细胞制备方法.pdf

描述了使冷冻保存的人肝细胞解冻并将所述肝细胞第二次冷冻保存而不损失活力的方法。其允许通过如下方式制备冷冻保存的汇集自多个供者的人肝细胞：使获自多个个体供者的肝细胞解冻，合并所述细胞形成汇集的肝细胞，和将所述汇集的肝细胞重新冷冻保存。该方法涉及使来自多个个体供者的肝细胞解冻，使该解冻的肝细胞维持在高于冷冻温度的低温下(例如，4℃)，并重新冷冻所述解冻的细胞而无需其它操作。所述方法允许所述人肝细胞在解冻后第二次冷冻保存，其活力与单次冷冻保存后相似。该高效方法可用于制备高活力的汇集的人肝细胞以用于使个体差异最小化的实验。

1.  一种制备冷冻保存的人肝细胞而无需离心的方法，所述人肝细胞由来自多个个体的肝细胞组成，所述方法包括：
在针对多个个体各自分开的器皿内冷冻保存肝细胞悬液中来自所述多个个体的肝脏的肝细胞；
使所述来自多个个体的肝细胞的器皿在37℃水浴中解冻直至所述肝细胞悬液达到约4℃的温度，仅至所述肝细胞悬液中的冰晶刚刚消失为止；
将多个器皿的来自多个个体的肝细胞汇集在一个容器中，其中所述肝细胞悬液维持约4℃的温度；
将汇集的肝细胞分配进入多个器皿；和
将汇集的肝细胞的多个器皿冷冻保存而无需稀释或更换所述肝细胞悬液。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝细胞悬液包含冷冻保护剂。

3.  如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述冷冻保护剂包含Dulbecco改良型伊格尔培养基：补充有10％胎牛血清和10％二甲亚砜(DMSO)的营养混合物F-12(DMEM/F12)培养基。

4.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝细胞的冷冻保存包括以约-1℃/分钟的速率冷冻保存所述肝细胞至约-70℃。

5.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在冷冻贮存系统中贮存所述冷冻保存的汇集的肝细胞。

6.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述肝细胞的贮存包括在约-150℃或更低的温度下贮存。

7.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从多个个体的肝脏分离肝细胞。

8.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括解冻所述冷冻保存的汇集的肝细胞用于实验。

细胞制备方法
相关申请的交叉参考
本发明专利申请按照35USC§111提交，要求2012年9月18日提交的美国临时专利申请61/702,335的优先权，其通过引用纳入本文。
技术领域
本发明领域一般涉及制备冷冻保存肝细胞的新方法，具体涉及分离的肝脏实质细胞(肝细胞)。
背景技术
肝的实质细胞，一般称为肝细胞，是药物代谢有关的主要细胞类型，并且是可被肝毒物损伤的细胞。因此，这些细胞代表了用于评价药物代谢和肝毒性所需的实验系统。有多篇科学出版物关于肝细胞在药物研发中的此类应用。
药物研发的主要问题在于，大量候选药物会因其无功效或具有负作用而在临床中失败，即便选择用于临床试验的候选药物已经采用实验动物进行了广泛的临床前研究并认为具有可接受的功效和安全性也是如此。主要原因之一是物种差异，即，人类药物作用可能不同于实验动物中发现的那样。
主要物种差异之一是药物代谢。现已知人和非人动物在多种药物代谢酶通路中具有差异，最重要的是P450单加氧酶中的差异。所述酶通路中的差异造成外源物质的代谢命运差异。如果某一药物的毒性由仅在人类中形成的代谢所致，则该药物可能对人类具有毒性，而对实验动物却并非如此。相反，如果某一药物的毒性代谢具有动物特异性但不在人类中形成，则该药物可能对动物具有毒性而非人类。
因此，分离自实验动物和人类的肝细胞代表了用于评价药物代谢和毒性的可能物种差异的重要实验系统。肝细胞的应用通过成功冷冻保存而进一步具有实用性。冷冻保存的肝细胞使科学人员能够利用肝细胞，简单地通过解冻并使用该细胞而进行研究，避免了耗时的分离操作。目前，来自动物和人类的冷冻保存的肝细胞可市售购得，以用于研究。
人类药物代谢的个体差异是已确立的现象。该差异可能由遗传和环境因素 造成。
来自一个个体的肝细胞可能与来自另一个体的肝细胞具有本质差异。为协助使个体差异"标准化"，基于人类的药物代谢系统通常涉及来自不同个体的合并的材料。例如，用于评价药物代谢的主要实验系统之一，人肝微粒体，通常由多个人类肝脏制备。该方法已于近期延伸至人肝细胞。
解冻、汇集和重新冷冻肝细胞的典型操作需要稀释冷冻保存培养基，然后离心通过高密度介质，以富集活细胞，然后进行第二次冷冻。这将会是费力的操作。
发明内容
描述了用于制备从先前冷冻保存的细胞汇集的冷冻保存的肝细胞的方法。所述方法的新颖部分在于，解冻、汇集和重新冷冻保存肝细胞，但不包括先对冷冻保存培养基进行稀释，然后通过等密度(iso-density)离心富集活细胞的传统操作。
采用该新方法，将先前冷冻保存的分离自个体供者的肝细胞贮存在液氮或维持在约-150摄氏度(℃)的冰柜中。为制备汇集自多个供者的冷冻保存的肝细胞，使来自多个个体供者的肝细胞在37℃水浴中解冻，仅至冰晶刚刚消失(此时解冻的溶液在约4℃下)。使解冻的肝细胞保持在设定为约4℃的冰浴中。将来自多个供者的肝细胞一起放(汇集)至冰浴中的容器内。在向该汇集物添加来自所有供者的肝细胞之后，将含有来自多个供者的细胞的肝细胞悬液分配进入多个冷冻用小瓶中用于冷冻保存。将"汇集的"冷冻保存的肝细胞贮存在液氮冰柜或维持在约-150℃的冰柜中。可使冷冻保存的"汇集的"肝细胞解冻并用于采用传统操作的实验。
在一个总体方面，用于制备冷冻保存的人肝细胞的方法由如下要点组成：来自多个个体而未经离心的肝细胞包含来自多个个体肝脏的冷冻保存的肝细胞，其位于对应所述多个个体各自的分开器皿内的肝细胞悬液中；使所述来自多个个体的肝细胞的器皿在37℃水浴中解冻直至所述肝细胞悬液达到约4℃的温度，仅至所述肝细胞悬液中的冰晶刚刚消失的程度；将多个器皿的来自多个个体的肝细胞汇集在容器中，使肝细胞悬液的温度维持在约4℃的温度；将汇集的肝细胞分配至多个器皿；和，冷冻保存所述多个汇集肝细胞的器皿，而不稀释或更换肝细胞悬液。
实施方式可包括如下特征中的一种或多种。例如，肝细胞悬液可包含冷冻 保护剂，例如，Dulbecco改良型伊格尔培养基：补充有10％胎牛血清和10％二甲亚砜(DMSO)的营养混合物F-12(DMEM/F12)培养基。分离的肝细胞可来自多个个体的肝脏。
所述肝细胞的冷冻保存可包括以约-1℃/分钟的速率降低温度至约-70℃。冷冻保存的汇集的肝细胞可被贮存在例如，约-150℃或更低温度下的冷冻贮存系统中。所述冷冻保存的汇集的肝细胞可在后期解冻用于实验。
附图说明
图1是将冷冻保存的来自不同个体供者的肝细胞解冻并汇集，和分配所述汇集的肝细胞以供冷冻保存的新方法的示意图。
具体实施方式
发明人已开发出一种用于制备冷冻保存的汇集自多个供体的人肝细胞的改进方法。该方法涉及来自多个个体的肝细胞的分离和冷冻保存。将分离并冷冻保存的肝细胞贮存在冷冻保存库中。在从多个个体收集肝细胞之后，采用该改进的方法使所述肝细胞解冻、汇集并重新冷冻保存。
该改进方法的要素在于，在37℃快速解冻肝细胞以最小化冰晶形成和伴随的细胞损伤，使解冻的肝细胞保持在约4℃，在约4℃下汇集来自多个个体供者的肝细胞，将汇集的肝细胞分配至多个供于冷冻保存的容器("冷冻用小瓶(cryovial)")中，以及冷冻保存。该新方法避免了稀释冷冻保存物、通过等张密度梯度离心以富集活细胞、在冷冻保存物中重悬细胞沉淀物、汇集来自多个供体的肝细胞、分配汇集的肝细胞至冷冻用小瓶中和重新冷冻保存的多重、费力和损伤性步骤。
在人体内时，肝脏细胞(肝细胞)是发生药物代谢的细胞。因此，培养的人肝细胞代表了用于评价药物代谢和药物毒性的生理学相关模型。为获得肝细胞，从肝脏组织分离所述细胞并随后利用冷冻保存来存放。
本发明的其他方面之一是从不同个体收集肝细胞。这些肝细胞从已获准肝移植但因缺乏合适受者而尚未使用的肝脏组织。在美国，有若干机构，例如，先进医药国际研究会(HAM)和国家发展研究院(NDRI)专门负责将人肝脏分配至研究实验室。
肝细胞被贮存在冷冻保存库中，所述冷冻保存的细胞可后续被解冻用于实验。已知在肝细胞性质(由其是药物代谢能力)上存在本质个体差异。为能够产生代表"标准化的"人群的结果，采用来自多个个体的肝细胞(汇集的肝细胞)的 混合物。传统操作包括使先前冷冻保存的来自个体供者的肝细胞解冻，稀释以使冷冻保存毒性最小化，离心以收集肝细胞，密度梯度分离活力和非活力细胞/细胞碎片，使纯化的细胞在冷冻保存物中悬浮，在冷冻用小瓶中分配，和重新冷冻保存。因为多重稀释和离心步骤，这些步骤是耗时且费力的。
本发明提供用于制备冷冻保存的汇集的人肝细胞的新方法。采用该新方法，使个体的冷冻保存的人肝细胞解冻、汇集、分配至冷冻用小瓶中，并重新冷冻保存。避免了多重离心步骤、密度梯度和新冷冻保存物的应用。
用于制备汇集的冷冻保存的来自多个个体的人肝细胞的方法示于图1并进行如下操作：
1.通过浸在维持于37℃下的水浴内的水中，使来自多个个体患者的冷冻保存人肝细胞的小瓶解冻。一旦冰晶消失，即将小瓶置于维持在4℃的冰浴中。
2.通过将肝细胞从小瓶移出并置入维持在4℃冰浴中的玻璃烧杯内来将所述肝细胞重新合并(汇集)。
3.采用移液器将重新分配的汇集的肝细胞吸入多个小瓶用于第二次冷冻保存。不进行离心或细胞纯化。
4.汇集的肝细胞的小瓶冷冻保存在可程序控制冰箱中以恒定速率冷冻，具体以约-1℃/分钟降温直至达到合适的低温，具体为约-70℃或更低。采用合适设备，具体是液氮冷冻贮存系统，使冷冻保存的细胞在合适温度(具体是约-150℃或更低)下贮存。
对于采用所述冷冻保存的汇集的肝细胞的实验而言，将各小瓶肝细胞移出液氮冷冻贮存环境，在37℃水浴解冻，并在50mL冷冻保存肝细胞回收培养基(CHRM；马里兰州哥伦比亚的APSciences公司)中以100x g离心10分钟。所得沉淀可重悬并用于实验。
实施例
1.使分离并冷冻保存的来自六个个体的人肝细胞在水浴中解冻直至冰晶消失并立即放置于维持在约4℃的冰浴中。采用控制速率冰箱以约-1度/分钟的程序降至-90℃将解冻的肝细胞冷冻保存第二段时间。将肝细胞在液氮中贮存7天。使来自初始冷冻保存和第二次冷冻保存的肝细胞在37℃水浴中解冻，通过冷冻保存肝细胞回收培养基(APSciences公司)离心回收，重悬于培养基中，并通过台盼蓝拒染法测定活力。观察到以下结果：

结果显示该新方法允许从冷冻保存和之后的第二次冷冻保存回收人肝细胞而不明显损失活力。该成功结果表示来自多个个体的肝细胞可被解冻、汇集和重新冷冻保存。
2.使分离并冷冻保存的来自八个个体的人肝细胞在水浴中解冻直至冰晶消失，然后立即将其置入保持在约4℃的冰浴中。使该解冻的肝细胞汇集、分配至新的冷冻用小瓶中，并采用控制速率冰箱以约-1度/分钟的程序降至-90℃进行第二次冷冻保存。将汇集的肝细胞在液氮中贮存7天。使来冷冻保存的汇集的肝细胞在37℃水浴中解冻，通过冷冻保存肝细胞回收培养基(APSciences公司)离心回收，重悬于培养基中，并通过台盼蓝拒染法测定活力。活力测定为91％。因此，结果表明可采用本发明制备汇集自多个供者的冷冻保存人肝细胞。