一种检测LEBER病线粒体T14502C试剂盒.pdf

本发明提供一种检测Leber病线粒体T14502C试剂盒，由DNA提取混合液、扩增T14502C片段的PCR混合液、针对T14502C设计的一对外引物和一对内引物、限制性内切酶、阳性对照和阴性对照组成。不仅解决了传统上从Leber病患者血液中提取DNA的问题，减轻被检者的痛苦；而且还解决了跨地区传递样本的问题，血滤纸片、毛发以及口腔粘膜刮片或唾液斑滤纸片等可以很容易的放在信封内，并可通过邮寄的方式跨地区传递。本发明试剂盒应用成本低；检测流程简便、快速，结果判读直观，应用本发明可确保检测结果的特异性和稳定性，可在检测与Leber病相关的线粒体基因ND1T14502C突变中的应用。

1.  一种检测Leber病线粒体T14502C试剂盒，其特征在于，由DNA提取混合液、扩增T14502C片段的PCR混合液、针对T14502C设计的一对外引物、针对T14502C设计的一对内引物、限制性内切酶、阳性对照和阴性对照组成，其中，提取DNA提取混合液主要由细胞裂解液、蛋白酶K、氯仿、苯酚、无水酒精组成；扩增T14502C片段的PCR混合液试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、MgCl₂、三蒸水和Taq酶，针对T14502C设计的一对外引物是外前向引物F: GCA TAA TTA AAC TTT ACT TC (SEQ ID NO:1)，外反向引物R: AGA ATA TTG AGG CGC CAT TG (SEQ ID NO:2)；针对T14502C设计的一对内引物包括内前向引物F:TACTCCTC AATAGCCATCGCTGTAGTATATCCAAAGACAACCATCATTCCCCCTAAATTAA(SEQ ID NO:3)，内反向引物R:TCTGTTGAGTGTGGGTTTAGTAA(SEQ ID NO:4)；限制性内切酶是限制性内切酶PacⅠ；阳性对照是含有线粒体序列第14502位点不能够发生酶切样本；阴性对照是线粒体序列第14502位点发生酶切样本。

2.  根据权利要求1所述的一种检测Leber病线粒体T14502C试剂盒，其特征在于，在扩增T14502C的PCR混合液中添加0.1-0.2μl二甲基亚砜。

3.  根据权利要求1所述一种检测Leber病线粒体T14502C试剂盒在检测与Leber病相关的线粒体基因ND1T14502C突变中的应用。

4.  根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）基因组DNA的提取：运用蛋白酶K消化裂解法，从少量的血液标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液的样本中提取基因组DNA；
（2）特异性PCR扩增：使用Primer 5.0软件和Oligo7.0软件根据SEQ ID NO:5所示的人类线粒体基因序列所设计的引物F_外/R_外、F_内/R_内是能扩增出包含上述Leber病的线粒体突变位点的片段，F外/R外扩增出为线粒体DNA的核苷酸14081-15017，其序列为序列表中的SEQ ID NO:1、2；F内/R内扩增出为线粒体DNA的核苷酸14441-14656，其序列为序列表中的SEQ ID NO:3、4；
（3）酶切鉴定：将上述PCR产物用限制性内切酶PacⅠ对T14502C突变位点处进行酶切；
（4）突变检测：聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，直接根据酶切PCR产物产生的DNA片段数量及DNA片段大小，检测mtDNA是否发生T14502C突变。

一种检测Leber病线粒体T14502C试剂盒
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及用于检测与Leber病相关的线粒体DNA T14502C突变的试剂盒，还涉及一种与Leber病相关的线粒体基因突变的检测方法，特别涉及检测线粒体ND6T14502C突变的方法，以及上述方法或上述的试剂盒在检测与Leber病相关的线粒体DNA T14502C突变中的应用。
背景技术
Leber遗传性视神经病变（Leber's Hereditary Optic Neuropathy，LHON，简称Leber氏病）是一种母系遗传性视神经病变，主要累及视网膜、巩膜筛板前部视乳头黄斑束纤维，导致视神经退行性变的母系遗传病，严重的影响着人们正常的生产、生活。根据国家卫生部（http://www.moh.gov.cn/）最新数据统计我国现有的低视力人口约有710万，盲人约有500万，占总人数的0.4%，成为世界上视力损伤最严重的国家之一。其中，由视神经病变引起的约为55万。1871年德国眼科医生Theodor Leber首次报道该病的临床症状、体征和遗传特性。1972年Erickson等发现LHON的遗传方式呈典型的母系遗传特征。1988年Wallace DC等发现了第一个与LHON相关的线粒体基因组DNA（mitochondria DNA, mtDNA）突变位点ND4 G11778A。目前已报道50多种线粒体DNA突变位点与LHON致病相关(http://www.mitomap.org/)，其中90%以上的LHON的家系是由氧化磷酸化复合物I亚基上的ND4 G11778A、ND1 G3460A和ND6 T14484C这3个原发突变位点所致。为了进一步探究LHON的发病机制，在全国范围内收集了大量的LHON家系，除上述3个原发性突变位点外，相继发现了tRNA^MetA4435G、ND4 G11696A、tRNA^ThrA15951G、ND1 T3866C、ND1 T3394C、ND5 T12338C和ND6 T14502C突变与LHON相关，与线粒体相关的Leber氏病在早期临床症状不明显，早期的检查常常会因此被耽误，尤其在我国偏远农村地区，这种情况普遍存在。因此，在高危人群和易感人群中开展mtDNA突变筛查，对于预防和控制与线粒体相关的原发性Leber氏病的发生有着极其重要的作用。
自发现与mtDNA突变相关的疾病以来，检测线粒体突变位点的检测方法主要还是序列测定。直接测序法是鉴定突变的黄金标准，但该操作繁琐，费用昂贵限制了它的广泛应用。
近年来，国内相继报道了Leber遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒及其检测方法，以满足对线粒体突变突变进行广泛筛查的需要，如福建医科大学于2005年申请了的基因诊断试剂盒及其检测方法专利（专利号：200510006097.8），该发明是根据90％以上的Leber氏遗传性视神经病变患者的线粒体DNA突变属于3个原发性致病位点突变（G11778A、G3460A和T14484C），设计和合成位点特异性PCR引物，直接以全血样作PCR的DNA模板，利用等位基因特异性多重PCR技术，单管一次性PCR反应，同时检测LHON患者的线粒体DNA的3个原发性致病突变位点，具有简便快速、高效、费用低、特异性好、只需微量血液样本等优点，为LHON患者的快速临床基因诊断提供一种简易、可靠的方法和试剂盒，具有巨大的普及推广应用价值。但是该方法存在血液中直接PCR扩增的难度加大，实验中采取的多重PCR的条件要求将会增加，检测方法跟普通的方法没有本质的区别。2006年杭州优思达生物科技有限公司建立一种以单核苷酸多态性核酸试纸快速检测LHON线粒体DNA 中G11778A 位点突变的新方法（专利号：200610003429.1）。在应用单核苷酸多态性核酸检测试纸条进行多态位点或突变位点的检测时,需要设计一条特异性延伸引物，这条引物的3’端碱基紧临多态性碱基或突变碱基,其在DNA聚合酶的作用下开始延伸,带有抗原标记与模板对应的双脱氧单核苷酸(ddNTP) 被连接到延伸引物上。虽然该方法能够实现短时间内的检测阳性位点，但PCR扩增条件严格，存在假阴性的几率大大增加。
发明内容
本发明的目的是针对目前检测ND6 T14502C突变的方法所存在的缺点，提供一种快速、简便、准确、经济的检测Leber病相关的线粒体DNA T14502C突变的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，由DNA提取混合液、扩增T14502C片段的PCR混合液、针对T14502C设计的一对外引物、针对T14502C设计的一对内引物、限制性内切酶、阳性对照、阴性对照组成。其中，提取DNA提取混合液主要由细胞裂解液、蛋白酶K、氯仿、苯酚、无水酒精组成；扩增T14502C片段的PCR混合液试剂包括dNTP(脱氧单核苷酸)、10×PCR缓冲液、MgCl₂、三蒸水和Taq酶(DNA聚合酶)，针对T14502C设计的外引物包括外前向引物F: GCA TAA TTA AAC TTT ACT TC (SEQ ID NO:1)，外反向引物R: AGA ATA TTG AGG CGC CAT TG (SEQ ID NO:2)；针对T14502C设计的内引物包括内前向引物F: TACTCCTC AATAGCCATCGCTGTAGTATATCCAAAGACAACCATCATTCCCCCTAAATTAA (SEQ ID NO:3)，内反向引物R: TCTGTTGAGTGTGGGTTTAGTAA (SEQ ID NO:4)；限制性内切酶包括限制性内切酶PacⅠ；阳性标本对照是含有线粒体序列第14502位点发生酶切样本；阴性标本对照是线粒体序列第14502位点不能够发生酶切样本。
在上述试剂盒中，在扩增T14502C的PCR混合液中添加用于提高延伸反应特异性的少许二甲基亚砜（0.1-0.2μl为宜）
本发明的另一个目的是提供所述试剂盒在检测与Leber病相关的线粒体基因ND1T14502C突变中的应用。通过以下步骤实现：
（1）基因组DNA的提取：运用蛋白酶K消化裂解法，从少量的血液标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液的样本中提取基因组DNA；
（2）特异性PCR扩增：使用Primer 5.0软件和Oligo7.0软件根据SEQ ID NO:5所示的人类线粒体基因序列所设计的引物F_外/R_外、F_内/R_内是能扩增出包含上述Leber病的线粒体突变位点的片段，F外/R外扩增出为线粒体DNA的核苷酸14081-15017，其序列为序列表中的SEQ ID NO:1、2；F内/R内扩增出为线粒体DNA的核苷酸14441-14656，其序列为序列表中的SEQ ID NO:3、4
（3）酶切鉴定：将上述PCR产物用限制性内切酶PacⅠ对T14502C突变位点处进行酶切；
（4）突变检测：聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，直接根据酶切PCR产物产生的DNA片段数量及DNA片段大小，检测mtDNA是否发生T14502C突变。
在上述检测mtDNA T14502C突变的方法中，可从血标本（如一滴血）、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液的样本中快速提取基因组DNA，根据取样方式或被测样本形式不同，对不同样本进行相应的预处理，处理方法如下：
（1）血标本（如一滴血）：取20～200μl少量血标本（如一滴血）或1cm²的血滤纸片放入1.5ml EP管（离心管），加入900μl红细胞裂解缓冲液（20mmol/L Tris-HCl，pH 7.6）(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液)室温静置10min，充分裂解红细胞，12000rpm离心1min，收集白细胞沉淀；
（2）带毛囊的毛发：用70%乙醇洗带毛囊的毛发1 次，后再用蒸馏水冲洗毛发2次。在1.5ml EP管中分别放入2～4 根毛发，毛囊置于EP管底部，用干净的剪刀剪去毛发高于EP管的部分；
（3）口腔粘膜刮片或唾液：收集唾液前，必须让被收集者漱口。以除去口腔中过多的老化细胞、食物残渣、牙膏、咖啡、烟等物质。半小时内不要喝水、进食、吸烟，然后开始收集口腔粘膜刮片或唾液，可视条件选择如下方法收集唾液样本：①舌头围绕口腔刮取粘膜细胞，将约0.1ml唾液直接吐进EP管内；②生理盐水漱口，吐进EP管内，吸取PBS溶液至装有通过上述任一种方法收集的唾液样本的EP管中，反复吹打后，12000rpm离心5min，除去上清，重复该过程一次；③用棉拭子反复刮拭面颊内壁6次，空气中干燥，然后用灭菌过的镊子小心撕去其外表面，放入EP管中；④将唾液吐在滤纸上，空气中干燥后形成唾液斑，再用干净的剪刀剪成大小约1cm²碎纸片置于EP管中。
然后用细胞裂解液和蛋白酶K对上述样本进行消化裂解，利用盐析法去除蛋白等杂质，异丙醇沉淀DNA，最后用高压灭菌水溶解后于-20℃保存备用。
在本发明的实施方案中，引物设计的指导思想是，针对mtDNA T14502C位点存在的位置相邻近，扩增在一条片段上，故应设计3'末端与14502位点野生型T和14502位点突变型C相对应的上游引物；针对 14502位点设计3'末端分别与14502位点野生型T和14502位点突变型C相对应的下游引物。（参照图1）
本发明人针对特异性PCR扩增后(图2)，mtDNA T14502C位点形成了酶切位点。酶切位点是由mtDNA T14502C突变形成的，其中的限制性内切酶为PacⅠ，其位点处为序列表中的SEQ ID NO:3、4；
用以上设计的引物，以相应的被检测样本的DNA为模板，通过PCR扩增后分别获得明亮清晰的大小约216bp的恒定扩增带， 14502突变位点对应于扩增片段的第62位。
在上述检测线粒体基因Leber病突变的方法中，结合特异性PCR技术和酶切技术，每份DNA样本分别用特异性引物即引物F/R于PCR反应管中进行普通PCR扩增，然后进行突变位点处的酶切，通过一次PCR便可在几小时内检出Leber病相关的mtDNA T14502C突变。
理论上，基因组DNA样本经一次PCR反应，即体系中仅加入针对突变型位点T14502C引物F/R后，加入针对突变位点新形成的限制性内切酶PacⅠ进行酶切，就可进行检测。也就是说，同一基因组DNA样本经一次PCR-酶切，从而使检测结果更为准确、可信。
本发明人还根据本发明中设计的引物序列，通过人工合成（委托生物公司）获得引物，并将引物按一定的比例混合，与提取样本基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、阳性标本对照、阴性标本对照以及使用说明书组合起来，制成了用于体外检测母系遗传Leber病线粒体基因mtDNA T14502C突变的试剂盒，使得样本DNA提取、特异性PCR扩增和酶切可以在试剂盒提供的试剂基础上顺利完成。其中，提取样本DNA的试剂主要由细胞裂解液和溶液Ⅰ（主要成分是蛋白酶K）组成；PCR扩增反应试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、MgCl₂、三蒸水和Taq酶，限制性内切酶包括限制性内切酶PacⅠ。
用本发明的方法及其制备的体外检测Leber病相关的线粒体基因mtDNA T14502C突变试剂盒具有以下特点：
1. 传统上获得Leber病患者基因组DNA的方法是从血液中提取，每人大约需要3～5ml。这种采血方法给很多被检者尤其是婴幼儿带来了一些痛苦和伤害，而且在跨地区传递样本时存在一定的风险和麻烦。本发明运用蛋白酶K消化裂解法，从少量的血液标本（如一滴血）、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液等样本中快速提取基因组DNA。该方法不仅解决了传统上从Leber病患者血液中提取DNA的问题，减轻被检者的痛苦；而且还解决了跨地区传递样本的问题，血滤纸片、毛发以及口腔粘膜刮片（棉拭子）或唾液斑滤纸片等可以很容易的放在信封内，并可通过邮寄的方式跨地区传递。
2. 目前国内外有几种线粒体相关的母系遗传性疾病基因诊断方法，如直接测序法荧光定量PCR检测方法、基因芯片检测方法等，由于其自身的缺陷，如费时费力、操作繁琐以及检测费用偏高而不易在临床进行推广。与这些方法相比较， PCR-酶切技术则结合了特异性PCR技术及酶切技术两者的优点，每份DNA样本用特异性引物即引物F/R于PCR反应管中进行特异性PCR扩增，通过一次PCR-酶切便可在几小时内同时检出mtDNA T14502C突变。另外值得一提的是，本方法所用的引物均经过仔细设计。首先，正常和突变等位基因间不同的碱基在酶切过程中对特异性限制性内切酶形成的位点不同，因而大大提高了酶切的特异性；另外由正常对照和空白对照的产物可作为整个PCR反应的分子内控指标，从而避免假阴性结果的出现，提高检测结果的稳定性。通过调整不同引物的浓度和比例以及对PCR反应条件进行优化，以确保结果的特异性和稳定性。
3. 应用本发明提供的试剂盒进行mtDNA T14502C突变检测，成本较其他检测方法更低；检测流程简便、快速，结果判读直观；对实验设备及操作人员无特殊要求，适合在一般医院、分子生物实验室开展，便于在全国范围内特别是欠发达地区实行Leber病相关的mtDNA T14502C突变的大规模筛查和预防性检查。
附图说明
图1是本发明的特异性巢式PCR引物示意图。
图2是本发明的特异性巢式PCR扩增方案示意图。
图3是携带T14502C突变Leber病家系系谱图。
图4是基因特异性巢式PCR扩增鉴定mtDNA T14502C的7%聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
符号说明：
图1和3中：F外为特异性巢式PCR第一次扩增的正向引物；R外为特异性巢式PCR第一次扩增的反向引物，与F外配对使用；F内为特异性巢式PCR第二次扩增的正向引物，R内为特异性巢式PCR第二次扩增的反向引物，与F内配对使用；T14502C表示为线粒体DNA第14502位，野生型为T，发生基因突变后为C。
图3中：□ 为正常男性个体；○为正常女性个体；■为发病男性个体；●为发病女性个体；◥为先证者；Ⅰ为该家系的第一代成员；Ⅱ为该家系的第二代成员；Ⅲ为该家系的第三代成员。
图4中：F1表示经过 PCR扩增产物未酶切的电泳图； F2为阳性对照者，F3为先证者的丈夫（Ⅱ-6）；F4为先证者的父亲(Ⅰ-1)；F5表示先证者携带T14502C突变位点检测的PCR扩增产物酶切鉴定的电泳图（Ⅱ-7）；F6为先证者的儿子（Ⅲ-3）； F7为阴性对照；F8是对照mark标记条带。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1   本发明一种试剂盒
本发明提供的试剂盒，由DNA提取混合液、扩增T14502C片段的PCR混合液、针对T14502C设计的一对外引物、针对T14502C设计的一对内引物、限制性内切酶、阳性对照、阴性对照组成。其中，DNA提取混合液主要由细胞裂解液和蛋白酶K、氯仿、苯酚、无水酒精组成；扩增T14502C片段的PCR混合液2包括dNTP(脱氧单核苷酸)、10×PCR缓冲液、MgCl₂、三蒸水和Taq酶(DNA聚合酶)，针对T14502C设计的一对外引物是外前向引物F: GCA TAA TTA AAC TTT ACT TC (SEQ ID NO:1)，外反向引物R: AGA ATA TTG AGG CGC CAT TG (SEQ ID NO:2)；针对T14502C设计的内引物是内前向引物F: TACTCCTCAATAGCCATCGCTGTAGTATATCCAAAGACAACCATCATTCCC CCTAAATTAA (SEQ ID NO:3)，内反向引物R: TCTGTTGAGTGTGGGTTTAGTAA (SEQ ID NO:4)；限制性内切酶为限制性内切酶PacⅠ；阳性对照是含有线粒体序列第14502位点能够发生酶切样本；阴性对照是线粒体序列第14502位点不发生酶切样本。
在上述试剂盒中，在扩增T14502C的PCR混合液中添加用于提高延伸反应特异性的少许二甲基亚砜（0.1-0.2μl为宜）。
实施例2  携带线粒体ND6 T14502C突变的Leber病家系的检测
1. 检测样本
选择1个携带T14502C突变的Leber病家系。其家系图参见图3。这个家系呈现典型的母系遗传，发病者均以视力下降为唯一的临床症状，但是家系中每个发病成员的视力损伤程度不等。这个家系总人数为18人，其中母系成员数为14人，患Leber病者有8人。
2. 基因组DNA的提取
分别获取5名受检者的样本（包括采集Ⅱ-7和Ⅱ-6的毛细血管一滴静脉血滤纸片；Ⅰ-1为口腔粘膜刮片或唾液；Ⅲ-3和Ⅲ-4为带毛囊的头发），将血滤纸片用干净的剪刀剪成大小约1cm2的碎纸片放入1.5ml EP管（Eppendorf管），加入900μl红细胞裂解缓冲液（20mmol/L Tris-HCl，pH 7.6）室温静置10min，充分裂解红细胞，12000rpm离心1min，收集白细胞沉淀；收集唾液样本：①舌头围绕口腔刮取粘膜细胞，将约0.1ml唾液直接吐进EP管内；②生理盐水漱口，吐进EP管内，吸取PBS溶液至装有通过上述任一种方法收集的唾液样本的EP管中，反复吹打后，12000rpm离心5min，除去上清，重复该过程一次；③用棉拭子反复刮拭面颊内壁6次，空气中干燥，然后用灭菌过的镊子小心撕去其外表面，放入EP管中；④将唾液吐在滤纸上，空气中干燥后形成唾液斑，再用干净的剪刀剪成大小约1cm²碎纸片置于EP管中；带毛囊的头发样本用70%乙醇洗带毛囊的毛发1 次，后再用蒸馏水冲洗毛发2次。在1.5ml EP管中分别放入2～4 根毛发，毛囊置于EP管底部，用干净的剪刀剪去毛发高于EP管的部分。然后加入600μl细胞裂解液，混匀后再加入溶液Ⅰ，使得蛋白酶K的工作浓度为20μg/ml。充分混匀后55℃消化裂解，接着以盐析法去除蛋白等杂质，异丙醇沉淀DNA，最后用高压灭菌水或TE缓冲液溶解后于-20℃保存备用。
3. 引物设计
使用Primer 5.0软件和Oligo7.0软件协助设计改良引物，根据已公开的人类线粒体基因剑桥参考序列（SEQ ID NO:5）进行设计，引物的设计方案（见图1）如下：
针对mtDNA 14502位点，保证引物设计的特异性，我们设计巢式PCR两对引物F外/R外，F内/R内；它们长度、退火温度相近便于实验条件稳定，以增强特异性。由此设计出的4263位点的巢式PCR引物包括外前向引物F: GCA TAA TTA AAC TTT ACT TC (SEQ ID NO:1)，外反向引物R: AGA ATA TTG AGG CGC CAT TG (SEQ ID NO:2)；针对T14502C设计的内引物包括内前向引物F: TACTCCTCAATAGCCATCGCTGTAGTATATCCAAAGACAACCATCATTCCCCCTA AATTAA (SEQ ID NO:3)，内反向引物R: TCTGTTGAGTGTGGGTTTAGTAA (SEQ ID NO:4)。
4.基因特异性巢式PCR扩增
根据上述设计的4条引物序列，通过人工合成（委托生物公司）获得2对引物，以上述提取的被检样本基因组DNA为模板，进行基因特异性巢式PCR扩增和7%的聚丙烯酰胺凝胶电泳酶切鉴定（见图2）。

巢式PCR循环参数使用外引物为94℃预变性5min，接着94℃变性30s，58℃退火30s，72 ℃延伸30s，重复循环30次后，然后使用内引物94℃变性30s，55℃退火 30s，72 ℃延伸30s，重复循环30次后，最后于72 ℃再延伸5 min。PCR产物5～10 μl在7%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，经EB染色后在凝胶成像仪上观察并照相记录结果。
5. 结果
根据图4可知，当先证者和正常对照样本的基因组DNA分别经2对引物F_外/R_外，F_内/R_内巢式PCR酶切鉴定后，只产生一条280bp恒定扩增带，经限制性内切酶PacⅠ酶切鉴定后，产生的恒定扩增带被限制性内切酶切成两段（参见图4泳道F5），证明先证者样品不携带mtDNA T14502C突变；而经限制性内切酶酶切鉴定后，产生的恒定扩增带没有被限制性内切酶切成两段（参见图4泳道F2），证明该样品携带mtDNA T14502C突变。家系先证者（Ⅱ-13）的基因组DNA经2对引物F_外/R_外，F_内/R_内进行巢式PCR后，出现了1条280bp的恒定扩增带（参见图4泳道F1）；而经限制性内切酶酶切后，该条带没有酶切开，证明了该样品携带mtDNA T14502C突变。F5表示先证者携带T14502C突变位点检测的PCR扩增产物酶切鉴定的电泳图（Ⅱ-7）；F2为阳性对照者，F3为先证者的丈夫（Ⅱ-6）；F4为先证者的父亲(Ⅰ-1)；F6为先证者的儿子（Ⅲ-3）；F7为阴性对照；F8是对照mark标记条带。
6.基因特异性巢式PCR扩增检测方法可靠性的检验
经基因特异性巢式PCR扩增酶切鉴定后，我们在家系母系成员中检测出携带T14502C突变阳性个体。进一步将这些标本的PCR扩增产物进行测序分析，测序结果与基因特异性巢式PCR扩增结果相吻合，说明使用本发明方法检测线粒体基因T14502C突变的可靠性和稳定性。
基因特异性巢式PCR技术与荧光定量PCR技术、测序及基因芯片技术相比具有如下优点（见表2）。


以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。
<110>  浙江大学
<120>  一种检测Leber病线粒体T14502C试剂盒
<160>  5    
 
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人(homo sapiens)
<400>  1
GCA TAA TTA AAC TTT ACT TC                                             
 
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人(homo sapiens)
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AGA ATA TTG AGG CGC CAT TG
 
<210>  3
<211>  61
<212>  DNA
<213>  人(homo sapiens)
<400>  3
TACTCCTCAATAGCCATCGCTGTAGTATATCCAAAGACAACCATCATTCCCCCTAAATTAA
 
<210>  4
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人(homo sapiens)
<400>  4
TCTGTTGAGTGTGGGTTTAGTAA
 
<210>  5
<211>  16569
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<221>  misc_feature
<222>  (3107)..(3107)
<223>  n is a, c, g, or t
<400>  5
gatcacaggt ctatcaccct attaaccact cacgggagct ctccatgcat ttggtatttt  60
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