水稻OSCTE3基因在增强植物耐冷性中应用.pdf

本发明公开了水稻OsCTE3基因在增强植物耐冷性中应用。本发明提供了序列表中序列1所示的蛋白在增强植物耐冷性中的应用、序列表中序列1所示的蛋白的编码基因在增强植物耐冷性中的应用。本发明的实验结果表明，OsCTE3基因在对照和冷胁迫处理条件下，在超表达转基因株系中的表达量显著的高于野生型对照日本晴，同时表型鉴定显示过表达OsCTE3基因能够显著改善水稻抵御低温胁迫的能力。本发明为改良、增强水稻耐冷性，加速抗逆分子育种进程，具有十分重要的理论和实际意义。

1.  序列表中序列1所示的蛋白在增强植物耐冷性中的应用。

2.  序列表中序列1所示的蛋白的编码基因在增强植物耐冷性中的应用；所述蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因；
1)序列表中序列2、3的自5′末端第268位-1029位所示的DNA分子；
2)序列表中序列2、3所示的DNA和RNA分子；
3)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
4)与1)或2)所述的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

3.  含有序列表中序列1所示蛋白的编码基因的重组表达载体在增强植物耐冷性中的应用。

4.  根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述重组表达载体为在pCUbi1390的多克隆位点间插入所述序列表中序列1所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。

5.  根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。

6.  含有权利要求2、3或4所述编码基因的表达载体。

7.  根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述序列表中序列1所示的蛋白的编码基因或与所述基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列导入植物组织、细胞或器官，植物耐冷性获得提高。

8.  根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体的构建过程中，在其转录起始核苷酸前加上增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。

水稻OsCTE3基因在增强植物耐冷性中应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中水稻E3泛素化连接酶基因OsCTE3在增强植物耐冷性中的应用。
背景技术
在水稻的整个生命周期中，经常受各种非生物胁迫和生物胁迫，这些严重影响植物的生长和发育，并会影响作物的产量和品质。而水稻作为主要的粮食作物，提高其抗逆性尤为重要，而发掘改善水稻抵抗非生物胁迫能力的基因将为水稻的抗逆分子机制研究和分子辅助育种奠定基础。泛素-蛋白酶体途径广泛存在于真核生物中，主要包括泛素化系统和26S蛋白酶体系统两部分。该途径在维持细胞功能，细胞周期运转，胚胎发育，激素响应，抵御环境胁迫和衰老等方面发挥着重要的作用。在泛素化系统中，关键酶主要包括泛素活化酶(Ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素结合酶(Ubiquitin-conjugating enzyme，E2)和泛素连接酶(Ubiquitin-protein ligase，E3)。在水稻中E1基因有6个，E2及E2-like基因有49个，而E3基因则超过1300个。这些可能是由于在泛素化系统中，E3的功能主要是特异性地识别不同的泛素化底物，从而使泛素从E2蛋白转移到特定的底物上。因此，E3被认为是该途径识别目标底物的最主要成分。根据不同E3基因上的结构域，可将其分为两大类：即单亚基E3和多亚基E3。单亚基包括具有HECT(homologous to E6-associated protein carboxyl terminus)结构域的E3、含有环指状(RING finger)结构域的E3和含有U-box结构域的E3。
OsCTE3是一种含有RING-finger结构域的E3泛素连接酶基因，RING-finger结构域是指70个氨基酸中由半胱氨酸(C)和组氨酸(H)组成的8个氨基酸通过与锌离子螯合作用C3H2C3(RING-H2)或C3H1C4(RING-HC)构型。Ring finger结构域是RING结构域家族最典型的特点，而此结构域是E3具有泛素连接功能的最主要因素并且每一环指结构域连有两个锌离子，因为环指结构域维持其特定的构象需要锌离子。E3活性依赖于环指结构域，并通过其与E2相连发挥蛋白质-蛋白质相互作用(PPIs)的功能。据统计在拟南芥和水稻中分别有426个和425个具有RING finger结构域的E3基因，这在E3基因中占有相当高的比例。已被报道的许多E3连接酶都参与非生物胁迫响应，并在其中扮演重要的角色。例如SDIR1和RHA2a是依赖ABA信号通路的盐胁迫和干旱胁迫响应的正调控因子；DRIP1和DRIP2 E3连接酶中含有DREB2A转录因子，它们则是干旱胁迫响应的负调控因子。
虽然近年来对于E3泛素化连接酶参与非生物胁迫应答反应的机制有了初步的研究，但是还远远不够，其作用机制还不是太清楚，因此更多的参与植物非生物胁迫调控的泛素化连接 酶E3还有待鉴定和深入研究。
发明内容
本发明的目的是提供序列表中序列1所示的蛋白及其编码基因(OsCTE3)。
本发明提供了序列表中序列1所示的蛋白及其编码基因在增强植物耐冷性中的应用；所述蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因；
1)序列表中序列2、3的自5′末端2第268位-1029位所示的DNA分子；
2)序列表中序列2、3所示的DNA和RNA分子；
3)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
4)与1)或2)所述的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
含有序列表中序列2所示蛋白的编码基因的重组表达载体在增强植物耐冷性中的应用也属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体的构建过程中，在其转录起始核苷酸前加上4个Myc蛋白标签，在pCUbi1390的多克隆位点间，即Ubiquitin启动子后插入所述序列表中序列1所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。
所述植物为单子叶植物-水稻，包括双子叶植物。
本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将序列表中序列1所示的蛋白的编码基因导入植物中，得到转基因植物；所述转基因植物与目的植物相比耐冷性增强。
本发明通过低温胁迫下OsCTE3基因的表达差异，以及超表达水稻植株在冷胁迫条件下的抗性变化，开展其基因克隆与功能分析，分析候选基因与水稻冷胁迫应答的关系。结果表明，OsCTE3基因在对照和冷胁迫处理条件下，在超表达转基因株系中的表达量显著的高于野生型对照日本晴，同时表型鉴定显示过表达OsCTE3基因能够显著改善水稻抵御低温胁迫的能力。本发明为改良、增强水稻耐冷性，加速抗逆分子育种进程，具有十分重要的理论和实际意义。
附图说明
图1为以实时定量PCR分析OsCTE3在对照条件下野生型和超表达株系中的表达量
图2为以实时定量PCR分析OsCTE3在冷胁迫下的野生型和超表达株系中的表达量
图3为Southern blot方法检测超表达株系中的目的基因
图4为超表达OsCTE3转基因植株的耐冷性鉴定
具体实施方法
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中说用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、过表达OsCTE3基因转基因株系的获得
1、过表达载体构建
根据日本晴序列全长设计引物，以日本晴cDNA为模板，扩增获得OsCTE3的基因全长，同时在5′和3′端加上Pst I、BamH I酶切位点，扩增引物为：
F：5′-GCACTGCAGATGGACCAGATTTACATGGCT-3′(下划线部分为Pst I酶切位点)；
R：5′-GACGGATCC TCAGAACAAGAGCAGGCACAG-3′(下划线部分为BamH I酶切位点)，扩增产物经Pst I和BamH I酶切纯化后，回收目的DNA片段(762bp)；同时，用EcoR I和BamH I酶切表达载体pCUbi1390(含有Ubiquitin 1启动子)(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Hao Peng，Qian Zhang，Yadong Li，Cailin Lei，Ying Zhai，Xuehui Sun，Daye Sun，Ying Sun，Tiegang Lu(2009)A putative leucine-rich repeat receptor kinase，OsBRR1，is involved in rice blast resistance Planta，230：377-385)，T4连接酶连接，得到目的质粒，然后Pst I单酶切将人工合成的4×Myc蛋白标签核酸序列(CTGCAGATGAGCGGGTTAATTAACGGTGAACAAAAGCTAATCTCCGAGGAAGACTTGAACGGTGAACAAAAATTAATCTCAGAAGAAGACTTGAACGGACTCGACGGTGAACAAAAGTTGATTTCTGAAGAAGATTTGAACGGTGAACAAAAGCTAATCTCCGAGGAAGACTTGAACGGTAGCCTGCAG)插入到起始密码子前(OsCTE3蛋白第一个氨基酸前面)，阳性克隆质粒进行PCR和测序验证，测序结果表明在载体pCUbi1390的Pst I和BamH I酶切位点间插入了序列表中序列2第268位-1029位所示的OsCTE3基因片段，该序列所编码的OsCTE3蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。将重组载体命名为pCUbi1390-OEOsCTE3。
冻融法将表达载体pCUbi1390-OEOsCTE3转入农杆菌EHA105感受态细胞中(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Ruifang Yang，Qicai Tang，HuimeiWang，Xiaobo Zhang，Gang Pan，HongWang and Jumin Tu(2011)Analyses of two rice(Oryza sativa)cyclin-dependent kinase inhibitors and effects of transgenic expression of OsiICK6 on plant growth and development，Annals of Botany，107：1087-1101)，方法参照分子克隆实验指南。
2遗传转化
用农杆菌介导的遗传转化法，以日本晴为受体材料，进行遗传转化(培养基配方见表1)，具体方法如下：
1)愈伤诱导
取适量成熟的水稻种子，脱壳后，先用70％酒精清洗消毒1min，期间不断地摇荡，再用15％的次氯酸钠消毒处理30min(可置于摇床上振荡)；最后用无菌蒸馏水冲洗4-5次，用无菌 滤纸吸干种子表面水分后接种。将消毒处理后的种子接种于含有2.0mg/L的2，4-D的诱导培养基中，28℃暗培养30-40天。培养获得的愈伤在继代培养基上扩大培养，每2周继代一次，直至胚性愈伤形成。
2)农杆菌侵染 
a)将携带有表达质粒载体pCUbi1390-OEOsCTE3的农杆菌划线于含有抗生素(50mg/L卡那霉素、25mg/l利福平)的LB固体培养基表面，28℃。
b)用灭过菌的牙签挑取单克隆菌落，接种到5ml含有相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃，200r/min震荡培养到OD600＝0.5。
c)取活化好的的新鲜菌液按1∶100的比例接种到25ml相同的YEB液体培养基中，在相同条件下培养至OD600＝0.5。
d)菌液在5000g，4℃下离心10min收集菌体，弃去上清液；加入25ml 10mM的MgSO4悬浮菌体，并用移液枪轻轻吸打使其充分悬浮，在5000g，4℃下离心10min重新收集菌体，弃去上清液。
e)用25ml含有200μM乙酰丁香酮(AS)的AA-AS浸染培养基重新悬浮。
f)将生长状态良好的胚性愈伤从继代培养基中转移至表面覆有无菌滤纸的培养皿中(愈伤切成0.3-0.4mm大小)，在超净工作台上风干10-20min。
g)将干燥的胚性愈伤浸入含有上述菌液的50ml离心管中20min，期间每隔5min摇荡一次；之后倒掉菌液，将愈伤取出置于无菌滤纸上风干10-20min，然后转移至表面铺有无菌滤纸的含有200μM乙酰丁香酮(AS)的CC培养基中，25℃黑暗条件下共培养3d。
h)收集表面没有明显农杆菌的愈伤组织，用含600mg/l头孢霉素的无菌水冲洗3次，吸取多余水分。
i)将愈伤组织转入筛选培养基(含500mg/l头孢霉素和50mg/l潮霉素的N6培养基)上继续筛选2-3次，每次两周。最终得到生长良好的鲜黄色潮霉素抗性愈伤组织。
3、转化体植株再生
取新鲜潮霉素抗性的愈伤，将愈伤组织分割成2mm的小块，接于预分化培养基中，28℃暗培养7天，然后置于光照培养间(12h光照/12h黑暗)继续培养8-9天后将已分化出不定芽的愈伤组织后转入再生培养基(250mL组培瓶)上，继续光照培养。等到不定芽长成4-6cm高的小苗后再转移到生根培养基中，在28℃，光照培养间(12h光照/12h黑暗)条件下培养约15天，得到转化体植株，移到温室种植(T0代)，一月后取叶片进行PCR阳性鉴定(Hpt-F：5’-CTATTTCTTTGCCCTCGGAC-3’，Hpt-R：5’-CCTGACCTATTGCATCTCCC-3’)， 并收获其阳性植株种子(T1代)。
表1遗传转化所用培养基及其配方

实施例2、冷胁迫处理条件下OsCTE3基因的表达差异分析
日本晴(Nipponbare，Oryza sativa ssp.japonica)(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Yongqing Jiao，Yonghong Wang，Dawei Xue，Jing Wang，Meixian Yan，Guifu Liu，Guojun Dong，Dali Zeng，Zefu Lu，Xudong Zhu，Qian Qian and Jiayang Li(2010)Re gulation of OsSPL14 by OsmiR156 defines ideal plant architecture in rice.Nature Genetics，42，541-544)；
1、转基因株系及野生型对照日本晴的低温处理
水稻日本晴及超表达转基因植株的种子经消毒处理，室温浸种2d，37℃催芽1d，萌发后选发芽一致的种子播于装有草炭土的塑料盒中，每格10粒。于三叶期进行低温(4℃)处理，处理24h后进行取样，取正常生长条件和冷处理条件下的叶片，液氮速冻，-70℃低温保存，用于RNA提取。
2、实时定量PCR分析
采用TRIZOL试剂提取实验样品总RNA，并进行RNA纯度的分析：用1％琼脂糖凝胶电泳快速检测提取的总RNA的完整性，DNase I消化RNA中的基因组DNA，具体方法和步骤参照说明书。
反转录：
第一链cDNA的合成用反转录用试剂盒(abm公司，Code no：G490)。
Real Time PCR分析：
Real Time PCR分析，所用OsCTE3的PCR引物如下：F：5′-ACAGTGCCCTGTGTGTAAGG-3′；R：5′-TGTGTGCCGTGACATAGTGG-3′；内参基因Actin1引物序列为F：5′-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3′；R：5′-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3′。Real Time PCR的分析使用TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq试剂盒(Code no：DRR041A)，应用的Real Time PCR扩增仪为AB I 7300，方法见说明书。
数据分析：
用相对定量法计算目的基因相对表达量其中ΔΔCt＝[(待测样品目的基因的Ct-待测样品看家基因的Ct)-(对照组目的基因的Ct-对照组看家基因的Ct)]。标准方差的计算用Excel完成，先用统计函数STDEV算出样品和对照的S值，再将两个S值算平方，算出(S12+S22)/3的值，进而算出X＝Power((S12+S22)/3，0.5)，最后算出方差＝(2(-ddct-x)-2(-ddct+x))/2。
定量PCR的结果显示：OsCTE3基因在冷胁迫条件下在日本晴，转基因株系和部分水稻种质资源中的表达量下降；超表达OsCTE3的株系中该基因的表达量在对照和冷胁迫条件下都显著的高于对照日本晴(图1和图2)。
实施例3、OsCTE3的Southern blot分析
Southern杂交检测采用地高辛随机引物标记法标记探针，化学发光检测技术进行检测，具体参照试剂盒DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II说明书。
实施例4、OsCTE3超表达株系的耐冷表型鉴定
对OsCTE3基因的过表达转基因材料进行耐冷表型鉴定，方法同上。结果显示：与野生型水稻日本晴相比，OsCTE3基因过表达株系的耐冷性显著提高(图4)。
虽然，上文中已经用一般性的说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之做一些修改和改进，这对本领域技术人而言是显而易见的。因此在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。