147009A1/1页21IPSEN17作为制备治。
3、疗由黑素皮质素受体4突变体引起的肥胖症药物的应用。2根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述肥胖症为早发性肥胖症。3根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述IPSEN17的化学结构式为。4根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述IPSEN17的药物靶点为细胞膜定位缺陷的人黑素皮质素受体4突变体。5根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述IPSEN17在制备治疗细胞膜定位缺陷的人黑素皮质素受体4突变体引发的早发性肥胖药物中的应用。权利要求书CN104147009A1/10页3IPSEN17作为制备治疗由黑素皮质素受体4突变体引起的肥胖症药物的应用技术领域0001本发明涉及药物领域，具体是一种新颖。
4、的小分子苯并咪唑化合物IPSEN17作为药学伴侣分子功能拯救黑素皮质素受体4突变体及其在制备抗肥胖药物中的应用，即IPSEN17作为制备治疗由黑素皮质素受体4突变体引起的肥胖症药物的应用。背景技术0002某些G蛋白偶联受体GPROTEINCOUPLEDRECEPTOR，GPCR的突变会引起人类疾病，如色素性视网膜炎RETINITISPIGMENTOSA，肾性尿崩症NEPHROGENICDIABETESINSIPIDUS，性腺机能减退症HYPOGONADISM，先天性巨结肠症HIRSCHSPRUNGDISEASE和严重的早发性病态肥胖症EARLYONSETMORBIDOBESITY1,2,3。G。
5、PCR突变导致的疾病通常是由于受体蛋白发生错误折叠导致构象改变，进而使其在内质网及高尔基体中发生滞留所引起的。而错误的突变受体一般会在细胞内发生降解。到目前为止，各类GPCR突变体的研究结果清楚地表明突变受体胞内运送功能发生缺陷，不能正常的到达其功能位点细胞膜发挥作用。一般来说，这类胞内留存型突变体如果能顺利到达细胞膜作用位点，也许就不会影响或只会轻微的影响配体的结合效率，从而也不会直接影响信号的传导。研究表明，当用二甲基亚砜、甘油、氧化三甲胺等小分子化合物处理野生型WT受体和受体突变体时，可以提高其膜表达的水平。尽管这些小分子不可能发展成为临床可行的治疗方案，但至少给我们提供了一个可行的研究。
6、思路用药理小分子化合物即药学伴侣分子进行处理，可以拯救由于突变所导致的受体蛋白折叠及膜表达量的缺陷，进而使其信号功能得到恢复。近年来，越来越多的实验数据表明药学伴侣分子可以作为折叠的模板协助不同类的突变受体蛋白进行正确的折叠，进而顺利的完成蛋白质从内质网到细胞膜功能位点运送的过程。视紫红质受体RHODOPSINRECEPTOR突变体、促性腺激素释放激素受体GONADOTROPINRELEASINGHORMONERECEPTOR，GNRHR突变体4,5,6,7,8、黑色素浓集激素1型受体MELANINCONCENTRATINGHORMONERECEPTOR1，MCHR1突变体、V1A、V1B和V。
7、2R加压素受体VASOPRESSINRECEPTOR突变体以及实验室产生的和阿片受体OPIOIDRECEPTOR突变体等4,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18都是已成功的案例。值得一提的是最早开发的后叶加压素拮抗剂SR4905912,18，一种穿膜的非肽类小分子，能够作为V2R特异性的药学伴侣分子拯救内质网留存的V2后叶加压素突变受体，临床结果清楚的显示对于肾原性尿崩症NEPHROGENICDIABETESINSIPIDUS，NDI患者，能使肾功能发生显著的提高。此次临床测试显示细胞渗透性小分子GPCR逆激动剂作为GPCR突变受体功能拯救的药学伴侣分子具有很大的发展潜力。。
8、0003黑素皮质素受体4MELANOCORTIN4RECEPTOR，MC4R是一个典型的GPCR，在人类及动物基因的研究中均有发现，对于能量平衡发挥重要的作用。MC4R基因突变所导致的肥胖表型，是最常见的单基因形式的早发性肥胖的典型代表。到目前为止，已从不同种族的肥胖病人体内鉴定出超过150个MC4R突变体。据估计，大约6的早发性肥胖是因为MC4R突说明书CN104147009A2/10页4变引起的。已有的功能研究表明MC4R的大多数突变体是由于不能正常运送到细胞膜表面而导致的功能缺陷。因此，寻找MC4R特异性的药学伴侣分子，拯救突变受体的细胞膜表达或信号传导缺陷，很有可能能够治疗由于MC4R。
9、基因突变引起的早发性肥胖病症。0004目前已有MC4R的细胞穿膜非肽类小分子拮抗剂被鉴定出能拯救MC4R胞内留存型突变受体的细胞膜表达及信号传导缺陷，包括ML0025376419,20、PBA21、MTHP、PPPONE、MPCI、DCPMD及NBP22等。这些测试化合物结构分属于不同的化学物类别，并对MC4R突变受体显示出不同的效价强度及效能。甚至对于同一个特定的化合物来说，其对不同受体的拯救能力及拯救效果也存在很大的区别。由于与肥胖相关的MC4R的突变受体缺陷具有多样性，因此拯救多种MC4R突变体细胞膜表达及功能缺陷的化合物亟待开发。发明内容0005本发明的目的是提供IPSEN17作为制备。
10、治疗由黑素皮质素受体4突变体引起的肥胖症药物的应用，其中IPSEN17特异性恢复黑素皮质素受体4突变体细胞膜表达和拯救突变受体信号分子产生能力及其在制备以MC4R突变体为靶点的个性化抗肥胖药物中的应用。0006本发明的目的通过以下技术方案实现的0007IPSEN17作为制备治疗由黑素皮质素受体4突变体引起的肥胖症药物的应用。0008而且，所述肥胖症为早发性肥胖症。0009而且，所述IPSEN17的化学结构式为00100011而且，所述IPSEN17的药物靶点为细胞膜定位缺陷的人黑素皮质素受体4突变体。0012而且，所述IPSEN17在制备治疗细胞膜定位缺陷的人黑素皮质素受体4突变体引发的早发性。
11、肥胖药物中的应用。0013本发明的优点和积极效果00141、本发明中针对一个新型的MC4R拮抗剂，IPSEN17，进行了不同MC4R突变体细胞膜表达及信号传导功能的拯救能力研究。本发明利用IPSEN17在人肾胚胎细胞HEK293中功能拯救10种不同细胞膜表达缺陷的人黑素皮质素受体4，该小分子药学伴侣分子拯救黑素皮质素受体4突变体细胞膜表达的EC50小于107M，其中2种突变受体的EC50达到小于108M的水平。被拯救的黑素皮质素受体4突变体的信号分子产生能力的EC50小于107M，其中1种突变受体的EC50已达到小于108M的水平。00152、本发明首次发现IPSEN17为人黑素皮质素受体4的。
12、药学伴侣分子，具有较好的说明书CN104147009A3/10页5恢复细胞膜定位缺陷的人黑素皮质素受体4突变体的细胞膜表达能力和恢复突变体信号分子的产生能力，可应用于制备个性化抗肥胖药物用以治疗由MC4R突变引起的早发性肥胖。00163、本申请所述IPSEN17对10种人黑素皮质素受体4突变体包括S58C23，E61K24，N62S25，I69T24，P78L26，C84R27，T162I24，R165W28，W174C29，C271Y30细胞膜表达拯救测试结果表明该小分子的EC50107M，其中T162I和R165W的EC50108M。拯救后的10种受体突变体包括S58C，E61K，N62S。
13、，I69T，P78L，C84R，T162I，R165W，W174C，C271Y的信号分子产生能力的EC50107M，其中C84R的EC50108M。因此，IPSEN17在治疗由于人黑素皮质素受体4突变体细胞膜表达缺陷所引发的早发性肥胖的药物开发与应用方面具有广阔的前景。附图说明0017图1为本发明IPSEN17介导的人MC4R胞内留存型突变体免疫荧光显微镜检测。其中，“”表示样品细胞不用IPSEN17处理，“”表示样品细胞用1MIPSEN17处理12H时。具体实施方式0018为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保。
14、护范围。0019本发明所述IPSEN17的化学结构式为00200021本发明以质粒PCDNA31为表达载体，在其多克隆位点依次插入流感病毒血凝素HA序列和人黑素皮质素受体4基因的编码区序列，这些序列一起组成一个N端HA标记的人黑素皮质素受体4表达序列，以构建野生型人黑素皮质素受体4表达载体PCDNA31HAMC4R。0022本发明利用PCDNA31HAMC4R为模板，利用点突变技术将系列突变位点引入人黑素皮质素受体4编码区，构建了10个已经临床鉴定的细胞膜表达缺陷黑素皮质素受体4突变体表达载体。这些受体突变体包括S58C，E61K，N62S，I69T，P78L，C84R，T162I，R165W。
15、，W174C，C271Y。0023本发明利用磷酸钙法将PCDNA31空载体、野生型人黑素皮质素受体4表达载体和各个人黑素皮质素受体4突变体表达载体转染入人肾胚胎细胞HEK293，构建了12个稳定表达的混合细胞系。0024本发明IPSEN17对突变受体的细胞膜表达恢复试验和信号分子产生分析方法包说明书CN104147009A4/10页6括以下步骤0025稳定细胞系的药物处理将稳定细胞系细胞分别培养于6孔或96孔平板，每孔各加IPSEN17到所需浓度，按所需时间培养细胞。0026受体细胞膜表达定量分析将IPSEN17处理后的稳定细胞系细胞进行FITC偶联的抗HA抗体免疫标记，其荧光强度用流式细胞仪。
16、进行量化检测。0027受体细胞膜表达的药理学分析将稳定细胞系细胞进行IPSEN17处理，在不同处理时间段将稳定细胞系细胞进行FITC偶联的抗HA抗体免疫标记，其细胞膜表达的剂量依赖性曲线用流式细胞仪进行量化检测，并利用GRAPHPADPRISM5软件计算其有效中浓度EC50和最大浓度值EMAX。0028受体激活信号分子的药理学分析将IPSEN17处理后的稳定细胞系细胞进行MSH刺激处理，然后利用APPLIEDBIOSYSTEMS公司的96孔环腺苷酸免疫分析系统和其CAMPHIRANGEKIT进行信号分子CAMP产生的剂量依赖性曲线，并利用GRAPHPADPRISM5软件计算其有效中浓度EC50。
17、和最大浓度值EMAX。0029本发明黑素皮质素受体4及其突变体表达适用于不同细胞系作为宿主，实施例选择的是HEK293作为宿主。采用DULBECCOSMODIEDEAGLESMEDIUM含10的胎牛血清GIBCO，100单位/毫升的盘尼西林和100毫克/毫升的链霉素GIBCO培养基，在37下的CO2培养箱中培养。0030实施例10031本发明人黑素皮质素受体4及其突变体表达载体的构建，方法如下0032根据已知人黑素皮质素受体4基因的DNA序列NCBI参考序列NM_0059122，设计引物并扩增其基因序列，通过PCR引物引入酶切位点，在其基因上游添加ECORI限制性酶切位点和HA标记序列，下游添。
18、加XBAI限制性酶切位点，扩增生成的核苷酸序列命名为ECORIHAMC4RXBAI，将其克隆到商用载体PCDNA31中，插入位点为ECORI和XBAI，构建后含有该序列的载体命名为PCDNA31HMC4R。引物合成于上海捷瑞生物工程有限公司，PCR扩增所用试剂及实验所用内切酶、DPN酶均为FERMENTAS品牌。0033上述人肾胚胎细胞HEK293表达载体及其突变表达载体的构建方法，包括步骤S1S6，具体如下0034S1以人基因组DNA为模板，设计PCR扩增所用引物。0035上游引物5AAGAATTCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTCTCGAGATGGTGAACTC。
19、CACCCACCGTG3用以引入ECORI酶切位点和HA标记序列，0036下游引物5CCTCTAGATTAATATCTGCTAGACAAGTC3用以引入XBAI酶切位点。0037S2以人基因组DNA为模板，通过PCR扩增HMC4R基因编码区DNA片段。扩增体系为50L，包括100NG人基因组DNA，025MMDNTPS，04M上引，04M下引，1PFUDNAPOLYMERASEBUFFER，15MMMGCL2和25UPFUDNAPOLYMERASE。PCR反应程序为95模板预变性2MIN；95模板变性1MIN，56引物退火45S，72引物延伸90S35个循环；最后72再延伸10MIN。0038。
20、S3PCR产物进行切胶回收纯化，使用限制性内切酶ECORI和XBAI切割ECORIHAMC4RXBAIDNA片段，将其与ECORI和XBAI切割的商用质粒PCDNA31相连接，得到含有ECORIHAMC4RXBAI序列的载体PCDNA31HMC4R；说明书CN104147009A5/10页70039S4以PCDNA31HMC4R为模板，分别设计不同突变受体的扩增引物0040S58C上引5CTGGGTGTCATCTGCTTGTTGGAGA30041下引5TCTCCAACAAGCAGATGACACCCAG30042E61K上引5ATCAGCTTGTTGAAGAATATCTTAG30043下引5CT。
21、AAGATATTCTTCAACAAGCTGAT30044N62S上引5GCTTGTTGGAGAGTATCTTAGTGAT30045下引5ATCACTAAGATACTCTCCAACAAGC30046I69T上引5TGATTGTGGCAACAGCCAAGAACAA30047下引5TTGTTCTTGGCTGTTGCCACAATCA30048P78L上引5ATCTGCATTCACTCATGTACTTTTT30049下引5AAAAAGTACATGAGTGAATGCAGAT30050C84R上引5TACTTTTTCATCCGCAGCTTGGCTG30051下引5CAGCCAAGCTGCGGATGAAAAA。
22、GTA30052T162I上引5ATAACATTATGATAGTTAAGCGGGT30053下引5ACCCGCTTAACTATCATAATGTTAT30054R165W上引5TGACAGTTAAGCTGGTTGGGATCAT30055下引5ATGATCCCAACCAGCTTAACTGTCA30056W174C上引5AAGTTGTATCTGTGCAGCTTGCACG30057下引5CGTGCAAGCTGCACAGATACAACTT30058C271Y上引5TCTACATCTCTTATCCTCAGAATCC30059下引5GGATTCTGAGGATAAGAGATGTAGA30060S5以PCDNA。
23、31HMC4R为模板，扩增点突变DNA片段，扩增体系为50L，包括25NGPCDNA31HMC4R质粒DNA，05MMDNTPS，125NG上引，125NG下引，1PFUDNAPOLYMERASEBUFFER，15MMMGCL2和25UPFUDNAPOLYMERASEFERMENTAS。PCR反应程序为95模板预变性30S；95模板变性30S，55引物退火1MIN，68引物延伸13MIN15个循环；最后68再延伸10MIN。0061S6PCR扩增完后加入1LDPN酶，37孵育2H3H，取5L进行大肠杆菌XL1BLUE感受态转化实验，挑取单克隆，送样测序，并对正确的突变载体进行质粒大提SOLAR。
24、BIO质粒大提试剂盒，测定质粒浓度及纯度存于80细胞转染备用。0062实施例20063黑素皮质素受体4及其突变体表达选择HEK293细胞作为宿主，采用磷酸钙转染法进行转染操作，并用含G418的培养基进行筛选。包被液01GELATINSIGMA配方如下1GGELATIN溶解于1LPBS中，高温灭菌，4贮藏。转染试剂配方如下所示25MCACL21838GCACL22H2OSIGMA溶于30ML三蒸水中，过022MMILIPORE滤膜，2BSS280MMNACL，15MMNA2HPO3，50MMBESSIGMA，PH695，过022M滤膜，20贮藏。生长培养基配方如下50ML胎牛血清，500L庆大霉。
25、素40MG/ML，SOLARBIO，25MLHEPES1M，SIGMA，447MLDMEM高糖，GIBCO，4贮藏。筛选培养基配方如下50ML胎牛血清，500L庆大霉素40MG/ML，5MLHEPES1M，500LG418250MG/ML，SOLARBIO，444MLDMEM高糖，4贮藏。WA/BSA配方如下141GWAYMOUTHMB752/1SIGMA，477G说明书CN104147009A6/10页8HEPES，224GNAHCO3，加入接近1L双蒸水，调节PH至77，定容至1L，加入1GBSAROCHE，室温溶解，过滤除菌，4贮藏。实验所用培养瓶、培养皿等细胞培养耗材均为NEST品牌。。
26、0064人肾胚胎细胞HEK293转染野生型PCDNA31HMC4RWT，空载体PCDNA31及12种突变表达载体，包括步骤S1S4，具体如下0065S1转染实验前48H铺100MM细胞培养皿，细胞培养皿使用前用01的GELATIN在室温下进行包被，约45MIN，弃掉包被液。每个皿内铺板的细胞数约为5107，当贴壁细胞覆盖5080平皿底面积时，进行转染。0066S2按以下转染体系进行操作440L无菌三蒸水，50L25MCACL2，10L质粒DNA1MG/ML混匀后加入500L的2BSS，混匀，室温放置15MIN，逐滴加入至准备好的9ML生长培养基中，混匀。0067S3弃掉培养皿中的培养基，加入S。
27、2步骤中混匀的转染体系。0068S4培养箱中过夜24H，加入5MLWA/BSA洗培养皿，重复两次，胰酶GIBCO消化，转移至T75培养瓶中，加入含G418的筛选培养基，定期换液，筛选时间约4周。0069S5筛选出的稳定细胞系可传代培养，进行下一步实验。0070实施例30071野生型WT与各突变表达载体在HEK293中细胞膜表达的定量分析测定采用FACS进行。即测定分析构建好的稳定表达的混合细胞系在药学伴侣分子IPSEN17处理与不处理两种情况下细胞膜表达量的差异。实验中所用的IPSEN17纯度为98，由申请人合成；MSH的纯度为95，购于上海强耀生物科技有限公司。培养完成后的整个实验操作均在冰。
28、上进行，具体步骤如下S1S50072S1WT、突变受体及空载体PCDNA31稳定细胞系以1104细胞/孔的密度铺六孔板，培养24H。WT或突变HMC4R表达细胞系加入对照BUFFER或特定浓度的化合物IPSEN17，继续培养12H。0073S2细胞转移至15ML离心管中，用无菌的PBS包括137MMNACL，27MMKCL，14MMKH2PO4和43MMNA2HPO4，PH74洗三遍，用5的多聚甲醛SOLARBIO室温固定30MIN，细胞用PBS洗三遍，加入5W/VBSA/PBS封闭1H，终止非特异性反应。0074S3弃掉废液，FITC标记的ANTIHA抗体SIGMA用05W/VBSA/PBS。
29、稀释1000倍，孵育细胞1H。然后用PBS轻柔的冲洗五遍。0075S4利用BDFACSARIA流式细胞术进行实验测定。0076S5以稳定表达空载体PCDNA31的细胞系为阴性对照，计算公式为MUTANTPCDNA31/WTPCDNA31100。每个实验三个重复，且至少需三次独立实验所得的数据分析有效。0077实施例40078利用共聚焦显微镜对IPSEN17对WT，空载体PCDNA31及10种HMC4R突变体的拯救效果进行直观检测分析。具体操作步骤如下S1S50079S1WT、突变受体及空载体PCDNA31稳定细胞系以5103细胞/孔的密度铺8孔的CHAMBERS，CHAMBERS使用前用01M。
30、G/ML的POLYDLYCINEBBI进行包被，在细胞培养箱中培养24H。WT或突变HMC4R表达细胞系加入对照BUFFER或特定浓度的IPSEN17，继续培养12H。说明书CN104147009A7/10页90080S2按照实施案例3中的S2、S3步骤操作。0081S3利用NIKONA1SI日本激光共聚焦显微镜进行观察，拍照。0082实施例50083激动剂诱导下受体激活信号分子CAMP水平的测定。具体步骤如下S1S40084S1WT、突变受体及空载体PCDNA31稳定细胞系以1103细胞/孔的密度铺提前用01MG/ML的多聚赖氨酸包被的96孔板，培养24H。WT或突变HMC4R表达细胞系加入。
31、BUFFER或化合物IPSEN17，继续培养12H。0085S2用DMEM培养基洗三次或五次，加入含特定浓度MSH的DMEM培养基，诱导45MIN。0086S3利用APPLIEDBIOSYSTEMS公司的96孔环腺苷酸免疫分析系统和其CAMPHIRANGEKIT进行细胞内CAMP水平的测定。0087S4利用GRAPHPADPRISM5软件分析实验数据作出非线性回归S型曲线，并计算得到EC50值。0088结果及分析00891表1为本发明实施例3中IPSEN17介导的人的MC4R胞内留存型突变体细胞膜表达水平的定量分析结果。结果显示在没有IPSEN17处理的情况下，MC4R的十种突变体包括S58C。
32、，E61K，N62S，I69T，P78L，C84R，T162I，R165W，W174C，C271Y的细胞膜表达具有受体特异性，表达效率从9到39不等。而当用1MIPSEN17处理12H时，十种MC4R突变体的细胞膜表达效率都显著增加，变化范围为134到179。此外，IPSEN17还能使野生型WTMC4R的细胞膜表达效率从100增加到189。以上结果与本发明实施例4中免疫荧光的检测结果相一致图1。表明IPSEN17作为MC4R的一种药学伴侣分子对其突变受体而言并不是突变体特异性的药学伴侣分子。0090表1IPSEN17介导的人MC4R突变体细胞膜表面表达水平测定00910092备注表示与未用IP。
33、SEN17处理的野生型WTMC4R对照相比，突变受体的细胞说明书CN104147009A8/10页10膜表达水平具有显著性差异，P005。数据以多次实验N的SEM方式表示，未用IPSEN17处理的野生型WTMC4R的细胞膜表达水平设为100。00932表2为本发明实施例5中IPSEN17处理对人的MC4R突变体功能拯救的分析结果。实验中用1MIPSEN17处理12H后，再用1MMSH作用45MIN。结果显示十个突变受体均能对MSH的刺激做出响应，且在利用IPSEN17处理后，CAMP的积累发生显著性变化。以无IPSEN17处理的野生型WT信号响应值为内参，设为100，IPSEN17处理后WT信。
34、号提高到105。在无IPSEN17处理情况下，突变受体对受体激动剂MSH刺激的响应值在316之间，处理后，所有的突变受体表现出信号增强的趋势，响应值变化范围在2698之间。在利用MSH刺激处理前增加用DMEM冲洗的步骤三次到五次，不管是对WT还是突变受体，其信号响应水平都得到提高，变化范围为38112，这一步骤进一步确定IPSEN17与MC4R受体结合后，影响了受体激动剂MSH与受体的结合。综上，十种突变受体都能引起胞内运送缺陷或受体成熟的缺陷，但这并不会影响配体结合效率或后续信号传导的功能。因为这些突变受体一旦成功到达细胞膜，就能够对受体激动剂的刺激做出正确的响应。本研究发现IPSEN17能。
35、够激活信号分子CAMP的产生，将突变受体的信号传导水平拯救到不同的水平，且具有较强的突变体特异性特征。0094表2MSH作用下，IPSEN17拯救人MC4R突变体信号分子CAMP的产生水平00950096备注表示与未用IPSEN17处理的野生型WTMC4R对照相比突变受体的CAMP产生水平具有显著性差异，P005。数据以多次实验N的SEM方式表示，未用IPSEN17处理的野生型WTMC4R的CAMP产生水平设为100。00973表3为本发明实施例3中IPSEN17作为MC4R的药学伴侣分子的药理学研究分析结果。为研究IPSEN17在拯救野生型WT受体及MC4R突变受体方面的效价及效能，用不同浓。
36、度的IPSEN17104M1011M处理12H，紧接着进行FACS实验测定受体的细胞膜表达水平。结果显示，IPSEN17对每个突变受体的拯救能力具有剂量依赖型特征且在106M能够达到细胞膜表达的最大水平，这预示着IPSEN17在拯救MC4R细胞膜表达方面具有较高效率。说明书CN104147009A109/10页11IPSEN17的效应浓度EC50对于每种不同突变受体的结果是不同的，但几乎都达到108M的水平，表明IPSEN17介导的MC4R突变受体的细胞膜表达水平的拯救有严格的剂量依赖性，且针对不同的突变受体拯救能力也存在差异性。0098表3IPSEN17对人的MC4R突变受体的细胞膜表达水平。
37、拯救的药理学分析009901000101备注数据以多次实验N的SEM方式表示，EC50代表每种突变受体的细胞膜表达水平达到最大值的50时，IPSEN17的浓度。未用IPSEN17处理的野生型WTMC4R的细胞膜表达水平设为100。01024表4为本发明实施例5中突变受体在用IPSEN17拯救后，不同浓度受体激动剂MSH激活信号分子CAMP的药理学测定结果。IPSEN17能够有效的拯救多种MC4R突变受体，是一种潜在的MC4R药学伴侣分子，有望开发成治疗MC4R突变型肥胖的临床药物。用IPSEN171M，12H处理后，测定了MSH105M1012M，45MIN刺激下WT及突变受体包括S58C，E。
38、61K，N62S，I69T，P78L，C84R，T162I，R165W，W174C和C271Y在内的CAMP积累的剂量响应曲线。结果显示，在用IPSEN17处理后，突变受体的CAMP信号水平发生显著性提高。与未用IPSEN17处理的WT相比，处理后的WT与突变体的剂量响应曲线都发生了右移，且EC50的值提高了232倍。这是在用培养基洗过5次后的结果，表明IPSEN17与MSH很可能在与MC4R结合时是竞争性的关系。0103表4IPSEN17处理后的MC4R野生型WT及突变体的药理学分析0104说明书CN104147009A1110/10页120105备注表示与未用IPSEN17处理的野生型WT。
39、MC4R对照相比突变受体的CAMP产生水平具有显著性差异，P005。数据以多次实验N的SEM方式表示，未用IPSEN17处理的野生型WTMC4R的EMAX设为100对照，以9次实验结果计算所得。EC50代表每种受体CAMP水平达到最大值的50时，MSH的浓度。说明书CN104147009A121/6页1300010002序列表CN104147009A132/6页140003序列表CN104147009A143/6页150004序列表CN104147009A154/6页160005序列表CN104147009A165/6页170006序列表CN104147009A176/6页18序列表CN104147009A181/1页19图1说明书附图CN104147009A19。