提高棉纤维长度的方法
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发明背景
本发明涉及植物分子生物学领域，更具体地涉及棉花WRINKLED1样(WRIL)基因，其编码的蛋白质作为参与脂肪酸生物合成的基因的转录因子。本发明还涉及提高棉花的棉纤维长度的方法。在一个实施方案中，这些方法包括调节参与宿主棉花细胞中脂肪酸生物合成的酶的活性水平和/或培养宿主棉花细胞。在另一个实施方案中，这些方法涉及操纵转录因子，所述转录因子可以调节编码参与脂肪酸生物合成的酶的基因。
本文中用于说明本发明的背景或者提供额外的关于实施的细节的出版物和其他材料，通过引用纳入本申请中，并且为方便起见，分别被列于参考文献中。
棉花(Gossypium spp.)是世界上最重要的纤维植物，也是重要的油料种子作物，在80多个国家种植，世界产量的最高纪录为2006/2007年种植季的1.22亿包(480磅/包)(美国农业部海外农业服务局(United States Department of Agriculture–Foreign Agricultural Service))。在1994/1995年，已经发生生产相对于消费的不足，据预计，在2009/2010生长季该不足将继续扩大至250万包(480磅/包)(美国农业部海外农业服务局(United States Department of Agriculture–Foreign Agricultural Service[USDA–FAS])2009)。棉花生产为大约1亿个家庭提供收入，大约有150个国家参与了棉花的进口和出口。据估计，它的全世界经济影响为大约为每年5千亿美元。此外，在粮食短缺的经济体系中，改良棉花种子用于食品和饲料能深度提高数百万人民的营养和生计。棉花也是可再生生物燃料的潜在候选植物。棉纤维几乎是由纯的纤维素组成。相比于木质素，纤维素能够容易地转变为生物 燃料。优化的棉纤维的生产和加工将会确保这种天然可再生产品具备与石油衍生的合成的非再生纤维竞争的能力，以确保更好的可持续发展。
目前，种子总是作物用于人类和动物营养的最重要的部分。主要的种子贮藏化合物包括例如三酰基甘油(TAG)、蛋白质和碳水化合物，其典型地构成成熟种子的质量的大部分，并且这些组分的比例有物种特异性的较大变化。由于种子的组成和产率是育种和农业研究中的重要性状，碳和氮的分离而进入发育种子中的主要存储产物是重要的过程。在模式植物拟南芥(Arabidopsis)中，一种含有AP2结构域的转录因子WRINKLED1(WRI1；At3g54320)控制蔗糖向三酰基甘油的转化，并在控制碳和氮流入TAG生物合成和积累中显示较强的作用(Cernac and Benning,2004)。
由于棉花最重要的农艺性状是纤维质量和产量，提高对于棉纤维发育相关基因的认识很重要。棉纤维是单细胞的种子毛，棉纤维发育被认为是用于研究细胞骨架的动力学和功能的很好的模型系统(Seagull,1990)。探讨细胞骨架的动态变化和细胞骨架相关基因的表达是如何有助于纤维发育是很重要的。在这个方向已经取得了一些进展。细胞骨架蛋白GhActin已被证明对纤维伸长而不是纤维起始很重要(Li et al.,2005)。纤维优先的肌动蛋白结合蛋白(GhPFN2)的过表达过早地阻断细胞伸长(Wang et al.,2010)。另一方面，据报道，向下调节肌动蛋白解聚因子基因(actin depolymerizing factor，ADF)增加纤维长度和纤维强度((Wang et al.,2009)。
棉花的基因功能分析的最终目标是用它们来提高棉纤维的产量和品质。目前，只有相对很少的基因已经被成功地用于转化棉花并且提高棉纤维的产量和质量。其中不少来自碳水化合物的生物合成基因。例如，蔗糖合酶基因(sus和sps)和纤维素合成酶基因(acsA和acsB)的转基因过度表达改善棉纤维的长度和强度(Ruan et al.,2003；Jiang et al.,2011)。类似地，更高的木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶(XTH)活性可促进纤维细胞伸长，并且过表达的xth基因的转基因棉花增加了成熟的纤维长度(Lee et al.,2010)。碳水化合物生物合成基因的过度表达可将固定碳(fixed carbon)分配至碳水化合物，从而提高棉纤维的产量和品质。值得注意的是，发现一些转录因子，其可以调节在棉花生殖器官内的脂质和碳水化合物之间的碳流。拟南芥的研究已经表明，在花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)35S启动子的控制下过表达拟南芥WRI1 cDNA，导致种子含油量增加(Cernac and Benning, 2004)。另一方面，剪接突变等位基因wri1-1的拟南芥的种子油积累减少。该突变体中糖酵解降低，使发育的胚不能有效地将蔗糖转换成三酰基甘油的生物合成前体(Cernac and Benning,2004)。
可用的遗传资源和棉花基因序列将促进棉花主要农艺性状的改良。为此，2007年发起了确定完整的棉花基因组序列的公共项目。虽然该项目还正在进行，不断增加的棉花EST序列集(目前约40万条)被存放在公共数据库里。尽管有这么庞大数量的棉花基因序列可用，只有少数基因的功能已经确定。这主要是因为棉花基因功能的大规模分析一直受制于产生转基因棉花这个费力又耗时的过程。此外，许多棉花品种难以进行遗传转化。因此，迫切需要开发以基因组规模进行棉花基因的不依赖于物种的快速功能分析的方法。
病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)提供了有吸引力的转基因技术的替代，因为它无需植物转化而允许基因功能的研究(Ruiz et al.,1998；Burch-Smith et al.,2004)。候选基因的部分片段被插入到病毒载体内，产生重组病毒。用该重组病毒感染植物，导致产生病毒相关的小干扰RNA(siRNA)(Baulcombe，2004)，它可介导相关的内源基因转录物的降解，从而导致被接种植物中候选基因表达的沉默(Brigneti et al.,2004；Burch-Smith et al.,2004)。内源性基因表达的沉默效果一般可在病毒接种1-2周后进行检测。VIGS已成为使用最广泛的、的确很重要的反向遗传学的工具之一，尤其是对非模式植物而言。
人们需要识别参与生物合成途径的基因，其调节可导致棉纤维长度的增加。也需要开发用于增加棉纤维长度的方法。
发明内容
本发明涉及植物分子生物学，更具体地涉及棉花WRINKLED1样(WRIL)基因。更具体地，本发明涉及棉花基因WRIL，其产物作为参与调节脂肪酸生物合成的基因的转录因子。本发明还涉及提高棉花的棉纤维长度的方法。在一个实施方案中，这些方法包括调节宿主棉花细胞中参与脂肪酸生物合成的酶的活性水平和/或培养该宿主棉花细胞。在另一个实施方案中，这些方法涉及操纵转录因子，该转录因子可以调节编码参与脂肪酸生物合成的酶的基因。
在第一方面，本发明提供了分离的核酸，其编码GhWRIL蛋白，其包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述核酸包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述核酸包含如SEQ ID NO:1的第25-1338位核苷酸所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述核酸包含如SEQ ID NO:1的第25-1341位核苷酸所示的核苷酸序列。在另外的实施方案中，该核酸还包含植物可操作启动子(plant operable promoter)，其可操作地连接到该核酸。在一个实施方案中，该启动子是种子特异性启动子。在另一个实施方案中，种子特异性启动子是棉花种子特异性启动子。
在第二方面，本发明提供了分离的核酸，其编码GrWRIL蛋白，其包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，该核酸包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，该核酸包含如SEQ ID NO:3的第32-1345位核苷酸所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述核酸包含如SEQ ID NO:3的第32-1348位核苷酸所示的核苷酸序列。在另外的实施方案中，该核酸还包含可操作地连接到该核酸的植物可操作启动子。在一个实施方案中，该启动子是种子特异性启动子。在另一个实施方案中，该种子特异性启动子是棉花种子特异性启动子。
在第三方面，本发明提供了构建体或载体，其包含如本文所述的分离的核酸。在一个实施方案中，该构建体或载体是表达构建体或表达载体。在另一个实施方案中，该构建体或载体还包含可选择的标记。在另一实施方案中，该构建体或载体包括不含Cre-lox重组标记的系统。
在第四方面，本发明提供了转基因植物，其包含本文描述的核酸或载体。在一个实施方案中，该转基因植物是棉花植物。
在第五方面，本发明提供了用于棉花WRIL基因的下调。在一个实施例中，棉花WRIL基因的下调涉及使用RNA干扰(RNAi)，其中包括微小RNA(microRNA)和发夹RNA(hairpin RNA)。在另一个实施方案中，棉花WRIL基因的下调涉及使用病毒诱导的基因沉默(VIGS)。在一个实施方案中，提供下调GhWRIL基因的核酸。在另一个实施方案中，提供下调GrWRIL基因的核酸。在一个实施方案中，该核酸还包含植物可操作启动子，其可操作地连接到该核酸。在一个实施方案中，启动子是种子特异性启动子。在另一个实施方案中，种子特异性启动子是棉籽启动子。根据该方面，本 发明还提供了包含如本文所述的分离核酸的载体。在一个实施方案中，该载体是表达载体。在另一个实施方案中，该载体还包含选择标记。在另一个实施方案中，该载体包括不含Cre-lox重组标记的系统。根据该方面，本发明还提供了转基因植物或感染植物，其包含本文所述的核酸或载体。在一个实施方案中，该转基因或受感染的植物是棉花植物。
在第六方面，本发明提供了增加棉花的棉纤维长度的方法。在一个实施例中，方法涉及调节参与宿主棉花细胞中脂肪酸生物合成的酶的活性水平和/或培养该宿主棉花细胞。在一个实施方案中，所述酶是乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)，β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶I(β-ketoacyl-acyl carrier protein synthase I，KASI)或烯酰基-酰基载体蛋白还原酶(enoyl-acyl carrier protein reductase，ENR)。在另一个实施方案中，方法涉及到操纵转录因子，其可以调节参与脂肪酸生物合成的酶。在一个实施方案中，所述转录因子是一棉花WRIL蛋白。在另一个实施方案中，棉花WRIL蛋白是GhWRIL蛋白或GrWRIL蛋白。
附图说明
图1A和1B示出WRI1样蛋白的氨基酸序列比对(图1A)和系统发生树(图1B)。AtWRI1蛋白序列可以用GenBank登录号AAP80382获得，并且在SEQ ID NO:5中列出。GhWRI样基因(GhWRI-like，GhWRIL)，陆地棉(Gossypium hirsutum，四倍体)中的WRIL同源物，其蛋白质序列示于SEQ ID NO:2。GrWRIL，野生棉花雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii，四倍体棉花的推定起源物种之一)中的另一WRIL同源物，其蛋白质序列示于SEQ ID NO:4。JcWRIL，小桐子(Jatropha curcas)中的WRIL同源物，其蛋白质序列可以从国际申请公开号WO 2010/071608获得，并列于SEQ ID NO:6中。ZmWRI1-α，玉米(Zea mays)中的WRI1同源物，蛋白序列可以从GenBank登录号ACG32367获得，并且在SEQ ID NO:7示出。ZmWRI1-b中的另一玉米WRI1同源物，其蛋白序列可以用GenBank登录号NP_001131733获得，并且在SEQ ID NO:8中列出。
图2示出了载体对照(CK)和WRI1基因沉默棉铃和种子的表型。
图3示出，相比于对照棉铃，WRI1基因沉默棉铃上的纤维更长(P<0.001)。
图4示出了GhWRIL沉默的棉花种子中种子重量和含油量两者都降低。
图5示出在GhWRIL沉默棉籽中的脂肪酸谱改变。
图6示出在GhWRIL沉默棉籽中脂肪酸生物合成的基因下调。
图7示出了陆地棉的乙酰辅酶A羧化酶蛋白(SEQ ID NO:10)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的乙酰辅酶A羧化酶蛋白(SEQ ID NO:11)之间的部分序列比对。
图8A和图8B示出了KASI与KASII的蛋白质序列比对。图8A示出陆地棉KASI(SEQ ID NO:13)和拟南芥KASI(SEQ ID NO:14)的比对。图8B示出的陆地棉KASII(SEQ ID NO:16)、拟南芥KASII(SEQ ID NO:17)和小桐子KASII(SEQ ID NO:18)的比对。
图9A-9D示出在乙酰辅酶A羧化酶基因沉默的棉花植物的严重表型。图9A示出了sTRV1+sTRV2载体对照处理的棉花植株。图9B-9D示出了sTRV1+STRV-GhACCase1处理的棉花植株。
图10A-10E示出的脂肪酸伸长关键基因KASI和KASII沉默的棉花植物的严重表型。
发明详述
本发明涉及植物分子生物学，更具体地涉及棉花WRINKLED1样(WRIL)基因。更具体地，本发明涉及棉花基因WRIL，其产物作为参与调节脂肪酸生物合成的基因的转录因子。本发明还涉及提高棉花的棉纤维长度的方法。在一个实施方案中，这些方法包括调节宿主棉花细胞中参与脂肪酸生物合成的酶的活性水平和/或培养该宿主棉花细胞。在另一个实施方案中，这些方法涉及操纵转录因子，该转录因子可以调节参与脂肪酸生物合成的酶。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有通常本发明所属技术领域中技术人员所理解的相同含义。
本文所用的“等位基因”是指任何一种或多种替代形式的基因位点之一，所有这些等位基因涉及性状或特征。在二倍体细胞或生物体中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上的相应基因座。
本文所用的“基因”是指包括基因产物表达相关的5′端启动子区域、任何内含子和外显子区以及与基因产物表达相关的3'或5'非翻译区的核酸 序列。
本文所用的“基因型”指细胞或生物体的遗传组成。
本文所用的“表型”是指细胞或生物体的可检测的特征，其特征是基因表达的体现。
术语“多核苷酸”、“核酸”以及“核酸分子”在本文可互换使用，来表示核苷酸的聚合物，该聚合物可以是天然的或合成的核苷酸和/或核苷的线性的、有序的排列，包括脱氧核糖核酸、核糖核酸以及它们的衍生物。它包括染色体DNA、自我复制的质粒、可转染的DNA或RNA以及主要执行结构性作用DNA或RNA。除非另有说明，核酸或多核苷酸是从左至右、从5'至3'的方向书写的，核苷酸用其普遍接受的单字母代码表示。数字范围包括定义该范围的数字。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用来表示氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸可以通过它们公知的三字母或单字母符号表示。氨基酸序列分别从左向右、从氨基到羧基方向书写。数字范围包括定义该范围的数字。
本文所用的“增长的纤维长度”或“具有增长长度的纤维”指：相比非转基因的或非转染植物的棉纤维，转基因或转染植物中棉纤维增长了至少4％，优选地增长了至少5％，更优选地增长了至少6％，最优选增长了至少7％。
因此，在一方面，本发明提供了分离的核酸，其编码一个GhWRIL蛋白，该蛋白包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述核酸包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述核酸包含如SEQ ID NO:1的第25-1338位核苷酸所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述核酸包含如SEQ ID NO:1的第25-1341位核苷酸所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，该核酸还包含植物可操作启动子，其可操作地连接到该核酸。在一个实施方案中，该启动子是种子特异性启动子。在另一个实施方案中，种子特异性启动子是棉花种子特异性启动子。
在第二方面，本发明提供了分离的核酸，其编码GrWRIL蛋白，该蛋 白包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，该核酸包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，该核酸包含如SEQ ID NO:3的第32-1345位核苷酸所示的碱基序列。在另一个实施方案中，所述核酸包含如SEQ ID NO:3的第32-1348位核苷酸所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，该核酸还包含可操作地连接到该核酸的植物可操作启动子。在一个实施方案中，该启动子是种子特异性启动子。在另一个实施方案中，该种子特异性启动子是棉花种子特异性启动子。
在第三方面，本发明提供了构建体或载体，其包含如本文所述的分离的核酸。在一个实施方案中，该构建体或载体是表达构建体或表达载体。在另一个实施方案中，该构建体或载体还包含可选择的标记。在另一实施方案中，该构建体或载体包括不含Cre-lox重组标记的系统。
在第四方面，本发明提供了转基因植物，其包含本文所述的核酸或载体。在一个实施方案中，该转基因植物是棉花植物。
在第五方面，本发明提供了用于棉花WRIL基因的下调。在一个实施例中，棉花WRIL基因的下调涉及使用RNA干扰(RNAi)，其中包括微小RNA和发夹RNA。在另一个实施方案中，棉花WRIL基因的下调涉及使用病毒诱导的基因沉默(VIGS)。在一个实施方案中，提供下调GhWRIL基因的核酸。在另一个实施方案中，提供下调GrWRIL基因的核酸。在一个实施方案中，该核酸还包含植物可操作启动子，其可操作地连接到该核酸。在一个实施方案中，启动子是种子特异性启动子。在另一个实施方案中，该种子特异性启动子是棉籽启动子。根据一个实施方案，本发明还提供了包含如本文所述的分离核酸的载体。在一个实施方案中，所述载体是表达载体。在另一个实施方案中，所述载体还包含可选择的标记。在另一个实施方案中，该载体包括不含Cre-lox重组标记的系统。根据这一方面，本发明还提供了转基因植物或受感染植物，该植物包含本文所述的核酸或载体。在一个实施方案中，该转基因或受感染的植物是棉花植物。
根据这个方面，选择核酸来抑制天然基因的表达或沉默植物组织中的天然基因，以实现期望的表型。在一个实施方案中，所述天然基因的表达被抑制。这种抑制的实现可以通过，例如转化植物细胞，以包括链接到反义核苷酸序列、发夹结构、RNA干扰分子、双链RNA、微小RNA或其它的核酸分子的启动子，使组织优选(tissue-preferred)的该分子表达干扰天然 DNA序列的mRNA的翻译或以其他方式抑制了在植物细胞中的天然DNA序列的表达。关于RNA干扰技术或微小RNA技术的进一步说明，请参见，例如，美国专利号5034323、6326527、6452067、6573099、6753139和6777588。还可参见国际公开号WO 97/01952、WO 98/36083、WO 98/53083、WO 99/32619和WO 01/75164，以及美国专利申请公开号2003/0175965、2003/0175783、2003/0180945、2004/0214330、2005/0244858、2005/0277610、2006/0130176、2007/0265220、2008/0313773、2009/0094711、2009/0215860、2009/0308041、2010/0058498和2011/0091975。RNAi分子或微小RNA分子可通过本领域技术人员使用在本领域中公知的技术来制备，包括用于选择和检测可用于下调棉花WRIL基因的RNAi分子和微小RNA分子的技术。在另一个实施方案中，可以通过利用VIGS沉默该天然基因。这样的沉默可以通过VIGS系统感染棉花植物来完成，该系统至少包含候选的待沉默基因的部分片段。对于VIGS系统用于棉花的进一步说明，请参见国际公开号WO 2010/144058。
该构建体通常包括可操作地连接到本文所述核酸(例如，编码棉花WRIL蛋白的核酸或编码用于下调棉花WRIL基因的RNAi分子的核酸)的5'端和/或所述核酸的3'端的调控区域。包含所有这些元件的盒(cassette)在本文中也称为表达盒(expression cassette)。另外，这些表达盒可以包含表达盒构建体中的5'前导序列(leader sequence)。调节区(即：启动子、转录调节区和翻译终止区)和/或编码信号锚的多核苷酸对于宿主细胞而言或彼此之间而言可以是天然的/类似的。启动子和组织特异性启动子，如种子启动子，特别是棉籽启动子，对于制备用于棉花转化的构建体特别有用。或者，调控区和/或编码信号锚的多核苷酸可以是对宿主细胞异源的，或彼此异源的。参见，美国专利号7205453和美国专利申请公开号2006/0218670、2006/0248616和2009/0100536以及其中引用的参考文献。表达盒可以额外包含在表达盒构建体中的5'前导序列。这样的前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译的前导序列是本领域已知的，并且包括在国际公开号WO2008/094127以及其引用的参考文献中描述的那些。
若干启动子可以用于本发明的实施。这些启动子可以基于所期望的结果来选择。即，核酸可以与组成型、组织优选或其它启动子进行组合，以便在感兴趣的宿主细胞中表达。此类组成型启动子包括，例如，Rsyn7的核 心启动子(WO 99/48338和美国专利号6072050)、CaMV 35S核心启动子(Odell et al.,1985)、水稻肌动蛋白(McElroy et al.,1990)、泛素(Christensen and Quail,1989；Christensen et al.,1992)、pEMU(Last et al.,1991)、MAS(Velten etal.,1984)、ALS启动子(美国专利号5659026)等。其它组成型启动子包括，例如，在美国专利号5608149、5608144、5604121、5569597、5466785、5399680、5268463和5608142中所公开的。
其它启动子包括诱导型启动子，特别是来自病原体诱导型启动子的诱导型启动子。这类启动子包括来自感染后由病原体诱导的致病相关蛋白(PR蛋白)的启动子，例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶等。其它启动子包括在病原体感染位点或接近病原体感染位点处局部表达的启动子。在其它的实施方案中，启动子可以是伤口诱导型启动子。在其它实施方案中，可以使用化学品调控的启动子并通过应用外源化学调节剂来调节植物中基因的表达。启动子可以是应用化学品来诱导基因表达的化学品诱导型启动子或者是应用化学品来阻抑基因表达的化学品阻抑型启动子。此外，可以利用组织优选的启动子来靶向特定植物组织内的目的多核苷酸的增强表达。这些启动子中的每一个都在美国专利第6506962号、第6575814号、第6972349号和第7301069号以及美国专利申请公开第2007/0061917号和第2007/0143880号中进行了说明。棉籽启动子是本领域技术人员所熟知的，并且包括但不限于Gh-sp启动子(Song et al.,2000)和α球蛋白B启动子(Sunilkumar et al.,2002)。任意其它的追索种子特异性启动子(recourse seed specific promoter)可用于，例如大豆7S贮藏基因启动子(Qu et al.,2012)、麻风树(Jatropha)油质蛋白启动子(Popluechai et al.,2011)、2S贮藏蛋白启动子等。
通常，表达盒可以额外包括可选择的标记基因，用于选择转化细胞。利用可选择的标记基因来选择转化细胞或组织。通常，植物可选择的标记基因会编码对抗生素的抗性，其中合适的基因包括至少一组编码对抗生素大观霉素的抗性的基因、编码对链霉素的抗性的链霉素磷酸转移酶(spt)基因、编码对卡那霉素或遗传霉素的抗性的新霉素磷酸转移酶(nptII)基因、编码对潮霉素的抗性的潮霉素磷酸转移酶(hpt或aphiv)基因、乙酰乳酸合酶(als)基因。或者，植物可选择的标记基因会编码对除草剂的抗性，比如对磺酰脲类除草剂的抗性、对草铵膦的抗性、对草甘膦的抗性、抗铵性、对溴苯 腈的抗性、对咪唑啉酮的抗性和对2,4-二氯苯氧乙酸酯(2,4-dichlorophenoxyacetate，2,4-D)的抗性，包括编码对能抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂(例如草铵膦(Phosphinothricin)或Basta)的抗性的基因(例如bar基因)。通常参见国际公开WO 02/36782、美国专利第7205453号以及美国专利申请公开第2006/0218670号、第2006/0248616号、第2007/0143880号和第2009/0100536号，以及其中援引的参考文献。还可参见Jefferson et al.(1991)；De Wet et al.(1987)；Goff et al.(1990)；Kain et al.(1995)和Chiu et al.(1996)。该可选择的标记基因的罗列并不是限制性的。可以使用任意可选择的标记基因。可选择的标记基因还处于在待转化植物物种中可操作的启动子的控制下。这类启动子包括在国际公开WO2008/094127以及其援引的参考文献中描述的启动子。
或者，表达盒可以额外包括不含Cre-lox重组标记的系统，比如Zuo et al.(2001)描述的系统。这种系统用于生产不含选择标记的转基因棉花植物。
在制备表达盒时，可以对各种DNA片段进行操纵，以提供处于适当取向以及在适当时处于适当的阅读框的DNA序列。为此，可以使用衔接子(adapters)或接头(linkers)将DNA片段连接起来，或者可以涉及其它操纵以提供便利的限制位点、去除多余的DNA、去除限制位点等。为此，可以涉及体外诱变、引物修复、限制(restriction)、退火、再置换，例如转换和颠换。
一旦核酸已经被克隆到表达载体中，可以使用常规转化步骤将它引入到植物细胞中。术语“植物细胞”意在包括由植物得到的任何细胞，包括未分化的组织，比如愈伤组织和悬浮培养物，以及植物种子、花粉或植物胚。适合转化的植物组织包括叶组织、根组织、分生组织、原生质体、下胚轴，子叶、盾片、芽尖、根、幼胚、花粉和花药。“转化”是指通过外部应用来源于另一个不同基因型的细胞的重组DNA将细胞基因组进行定向修饰，导致将重组DNA被吸收并整合进入对象细胞的基因组。以这种方式，可以得到遗传修饰的植物、植物细胞、植物组织、种子等。
可以使用包含本发明启动子的DNA构建体来转化任意植物，尤其是棉花植物。通过各种常规技术可以将构建体引入期望的植物宿主的基因组。用于转化多种高等植物物种的技术是公知的，并且在科技文献中进行了说明。如本领域技术人员所熟知，转化方法可以随转化目标植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而变化。例如，可以使用比如植物细胞 原生质体的电穿孔和显微注射等技术将DNA构建体直接引入植物细胞的基因组DNA，或者可以使用DNA粒子轰击等弹道方法将DNA构建体直接引入植物组织。或者，可以将DNA构建体和合适的T-DNA侧翼区结合并且引入到常规的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)宿主载体中。当细胞被细菌感染时，根癌农杆菌宿主的毒力功能会引导构建体和邻近标记插入到植物细胞DNA中。因此，可以使用任何提供有效转化/转染的方法。参见例如美国专利第7241937号、第7273966号和第7291765号以及美国专利申请公开2007/0231905和2008/0010704和其中援引的参考文献。还可参见国际公开WO 2005/103271和2008/094127以及其中援引的参考文献。已经被用来转化油棕的技术包括基因枪介导的(biolistic-mediated)转化和农杆菌(Agrobacterium)介导的转化。参见例如Masli et al.(2009)；Omidvar et al.(2008)；Parveez et al.(2008)；Abdullah et al.(2005)；Parveez et al.(2000)；Chowdhury,et al.(1997)；以及美国专利申请公开2009/0038032。
可以培养通过以上任意一种转化技术得到的转化植物细胞以再生具有转化的基因型并因此具有期望的表型的整株植物，例如转基因植物。“转基因植物”是引入了外源DNA的植物。“转基因植物”包括其所有的无论是有性繁殖还是无性繁殖的后代、杂交种(hybrids)和杂交种(crosses)，并且这些后代和杂交种继续拥有外源DNA。再生技术取决于在组织生长培养基中对某些植物激素的操纵，典型地取决于已经和期望的核苷酸序列一起引入的杀生剂和/或除草剂标记。参见例如国际公开WO2008/094127以及其中援引的参考文献。
典型地，将上述转化方法用于产生稳定地并入了表达盒的转基因品种。在表达盒稳定地并入转基因植物以后，可以通过有性杂交将表达盒转移到其它植物。在一个实施方案中，转基因品种然后可以和另一个(非转化的或转化的)品种进行杂交，以产生新的转基因品种。或者，已经使用上述转化技术获得的特定棉花系的遗传性状可以使用植物育种领域公知的传统回交技术转移到另一系。例如，可以使用回交方法将工程性状从公共非优良品种转移到优良品种，或者从基因组包含外源基因的品种转移到一个或多个不含该外源基因的品种。如本文中所用，“杂交”可以指简单的X和Y杂交，或者回交过程，依上下文而定。根据待杂交的物种，可以使用多个标准育种技术中的任意一种技术。
一旦生产了这种类型的转基因植物，可以根据常规步骤培养植物本身。当然，可以从转基因植物中回收转基因种子。然后，可以将这些种子种植到土壤中并使用常规步骤培养以产生转基因植物。培养的转基因植物以如本文中所述的组织优选或组织特异性方式对目的DNA进行表达。
在第六方面中，本发明提供增加棉花的棉纤维长度的方法。在一个实施方案中，方法包括对宿主棉花细胞或棉花植物中参与脂肪酸生物合成的酶的活性水平进行调节。在一个实施方案中，该酶是乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)。在另一个实施方案中，该酶是β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶I(KASI)。在另一个实施方案中，该酶是烯酰基-酰基载体蛋白还原酶(ENR)。可以通过减少对该酶的表达来降低活性水平。在一个实施方案中，对酶活性进行调节是将酶活性降低。可以使用本文所述的将酶作为RNA干扰(RNAi)的目标的RNAi技术来降低酶活性水平。或者，可以使用本文所述的使用目标基因的至少部分片段的VIGS技术来降低酶活性水平。
在另一个实施方案中，方法包括操纵转录因子，该转录因子可以调节参与脂肪酸生物合成的酶。在一个实施方案中，该转录因子是棉花WRIL蛋白。在另一个实施方案中，棉花WRIL蛋白是GhWRIL蛋白或GrWRIL蛋白。在一个实施方案中，对转录因子的操纵是减少表达。在一个实施方案中，可以使用本文所述的将转录因子mRNA作为RNAi的目标的RNAi技术来减少转录因子表达。或者，可以使用本文所述的使用目标转录因子基因的至少部分片段的VIGS技术来降低转录因子的活性水平。
除非另有说明，本发明的实施采用本领域技术范围内的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的常规技术。参见例如，Maniatis等人，1982，《分子克隆》(Molecular Cloning)(冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港)；Sambrook等人，1989，《分子克隆》(Molecular Cloning)，第二版，(冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港)；Sambrook以及Russell，2001，《分子克隆》(Molecular Cloning)，第三版，(冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港)；Ausubel等人，1992，《现代分子生物学实验技术》(Current Protocols for Molecular Biology)(约翰威立国际出版公司(John Wiley&Sons)，包括定期更新)；Glover，1985，《DNA克隆》(DNA Cloning)(IRL出版社，牛津)；Russell，1984，《植物分子生物学：实验课手册》(Molecular biology of plants:a laboratory course manual)(冷泉港 实验室出版社，纽约冷泉港)；Anand，《复杂基因组分析技术》(Techniques for the Analysis of Complex Genomes)(学术出版社，纽约，1992)；Guthrie以及Fink，《酵母遗传学和分子生物学指南》(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)(学术出版社，纽约，1991)；Harlow以及Lane，1988，《抗体》(Antibodies)(冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港)；《核酸杂交》(Nucleic AcidHybridization)(B.D.Hames&S.J.Higgins编著1984)；《转录与翻译》(Transcription And Translation)(B.D.Hames&S.J.Higgins编著1984)；《动物细胞培养》(Culture Of Animal Cells)(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；《固定化细胞和酶》(Immobilized Cells And Enzymes)(IRL出版社，1986)；B.Perbal，《分子克隆实用指南》(A Practical Guide To Molecular Cloning)(1984)；著作：《酶学方法》(Methods In Enzymology)(学术出版社，纽约)；《酶学方法》(Methods In Enzymology)，第154和155卷，(Wu等人编著)，《细胞及分子生物学的免疫化学方法》(Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology)(Mayer和Walker编著，学术出版社，伦敦，1987)；《实验免疫学手册》(Handbook Of Experimental Immunology)，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编著，1986)；Riott，《免疫学概论》(Essential Immunology)，第六版，Blackwell科学出版社，牛津，1988；Fire等人，《RNA干扰技术：从基础科学到药物开发》(RNA Interference Technology:From Basic Science to Drug Development)，剑桥大学出版社，剑桥，2005；Schepers,《RNA干扰实践》(RNA Interference in Practice)，Wiley–VCH,2005；Engelke,《RNA干扰(RNAi)：siRNA技术要点》(RNA Interference(RNAi):The Nuts&Bolts of siRNA Technology),DNA出版社，2003；Gott,《RNA干扰、编辑及修饰：方法与实验方案(分子生物学方法)》(RNA Interference,Editing,and Modification:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology))，人类出版社，托托瓦，新泽西州，2004；Sohail，《RNA干扰引起的基因沉默：技术与应用》(Gene Silencing by RNA Interference:Technology and Application)，CRC，2004。
实施例
通过参考以下实施例对本发明进行说明，其通过举例说明的方式提供并且不以任何方式限制本发明。利用了本领域熟知的标准技术或者下面具 体说明的技术。
实施例1
材料与方法
棉花苗：在温室中将棉籽进行增殖和发芽。使用带有2-3片真叶的4-14日龄的种苗进行VIGS检测。还可以使用只带有子叶的幼苗进行VIGS检测。
合成的TRV RNA1表达载体以及合成的TRV RNA2表达载体：参见国际公开号WO 2010/144058。
基因克隆及VIGS载体克隆：通过聚合酶连锁反应(PCR)从陆地棉叶样品的cDNA产物扩增出候选基因，并且将候选基因克隆到合成载体psTRV2001的XbaI和BamHI的位点。基因克隆所用的引物在表1中列出，表1还包括对克隆基因的序列的引用。
表1、基因引物及基因序列
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农杆菌浸润：将合成的psTRV载体及它们的衍生物通过电穿孔引入农杆菌菌株AGL1中。将3ml培养物在50mg/L卡那霉素以及25mg/L利福平中28℃下培养24小时。第二天，将培养物接种到含有50mg/L卡那霉素、10mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)以及20μM乙酰丁香酮的LB培养基中，并且在28℃摇床中培养过夜。通过离心收集农杆菌细胞并且将细胞在MMA溶液(10mM MES，10mM MgCl2，200μM乙酰丁香酮)中重悬直至最终OD600为1.5。将农杆菌混悬液在室温下并且不摇动的条件下放置3-4小时。浸润之前，将含有pTRV1/psTRV1或pTRV2/psTRV2载体的农杆菌 培养物按1:1的比例进行混合。通过注射器浸润或通过真空浸润将棉花植物用培养物浸润。对于注射器浸润，使用1ml无针注射器将农杆菌-接种物输送到两片或三片完全展开的最嫩叶的下侧。对于真空浸润，将整株植物浸入农杆菌-接种物中并且处于80-90kPa真空下5分钟，然后迅速释放真空，以使接种物迅速进入植物组织。下述所有数据都是通过真空浸润获得。但是，也可以使用注射器浸润，只不过注射器浸润比真空浸润更耗时。通过真空浸润得到的沉默效果比通过注射器浸润得到的沉默效果更好。浸润以后，使用过量的农杆菌细胞混悬液浸透被浸润植物的根系。被浸润植物在生长箱中25℃下以16小时光照/8小时黑暗的光周期培养。在测试假定宿主植物中VIGS的实验中也使用相同的方法。
脂肪酸分析：从100mg新鲜棉花叶或种子中用以前所述方法提取总脂(Ye et al.,2009)。除去干燥棉花种子的外种皮。将剩余部分研磨成细粉并且用己烷提取三次脂质。将合并的上清液转移到玻璃小瓶中并且在50℃下用干燥氮气流将己烷蒸发。确定粗制油的重量并且将油含量记为粗制油与胚乳干重的比值。
用3N甲醇-盐酸(SIGMA，密苏里州，美国)加上400μL 2,2-二甲氧基丙烷(SIGMA，密苏里州，美国)将大约10mg的脂质进行转甲基化。通过气相色谱仪(GC)将所得FAME分离，并且使用GC Agilent 6890(安捷伦(Agilent)，加利福尼亚，美国)进行检测，GC Agilent 6890采用氦气作为载气以及DB-23柱进行组分分离。在140℃下进行GC分析50秒并且以30℃/min的升温速率(ramp)升到240℃，并在最终温度下保持50秒。相较于FAME参照混合物(SIGMA，密苏里州，美国)，基于峰的保留时间对峰进行识别。基于三次生物学重复的总脂肪酸的峰面积百分比，对分析中包括的脂肪酸组合物的值进行计算。数据以均数±标准差提供。
RNA提取及分析：在液氮中将100mg叶组织或种子研磨成细粉并且用植物RNA纯化试剂(Invitrogen，加利福尼亚，美国)进行提取。使用Nanodrop(Thermo，特拉华，美国)测量RNA浓度。M-MLV逆转录酶(Promega，威斯康星，美国)用于逆转录反应及cDNA制备。使用cDNAs扩增相应的基因编码区。使用Power![]()
Green PCR Master mix(Applied Biosystems，加利福尼亚，美国)进行实时PCR，并在ABI7900HT中运行。所有样品都是一式三份，并使用预设Ct值的RQ manager(Applied Biosystems，加利福尼亚，美国)分析数据。棉花UBQ14转录物用作RNA样品的内部对照(F:CAACGCTCCATCTTGTCCTT(SEQ ID NO:27),R:TGATCGTCTTTCCCGTAAGC(SEQ ID NO:28))。分析中包括的Ct值基于三次生物学重复，每个生物样品有三次技术重复。基于三次生物学重复计算标准差。
实施例2、识别棉花WRI1样基因编码序列
参照拟南芥WRI1蛋白质序列(GenBank登录号：AAP80382)在GenBank中进行数据库搜索，首次识别出假定WRI1样基因编码序列。引物设计为F:GGCACGAGGGGGGAAGAAAAAAAA(SEQ ID NO:29),R:TAACCCGAAACATCAACCATTA(SEQ ID NO:30)，并且使用陆地棉的cDNA进行PCR以克隆全长cDNA，然后进行载体克隆以及测序。cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。推导出的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在棉花(Gossypium raimondii)的EST数据库http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html中还识别出另一种棉花WRIL蛋白。野生棉花Gossypium raimondii被认为是四倍体棉花的假定先驱物种中的一种。GrWRIL的cDNA序列如SEQ ID NO:3所示，并且推导出的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。进行蛋白质比对和系统进化分析(图1A和1B)。基于以上数据，棉花WRI1样蛋白(GhWRIL)与拟南芥WRI1(AtWRI1)具有51.4％的同源性。但是，不同棉花物种的WRIL同系物具有96.3％的同源性，这表明该蛋白在棉花物种的进化中起到非常重要的作用。
实施例3、通过敲减(knockdown)GhWRIL的表达获得的更长纤维长度
我们感兴趣的是WRIL对棉纤维长度的作用的功能性分析。为扩增陆地棉(G.hirsutum)的WRIL，设计PCR引物(SEQ ID NO:19和20)以通过PCR扩增陆地棉的543bp的cDNA，并将GhWRIL片段(SEQ ID NO:1)插入到sTRV2多克隆位点(MCS)，得到psTRV2:GhWRIL。还通过测序验证了GhWRIL的序列。将携带psTRV1的农杆菌培养物和携带psTRV2:GhWRIL或载体对照的农杆菌培养物进行混合。将混合的培养物真空浸润到带有2-3片真叶的陆地棉植株中(详情参见实施例1)。在GhWRIL沉默的棉花植株的 营养器官中没有明显的表型，比如叶宽和表皮毛分支形式。
在棉铃成熟并且棉纤维暴露之后，可以在GhWRIL沉默的棉花植株上观察到更大的棉铃尺寸以及更长的纤维长度(图2)。GhWRIL沉默的棉花植株的棉纤维长29.2mm，而sTRV载体处理的对照棉花植株的棉纤维长27.3mm(图3)。与对照种子相比，GhWRIL沉默的棉花植株的种子显示出更瘦小的表型(图2)。此外，GhWRIL沉默的棉花种子的种子重量和含油量都减少了(图4)。还发现脂肪酸谱变成具有较低的油酸(18:1)以及较高的亚油酸量(图5)。
接下来，我们试图识别棉花种子中转录因子WRIL调节的假定下游基因。我们使用从处理过的植株种子提取的总RNA进行定量实时PCR，以在分子水平证实WRIL基因的VIGS，结果如图6所示。GhWRIL沉默的植株种子中的WRIL RNA累积量比sTRV空载体感染的植株中的WRIL RNA累积量低得多，并且有22％的GhWRIL RNA留在GhWRIL沉默的植株中。在所有脂肪酸生物合成酶中，乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)控制通路主要的点并且催化脂质生物合成的限速步骤。乙酰辅酶A羧化酶催化乙酰辅酶A向丙二酸辅酶A的羧化，羧化是脂肪酸生物合成中的第一关键步骤。在GhWRIL沉默的种子中，将同型乙酰辅酶A羧化酶1急剧减少到只有对照种子的12％。烯酰基-酰基载体蛋白还原酶(ENR)和酮脂酰-酰基载体蛋白合酶(KASI)是明显下调基因中两个关键基因。KASI编码脂肪酸缩合反应的主要酶并且ENR是脂肪酸伸长周期中最后的酶。相比之下，其它FAS基因(例如编码酮脂酰-ACP合成酶II(KASII)和丙酮酸脱氢酶(PDH1)的基因)的转录物水平没有明显变化(图6)。
这些结果表示GhWRIL可以结合这三种基因(ACCase1，KASI及ENR)的启动子以调节它们的表达。当我们下调GhWRIL的活性时，这三种脂肪酸生物合成的关键基因的表达被下调并且抑制碳流向油的分布，另一方面，增强了蔗糖相关的最终产物棉花纤维。
实施例4、ACCase1、KASI及KASII的沉默导致营养生长缺陷
由于我们识别出了GhWRIL调节的目标基因，因此我们进一步测试是否可以通过直接操纵这些基因来增加纤维长度。
用识别GhWRIL的方法识别棉花ACCASE1及KASI、KASII基因，并 将基因片段插入到psTRV2载体(图7及图8A和8B)。GhACCase1的部分编码序列如SEQ ID NO:9所示，并且推导出的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。GhKASI的编码序列如SEQ ID NO:12所示，并且推导出的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。GhKASII的编码序列如SEQ ID NO:15所示，并且推导出的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。携带psTRV1的农杆菌培养物和携带psTRV2:GhACCase1、GhKASI、GhKASII或载体对照的农杆菌培养物进行混合。将混合的培养物真空浸润到带有2-3片真叶的陆地棉植株中(详情参见实施例1)。
所有这三种沉默的植物的植物营养生长显示出严重的表型(图9A-9D及图10A-10E)。
术语“a”、“an”和“the”的使用以及类似指代在描述本发明的上下文中(特别是在所附权利要求书的上下文中)解释为既包括单数也包括复数，除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”及“含有”被解释为开放式术语(即，意思是“包括，但不限于，”)，除非另有说明。本文中数值范围的列举仅打算用作单独指落入该范围的每一个单独值的速记方法，除非本文另外指明，并且每一个单独数值被纳入说明书中，好像其在本文被单独列举一样。例如，如果公开了范围10-15，那么也公开了11、12、13和14。本文描述的所有方法可以按任意合适的顺序实施，除非本文另有指明或与上下文明显矛盾。本文提供的任意以及所有实施例或者示例性语言(例如，“比如”)仅仅是为了更好地说明本发明，并不构成对本发明范围的限定，除非另有说明。说明书中的语言不应解释为表明任何非权利要求的元件为本发明的实践所必需的。
应当理解的是，本发明的方法和组合物可以以各种实施方案(本文只公开了其中的几个实施方案)的形式并入。本文描述了本发明的实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明的最好方式。一旦阅读了前述说明书，这些实施方案的变化对本领域普通技术人员来说可以变得显而易见。发明人期望技术人员在适当时应用这些变化，并且发明人希望本发明以不同于本文具体描述的方式实施。因此，本发明包括适用法律允许的所附权利要求中列举的主题的所有修改和等同物。此外，在所有可能的变化中上述要素的任意组合都被本发明所包括，除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾。
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