一种高效表达罗氏沼虾甲壳素的酿酒酵母工程菌技术领域
本发明涉及一种高效表达罗氏沼虾甲壳素的酿酒酵母工程菌，属于生物技术领域。
背景技术
水产养殖业是我国经济出口创汇的重要产业之一，渔业在我国已成为农业经济的增长点。
近年来甲壳类动物病害日趋严重，给我国水产养殖业带来巨大的经济损失。
甲壳类动物缺乏后天获得的特异性免疫功能，但是它们有比较完善的先天性非特异性免
疫系统，能够迅速识别和有效清除入侵的微生物。甲壳动物的抗菌肽，是具有较高抗菌活性，
水溶性好，热稳定的免疫效应因子，能够直接杀死或者清除病原微生物，是甲壳动物先天免
疫系统中的重要组成部分。多数抗菌肽具有广谱抗菌作用，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌
具有不同程度的杀菌或者抑菌作用。
甲壳素(Crustin)是虾蟹中研究较多的抗菌肽。目前，利用酿酒酵母对罗氏沼虾Crustin蛋
白进行真核表达及蛋白功能研究还未见报道。然而，基因的异源表达受到宿主、载体、启动
元件等多种因素的影响。因此，如何实现甲壳类动物来源的甲壳素Crustin的异源表达、活性
表达、高效表达是目前亟需解决的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明利用酿酒酵母实现了罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)
重要免疫因子-甲壳素Crustin的异源表达、活性表达、高效表达，对增强甲壳类动物对各种
主要疾病和环境变化的抵抗力、有效促进其健康生长发挥了重要作用。
本发明的第一个目的是提供一种高效表达罗氏沼虾甲壳素的酿酒酵母工程菌，所述工程
菌的构建方法是将罗氏沼虾甲壳素Crustin的cDNA克隆至表达质粒pHAC181上得到测序验证
正确的重组质粒pHAC181-MrCrustin(MrCrustin即代表来源于罗氏沼虾的Crustin)，然后设计
同源重组引物，利用同源重组技术将目的基因MrCrustin整合至酿酒酵母宿主菌株的GAL1启
动子下游。该工程菌在半乳糖的诱导下，可高效表达目的蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述MrCrustin的cDNA的CDS区域的核苷酸序列如SEQID
NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述MrCrustin的cDNA的CDS区域(codingsequence)翻
译后的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述表达质粒pHAC181是在商业化质粒YCplac181的SphI
和EcoRV位点插入3个组氨酸标签得到的，详见文献：AnalysesoftheeffectsofRck2pmutants
onPbs2pDD-inducedtoxicityinSaccharomycescervisiaeidentifyaMAPkinasedockingmotif,and
unexpectedfunctionalinactivationduetoacidicsubstitutionofT379,MolGenGenomics,2004,
271:208–219.
在本发明的一种实施方式中，所述宿主菌株为酿酒酵母GAL1-ScRCH1，是将酿酒酵母
BY4741(Sc04153268_s1)菌株里的ScRCH1基因的启动子替换成GAL1启动子。
在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母工程菌是按照如下方法构建得到的：(1)以
罗氏沼虾的cDNA为模板PCR扩增或者直接化学合成，得到核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的
MrCrustin基因片段；(2)将MrCrustin基因片段克隆到表达质粒pHAC181上，得到重组表达
质粒pHAC181-MrCrustin；(3)设计同源重组引物，对质粒pHAC181-MrCrustin进行扩增，得
到含有MrCrustin基因的核苷酸片段，使用同源重组的方法，将该核苷酸片段整合至酿酒酵母
菌株中GAL1启动子下游。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)，还包括将菌株在YPG培养基中诱导培养6h
后，提取菌株蛋白，用于做WESTERNBLOT检测，目的蛋白表达的菌株则为构建成功的酵母
工程菌。
本发明的第二个目的是提供一种高效表达罗氏沼虾甲壳素MrCrustin的方法，所述方法是
使用所述酿酒酵母工程菌为生产菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将酿酒酵母工程菌活化后，接种于YPG培养基
中，在半乳糖的诱导下培养6h；所述YPG培养基含有D-半乳糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母
提取物10g/L。
本发明还要求保护所述酿酒酵母工程菌生产得到的罗氏沼虾甲壳素MrCrustin，以及所述
酿酒酵母工程菌在水产养殖或者水产动物免疫及饲料添加剂等方面的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明构建的酿酒酵母工程菌，可以实现罗氏沼虾甲壳素MrCrustin的高效表达、
活性表达；本发明工程菌发酵得到的MrCrustin具有活力，诱导培养6h后每mL发酵液可得
到0.0584mg蛋白。
(2)本发明的工程菌为酿酒酵母工程菌，表达真核来源的MrCrustin，可以分泌经正确
折叠和加工的蛋白质；而且酿酒酵母具有在简单培养基中快速生长；本发明采用的宿主菌酿
酒酵母，是食品安全菌株，可以直接添加到饲料中。
(3)本发明以pHAC181为载体、GAL1-ScRCH1为宿主构建酿酒酵母工程菌，实现了甲壳
素MrCrustin的高效表达，以期增强甲壳类动物对各种主要疾病和环境变化的抵抗力，有效促
进其健康生长。目前新型饲料蛋白源与饲料添加剂的研制与开发己成为促进现代水产养殖业
健康发展的关键技术，本发明的酵母工程菌不仅可以更进一步对甲壳类动物重要免疫基因的
蛋白功能进行研究，也将为开发新型免疫增强型饲料添加剂提供科学依据及新方法。
附图说明
图1：罗氏沼虾甲壳素MrCrustincDNA扩增条带(339bp)；
图2：将罗氏沼虾甲壳素MrCrustincDNA克隆至载体pHAC181上时，菌落PCR验证阳性转化
子(Line2,3,4,5,6,7,9,10,11,12,14,15,16,18,19,20,21,23为正确的转化子)；
图3：将罗氏沼虾甲壳素MrCrustin克隆至载体pHAC181上时，阳性转化子的酶切验证(Line
1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18为正确的转化子)；
图4：高保真酶PrimeSTARGXL酶对重组质粒pHAC181-MrCrustin进行扩增(4694bp)；
图5：检测引物检测pHAC181-MrCrustin与含GAL1启动子的菌株同源重组(同源重组成功的
条带为622bp，a图中的Line1,2,3为正确的转化子；b图中的Line9,11为正确的转化子)；
图6：WESTERNBLOT检测到Gal-pHAC181-MrCrustin蛋白表达，目的蛋白为22KD。
具体实施方式
在本发明中，首先采用基因克隆技术，具体为：将罗氏沼虾RNA提取后，用反转录试
剂盒将RNA反转录为cDNA。利用高保真PCR酶将目的基因片段MrCrustin进行扩增。扩增得
到的基因片段与载体pHAC181连接，转入大肠杆菌感受态细胞transT1中，涂布于LA平板上
37℃过夜培养。LA平板上得到的阳性转化子进行酶切验证及测序验证。其次，利用同源重组
技术将带有目的基因MrCrustin的质粒pHAC181整合至酿酒酵母菌株GAL1-ScRCH1菌株中
GAL1启动子下游，整合成功的菌株在YPG培养基中诱导培养6h后，提取蛋白，用于
WESTERNBLOT检测。目的蛋白表达成功的菌株则为构建成功的酵母工程菌。
LA培养基的组成：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、琼脂12g/L，调PH
为7.0，Amp抗生素100mg/ml(120℃，20min)。
SD-Leu培养基的组成：含有酵母氮源(无AA)1.7g/L、硫酸铵5g/L、葡萄糖20g/L、10xAA
mix(-ura，-leu，-his)100ml，100xUra10ml，100xHis10ml，琼脂20g/L(120℃，20min)。
YPG培养基的组成：D-半乳糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L(115℃，20min)。
实施例1：酿酒酵母基因工程菌的构建(基因克隆)
通过构建高表达质粒pHAC181-MrSOD，具体方法为提取罗氏沼虾组织RNA，反转录试剂
盒将RNA反转录为cDNA。利用高保真酶将目的基因片段MrCrustin进行PCR扩增，MrCrustin
基因片段(CDS区域，不包含终止密码子，共339bp)，然后将这个片段克隆到高表达质粒
pHAC181多克隆位点上，最后对正确的重组子进行DNA测序，验证序列没有发生突变，得到
重组高表达质粒pHAC181-MrCrustin。
实施例2：酿酒酵母基因工程菌的构建(同源重组)
根据构建好的重组高表达质粒pHAC181-MrCrustin设计同源重组引物，利用高保真
PrimeSTARGXL酶对质粒pHAC181-MrCrustin进行扩增，扩增成功的长片段整合至酿酒酵母菌
株中GAL1启动子下游。
同源重组引物为F1、R1，序列如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示：
F1:caaatgtaataaaagtatcaacaaaaaattgttaatatacctctatactttaacgtcaaggagaaaaaacccggatctcaaa
ATGAAGGGTCTCCTGGTTTGC
R1：tatggacgaggtaataaggaaactcagaaccagaatagtggcatgagctctccaatttaacatatttgccattagtgacc
CGATGATAAGCTGTCAAACATG
基因同源重组(整合)的具体步骤为：
1.挑活化的GAL1-ScRCH1菌株单菌落，接种到3mlYPD培养基，30℃220rpm培养过夜。
2.取300ul过夜培养物接种到4.7ml2*YPD中，30℃培养4～5h(达到OD600＝0.6-1.0)；
3.将5ml菌液分3管，室温离心4000rpm，1min,弃上清，再用1ml水重悬合并到1
个EP管中，3000rpm离心1min，弃上清。
4.加100ul的0.1MLiAc溶液，吹吸混匀，12000rpm离心10s，弃上清。
5.重复步骤4。
6.依次加入下列物质，加入后温和混匀：
240μlPEG(50％w/v)
36μl1.0MLiAc
10μlssDNA(10mg/ml，用前煮5min，放于冰上5-10min)
5-10ugpcr片段DNA
7.混匀，30℃水浴中温育30min；
9.42℃水浴中温育30min(热激)；
10.3000rpm离心除去上清，用1ml的无菌水重悬菌体，3000rpm离心1min弃上清，预
留100ul菌液铺在选择平板(SD-LEU)上，30℃培养3～5天。
11.将长出的转化子在SD-LEU平板上进行划线纯化。单菌落接种于YPD培养基中过夜培
养，提取转化子基因组，用检测引物进行PCR检测，有目的片段扩增出的转化子即为同源重
组成功的菌株Gal-pHAC181-MrCrustin。
检测引物为DF、DR，序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示：
DF:CCTGGCCCCACAAACCTTC
DR:GCCGAAAAAGCTTAGTGGTTTG
实施例3：工程菌株蛋白表达与WESTERNBLOT检测
上述同源重组成功的Gal-pHAC181-MrCrustin菌株单菌落接种于SD-LEU培养基5ml中过
夜培养，培养物第二天转接于45mlYPG培养基中，经半乳糖诱导培养6h(OD检测为1.2-1.5)
后，提取菌株蛋白。提取的蛋白用于WESTERNBLOT检测。
具体步骤为：
(一)细胞中总蛋白的提取
1、挑取单菌落于所需液体培养基中30℃过夜培养至饱和；
2、取5mL过夜培养的菌液加入45mL新鲜的液体培养基并且在30℃摇床里振荡培养约
6h(OD＝1.2～1.5)(转速为220rmp)；
3、以8000rpm1min收集菌体，去掉上层的液体；
4、用预冷双蒸水重悬菌体，并于离心后去掉上清液；
5、加入与菌体等量并预冷的PEB(ProteinExtractionBuffer),PEB中加入100×PMSF；
6、加入与菌体等体积的酸洗玻璃珠；
7、在振荡混合器上振荡EP管10×30s，每次振荡后放冰上1min；
8、12000rpm离心10min，吸取上清液于冰上保存，弃去沉淀；
9、用考马斯亮蓝法检测浓度(OD595)，将样品浓度调整一致；
10、加入5×SB95℃煮5min
(二)考马斯亮蓝法检测蛋白浓度
1、标准蛋白溶液的制备：称量BSA固体10mg溶解于1mL的水中，得到10mg/mL的溶
液作为标准贮液。用标准贮液配制系列稀释的标准蛋白溶液，其浓度分别为1.2mg/ml、
1.0mg/ml、0.8mg/ml、0.6mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml。
2、待测蛋白溶液的制备：将待测样品稀释至浓度在0.1mg/ml—1.2mg/ml之间。(根据经
验稀释15倍)
3、4μl染液+200μl蛋白溶液，混匀，静置3min。按照核酸蛋白分析仪的“protein”程序
测定蛋白浓度。
在本实验中，测得的蛋白浓度为14.6ug/ul。换算可得蛋白浓度为0.0584mg/ml，即每
mL发酵液得到0.0584mg蛋白。
将蛋白稀释为8ug/ul，用于后续实验。
(三)SDS-PAGE
1.装置组装
注意：(1)玻璃板，橡胶带，梳子，要洗净晾干
(2)要密封好，防止漏胶
2.制胶
注意：(1)灌胶要迅速
(2)分离胶的灌注距短玻璃板顶端约2cm
(3)注意是否有气泡
(4)在胶液界面加入薄层水，平齐分离胶面，15-30min聚合完好
3.蛋白样品制备
蛋白样品+SampleBuffer,沸水浴煮沸5min，冰上冷却5min。
4、上样，必须点预染Marker，电泳。
浓缩胶80V，分离胶100V。
(四)转印(浸渍法)
1、在冰盒里装上水，冻实
2、将转移缓冲液冷却至4℃
3、在浅的托盘中倒入转移缓冲液
4、将与胶尺寸大小相等的PVDF膜，用铅笔标记好，在甲醇里浸泡约3min，再转移至转
移缓冲液浸湿平衡，直到没有气泡
5、将4张与胶大小相符的Whatmman滤纸放置转移缓冲液中充分浸湿
6、将吸水棉在转移缓冲液中充分浸湿
7、电泳后，带上手套，切取有用部分的胶将其迅速的在转移缓冲液中洗涤
8、打开转槽胶板，依次放入：浸湿吸水棉—2层Whatmman滤纸—胶—PVDF膜--2层
Whatmman滤纸—浸湿吸水棉，注意不要有气泡。
9、小心合上转移槽的胶板，立即放入转移槽中，注意正负极方向
10、在转移槽中加入磁棒，倒入转移缓冲液，使其浸没转印胶板，将转移槽放在磁力搅
拌器上，放入冷却冰盒
11、插入电极，注意再检查一下正负极方向，打开开关，转移电泳100V1h
12、转移结束后，断开电源并拔下槽上插头，从上到下拆卸转移各层，取出PVDF膜。
(五)封闭
加入封闭液封闭，用摇床轻轻摇动1h-4h
(六)加入一抗
1、轻轻转移掉封闭液
2、加入一抗杂交液，室温2h或4℃过夜
(七)加入二抗
1、轻轻转移掉一抗杂交液(可重复使用)，用TBST洗3次，每次10min
2、加入二抗杂交液，室温轻摇2h
3、用TBST洗膜3次，每次10min
(八)反应
1、用不同的tip头分别取100ul底物溶液1和100ul底物溶液2在1.5ml管中混匀，然后
将这200ul混合液转滴于保鲜膜上。将洗好的膜，让它滴干多余的洗液，覆盖于显色底物上，
反应5min。
2、用滤纸吸掉膜上的底物明流。
(九)曝光显影——暗光下操作
1、将膜用适当大小的保鲜膜包好，压上X光片,曝光，计时；
2、将显影液，定影液分别倒入浅的托盘中
3、取出X光片，放入显影液5min
4、自来水迅速冲洗
5、立即放入定影液5min
6、大量自来水冲洗
7、悬挂晾干
显影后，依据蛋白MARKER相比，检测到有Gal-pHAC181-MrCrustin目的蛋白表达(22KD)
的则为成功构建的酿酒酵母MrCrustin免疫蛋白工程菌株。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，
在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以
权利要求书所界定的为准。
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