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1、10申请公布号CN104145817A43申请公布日20141119CN104145817A21申请号201410369167522申请日20140730A01H4/0020060171申请人贵州师范大学地址550001贵州省贵阳市云岩区宝山北路116号72发明人罗充辛柯姚红艳冯晓英陈显刚吴涛罗开源赵敏74专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所普通合伙11350代理人汤东凤54发明名称明日叶叶片组织培养快繁技术57摘要本发明公开了一种明日叶叶片组织培养快繁技术，选取明日叶叶片，用流水冲洗,75酒精溶液浸泡，无菌水冲洗，放入01升汞溶液中消毒，之后再用无菌水冲洗；切块；种于愈伤组织诱导培养基中培。
2、养2030天叶片切口处长出愈伤组织团；再将愈伤组织团切块,转接至愈伤组织增殖培养基上培养2030天对愈伤组织增殖；将增殖的愈伤组织切块，转接于丛生芽诱导培养基中进行培养30天分化产生丛生芽；将丛生芽基部的愈伤组织切除，分割为单个芽，将芽接种于生根培养基中培养20天得到再生植株幼苗；驯化练苗一周后移栽入灭菌处理的椰壳土中直至幼苗成活。本发明的有益效果是明日叶叶片做繁殖材料，成本低，材料来源广。51INTCL权利要求书1页说明书3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页10申请公布号CN104145817ACN104145817A1/1页21明日叶叶片组织培养快繁。
3、技术，其特征在于按照以下步骤进行1选取明日叶叶片，用流水冲洗,放入无菌操作台上备用；2用75酒精溶液浸泡，无菌水冲洗，放入01升汞溶液中消毒，之后再用无菌水冲洗；3用无菌滤纸吸干叶片的水，然后切块；4将叶片接种于愈伤组织诱导培养基中，置于24培养箱中2000LX光强下培养，光照条件为每天16小时光照，8小时黑暗，培养2030天叶片切口处长出愈伤组织团；5再将愈伤组织团切块,转接至愈伤组织增殖培养基上，培养温度25，光照条件为16小时光照，8小时黑暗，光照强度3000LX，培养2030天对愈伤组织增殖；6将增殖的愈伤组织切块，转接于丛生芽诱导培养基中进行培养，培养温度25，光照条件为16小时光照。
4、，8小时黑暗，光照强度3000LX，培养30天分化产生丛生芽；7将丛生芽基部的愈伤组织切除，分割为单个芽，将芽接种于生根培养基中，培养温度25，光照条件为16小时光照，8小时黑暗，光照强度3000LX，培养20天得到再生植株幼苗；8选取健壮幼苗于组培瓶中，移至自然环境条件下3天，打开组培瓶盖3天驯化练苗，经过驯化炼苗一周后移栽入灭菌处理的椰壳土中，上覆薄膜，浇水，保持空气湿度，1周后逐渐打开薄膜，直至幼苗成活。2按照权利要求1所述明日叶叶片组织培养快繁技术，其特征在于所述步骤3、步骤5、步骤6切块为1CM2。3按照权利要求1所述明日叶叶片组织培养快繁技术，其特征在于所述愈伤组织诱导培养基为MS。
5、1MG/L6BA3MG/LNAA；所述愈伤组织增殖培养基为MS6BA2MG/L2,4D1MG/L；所述丛生芽诱导培养基为MS6BA1MG/LNAA05MG/L；所述生根培养基为1/2MS002MG/LNAA。权利要求书CN104145817A1/3页3明日叶叶片组织培养快繁技术技术领域0001本发明属于植物培育技术领域，涉及明日叶叶片组织培养快繁技术。背景技术0002明日叶药食两用，尤其在药用方面的价值更是被各界公认为极具发展潜力的新兴蔬菜。我国20多年前从日本引进明日叶，目前国内仅有少数几家公司刚引种，栽培面积很小，原料在国际市场价格很高，需求量大。在生产过程中，明日叶植株通常在种植后12年。
6、即进入繁殖期，开花结实后立即死亡。明日叶花期持续较长，果实结实率较低，在采收时种子成熟度不一，并且其果实为双悬果，造成明日叶的种子发芽率极低，不易大规模栽培。如今明日叶种苗的繁育及栽培技术已成为制约明日叶及其加工品发展的瓶颈，而文献中关于明日叶的种苗繁育及栽培报道甚少，导致市场上明日叶及其产品的价格居高不下。0003为扩大明日叶的工业化生产规模，曾先后有一些关于明日叶组织培养方面的研究报道。目前，已发表的研究结果分为三种一是李佳等研究发现明日叶的叶柄和叶片均不适宜作为外植体进行组织培养，只是利用带芽茎段进行了愈伤组织的诱导及分化等培养；二是吕秀立等报道利用明日叶种子获取无菌苗进而分化增殖的培养。
7、方法；三是郭志友等报道了利用叶柄及叶片作为外植体进行组织培养的方法。0004本研究和上述三者的研究相比，虽然同为利用组织培养的手段构建明日叶的繁育体系，但是却和三者有着极大的区别。首先，和李佳等的研究相比，本研究打破了叶片不能作为外植体进行诱导的结论，且带芽茎段和本研究所选用的叶片相比，材料有极大的限制性；其次，和吕秀立等研究相比，本研究的材料受限性大大降低；最后，和郭志友等的研究结果相比，虽然取材相似，但本研究结果显示MS作为基础培养基效果较好，而郭志友的报道却认为N6基础培养基适合进行培养效果明显，因此两者选用的基础培养基有着极大的不同。发明内容0005本发明的目的在于提供一种明日叶叶片组。
8、织培养快繁技术，解决了明日叶种子发芽率低，市场上原材料不足、价格昂贵的问题。0006本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行00071选取明日叶叶片，用流水冲洗,放入无菌操作台上备用；00082用75酒精溶液浸泡，无菌水冲洗3次，放入01升汞溶液中消毒灭菌，之后再用无菌水冲洗5次；00093用无菌滤纸吸干叶片的水，然后切割；00104将叶片接种于愈伤组织诱导培养基中，置于24培养箱中2000LX光强下培养，光照条件为每天16小时光照，8小时黑暗，培养2030天叶片切口处长出愈伤组织团；00115再将愈伤组织团切块,转接至愈伤组织增殖培养基上，培养温度25，光照条件为16小时光照，8小时黑暗，光。
9、照强度3000LX，培养2030天对愈伤组织增殖；说明书CN104145817A2/3页400126将增殖的愈伤组织切块，转接于丛生芽诱导培养基中进行培养，培养温度25，光照条件为16小时光照，8小时黑暗，光照强度3000LX，培养30天分化产生丛生芽；00137将丛生芽基部的愈伤组织切除，分割为单个芽，将芽接种于生根培养基中，培养温度25，光照条件为16小时光照，8小时黑暗，光照强度3000LX，培养20天得到再生植株幼苗；00148选取健壮幼苗于组培瓶中，移至自然环境条件下3天，打开组培瓶盖3天驯化练苗，经过驯化炼苗一周后移栽入灭菌处理的椰壳土中，上覆薄膜，浇水，保持空气湿度，1周后逐渐打。
10、开薄膜，直至幼苗成活。0015进一步，所述步骤3、步骤5、步骤6切块为1CM2。0016进一步，所述愈伤组织诱导培养基为MS1MG/L6BA3MG/LNAA；所述愈伤组织增殖培养基为MS6BA2MG/L2,4D1MG/L；所述丛生芽诱导培养基为MS6BA1MG/LNAA05MG/L；所述生根培养基为1/2MS002MG/LNAA。0017本发明的有益效果是明日叶叶片做繁殖材料，成本低，材料来源较广。具体实施方式0018下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。0019本发明采用MS为基础培养基，配置不同植物生长物质的组合0020愈伤组织诱导培养基MS1MG/L6BA3MG/LNAA；0021愈。
11、伤组织增殖培养基MS6BA2MG/L2,4D1MG/L；0022丛生芽诱导培养基MS6BA1MG/LNAA05MG/L；0023生根诱导1/2MS002MG/LNAA。0024本发明按照以下步骤进行00251以叶片为外植体，叶片优选上端的，稍微幼嫩的叶片，但避免采集新叶，用流水冲洗1520MIN后,放入无菌操作台上备用。00262在接种室，超净工作台上用75酒精溶液浸泡植物材料30S后取出，无菌水冲洗3次，放入01升汞溶液中消毒7MIN，无菌水冲洗7次。00273用无菌滤纸吸干叶片的水，然后切成1CM2大小。00284将叶片接种于愈伤组织诱导培养基中，置于24培养箱中2000LX光强下培养，光。
12、照条件为每天16小时光照，8小时黑暗，培养2030天至叶片切口处长出愈伤组织团并增大。00295再将愈伤组织团均匀切割为1CM2,转接至愈伤组织增殖培养基上，培养温度25左右，光照条件为16小时光照，8小时黑暗，光照强度3000LX，培养2030天愈伤组织可增殖至6CM2左右。00306将增殖的愈伤组织切割为1CM2大小，转接于丛生芽诱导培养基中进行培养，培养温度25左右，光照条件为16小时光照，8小时黑暗，光照强度3000LX，培养1520天后愈伤组织再分化产生丛生芽，30天后丛生芽生长良好。00317将丛生芽基部的愈伤组织切除，分割为单个芽，将芽接种于生根培养基中，培养温度25左右，光照条。
13、件为16小时光照，8小时黑暗，光照强度3000LX，培养20天后芽基部分化产生根，生长良好，得到再生植株幼苗。说明书CN104145817A3/3页500328选取健壮幼苗于组培瓶中，移至自然环境条件下3天，打开组培瓶盖3天驯化练苗，经过驯化炼苗一周后移栽入灭菌处理的椰壳土中，上覆薄膜，注意浇水，保持空气湿度，1周后逐渐打开薄膜，并减少浇水频率，成活率可达94以上。0033本发明通过叶片组织培养构建明日叶的新型繁育体系，打破了由于种子发芽率低而造成的生产瓶颈，为规模化生产提供了条件。0034以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。说明书CN104145817A。