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1、10申请公布号CN104152411A43申请公布日20141119CN104152411A21申请号201410387444522申请日20140808C12N5/0783201001A61K39/00200601A61P35/0020060171申请人烟台博毓生物科技有限公司地址264003山东省烟台市高新区科技大道39号山东国际生物科技园72发明人张增明方志明54发明名称一种自体树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞的制备方法及其应用57摘要本发明提供了一种自体树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞制备方法，其中包括如下特征来自于癌症患者自身的肿瘤浸润性T淋巴细胞，在使用自体肿瘤抗原负载的树突状。
2、细胞作为滋养层细胞和白介素2作用下激活大量扩增，具有高活性的抗肿瘤细胞毒性应答；本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的自体肿瘤浸润性T淋巴细胞的试剂盒，具有高效的抗肿瘤功能。51INTCL权利要求书2页说明书8页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书8页附图4页10申请公布号CN104152411ACN104152411A1/2页21一种自体树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，使用自体肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞和白介素2，激活扩增肿瘤浸润性T淋巴细胞，使肿瘤浸润性T淋巴细胞得以大量增殖，培养到20天细胞数达到5108以上。
3、，增殖倍数达到1000倍以上，并具有高活性的抗肿瘤细胞毒性应答。2根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中以树突状细胞负载了自体肿瘤抗原，并在树突状细胞膜上高表达的CD80、CD83、CD86和CD137L多肽，及其加工的肿瘤抗原表位，通过强酸，强碱和/或辐照、及通过高速离心收集树突状细胞进行纯化收集。3根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中肿瘤浸润性T淋巴细胞和自体肿瘤抗原来源于癌症患者手术后新鲜自体肿瘤组织。新鲜自体肿瘤组织使用眼科剪剪碎成1MM3的小块，所得剪碎的组织小块用025质量体积比胰酶或100活性单位/MLI型胶原酶溶液以1克05ML的重量体积比消化30分钟后，。
4、加入消化液溶液体积1/5的小牛血清终止，消化液过10M细胞筛，并用5ML1PBSPH74洗涤两次，过滤后的溶液以1000RPM离心收集细胞沉淀，加入AIMV培养基重悬至10ML，单细胞悬液经连续密度梯度离心分离得到肿瘤浸润性T淋巴细胞和肿瘤细胞。肿瘤细胞用AIMV培养基液稀释成细胞浓度为2106/ML的细胞悬液，分装于冻存管，严密封口，用液氮行快速冷冻，室温慢融，反复冻融35次，5000RPM离心10分钟后取上清，加入到15ML离心管中制备成自体肿瘤抗原，于80储存，用于负载树突状细胞。4根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述自体肿瘤抗原负载的树突状细胞与肿瘤浸润性T淋巴细胞首。
5、先共培养5天，所述树突状细胞与淋巴细胞的用量比例为树突状细胞数淋巴细胞数1101，更优选地，为树突状细胞数淋巴细胞数3151。共培养5天后，将肿瘤浸润性T淋巴细胞用5ML移液管吸出至新培养瓶中，并补充1020ML新鲜淋巴细胞培养基含50500活性单位/ML白介素2，在37、5CO2培养箱中继续培养23天；继续补充2040ML新鲜细胞培养基含50500活性单位/ML白介素2，在37、5CO2培养箱中继续培养23天；然后肿瘤浸润性T淋巴细胞连续增殖培养到1821天，使得细胞数达到5108以上。5根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述自体肿瘤抗原负载的树突状细胞，优选地，加入到细胞培。
6、养板中使用包括强酸、强碱和/或辐照处理，将自体肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞。6一种制备自体肿瘤浸润性T淋巴细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括A液为淋巴细胞培养基；B液为GMCSF和IL4混合液；C液为肿瘤坏死因子溶液；D液为白介素2溶液；E液为组织消化液；F液为淋巴细胞分离液；G液为生理盐水；细胞培养板以及使用说明书；权利要求书CN104152411A2/2页3其中，所述使用说明书包括权利要求35所述的方法。试剂盒组分分装试剂盒规格为1次/盒，各组分的量为A液500ML/1瓶，B液05ML/1支，C液05ML/1支，D液05ML/1支，E液1ML/1支，F液20ML/1瓶，G液。
7、100ML/1瓶；分装后进行包装，得到自体肿瘤抗原负载的树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞的试剂盒。经培养获得的自体肿瘤抗原负载的树突状细胞，优选地，还包括强酸，强碱和/或辐照处理后自体肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞的培养板，如24孔细胞培养板、12孔细胞培养板和6孔细胞培养板等。7根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述自体肿瘤抗原负载的树突状细胞，优选地，还包括强酸，强碱和/或辐照处理后自体肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞的培养板，如24孔细胞培养板、12孔细胞培养板和6孔细胞培养板等。8根据权利要求17中任一项所述的方法制备的肿瘤浸润性T淋巴细胞，可用于治疗癌症的药物的制备中。
8、的应用。权利要求书CN104152411A1/8页4一种自体树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞的制备方法及其应用技术领域0001本发明涉及一种自体树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞的制备方法，其中包括如下特征来自于癌症患者手术后新鲜自体肿瘤组织分离得到的浸润性T淋巴细胞，在自体肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞和白介素2作用下激活大量扩增，具有高活性抗肿瘤细胞毒性应答；本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的自体肿瘤浸润性T淋巴细胞的试剂盒，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内的免疫治疗。背景技术0002肿瘤浸润性T淋巴细胞TUMORINLTRATINGLYMPHOCYTES，TIL在体。
9、外加白介素2INTERLEUKIN2，IL2培养扩增后，其抗肿瘤作用比LAK细胞强50100倍，而且只需要小量的IL2就可以发挥作用，并且因其对自身肿瘤靶细胞具有特异性，成为国内外肿瘤生物研究的热点，并在临床治疗中得到使用。0003TIL细胞主要含有CD8、CD4T淋巴细胞和NK细胞等，治疗对黑素瘤、肺癌、肾癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌和白血病等肿瘤治疗有明显疗效。TIL细胞数量和杀伤功能与疗效直接相关，治疗中存在的问题在于获得大量TIL细胞有限和培养时间过长。TIL细胞体外扩增至5108平均需59天，扩增至5109则平均需80天，TIL在含IL2的培养基中经过一段时间培养后出现选择性扩增。
10、T淋巴细胞，CD3占80以上，CD4和CD8占50以上，NK细胞扩增低下，占不到10左右。因而传统使用的小剂量白介素2激活生长倍数有限，培养时间过长引起了TIL细胞杀伤功能低下。0004本发明提供了以自体肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞，在小剂量IL2作用下大量扩增TIL细胞，培养至20天细胞增殖到5108以上，增殖倍数达到1000倍以上，TIL细胞杀瘤活性在20天达到最佳，为患者临床治疗大大节约了时间，并发挥出最好的抗肿瘤作用，有助于提高临床疗效和延长患者生存期，而且可以大大降低细胞培养成本。发明内容0005本发明针对现有技术增殖培养TIL细胞的不足，特别是因TIL细胞扩增到临床治疗需。
11、要的细胞数量而培养时间过长，含IL2的培养基选择性扩增T淋巴细胞占有比例很低，因而产生的杀瘤活性低下。本发明通过前期研究实验发现自体肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞，作为滋养层细胞和低剂量IL2作用下培养TIL细胞，培养至20天细胞增殖倍数达到1000倍以上，TIL细胞数达到5108以上足以满足临床抗肿瘤的作用，保证癌症患者临床治疗疗效。0006自体肿瘤抗原负载的树突状细胞膜上高表达的CD80、CD83、CD86和CD137L多肽，及其加工的肿瘤抗原表位，将可以激活T淋巴细胞大量扩增和具有高活性的抗肿瘤细胞毒性应答。将该树突状细胞作为滋养层细胞，可产生对肿瘤细胞最佳的杀伤活性。0007本。
12、发明涉及一种自体树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞增殖的制备方法，其说明书CN104152411A2/8页5特征在于，使用自体肿瘤抗原负载的树突状细胞和白介素2，扩增激活肿瘤浸润性T淋巴细胞，使肿瘤浸润性T淋巴细胞得以大量增殖。0008本发明所述的自体肿瘤抗原负载的树突状细胞，通过强酸，强碱和/或辐照、及通过高速离心收集树突状细胞，作为TIL激活扩增的滋养层细胞。0009本发明所述方法中肿瘤浸润性T淋巴细胞来源于癌症患者手术后新鲜自体肿瘤组织。0010新鲜自体肿瘤组织使用眼科剪剪碎成1MM3的小块，所得剪碎的组织小块用025质量体积比胰酶或100活性单位/MLI型胶原酶溶液以1克05ML的重量。
13、体积比消化30分钟后，加入消化液溶液体积1/5的小牛血清终止，消化液过10M细胞筛，并用5ML1PBSPH74洗涤两次，过滤后的溶液以1000RPM离心收集细胞沉淀，加入AIMV培养基重悬至10ML，单细胞悬液经连续密度梯度离心分离得到肿瘤浸润性T淋巴细胞和自体肿瘤细胞。0011肿瘤细胞用AIMV培养基液稀释成细胞浓度为2106/ML的细胞悬液，分装于冻存管，严密封口，用液氮行快速冷冻，室温慢融，反复冻融35次，5000RPM离心10分钟后取上清，加入到15ML离心管中制备成自体肿瘤抗原，于80储存，用于负载树突状细胞。0012本发明所述自体肿瘤抗原负载的树突状细胞与浸润性T淋巴细胞首先共培养。
14、5天，所述树突状细胞与淋巴细胞的用量比例为树突状细胞数淋巴细胞数1101，更优选地，为树突状细胞数淋巴细胞数3151。0013共培养5天后，将浸润性T淋巴细胞用5ML移液管吸出至新培养瓶中，并补充1020ML新鲜淋巴细胞培养基含50500活性单位/ML白介素2，在37、5CO2培养箱中继续培养23天；继续补充2040ML新鲜细胞培养基含50500活性单位/ML白介素2，在37、5CO2培养箱中继续培养23天；然后肿瘤浸润性T淋巴细胞连续增殖培养到1821天，使得细胞数达到5108以上。0014优选地，本发明所述自体肿瘤抗原负载的树突状细胞用淋巴细胞培养基重悬，加入到细胞培养板中，使用包括强酸、。
15、强碱和/或辐照处理，将自体肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞。0015本发明使用的细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基或RPMI1640培养基加入50500活性单位/ML白介素2和10体积比自体血清或胎牛血清，优选地，细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基，如AIMV、XVIVO和GTT551等，含有500活性单位/ML白介素2。0016本发明还提供了一种制备自体肿瘤浸润性T淋巴细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括0017A液为淋巴细胞培养基；0018B液为GMCSF和IL4混合液；0019C液为肿瘤坏死因子溶液；0020D液为白介素2溶液；0021E液为组织消化液；0022F液为淋巴细胞分离液。
16、；0023G液为生理盐水；说明书CN104152411A3/8页60024细胞培养板以及使用说明书；0025其中，所述使用说明书包括本发明中所述的方法。0026试剂盒组分分装试剂盒规格为1次/盒，各组分的量为A液500ML/1瓶，B液05ML/1支，C液05ML/1支，D液05ML/1支，E液1ML/1支，F液20ML/1瓶，G液100ML/1瓶；分装后进行包装，得到自体肿瘤抗原负载的树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞的试剂盒。0027经培养获得的自体肿瘤抗原负载的树突状细胞，优选地，还包括强酸、强碱和/或辐照处理后自体肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞的培养板，如24孔细胞培养板、12孔。
17、细胞培养板和6孔细胞培养板等。0028本发明还提供了上述方法及其试剂盒制备TIL细胞，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内的多个疗程的免疫治疗。附图说明0029图1表示本发明实施例一制备的实施例细胞表型流式细胞仪检测流式图；0030图2表示发明实施例2制备的肿瘤细胞增殖图；0031图3表示本发明实施例三制备的TIL细胞表型流式细胞仪检测流式图；0032图4表示本发明附子多糖诱导培养的NKT细胞酶联免疫斑点试验检测干扰素分泌结果图。具体实施方式0033本发明发现通过自体肿瘤抗原负载的树突状细胞可以作为人工抗原递呈细胞，可以促进CD8A、NK细胞和CD4中TH1细胞大量增殖，抑制TIL细胞中调节。
18、性T淋巴细胞的增殖和产生，延长TIL细胞端粒酶活性，产生对肿瘤细胞最佳的杀伤活性。TIL细胞培养至20天细胞增殖倍数达到1000倍以上，TIL细胞数达到5108以上满足临床治疗需要，可用于多次抗肿瘤临床应用。0034对本发明涉及的一种自体肿瘤浸润性T淋巴细胞增殖的制备方法进行具体说明。本发明涉及采用自体肿瘤抗原负载的树突状细胞和白介素2，扩增激活肿瘤浸润性T淋巴细胞，使得CD8A、NK细胞和CD4中TH1细胞大量扩增，获得具有抗肿瘤作用的TIL细胞。0035本发明涉及一种自体肿瘤浸润性T淋巴细胞增殖的制备方法，其特征在于，使用自体肿瘤抗原负载的树突状细胞和白介素2，扩增激活肿瘤浸润性T淋巴细胞。
19、，使肿瘤浸润性T淋巴细胞得以大量增殖。0036本发明所述的自体肿瘤抗原负载的树突状细胞膜上高表达的CD80、CD83、CD86和CD137L多肽，及其加工的肿瘤抗原表位，将可以激活T淋巴细胞大量扩增和具有高活性的抗肿瘤细胞毒性应答。通过强酸，强碱和/或辐照、及通过高速离心收集树突状细胞进行处理，作为TIL激活扩增的滋养层细胞。0037本发明所述方法中肿瘤浸润性T淋巴细胞来源于癌症患者手术后新鲜自体肿瘤组织。0038新鲜自体肿瘤组织使用眼科剪剪碎成1MM3的小块，所得剪碎的组织小块用025质量体积比胰酶或100活性单位/MLI型胶原酶溶液以1克05ML的重量体积比说明书CN104152411A4。
20、/8页7消化30分钟后，加入消化液溶液体积1/5的小牛血清终止，消化液过10M细胞筛，并用5ML1PBSPH74洗涤两次，过滤后的溶液以1000RPM离心收集细胞沉淀，加入AIMV培养基重悬至16ML，制备成单细胞悬液。0039用5ML移液管取5ML淋巴细胞分离液加入到15ML离心管中，再向其中缓慢加入8ML单细胞悬液，1600RPM转每分钟离心25分钟，经连续密度梯度离心后，中间白膜层为肿瘤浸润性T淋巴细胞，下层沉淀的细胞为自体肿瘤细胞。0040肿瘤细胞用AIMV培养基液稀释成细胞浓度为2106/ML的细胞悬液，分装于冻存管，严密封口，用液氮行快速冷冻，室温慢融，反复冻融35次，5000RP。
21、M离心10分钟后取上清，加入到15ML离心管中制备成自体肿瘤抗原，于80储存，用于负载树突状细胞。0041来自肿瘤患者100ML外周血经FICOLLHYPAQUE密度梯度离心，得到单个核细胞。外周血单个核细胞用RPMI1640培养基重悬，贴壁细胞加入完全培养基诱导培养，含有1000IU/MLGMCSF、500IU/MLIL4，放置37、5CO2培养箱中，培养五天后收获未成熟树突状细胞。计数后，35106未成熟树突状细胞加入500L制备好的自体肿瘤抗原，负载树突状细胞，放置37、5CO2培养箱中培养24小时，加入20NG/ML肿瘤坏死因子培养12小时，制备得到成熟树突状细胞。0042本发明所述自。
22、体肿瘤抗原负载的树突状细胞与浸润性T淋巴细胞首先共培养5天，所述树突状细胞与淋巴细胞的用量比例为树突状细胞数淋巴细胞数1101，更优选地，为树突状细胞数淋巴细胞数3151。0043优选地，本发明所述自体肿瘤抗原负载的树突状细胞用淋巴细胞培养基重悬，加入到细胞培养板中，使用包括强酸、强碱和/或辐照处理，将自体肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞。0044共培养5天后，将浸润性T淋巴细胞用5ML移液管吸出至新培养瓶中，并补充1020ML新鲜细胞培养基含50500IU/ML白介素2，在37、5CO2培养箱中继续培养23天；继续补充2040ML新鲜细胞培养基含50500活性单位/ML白介素2，在37。
23、、5CO2培养箱中继续培养23天；然后肿瘤浸润性T淋巴细胞连续增殖培养到1821天，使得细胞数达到5108以上。0045本发明使用的细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基或RPMI1640培养基加入50500活性单位/ML白介素2和10体积比自体血清或胎牛血清，优选地，细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基，如AIMV、XVIVO和GTT551等，含有500活性单位/ML白介素2。0046本发明还提供了一种制备自体肿瘤抗原负载的树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括0047A液为淋巴细胞培养基；0048B液为GMCSF和IL4混合液；0049C液为肿瘤坏死因子溶液；0050。
24、D液为白介素2溶液；0051E液为组织消化液；0052F液为淋巴细胞分离液；0053G液为生理盐水；说明书CN104152411A5/8页80054细胞培养板以及使用说明书；0055其中，所述使用说明书包括本发明中所述的方法。0056试剂盒组分分装试剂盒规格为1次/盒，各组分的量为A液500ML/1瓶，B液05ML/1支，C液05ML/1支，D液05ML/1支，E液1ML/1支，F液20ML/1瓶，G液100ML/1瓶；分装后进行包装，得到自体肿瘤抗原负载的树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞的试剂盒。0057经培养获得的自体肿瘤抗原负载的树突状细胞，优选地，还包括强酸、强碱和/或辐照处理后自体。
25、肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞的培养板，如24孔细胞培养板、12孔细胞培养板和6孔细胞培养板等。0058作为本发明TIL细胞扩增培养中使用的细胞培养板、细胞培养皿、培养瓶、细胞培养袋，可例举，为75CM2细胞培养瓶、175CM2细胞培养瓶、250ML细胞培养袋等细胞培养用器材容器，均可用于本发明，优选细胞培养袋。0059本发明的制造方法中对TIL细胞进行冻存，对冻存液无特殊限制，但优选例如为50小牛血清、40细胞培养液和10二甲基亚砜，其中细胞培养液更优选为TIL细胞培养液。0060在培养基中可以添加血清或血浆进行培养。它们在培养基中的添加量不受特殊限制，如大于0容量至20容量，且可以。
26、根据不同的培养阶段而改变血清或血浆的用量，优选为5体积比。例如，可以阶段性减少血清或血浆浓度来使用。另外，作为血清或血浆的来源，可以是自己意味着与所培养的细胞来源相同或非自己意味着与所培养的细胞的来源不同中的任一种，从安全性的观点出发，优选自己来源的血清或血浆。另外，也可以添加如人血清白蛋白之类经分离纯化的血清成分。0061本发明的自体TIL细胞增殖的制备使用上述各种成分及培养基来实施。本发明中使用的培养培养条件也没有特殊限制，可以使用通常的细胞培养中使用的条件。例如，可在37、5CO2等条件下培养。还可以实施如下等操作间隔适当的时间添加新鲜培养基来稀释细胞培养液，或更换培养基，或更换细胞培养。
27、用器材等。0062本发明还提供TIL细胞在临床应用中多次的抗肿瘤治疗，更好地在生物体内发挥抗肿瘤免疫应答，达到很好的治疗效果。此外，上述TIL细胞还具有如下优点，多次TIL细胞治疗将更好地引发CD8、TH1细胞免疫应答和NK细胞杀瘤活性，抑制调节性T淋巴细胞免疫抑制活性，产生高效、长效地抗肿瘤免疫效应，因此非常利于患者疗效的提高和生存期的延长。0063以下，结合实施例对本发明做更具体的描述，但本发明不限于此。0064实施例一自体肿瘤浸润性T淋巴细胞的制备0065采集乳腺癌、肺癌、黑色素瘤和肝癌患者各1名的新鲜自体肿瘤组织与其签署了知情同意书，使用眼科剪剪碎成1MM3的小块，所得剪碎的组织小块用。
28、025质量体积比胰酶或100活性单位/MLI型胶原酶溶液以1克05ML的重量体积比消化30分钟后，加入消化液溶液体积1/5的小牛血清终止，消化液过10M细胞筛，并用5ML1PBSPH74洗涤两次，过滤后的溶液以1000RPM离心收集细胞沉淀，加入AIMV培养基美国LIFE公司重悬至16ML，制备成单细胞悬液。0066用5ML移液管取5ML淋巴细胞分离液加入到15ML离心管中，再向其中缓慢加入说明书CN104152411A6/8页98ML单细胞悬液，1600RPM转每分钟离心25分钟，经连续密度梯度离心后，中间白膜层为肿瘤浸润性T淋巴细胞，下层沉淀的细胞为自体肿瘤细胞。0067肿瘤浸润性T淋巴细。
29、胞用10ML1PBSPH74洗涤1次，1000RPM、4下离心10分钟，细胞用2MLAIMV培养基重悬。取10UL细胞液用1PBSPH74稀释10倍，稀释液加入1倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活细胞，细胞活率均达到98以上。0068取苔盼兰染色计数后的06106肿瘤浸润性T淋巴细胞，分三组，第一组分别添加到有20LFITC标记鼠抗人CD3单抗、20LPE标记鼠抗人CD56单抗和20LPERCP标记鼠抗人CD8单抗；第二组分别添加20LFITC标记鼠抗人CD3单抗、20LPE标记鼠抗人CD4单抗和20LPERCP标记鼠抗人CD2。
30、5单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20LFITC标记鼠IGG1、20LPE标记鼠IGG1和20LPERCP标记鼠IGG1。置于4冰箱染色30分钟，然后用1ML的1磷酸盐缓冲液PBS洗涤三次，最后用05ML的1PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCALIBUR流式细胞仪美国BD公司检测。图1结果显示，乳腺癌患者来源分离得到的TIL细胞表型为CD3细胞为8777，CD3/CD8细胞为5452，CD56细胞为1209，CD3/CD4细胞为7817和CD4/CD25细胞为2769，表明TIL细胞中CD3/CD8细胞和CD56NK细胞含量比较低下。0069实施例二自体肿瘤抗原负载树突状。
31、细胞的制备0070实施例一中获得肿瘤细胞用AIMV培养基液稀释成细胞浓度为2106/ML的细胞悬液，分装于冻存管，严密封口，用液氮行快速冷冻，室温慢融，反复冻融35次，5000RPM离心10分钟后取上清，加入到15ML离心管中制备成自体肿瘤抗原，于80储存，用于负载树突状细胞。0071来自肿瘤患者100ML外周血经FICOLLHYPAQUE密度梯度离心，得到单个核细胞。外周血单个核细胞用AIMV培养基重悬，贴壁细胞加入完全培养基诱导培养，含有1000IU/MLGMCSF、500IU/MLIL4，放置37、5CO2培养箱中，培养五天后收获未成熟树突状细胞。计数后，35106未成熟树突状细胞加入5。
32、00L制备好的自体肿瘤抗原，负载树突状细胞，放置37、5CO2培养箱中培养24小时，加入20NG/ML肿瘤坏死因子培养12小时，收获成熟树突状细胞，1000RPM离心10分钟后弃上清，用制备得到成熟树突状细胞。0072取苔盼兰染色计数后的06106树突状细胞，分三组，第一组分别添加到有20LFITC标记鼠抗人CD80单抗、20LPE标记鼠抗人CD86单抗和20LPERCP标记鼠抗人CD11C单抗；第二组分别添加20LFITC标记鼠抗人CD137L单抗、20LPE标记鼠抗人CD83单抗和20LPERCP标记鼠抗人CD11C单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20LFITC标记鼠IGG1、20LP。
33、E标记鼠IGG1和20LPERCP标记鼠IGG1。置于4冰箱染色30分钟，然后用1ML的1磷酸盐缓冲液PBS洗涤三次，最后用05ML的1PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCALIBUR流式细胞仪检测。检测结果显示，树突状细胞表型为CD80为961、CD86为988、CD83为86和CD137L为86，表明通过本发明技术得到细胞为成熟树突状细胞，并高表达各类共刺激分子。0073实施例三自体肿瘤浸润性T淋巴细胞大量增殖培养0074取实施例二中制备的6106成熟树突状细胞用3MLAIMV培养基重悬，每孔05ML加入到6孔细胞培养板中，浸润细胞培养板底面，使用100GY射线辐照处理，将。
34、自体肿瘤说明书CN104152411A7/8页10抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞。向6孔细胞培养板每孔中加入3106肿瘤浸润性T淋巴细胞，每孔为3ML的AIMV培养基含500活性单位/ML白介素2。自体肿瘤抗原负载的树突状细胞与肿瘤浸润性T淋巴细胞首先共培养5天。0075激活培养5天后，将浸润性T淋巴细胞用5ML移液管吸出至新培养瓶中，并补充1020ML新鲜AIMV培养基含500活性单位/ML白介素2，在37、5CO2培养箱中继续培养23天；继续补充2040ML新鲜AIMV培养基含500活性单位/ML白介素2，在37、5CO2培养箱中继续培养23天；然后肿瘤浸润性T淋巴细胞连续增殖培养到1。
35、821天。0076取10UL细胞液用1PBSPH74稀释10倍，稀释液加入1倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活细胞，细胞活率均达到98以上。图2结果显示，随着TIL细胞体外培养时间增加，扩增倍数也不断增加，实施例一中四名肿瘤患者TIL细胞培养到20天，细胞扩增倍数均高于1100倍，每位患者的TIL细胞数均高于5108。0077取经激活扩增的06106肿瘤浸润性T淋巴细胞，分三组，第一组分别添加到有20LFITC标记鼠抗人CD3单抗、20LPE标记鼠抗人CD56单抗和20LPERCP标记鼠抗人CD8单抗；第二组分别添加20LFIT。
36、C标记鼠抗人CD3单抗、20LPE标记鼠抗人CD4单抗和20LPERCP标记鼠抗人CD25单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20LFITC标记鼠IGG1、20LPE标记鼠IGG1和20LPERCP标记鼠IGG1。置于4冰箱染色30分钟，然后用1ML的1磷酸盐缓冲液PBS洗涤三次，最后用05ML的1PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCALIBUR流式细胞仪美国BD公司检测。图3结果显示，其中一名黑色素瘤患者来源培养得到的TIL细胞表型为CD3细胞为9368，CD3/CD8细胞为8210，CD56细胞为4239，CD3/CD4细胞为7091和CD4/CD25细胞为873，表明TI。
37、L细胞中CD3/CD8细胞和CD56NK细胞含量对比实施例一分离得到TIL细胞显著提高，CD4/CD25调节性T淋巴细胞数量得到很大的抑制。0078实施例四TIL细胞体外杀瘤试验0079选择相应的肺癌细胞A549和肝癌细胞HEPG2作为靶细胞，用51CR标记，即靶细胞2106/ML通过与300CI51CR在RPMI1640培养基中37孵育2小时。标记好的靶细胞用1PBS洗涤三次，并最终用RPMI1640含10小牛血清重悬到2105的浓度。以每孔2104个标记的靶细胞01ML添加到96孔板的孔中。0080根据转化医学杂志报道的转移性黑色素瘤中自体肿瘤浸润性T淋巴细胞和低剂量白介素2的适应性细胞治。
38、疗ELLEBAEKE1，IVERSENTZ，JUNKERN，ETALADOPTIVECELLTHERAPYWITHAUTOLOGOUSTUMORINFILTRATINGLYMPHOCYTESANDLOWDOSEINTERLEUKIN2INMETASTATICMELANOMAPATIENTSJTRANSLMED2012AUG21；10169中德现有技术，制备TIL细胞作为对比例。0081将实施例三中制备的TIL细胞和现有技术制备的TIL细胞作为效应细胞，分别以251、51、101、201和401的效靶比加入对应的孔中，在37孵育4小时。孵育后，取上清75L组分用放射计数器计数。特异的51CR释放。
39、的百分比根据下述的公式进行计算。0082说明书CN104152411A108/8页110083其中，自发释放的每分脉冲数通过单独培养靶细胞未加效应细胞获得，最大释放的每分脉冲数是用终浓度2NP40表面活性剂，上海生工处理的单独培养靶细胞后获得的。检测的每分脉冲数通过添加效应细胞的靶细胞培养获得的。0084图4显示了由实施例三获得的TIL细胞，对肺癌细胞A549和肝癌细胞HEPG2产生抗肿瘤免疫应答，随着效靶比不断提高，对肿瘤细胞产生的CTL应答也特异升高。并且由本发明制备的TIL细胞毒性活性明显高于现有技术制备的TIL细胞。0085实施例五自体肿瘤抗原负载的树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞的。
40、试剂盒制备0086试剂盒由如下成分组成0087A液为淋巴细胞培养基；0088B液为GMCSF和IL4混合液；0089C液为肿瘤坏死因子溶液；0090D液为白介素2溶液；0091E液为组织消化液；0092F液为淋巴细胞分离液；0093G液为生理盐水；0094细胞培养板以及使用说明书；0095其中，所述使用说明书包括实施例14所述的方法。0096试剂盒组分分装试剂盒规格为1次/盒，各组分的量为A液500ML/1瓶，B液05ML/1支，C液05ML/1支，D液05ML/1支，E液1ML/1支，F液20ML/1瓶，G液100ML/1瓶；分装后进行包装，得到自体肿瘤抗原负载的树突状细胞激活肿瘤浸润性T淋巴细胞的试剂盒。0097培养获得的自体肿瘤抗原负载的树突状细胞在细胞培养板中经射线辐照处理，将自体肿瘤抗原负载的树突状细胞作为滋养层细胞，使用的细胞培养板为1块6孔细胞培养板。说明书CN104152411A111/4页12图1说明书附图CN104152411A122/4页13图2说明书附图CN104152411A133/4页14图3说明书附图CN104152411A144/4页15图4说明书附图CN104152411A15。