小麦黑穗菌TILLETIACONTROVERSAKHN的实时荧光定量鉴定方法及试剂盒.pdf

摘要
申请专利号：	CN201510017724.1	申请日：	2015.01.14
公开号：	CN104774919A	公开日：	2015.07.15
当前法律状态：	实审	有效性：	审中
法律详情：	实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20150114\|\|\|公开
IPC分类号：	C12Q1/68; C12Q1/04; C12R1/645(2006.01)N	主分类号：	C12Q1/68
申请人：	中国农业科学院植物保护研究所
发明人：	高利; 陈万权; 蔚慧欣; 刘太国; 刘博
地址：	100193北京市海淀区圆明园西路2号
优先权：	2014104789825 2014.09.18 CN
专利代理机构：	北京海虹嘉诚知识产权代理有限公司11129	代理人：	吴泳历
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内容摘要

本发明“小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)的实时荧光定量鉴定方法及试剂盒”，涉及植物病害检测技术。包括如下步骤：(1)获得TCK阳性质粒标准品的实时定量标准曲线，其中Ct值为纵坐标，起始模板拷贝数为横坐标；(2)提取待测样品的DNA；(3)以所述待测样品的DNA为模板进行实时荧光定量PCR反应，(4)根据所述实时荧光定量PCR反应获得的Ct值以及所述实时定量标准曲线得到所述待测样品中TCK的拷贝数；其特征在于：所述实时荧光定量PCR反应采用的引物如下：上游引物ACGACCGACTTTCCGAGAGC下游引物GTGTGGGACGAAGGCATCAA；还提供了基于该方法的试剂盒。

权利要求书

1.  小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)的实时荧光定量鉴定方法，包括如下步骤：
(1)获得TCK阳性质粒标准品的实时定量标准曲线，其中Ct值为纵坐标，起始模板拷贝数为横坐标；
(2)提取待测样品的DNA；
(3)以所述待测样品的DNA为模板进行实时荧光定量PCR反应，
(4)根据所述实时荧光定量PCR反应获得的Ct值以及所述实时定量标准曲线得到所述待测样品中TCK的拷贝数；
其特征在于：所述实时荧光定量PCR反应采用的引物如下：
上游引物  ACGACCGACTTTCCGAGAGC，
下游引物  GTGTGGGACGAAGGCATCAA。

2.  根据权利要求1所述的鉴定方法，所述实时荧光定量PCR反应的体系如下：

3.  根据权利要求1所述的鉴定方法，所述实时荧光定量PCR反应的体系程序如下：95℃10 分钟，95℃15秒，60℃60秒，40个循环。

4.  用于鉴定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)的实时荧光定量试剂盒，其特征在于：包括除DNA模板之外的用于实时荧光定量PCR反应的试剂和标准曲线方程说明书；
所述试剂中的引物如下：
上游引物  ACGACCGACTTTCCGAGAGC，
下游引物  GTGTGGGACGAAGGCATCAA；
所述标准曲线方程为TCK阳性质粒标准品的实时定量标准曲线的方程，所述标准曲线的纵坐标为Ct值，横坐标为所述TCK阳性质粒标准品的起始模板拷贝数。

说明书

小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)的实时荧光定量鉴定方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及植物病害检测技术，特别是一种小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)的实时荧光定量鉴定方法。
背景技术
小麦矮腥黑穗病菌(Tilletia controversa Kühn，简称TCK)引起的小麦矮腥黑穗病是一种重要的国际检疫性病害，对小麦生产造成严重的危害，也是我国外来生物入侵研究的主要物种之一(王圆，1997)。在其流行年份，小麦矮腥黑穗病引起的产量损失一般为20％～50％，严重时可达75％～90％，甚至绝产。病菌抗逆性极强，其冬孢子在土中可存活3～7年，包裹在菌瘿中的冬孢子甚至可保持活力长达10年以上。此病害一旦发生，很难防治或根除，所以国际上有15个国家将其列为检疫对象。我国在20世纪60年代把此病害列为检疫对象。在腥黑粉菌中，TCK与其近缘种小麦网腥黑粉菌、小麦光腥黑粉菌等在形态学上极为相似，难于区别。
传统的病害诊断、检测方法主要是依据病原形态学、生理学和生物化学的特性，不但过程繁琐、时间周期长，而且准确性差、精度不高。因此，利用分子生物学手段快速、准确地鉴别小麦矮腥黑粉菌具有重要的意义。
1996年Ferreira等首次将PCR技术引进到印度腥黑穗病的鉴定中来，他们选择了印腥线粒体DNA的一个2.3kb的EcoR1片段进行了克隆和测序，设计的特异性引物TI1/TI4从25种腥黑穗病菌菌株中鉴定出了印腥。另外，Smith等通过克隆印腥线粒体DNA的Dra1片段，进行了序列分析，设计了两套寡核苷酸引物对Ti17/M1和Ti17/M2能分别从印腥中扩增出大小为825bp和118bp特异性片段，也实现了对印度腥黑穗病的检测鉴定工作。2000年Frederick根据线粒体的差异设计了5对针对印度腥黑穗病的特异性引物和3对针对黑麦草腥黑穗病的特异性引物，分别能将印度腥黑穗病菌株和黑麦草腥黑穗病菌株从其近缘属种中鉴别出来。张竞宇等利用核糖体ITS序列上的差异在Tilletia属20个种中设计了一对特异性引物T1/T2，能将T.indica和T.walkeri从其它种中区分开来，而后又根据T.indica和T.walkeri线粒体之间的差异设计了一对特异性引物M1/M2,可以将二者区分开来，为了使反应更为灵敏，建立了套式PCR技术，以便于提供更简单的鉴定方法。2004年高强利用RAPD技术找到了一条可以将小麦网腥黑穗病菌株和小麦矮腥黑穗病菌株区别于其它黑粉菌株的条带，但是很遗憾在矮腥黑粉菌和网腥黑粉菌之间没有找到有差异的条带，没能将二者分开。梁宏等人依据核糖体的IGS1区特性，设计了一对特异性引物，可以将小麦光腥黑穗病菌株从其近缘属种中鉴别出来。
发明人前期研究中获得TCK差异片段661bp(Seq ID No.1)，并根据所得差异片段获得 TCK Scar标记及引物，见专利号201110051404.X记载。该标记能用于常规PC鉴定TCK菌，能够特异性地将TCK从近似菌种中鉴定出来。但是发明人发现，该专利中的标记引物及PCR方法不能很好地应用于预警小麦矮腥黑穗病以及筛选抗TCK小麦品种方面，可能是因为感染TCK且未表现病征的病株中，提取DNA后，TCK的DNA所占比例太小，也就是浓度太低，而普通PCR的灵敏性不足于检测到如此低浓度的模板。众所周知，实时定量PCR在灵敏度方面显著优越于普通PCR，因此发明人尝试将该Scar标记引物用于实时定量PCR来扩增TCK样本,但是无论是在实时荧光定量方法中还是在TaqMan水解探针法定量PCR中，都扩增不出信号。
为了能顺利利用实时定量PCR方法鉴定小麦矮星黑穗病，有必要通过设计筛选适合于实时定量PCR方法的特异性PCR引物，优化PCR反应体系得出一套灵敏性高、特异性好的实时定量检测方法。
发明内容
本发明根据上述领域的现状及需求，根据前期研究中筛选到的TCK差异基因片段Seq ID No.1，设计出TCK特异性引物及探针，基于ABI7500荧光定量扩增仪,优化Real-Time PCR反应体系，成功地建立SYBRGreenⅠ荧光染料法定量PCR检测体系检测TCK。
本发明建立的实时定量SYBRGreenⅠ荧光染料法检测TCK的技术方案如下：
小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)的实时荧光定量鉴定方法，包括如下步骤：
(1)获得TCK阳性质粒标准品的实时定量标准曲线，其中Ct值为纵坐标，起始模板拷贝数为横坐标；
(2)提取待测样品的DNA；
(3)以所述待测样品的DNA为模板进行实时荧光定量PCR反应，
(4)根据所述实时荧光定量PCR反应获得的Ct值以及所述实时定量标准曲线得到所述待测样品中TCK的拷贝数；
其特征在于：所述实时荧光定量PCR反应采用的引物如下：
上游引物   ACGACCGACTTTCCGAGAGC，
下游引物   GTGTGGGACGAAGGCATCAA。
所述实时荧光定量PCR反应的体系如下：

加入灭菌蒸馏水至20μl。
所述实时荧光定量PCR反应的体系程序如下：95℃10分钟，95℃15秒，60℃60秒，40个循环。
用于鉴定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)的实时荧光定量试剂盒，其特征在于：包括除DNA模板之外的用于实时荧光定量PCR反应的试剂和标准曲线方程说明书；
所述试剂中的引物如下：
上游引物   ACGACCGACTTTCCGAGAGC，
下游引物   GTGTGGGACGAAGGCATCAA；
所述标准曲线方程为TCK阳性质粒标准品的实时定量标准曲线的方程，所述标准曲线的纵坐标为Ct值，横坐标为所述TCK阳性质粒标准品的起始模板拷贝数。
本发明根据前期筛选到的TCK和TCT差异基因片段，设计特异于TCK的特异性引物，基于ABI7500荧光定量扩增仪,优化Real-Time PCR反应体系，成功地建立SYBRGreenⅠ荧光染料法定量PCR检测体系。检测中利用阳性梯度稀释标准品的Ct值绘制成标准曲线,再根据检测样品的Ct值就可以准确地测定靶标病原菌的起始模板的拷贝数。同时RT-PCR不需要内标，避免了两种模板(TCK和TCT)之间的干扰和竞争，是一种准确、可靠的科学定量方法。标准曲线法需要有较高的PCR扩增效率。该检测体系对重组质粒的检测灵敏度可达0.1fg，比常规PCR的灵敏度高出2～3个数量级，可用于小麦矮腥黑穗病的无症早期诊断和小麦矮腥黑穗菌与其近源种小麦网腥黑穗菌的鉴定，为病害流行学研究以及鉴定提供新了更灵敏的手段。
本发明还根据获得的特异性引物，以及引物和探针的组合提供了用于鉴定TCK的试剂盒。
附图说明
图1SYGR green法实时扩增曲线
图2SYGR green法标准曲线
标准曲线方程为：Y＝-3.226X+37.104R2＝0.994
图3SYGR green法标准曲线与样本扩增
图4SYGR green法标准曲线与样本扩增标准曲线图
图5小麦矮腥黑粉菌特异性引物验证
1～5小麦矮腥黑粉菌TCK1～TCK5；6～7小麦网腥黑粉菌TCT1～TCT2；8～9小麦光腥黑粉菌TFL1～TFL2；10～11小麦条锈菌；12小麦叶锈菌；13小麦白粉菌；14小麦杆锈菌； 15小麦赤霉菌；16双蒸水
具体实施方式
1.实验主要试剂
表一使用试剂清单

未经特别说明，本发明使用的试剂均为本领域常用试剂。
2.实验主要仪器
表二使用仪器清单

仪器名称仪器型号厂家涡旋振荡仪 QL-902 海门市其林贝尔仪器制造有限公司离心机 Centrifuge 5415D Eppendorf 分光光度计 NANODROP 2000 Therno scientific 荧光定量PCR仪 ABI7500 Applied Biosystems

3.本发明的实验材料：
小麦矮腥黑粉菌(T.controversa Kühn,TCK)共5个菌株来源于美国；小麦光腥黑粉菌(T.foetida Liro,TFL)共2个菌株，其中1个来源自捷克，其余1个来源国内不同地区，均由中国农业科学院植物保护研究所麦病组收存；小麦网腥黑粉菌(T.caries Tul.,TCT)共2个菌株，由重庆大学王中康教授提供；小麦条锈菌(Puccnia striiformis)、小麦叶锈菌(P.triticina)、小麦秆锈菌(P.graminis)、小麦白粉菌(Erysiphe graminis)、小麦赤霉菌(Fusarium graminearum)等由中国农业科学院植物保护研究所麦病组收存，可向公众发放作为非商业性实验用。
步骤一、引物，探针设计及验证
1.根据前期筛选到的TCK差异基因片段(Seq ID No.1)，利用Primer Primer 5.0软件设计特异于TCK的特异性引物和探针。
上游引物   ACGACCGACTTTCCGAGAGC，
下游引物   GTGTGGGACGAAGGCATCAA；
2.普通PCR方法鉴定引物特异性：
材料及其来源：
小麦矮腥黑粉菌TCK1～TCK14；小麦网腥黑粉菌TCT1～TCT2；小麦光腥黑粉菌TFL1～TFL2；小麦条锈菌；小麦白粉菌；小麦赤霉菌；双蒸水对引物的特异性进行验证。
反应体系总体积为25μl，其中含有10X PCR-buffer 2.5μl，Mg2+2μl(25mM)，dNTPs0.3μl(10mM)，上下游引物各1μl(10μM)，Taq DNA多聚酶0.3μl(2.5U/μl)，模板DNA 20ng，灭菌重蒸水补足25μl。
PCR扩增条件为：94℃5min；94℃30Sec，60℃30Sec,72℃1min,30个循环；72℃延伸10min；4℃forever
结果显示，引物仅在TCK样品中扩出条带，如图5。
步骤二、绘制标准曲线
1、质粒稀释
阳性标准品质粒：根据前期筛选到的TCK差异基因片段，构建了重组质粒作为阳性标准品。将差异性片段转移到pUCm-T载体中，使用UNIQ-10spin column plasmid DNA extraction kit(Shanghai Sangon,Shanghai,China)，提取重组质粒。
阳性标准品质粒进行10倍梯度稀释，依次稀释8个浓度，为模板，拷贝数为2.65×10⁹～2.65×10²，以ddH₂O为阴性对照。
2、反应体系
SYBR Green反应体系：用UltraSYBR Mixture(With ROX)(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0956)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。
扩增程序为：95°10min，(95℃15sec，60℃60sec)×40个循环，同时做熔解曲线分析。
RealTime反应体系为：

加入灭菌蒸馏水至20μl。
引物序列如下：
上游引物   ACGACCGACTTTCCGAGAGC
下游引物   GTGTGGGACGAAGGCATCAA
制定的标准曲线如图1所示，阳性标准品的实时扩增曲线如图2所示，溶解曲线如图3所示。标准曲线方程为：Y＝-3.226X+37.104R2＝0.994
步骤三灵敏性验证
材料：先让TCK3菌种萌发，然后和泡种阶段的小麦种子接触进行接菌，播种后于不同生长期(发芽期、一叶期、一叶一心期、三叶期、返青期、分蘖期、拔节期、成熟期)采集叶片，提取DNA作为模板，同时做健康小麦基因组DNA和纯水作对照进行检测。
扩增结果显示除分蘖期外的小麦均带有TCK，如图4，根据标准曲线方程计算出的结果(100fg-0.1fg)可以看出TCK含量的极少，该检测体系对重组质粒的检测灵敏度可达0.1fg，比常规PCR的灵敏度高出2～3个数量级。重组质粒稀释浓度为0.01ng-0.1fg,对应拷贝数为CN＝2.65×10⁹-2.65×10⁴。
附录序列表
Seq ID No.1TCK特异性片段

Seq ID No.2上游引物
ACGACCGACTTTCCGAGAGC
Seq ID No.3上游引物
GTGTGGGACGAAGGCATCAA。