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1、10申请公布号CN104151390A43申请公布日20141119CN104151390A21申请号201410383292122申请日20140806C07J63/00200601A61K31/56200601A61P35/00200601A61P1/1620060171申请人中国科学院西北高原生物研究所地址810001青海省西宁市西关大街59号72发明人岳会兰赵晓辉邵赟梅丽娟王启兰陶燕铎74专利代理机构兰州中科华西专利代理有限公司62002代理人李艳华54发明名称从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法及其应用57摘要本发明涉及一种从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法，该方法包括以下步骤将异叶青。
2、兰切段后用乙醇进行回流提取，得到提取液；该提取液经减压浓缩，即得提取物；所述提取物用乙酸乙酯在常温条件下进行萃取，得到萃取液，该萃取液经减压浓缩，得到乌苏甲酯粗提物；将所述乌苏甲酯粗提物溶解于乙酸乙酯中，然后加入硅胶拌样，溶剂乙酸乙酯挥干后，干法上硅胶柱二次，经减压浓缩后，得到较纯乌苏甲酯；所述较纯乌苏甲酯用乙醇溶解后结晶除杂，经过滤即得乌苏甲酯晶体。本发明工艺简单、操作简便且分离效率和分离纯度高。同时，本发明所得的乌苏甲酯晶体可应用在肿瘤和急性肝损伤疾病治疗中。51INTCL权利要求书1页说明书5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页10申请公布号CN10。
3、4151390ACN104151390A1/1页21从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法，包括以下步骤将异叶青兰切成长度为13CM的段，然后按1KG915L的料液质量体积比加入质量浓度为8595的乙醇，在温度为6575的条件下进行回流提取，提取次数23次，每次13H，合并得到提取液；该提取液经减压浓缩，即得提取物；所述提取物按1KG12L的料液质量体积比用乙酸乙酯在常温条件下进行萃取，萃取次数为3次，每次2H，合并得到萃取液，该萃取液经减压浓缩，得到乌苏甲酯粗提物；将所述乌苏甲酯粗提物溶解于乙酸乙酯中，然后加入所述乌苏甲酯粗提物质量12倍的硅胶拌样，溶剂乙酸乙酯挥干后，干法上硅胶柱；其次，用35。
4、倍柱体积的石油醚乙酸乙酯混合溶剂洗脱，经薄层层析TCL检测，得到含有乌苏甲酯的洗脱液A，该洗脱液A经减压浓缩后，得到乌苏甲酯粗品；所述乌苏甲酯粗品再次上硅胶柱，用24倍柱体积的所述石油醚乙酸乙酯混合溶剂洗脱，经薄层层析TCL检测，得到含有乌苏甲酯的洗脱液B，该洗脱液B经减压浓缩后，得到较纯乌苏甲酯；在3060温度下，所述较纯乌苏甲酯按1G2060ML的料液质量体积比用体积浓度为90100的乙醇进行溶解，然后在025的条件下进行13次结晶除杂，经过滤即得乌苏甲酯晶体。2如权利要求1所述的从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法，其特征在于所述步骤中的减压浓缩条件是指温度为6070，真空度为0608MP。
5、A。3如权利要求1所述的从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法，其特征在于所述步骤和所述步骤中的减压浓缩条件是指温度为4050，真空度为0608MPA。4如权利要求1所述的从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法，其特征在于所述步骤中石油醚乙酸乙酯混合溶剂是指将石油醚与乙酸乙酯按35ML1ML的比例混合而成的溶液。5如权利要求1所述的从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法所得的乌苏甲酯晶体在肿瘤和急性肝损伤疾病治疗中的应用，其特征在于该乌苏甲酯晶体作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂。权利要求书CN104151390A1/5页3从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法及其应用技术领域00。
6、01本发明涉及一种天然活性成分的制备方法与应用，尤其涉及从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法及其应用。背景技术0002异叶青兰DRACOCEPHALUMHETEROPHYLLUMBENTH是唇形科青兰属草本植物，又名白花枝子花、白花夏枯草、吉孜青保藏药名，新疆维语称马尔赞居西、祖帕尔。异叶青兰地上部分有平肝、清热作用，其气味香甜清润，闻之令人神清气爽，是维族、藏族用于治疗咳喘病和胃病的传统用药，主要用于治疗黄疽性发烧、肝热、热性病头痛、眼豁、口腔溃疡、支气管炎、高血压等多种病症。近年来，青兰属植物中的三萜类化合物由于具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、护肝、抗心律失常、免疫调节、调节血糖和降血压等多。
7、种药理活性，受到越来越多研究者的青睐。0003乌苏甲酯又名熊果酸甲酯，属于五环三萜类化合物，是熊果酸羧基酯化产物。熊果酸具有镇静、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗溃疡、降低血糖等多种生物学效应；熊果酸临床表现有显著而迅速降低谷丙转氨酶、血清转氨酶、消退黄疽、增进食欲、抗纤维化和恢复肝功能的作用；近年来发现熊果酸还具有抗致癌、抗促癌、诱导F9畸胎瘤细胞分化和抗血管生成作用。0004国内外相关文献显示，至今尚无乌苏甲酯单体制备和活性应用的相关报导。鉴于异叶青兰中乌苏甲酯含量很高，建立一种从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法很有必要。发明内容0005本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、操作简便且分离效。
8、率和分离纯度高的从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法。0006本发明所要解决的另一个技术问题是提供该乌苏甲酯的应用。0007为解决上述问题，本发明所述的从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法，包括以下步骤将异叶青兰切成长度为13CM的段，然后按1KG915L的料液质量体积比加入质量浓度为8595的乙醇，在温度为6575的条件下进行回流提取，提取次数23次，每次13H，合并得到提取液；该提取液经减压浓缩，即得提取物；所述提取物按1KG12L的料液质量体积比用乙酸乙酯在常温条件下进行萃取，萃取次数为3次，每次2H，合并得到萃取液，该萃取液经减压浓缩，得到乌苏甲酯粗提物；将所述乌苏甲酯粗提物溶解于乙酸乙酯。
9、中，然后加入所述乌苏甲酯粗提物质量12倍的硅胶拌样，溶剂乙酸乙酯挥干后，干法上硅胶柱；其次，用35倍柱体积的石油醚乙酸乙酯混合溶剂洗脱，经薄层层析TCL检测，得到含有乌苏甲酯的洗脱液A，该洗脱液A经减压浓缩后，得到乌苏甲酯粗品；所述乌苏甲酯粗品再次上硅胶柱，用24倍柱体积的所述石油说明书CN104151390A2/5页4醚乙酸乙酯混合溶剂洗脱，经薄层层析TCL检测，得到含有乌苏甲酯的洗脱液B，该洗脱液B经减压浓缩后，得到较纯乌苏甲酯；在3060温度下，所述较纯乌苏甲酯按1G2060ML的料液质量体积比用体积浓度为90100的乙醇进行溶解，然后在025的条件下进行13次结晶除杂，经过滤即得乌苏甲。
10、酯晶体。0008所述步骤中的减压浓缩条件是指温度为6070，真空度为0608MPA。0009所述步骤和所述步骤中的减压浓缩条件是指温度为4050，真空度为0608MPA。0010所述步骤中石油醚乙酸乙酯混合溶剂是指将石油醚与乙酸乙酯按35ML1ML的比例混合而成的溶液。0011如上所述的从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法所得的乌苏甲酯晶体在肿瘤和急性肝损伤疾病治疗中的应用，其特征在于该乌苏甲酯晶体作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂。0012本发明与现有技术相比具有以下优点1、由于本发明仅涉及乌苏甲酯的提取浓缩、萃取、硅胶柱层析和结晶四个步骤，纯化过程简单，因此，工艺。
11、简单、易于操作。00132、本发明采用二次硅胶柱分离与重结晶结合的方法，将乌苏甲酯粗提物进行快速分离纯化。因此，分离效率和分离纯度高。采用本发明方法，1KG异叶青兰能得到约38G乌苏甲酯，纯度970。00143、本发明方法所制得的乌苏甲酯晶体为熊果酸衍生物，其结构式如下；其分析结果如下白色针状晶体，C31H50O3，EIMSM/Z470MH；1HNMRACETONE，600MHZ523T,1H,J35HZ,H12，357S,CH3,H31，334S,1H,OH，315DD,1H,J32，87HZ,H3，078S,CH3,H24，084S,CH,H23，088S,CH3,J66HZ,H29，09。
12、5S,CH3,J66HZ,H30，099S,CH3,H26，112S,CH3,H25，113S,CH3,H27；13CNMRACETONE,150MHZ325CH2,C1，272CH2,C2，777CH,C3，386C,C4，554CH,C5，182CH2,C6，331CH2,C7，395C,C8，474CH,C9，369C,C10，230CH2,C11，1254CH,C12，1384C,C13，420C,C14，278CH2,C15，241CH2,C16，476C,C17，523CH,C18，390CH,C19，386CH,C20，305CH2,C21，367CH2,C22，279CH3,C。
13、23，150CH3,C24，154CH3,C25，167CH3,C26，236CH3,C27，1776C,C28，168CH3,C29，2O6CH3,C3O，568CH3，C31。00154、对本发明方法所制得的单体化合物乌苏甲酯晶体进行药理实验实验材料说明书CN104151390A3/5页5A受试药物异叶青兰提取分离得到的单体化合物乌苏甲酯（10G/20000G生药）；B剂量设计人临床用量100G生药/天，按60公斤体重计算为0167生药/KG，按动物与人公斤等效剂量折算，小鼠用184G生药/KG为中剂量，相当于临床等效剂量，高剂量为中剂量的2倍，低剂量为中剂量的1/2倍，换算为单体用量分别。
14、为，高剂量183MG/KG，中剂量092MG/KG，低剂量046MG/KG。实验灌胃用量为02ML/10G。0016C阳性对照药环磷酰胺，中美合资山西泰盛制药有限公司生产，批号0704121；肝速康胶囊，远达药业集团哈尔滨中药六厂有限公司生产，批号20070426。0017D动物CDICR小鼠，1921G，雌雄各半，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号为SCXK京20070001。0018E瘤株肝癌H22瘤株，中国医学科学院药物研究所肿瘤室提供，本实验室传代。0019F仪器AVE型半自动生化分析仪，爱威科技实业有限公司产品；电热三用水箱，北京医疗设备厂有限责任公司生产；6K15。
15、型离心机，SIGMA公司产品；微量加样器50200、1000UL等规格，瑞士SOCOREX生产；SARTORIUS电子天平，型号BP110S，德国生产。0020乌苏甲酯对荷瘤（肝癌H22）小鼠的影响取健康小鼠，体重1921G，在无菌条件下右腋皮下接种肝癌H22生理盐水瘤细胞悬液（17）02ML/只，接种后按体重随机分组，分别为荷瘤对照组，阳性药环磷酰胺组，熊果酸甲酯高、中、低剂量组，每组10只，雌雄各半，分笼饲养。0021各组分别给药，荷瘤对照组给予相同体积的蒸馏水02ML/10G，；环磷酰胺组于接种后24小时腹腔注射给药（02ML/20G）；其余各组灌胃给予相应药物（02ML/20G），每日。
16、一次，连续13天。末次给药后24小时，各组动物颈椎脱臼处死，解剖并剥离瘤体，摘取胸腺，脾，电子天平称重，以T检验进行统计学处理，其结果参见表1。0022表1单体乌苏甲酯对荷瘤小鼠的影响注与荷瘤对照组比较，P005,P001；与环磷酰胺组比较，P001。0023表1结果表明，阳性对照药环磷酰胺明显抑制荷瘤（肝癌H22）小鼠瘤体重量，体重减轻；乌苏甲酯高剂量对荷瘤（肝癌H22）小鼠瘤体重量有明显的抑制作用，体重增长三个剂量组均明显高于阳性对照药环磷酰胺组，三个剂量组小鼠胸腺，脾指数均高于环磷酰胺组。0024乌苏甲酯对四氯化碳致小鼠肝损伤的影响取健康小鼠，体重1922G，按体重随机分组，分组别为正常。
17、对照组，模型对照组，阳性对照组，乌苏甲酯高、中、低三组，各组分别灌胃给予相应药物，正常组和模型组给予相同体积的蒸馏水。除正常对照组外，其余各组小鼠药后腹腔注射01CCL4花生油溶液10ML/KG一次，16小时后，小鼠眶静脉取血，离心，测血清GPT活性。以T检验进行统计学处理，其结果参见表2。说明书CN104151390A4/5页60025表2单体乌苏甲酯对四氯化碳致小鼠肝损伤的影响注与模型对照组比较，P005。0026表2结果表明，乌苏甲酯单体的剂量在183MG/KG可明显的抑制CCL4所致小鼠血清GPT值升高，与模型对照组相比，有显著性差异。0027综上所述，本发明方法所制得的单体化合物乌苏。
18、甲酯晶体经药理实验表明，在抗肿瘤和急性肝损伤方面有一定的药用价值，可用于开发出新的具有更好药理活性的抗肿瘤和保肝药物。具体实施方式0028实施例1从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法，包括以下步骤将1KG异叶青兰切成长度为2CM的段，然后按1KG12L的料液质量体积比加入质量浓度为90的乙醇，在温度为70的条件下进行回流提取，提取次数2次，每次2H，合并得到提取液；该提取液在温度为65、真空度为07MPA的条件下经减压浓缩，即得提取物。0029提取物按1KG15L的料液质量体积比用乙酸乙酯在常温条件下进行萃取，萃取次数为3次，每次2H，合并得到萃取液，该萃取液在温度为45、真空度为07MPA的条。
19、件下经减压浓缩，得到乌苏甲酯粗提物。0030将乌苏甲酯粗提物溶解于乙酸乙酯中，然后加入乌苏甲酯粗提物质量15倍的硅胶拌样，溶剂乙酸乙酯挥干后，干法上硅胶柱；其次，用4倍柱体积的石油醚乙酸乙酯混合溶剂洗脱，经薄层层析TCL检测，得到含有乌苏甲酯的洗脱液A，该洗脱液A在温度为45、真空度为07MPA的条件下经减压浓缩后，得到乌苏甲酯粗品；乌苏甲酯粗品再次上硅胶柱，用3倍柱体积的石油醚乙酸乙酯混合溶剂洗脱，经薄层层析TCL检测，得到含有乌苏甲酯的洗脱液B，该洗脱液B在温度为45、真空度为07MPA的条件下经减压浓缩后，得到较纯乌苏甲酯，其纯度为867。0031其中石油醚乙酸乙酯混合溶剂是指将石油醚与。
20、乙酸乙酯按4ML1ML的比例混合而成的溶液。0032在45温度下，较纯乌苏甲酯按1G40ML的料液质量体积比用体积浓度为95的乙醇进行溶解，然后在15的条件下进行2次结晶除杂，经过滤即得纯度为981的乌苏甲酯晶体38G。0033实施例2从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法，包括以下步骤将2KG异叶青兰切成长度为1CM的段，然后按1KG9L的料液质量体积比加入质量浓度为85的乙醇，在温度为65的条件下进行回流提取，提取次数2次，每次1H，合并得到提取液；该提取液在温度为60、真空度为06MPA的条件下经减压浓缩，即得提取物。说明书CN104151390A5/5页70034提取物按1KG1L的料液质。
21、量体积比用乙酸乙酯在常温条件下进行萃取，萃取次数为3次，每次2H，合并得到萃取液，该萃取液在温度为40、真空度为06MPA的条件下经减压浓缩，得到乌苏甲酯粗提物。0035将乌苏甲酯粗提物溶解于乙酸乙酯中，然后加入乌苏甲酯粗提物质量1倍的硅胶拌样，溶剂乙酸乙酯挥干后，干法上硅胶柱；其次，用3倍柱体积的石油醚乙酸乙酯混合溶剂洗脱，经薄层层析TCL检测，得到含有乌苏甲酯的洗脱液A，该洗脱液A在温度为40、真空度为06MPA的条件下经减压浓缩后，得到乌苏甲酯粗品；乌苏甲酯粗品再次上硅胶柱，用2倍柱体积的石油醚乙酸乙酯混合溶剂洗脱，经薄层层析TCL检测，得到含有乌苏甲酯的洗脱液B，该洗脱液B在温度为40。
22、、真空度为06MPA的条件下经减压浓缩后，得到较纯乌苏甲酯，其纯度为854。0036其中石油醚乙酸乙酯混合溶剂是指将石油醚与乙酸乙酯按3ML1ML的比例混合而成的溶液。0037在30温度下，较纯乌苏甲酯按1G20ML的料液质量体积比用体积浓度为90的乙醇进行溶解，然后在0的条件下进行1次结晶除杂，经过滤即得纯度975的乌苏甲酯晶体82G。0038实施例3从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法，包括以下步骤将3KG异叶青兰切成长度为3CM的段，然后按1KG15L的料液质量体积比加入质量浓度为95的乙醇，在温度为75的条件下进行回流提取，提取次数3次，每次3H，合并得到提取液；该提取液在温度为70、真。
23、空度为08MPA的条件下经减压浓缩，即得提取物。0039提取物按1KG2L的料液质量体积比用乙酸乙酯在常温条件下进行萃取，萃取次数为3次，每次2H，合并得到萃取液，该萃取液在温度为50、真空度为08MPA的条件下经减压浓缩，得到乌苏甲酯粗提物。0040将乌苏甲酯粗提物溶解于乙酸乙酯中，然后加入乌苏甲酯粗提物质量2倍的硅胶拌样，溶剂乙酸乙酯挥干后，干法上硅胶柱；其次，用5倍柱体积的石油醚乙酸乙酯混合溶剂洗脱，经薄层层析TCL检测，得到含有乌苏甲酯的洗脱液A，该洗脱液A在温度为50、真空度为08MPA的条件下经减压浓缩后，得到乌苏甲酯粗品；乌苏甲酯粗品再次上硅胶柱，用4倍柱体积的石油醚乙酸乙酯混合。
24、溶剂洗脱，经薄层层析TCL检测，得到含有乌苏甲酯的洗脱液B，该洗脱液B在温度为50、真空度为08MPA的条件下经减压浓缩后，得到较纯乌苏甲酯，其纯度为902。0041其中石油醚乙酸乙酯混合溶剂是指将石油醚与乙酸乙酯按5ML1ML的比例混合而成的溶液。0042在60温度下，较纯乌苏甲酯按1G60ML的料液质量体积比用体积浓度为100的乙醇进行溶解，然后在25的条件下进行3次结晶除杂，经过滤即得纯度979的乌苏甲酯晶体133G。0043上述实施例13所得的乌苏甲酯晶体作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，用于治疗肿瘤和急性肝损伤疾病。0044上述实施例是对本发明的进一步详细说明，但不意味着对本发明的任何限制。在不脱离本发明上述思想的情况下，根据本领域普通技术知识和常规手段做出的各种替换方式或变更，均包含在本发明之内。说明书CN104151390A。