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1、10申请公布号CN104151408A43申请公布日20141119CN104151408A21申请号201410391800022申请日20140811201310354725620130815CNC07K14/325200601C12N15/32200601C12N15/70200601C12N1/21200601C12N15/84200601A01H5/00200601A01N47/44200601A01P7/0420060171申请人浙江大学地址310027浙江省杭州市西湖区浙大路38号72发明人潘刚毛节景龚盼程方民74专利代理机构杭州天勤知识产权代理有限公司33224代理人胡红娟54。
2、发明名称苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白VIP3DAA及其编码基因和应用57摘要本发明公开了苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白VIP3DAA及其编码基因和应用。该苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO1所示，编码基因的碱基序列如SEQIDNO2所示。所述应用是苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白在制备杀虫剂中的应用，以及编码基因在培育抗虫转基因植物中的应用。与现有技术相比，本发明以VIP3D基因和VIP3AA1基因为蓝本，设计并合成嵌合基因VIP3DAA，嵌合基因VIP3DAA表达获得的VIP3DAA蛋白对鳞翅目昆虫、蚜虫具有较高的杀虫活性；嵌合基因VIP3DAA能在棉花、玉米、油菜和大豆等植。
3、物细胞中高效表达，可用于培育抗虫转基因植物。66本国优先权数据51INTCL权利要求书1页说明书6页序列表8页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表8页附图2页10申请公布号CN104151408ACN104151408A1/1页21苏云金芽孢杆菌BACILLUSTHURINGIENSIS营养期杀虫蛋白VIP3DAA，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO1所示。2如权利要求1所述苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白VIP3DAA的编码基因，其特征在于，碱基序列如SEQIDNO2所示。3含有如权利要求2所述编码基因的表达单元。4如权利要求3所述的表达单元。
4、，其特征在于，启动子为T7启动子、LAC启动子或ARABAD启动子。5含有如权利要求2所述编码基因的表达载体。6含有如权利要求2所述编码基因的转化子。7如权利要求2所述编码基因在培育抗虫转基因植物中的应用。8如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗虫转基因植物为抗虫转基因棉花、玉米、油菜或大豆。9如权利要求1所述苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白VIP3DAA在制备杀虫剂中的应用。10如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述杀虫剂的杀灭对象为蚜虫。权利要求书CN104151408A1/6页3苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白VIP3DAA及其编码基因和应用技术领域0001本发明涉及生物防治技术领域，具体。
5、涉及苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白VIP3DAA及其编码基因和应用。背景技术0002农作物病虫害是我国的主要农业灾害之一，它具有种类多、影响大、并时常暴发成灾的特点，其发生范围和严重程度对我国国民经济、特别是农业生产常造成重大损失。据统计，我国每年因病虫害损失粮食近500亿斤、各类经济作物1800万吨。过去为了防治作物的各种虫害，化学农药被广泛使用，然而，一方面由于长期大量使用农药，导致部分昆虫产生了一定的耐药性或抗性，致使农药的使用剂量在逐年增加或使用全新的农药；另一方面，由于长期过度使用化学农药，导致人类赖以生存的环境受到不同程度污染。因此，需要寻找更好的途径防控各种病虫害。随着生物技术的发。
6、展，利用抗虫基因培育抗虫转基因植物是一条行之有效的途径。0003苏云金芽孢杆菌BACILLUSTHURINGIENSIS，BT是植物外源抗虫基因的重要供体菌，其毒性活性主要源自芽胞形成时所产生的伴孢晶体毒素，即杀虫晶体蛋白INSECTICIDALCRYSTALLINEPROTEIN，ICP，包括晶体毒素CRYSTALLINETOXIN，CRY和细胞裂解毒素CYTOLYTICTOXIN，CYT。ICP是由CRY基因和CYT基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。0004已报道的杀虫晶体蛋白基因有748种，很多已广泛应用于抗虫转基因育种中。然而，由于大部分商业化利用的转基因作物均。
7、为杀虫晶体蛋白类，随着这些转基因作物种植面积的扩大，害虫对单一的杀虫蛋白产生抗性已成为一个严峻的问题。因此寻找新的抗虫基因显得尤为重要。0005科学家经过不懈的努力，从一些营养生长时期的BT菌株中分离得到具有杀虫毒性的非伴孢晶体杀虫蛋白，合成后即被分泌到胞外，这就是被称为第二代抗虫蛋白的苏云金芽胞杆菌的营养期杀虫蛋白VEGETATIVEINSECTICIDALPROTEIN，VIP。VIPS主要分为VIP1、VIP2、VIP3和VIP4四种类型共108个杀虫蛋白，其中77个蛋白属于VIP3。VIP3的杀虫谱和杀虫活性与ICPS不同，前者对鳞翅目、鞘翅目和同翅目等害虫具有毒杀作用，且抗虫谱更广。。
8、目前，这些基因被广泛应用于抗虫转基因水稻、玉米和棉花育种。0006然而，VIP3基因的资源毕竟是有限的，而且不同的基因间的抗性存在比较大的差异，同时细菌的基因是富含AT的，这势必影响基因在植物中的表达，对相应基因进行人工改造，可以进一步提高基因的利用效率。0007文献FANGETAL,CHARACTERIZATIONOFCHIMERICBACILLUSTHURINGIENSISVIP3TOXINS,APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,2007,733956961；方军，苏云金杆菌营养期杀虫蛋白VIP3基因及其在转基因水稻中的应用，2008，博士论文，浙江大学。
9、图书馆通过将VIP3AB2的N端或C端与VIP3AA1的C端或N端嵌合，人工合成VIP3ABAA说明书CN104151408A2/6页4和VIP3AAAB，结果表明，嵌合基因的杀虫谱更广，而且对部分昆虫的杀虫活性更高。因此，通过人工合成嵌合基因是改造VIP3基因的有效途径。发明内容0008本发明提供了一种苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白VIP3DAA，该苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白能在植物细胞中高效表达，对鳞翅目昆虫具有较高的杀虫活性。0009一种苏云金芽孢杆菌BACILLUSTHURINGIENSIS营养期杀虫蛋白VIP3DAA，其氨基酸序列如SEQIDNO1所示。0010本发明还提供了所述苏云。
10、金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白VIP3DAA的编码基因，其碱基序列如SEQIDNO2所示。该编码基因是通过以下思路设计并合成的00111获取VIP3D基因GENBANKACCESSIONNODQ054848中编码VIP3D蛋白N端257个氨基酸的771个碱基序列；00122获取VIP3AA1基因GENBANKACCESSIONNOL48811中编码VIP3AA1蛋白C端532个氨基酸的1596个碱基序列；00133嵌合步骤1和2获得的两个碱基序列，获得一个初步改造的原始碱基序列；00144排除所述原始碱基序列中存在的典型的造成植物基因转录本不稳定的富含AT的序列以及常用的限制性内切酶位点，在不改变氨。
11、基酸序列的前提下进行密码子置换，获取改进后的碱基序列；00155将改进后的碱基序列的正链和对应的负链进行BLAST2分析，在不改变氨基酸序列的前提下进行密码子置换，排除序列中存在的反向重复序列；最终获得如SEQIDNO2所示的碱基序列。0016步骤4和5中的密码子置换，是采用植物基因组的主要偏爱密码子置换所述原始碱基序列或改正后的碱基序列中对应的密码子，以提高所述编码基因在目标植物中的表达效率。0017本发明中，所述植物基因组的主要偏爱密码子为单子叶植物水稻刘庆坡，水稻的密码子用法及起始和终止密码子侧翼序列对基因表达的影响，2005，博士学位论文，浙江大学图书馆和双子叶植物拟南介DURETLA。
12、NDMOUCHIROUDDEXPRESSIONPATTERNAND,SURPRISINGLY,GENELENGTHSHAPECODONUSAGEINCAENORHABDITIS,DROSOPHILA,ANDARABIDOPSIS1999PNAS9644824487的核基因组均偏好的密码子。0018将获得的SEQIDNO2所示的碱基序列重组到大肠杆菌等宿主细胞中表达，即获得具有SEQIDNO1所示氨基酸序列的苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白VIP3DAA。0019所述编码基因的GC含量为5932，与现有的VIP3基因的最高同源性为8864；而所述原始碱基序列的GC含量仅为3084，两者的同源性仅为6。
13、855。0020所述苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白VIP3DAA与现有的VIP3蛋白即VIP3AA1蛋白的最高同源性为963，与VIP3D蛋白的同源性925。0021本发明还提供了含有所述编码基因的表达单元、表达载体或转化子。作为优选，所述表达单元的启动子为T7启动子、LAC启动子或ARABAD启动子。在这些启动子的作用下，说明书CN104151408A3/6页5VIP3DA蛋白可以直接在大肠杆菌宿主细胞中实现胞内可溶表达。所述表达载体的原始载体可选用PET28A。0022本发明还提供了所述编码基因在培育抗虫转基因植物中的应用，包括00231构建含有所述编码基因的植物表达载体；00242将所述植。
14、物表达载体通过农杆菌介导转化植物愈伤组织；00253将植物愈伤组织转移到选择性培养基上继续培养，待分化成苗后，移栽至大田，筛选获得抗虫转基因植物。0026由于在设计所述编码基因时，是采用单子叶模式植物水稻和双子叶模式植物拟南介核基因组的共同偏好密码子进行密码子置换，因此该编码基因适合单子叶植物和双子叶植物，用于培育相应抗虫转基因植物。作为优选，所述抗虫转基因植物为抗虫转基因棉花、玉米、油菜或大豆。0027本发明还提供了所述苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白VIP3DAA在制备杀虫剂中的应用。所述杀虫剂的杀灭对象优选为鳞翅目昆虫。所述鳞翅目昆虫如斜纹夜蛾、菜青虫、棉铃虫、小地老虎和玉米螟等，更优选为斜。
15、纹夜蛾。所述杀虫剂的杀灭对象更优选为蚜虫。0028与现有技术相比，本发明的有益效果为0029本发明以VIP3D基因和VIP3AA1基因为蓝本，设计并合成嵌合基因VIP3DAA，嵌合基因VIP3DAA表达获得的VIP3DAA蛋白对鳞翅目昆虫、蚜虫具有较高的杀虫活性；嵌合基因VIP3DAA能在棉花、玉米、油菜和大豆等植物细胞中高效表达，可用于培育相应的抗虫转基因植物。附图说明0030图1为VIP3AA1、VIP3D和VIP3DAA蛋白质的氨基酸序列比对图；0031图2A为转基因棉花对草甘膦的抗性结果图；0032图2B为非转基因棉花对草甘膦的抗性结果图；0033图3A为非转基因棉花对蚜虫的抗性结果图。
16、；0034图3B为转基因棉花对蚜虫的抗性结果图。具体实施方式0035以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术，在AUSUBEL编写的由JOHNWTLEYANDSONS公司出版的CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY和JSAMBROOK等编写的由COLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS2001出版的MOLECULARCLONINGALABORATORYMANNUAL,3RDED等文献均有详细的说明。以下实施例中所用的实验材料如无特殊说明均为市售购买产品。0036实施例1嵌合基因的设计和合成0037以VIP3D基因和VIP3AA1。
17、基因为蓝本，设计嵌合基因VIP3DAA，具体步骤如下00381获取VIP3D基因GENBANKACCESSIONNODQ054848中编码VIP3D蛋白N端257个氨基酸的771个碱基序列；00392获取VIP3AA1基因GENBANKACCESSIONNOL48811中编码VIP3AA1蛋白C端532个氨基酸的1596个碱基序列；说明书CN104151408A4/6页600403嵌合步骤1和2获得的两个碱基序列，获得一个初步改造的原始碱基序列，如SEQIDNO3所示，该序列的GC含量仅为3084；00414在不改变氨基酸序列的前提下，将所述原始碱基序列中存在的典型的造成植物基因转录本不稳定的。
18、富含AT的序列以及常用的限制性内切酶位点置换为单子叶植物水稻刘庆坡，水稻的密码子用法及起始和终止密码子侧翼序列对基因表达的影响，2005，博士学位论文，浙江大学图书馆和双子叶植物拟南介DURETLANDMOUCHIROUDDEXPRESSIONPATTERNAND,SURPRISINGLY,GENELENGTHSHAPECODONUSAGEINCAENORHABDITIS,DROSOPHILA,ANDARABIDOPSIS1999PNAS9644824487核基因组均偏好的密码子，获得改进后的碱基序列；00425将改进后的碱基序列的正链和对应的负链进行BLAST2分析，在不改变氨基酸序列的前提。
19、下，将序列中存在的反向重复序列置换为单子叶植物水稻和双子叶植物拟南介核基因组均偏好的密码子，获得最终的嵌合基因VIP3DAA，如SEQIDNO1所示，该序列与SEQIDNO3所示的序列同源性仅有6855。SEQIDNO1所示的序列及含有该DNA片段的质粒PUCVIP3DAA均委托生工生物工程上海有限公司完成。0043实施例2嵌合基因的表达0044利用实施例1获得的VIP3DAA嵌合基因表达云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白VIP3DAA，具体包括0045将VIP3DAA嵌合基因构建到大肠杆菌质粒表达载体PET28A上，并转化大肠杆菌表达宿主BL21DE3；接种单菌落于5毫升LB培养基中，37培养过夜，。
20、再按1100比例进行稀释培养至OD600为0406，而后加入终浓度为1MM的IPTG进行诱导表达，诱导时间为46小时；离心收集菌体，加入20ML无菌水重悬，液氮反复冻融6次，离心去菌体，获取上清液。0046VIP3DAA蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO1所示。将VIP3DAA蛋白的氨基酸序列分别与VIP3AA1蛋白和VIP3D蛋白进行BLAST2比对，在蛋白质水平的同源性分别为963和925见图1。0047实施例3VIP3DAA蛋白的杀虫活性0048将实施例2获得的上清液喂养鳞翅目昆虫斜纹夜蛾，并以清水、转化有PET28A空载体的大肠杆菌的发酵上清液为对照，检测VIP3DAA蛋白对斜纹夜蛾的杀。
21、虫活性，结果见表1。0049表1三种样品对斜纹夜蛾的杀虫活性比较0050说明书CN104151408A5/6页70051从表1可看出，VIP3DAA蛋白对斜纹夜蛾具有显著的杀虫活性，喂食24H后斜纹夜蛾的平均死亡率达867，喂食48H后斜纹夜蛾的平均死亡率达100。而喂食其他两种样品的斜纹夜蛾，死亡率较低。0052实施例4用于培育抗虫转基因棉花00531载体的构建0054根据SEQIDNO1的序列，分别合成两条引物引物序列委托海桑尼生物科技有限公司合成，从质粒PUCVIP3DAA中PCR扩增出VIP3DAA基因，引物序列如下0055上游引物00565CACGGGGGACTCTAGAACAATG。
22、AACATGAACAACACTAAG3SEQIDNO4；0057下游引物00585CGGGGGATCCTCTAGTCACTTGATAGAAACGTCGTA3SEQIDNO5；0059PCR反应体系为00600061PCR反应参数006298，10秒，55，15秒，72，2分30秒，35个循环；72延伸5分钟。0063PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后，以XBAI酶切双TDNA载体PLMB001，用CLONTECH的HDCLONINGKIT将VIP3DAA克隆到PLMB001，用XBAI酶切鉴定，获得的阳性克隆再测序PE公司，377测序仪；上海生工生物工程技术服务有限公司验证，测序正确的质粒。
23、命名为PLMVIP3DAA。00642农杆菌制备0065通过电激法将载体PLMVIP3DAA导入农杆菌LBA4404，取含载体PLMVIP3DAA的农杆菌划板，挑单菌落在LB培养基中培养，为棉花转化准备农杆菌。说明书CN104151408A6/6页800663转基因棉花的获得00671选取陆地棉品种柯字312无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0506CM小段，接种于诱导培养基上MSB5有机物2,4D01MG/LKT01MG/L葡萄糖30G/LPHYTAGEL25G/L诱导愈伤组织；0068愈伤组织在继代培养基MS硝酸钾加倍，硝酸铵减半B5有机物2,4D005MG/LKT01MG/L葡萄糖30G/LP。
24、HYTAGEL25G/L继代几次后，挑选米粒状颗粒愈伤组织，将其转入分化培养基MSB5有机物葡萄糖30G/LPHYTAGEL25G/LKT015MG/LIBA05MG/L中，进一步分化成胚状体；00692超低温冰箱内取出保存的农杆菌菌株的甘油管在冰上融化，LB平皿上划线，265暗培养3648HR，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在另外的LB平皿划线，265暗培养3648HR，待皿内长出足够的菌落结束培养，把培养基表面菌落刮入三角瓶内的MGL培养基中，27、200R/MIN摇2HR，OD值在0515之间即可用于侵染；00703将分化成胚状体的愈伤组织从三角瓶转入无菌培养皿，去掉幼胚，发白和死亡。
25、等状态不好的愈伤组织，吹5分钟使表面稍为微干燥；把经活化的农杆菌菌液倒入其中，农杆菌菌液以刚盖过胚状体表面为宜，搅匀，静置510分钟，倒掉菌液，用滤纸吸干残余菌液，吹5分钟使表面稍为干燥，薄层分散于垫有滤纸的共培养培养基中，1921暗培养3842小时，待少部分愈伤组织表面出现不太明显的菌落结束共培养；00714将经过共培养的愈伤组织连同滤纸一起取出浸入含500MG/LCEF的无菌水中，将愈伤组织清洗干净，倒掉洗液，置于含有500MG/LCEF的无菌水浸泡1520MIN；浸泡期间多搅动，去掉幼胚，发白和死亡等状态不好的愈伤组织；倒掉洗液，用无菌水清洗三遍，滤纸吸干水分，小堆分散布于选择培养基一上。
26、，吹10分钟使表面稍为干燥；弱光培养20天左右继代转入选择培养基二正常光照培养，培养20天左右继代转入选择培养基三正常光照培养，培养2030天，黑色死亡愈伤上出现浅黄色颗粒较小生长正常的愈伤即为抗性愈伤。一般可以把抗性愈伤单克隆在选择培养基三上再继代一次以增加愈伤数量；00725从选择培养基上挑取单克隆抗性愈伤分别接种到分化培养基上，20天左右继代一次，分化和成苗的过程中尽量把不同克隆之间区分清楚；00736把筛选后获得的抗性愈伤转移到预分化培养基上先暗培养57天，而后16小时光照分化发芽46周，待抗性幼苗长成后转移到生根培养基上生根，最后将再生植株洗去培养基于温室或田间培养，直至收获T1种子。
27、；00747将T1代种子种于大田，用标记基因和目的基因的特异引物鉴定转基因后代中的标记基因和目的基因，获得抗虫转基因棉花。00754转基因棉花的抗性鉴定0076将第3部分步骤7获得的抗虫转基因棉花种子种于大田，用草甘膦上述标记基因的表达产物对草甘膦具有抗性涂抹转基因后代，获得稳定表达的转基因纯系如图2A和图2B。由图2A和图2B可见，转基因后代对草甘膦具有抗性。0077同时，田间鉴定转基因后代对蚜虫的抗性见图3A和图3B。由图3A和图3B可见，转基因后代明显没有蚜虫危害，对蚜虫具有显著的抗性。说明书CN104151408A1/8页900010002序列表CN104151408A2/8页100003序列表CN104151408A103/8页110004序列表CN104151408A114/8页120005序列表CN104151408A125/8页130006序列表CN104151408A136/8页140007序列表CN104151408A147/8页150008序列表CN104151408A158/8页16序列表CN104151408A161/2页17图1说明书附图CN104151408A172/2页18图2A图2B图3A图3B说明书附图CN104151408A18。