一种定量测定重组人PDCD5生物学活性的方法
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种测定具有促进细胞凋亡作用的重组人PDCD5(programmed cell death 5)生物学活性的方法。
背景技术
PDCD5是北京大学医学部在国际上首先发现的新的程序性细胞死亡相关基因，编码125个氨基酸的蛋白质。1999年在国际杂志发表论文时曾命名为TFAR19(TF-1cell apoptosis related gene 19)，2002年国际人类基因命名委员会将其统一命名为PDCD5。研究证明，PDCD5是一个新的抑癌基因，在多种肿瘤中表达下调，通过结合组蛋白乙酰转移酶Tip60发挥促进肿瘤细胞凋亡的作用。动物实验证明重组人PDCD5蛋白对肿瘤的的化疗具有明显的增敏效应，其本身未发现毒副作用。
PDCD5作为一种促凋亡蛋白，其本身没有诱导凋亡的能力，其活性是促进已发生的凋亡，因此需要凋亡诱导条件。
关于PDCD5活性的文献报道(中国免疫学杂志2000，16(1)，8-11)；中国专利公开号CN1218833A；中国专利公开号CN101214371A)多使用降低或去除培养液中血清浓度、去除细胞生长因子、加入化疗药物等因素诱导细胞发生凋亡，同时加入PDCD5与细胞孵育一定时间促进凋亡，采用流式细胞术检测细胞凋亡率。该检测方法计数细胞数量大，适于定性评价。但该方法操作环节多，过程长，重复性差，定量不准确，剂量-效应关系不明显，难以对重组人PDCD5的活性进行精确定量测定。因此需要建立一种简便、快速、准确定量测定重组人PDCD5活性的方法，用于重组人PDCD5生产的质量控制。
本发明主要体现在，用不完全培养液充分洗涤以去除细胞中的血清，完全撤除培养液中的血清作为细胞凋亡诱导因素，优化96孔板中的细胞数量与孵育时间，采用改进的MTT比色方法测定活存细胞数量，获得的数据经过4参数方程拟合，得到了明显的剂量-效应关系。该方法简便，快速，精密度高。
发明内容
本发明的目的是，提供一种简便、快速、准确定量测定重组人PDCD5活性的方法，用于重组人PDCD5产品的质量研究。
本发明的技术方案是：将传代培养对数生长期的肿瘤靶细胞株用基本上不含血清的不完全培养基洗涤，用上述培养基重悬细胞，调整细胞浓度，以每孔1-8万的细胞浓度铺于96孔板中，同时加入不同浓度的待测重组人PDCD5，置于37℃、5％二氧化碳培养箱孵育时间18-40h。每孔加入MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)或者WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐])，继续孵育一段时间，测定0D630光吸收值，采用Origin7.0软件中的4参数方程y＝(A-D)/(1+(x/C)B+D拟合，求得方程C值，即为PDCD5的ED50值。
测活用肿瘤靶细胞株为HL60、K562、Raji、NB4、Jurkat、HEL等白血病细胞株，优选HL60、K562细胞株，首选HL60细胞株。
在进一步的实施方案中，优选不完全培养基离心洗涤细胞的次数为1次以上，例如1、2或者3次，更优选2次。
在进一步的实施方案中，测定活性时的细胞培养基血清含量为0-2％(体积比，以下同)，优选0-0.1％，更优选0。
在进一步的实施方案中，优选96孔板中细胞数目为每孔1万，2万，4万和8万细胞数目，更优选细胞密度是40000个/孔。在进一步的实施方案中，优选PDCD5与细胞孵育时间为18h，24h和40h，最优选24h。
在进一步的实施方案中，使用MTT，利用比色法测定存活细胞数量。
对本方案中影响测定灵敏性的细胞洗涤次数、细胞培养基中的血清浓度、96孔板中细胞数目、细胞孵育时间等因素分别进行了优化，使PDCD5促进去血清诱导的细胞凋亡具有较明显剂量-效应关系的因素。
离心洗涤细胞次数的选择：
细胞收集后，用不完全培养基离心洗涤细胞的次数，对最终的ED50数值有较大的影响。细胞离心条件为1500rpm，离心时间为5分钟。固定其他条件如细胞数4万/孔，PDCD5与细胞孵育24h，孵育细胞的血清浓度为0。选择离心次数0次、1次、2次和3次，通过分析比较ED50和R2值，得到了最优化的细胞洗涤次数是1次以上，首选2次(表1，图1)。
表1.细胞洗涤次数对PDCD5ED50的影响
洗涤次数
0
1
2
3
ED50(ug/ml)
25.9597
12.3486
12.0632
8.7231
R2值
0.9469
0.9943
0.9927
0.9955
孵育细胞培养基中血清浓度的选择：
孵育细胞培养基中的血清浓度，影响PDCD5杀伤靶细胞的效果。孵育细胞培养基中的血清浓度高低与凋亡启动强度高度相关。血清浓度高，则杀伤的剂量-效应关系不明显，甚至看不到杀伤效果。固定其他条件如细胞数4万/孔，PDCD5与细胞孵育24h，细胞离心洗涤次数为2次，分别选择细胞培养基中的血清含量0％，0.1％，0.5％，2％，通过分析比较ED50和R2值(表2，图2)，得到了最优化的细胞培养基中的血清浓度为0％，即完全撤除血清。
表2.孵育培养基中的血清浓度对PDCD5ED50的影响
血清浓度
0％
0.1％
0.5％
2％
ED50(ug/ml)
10.5783
22.4977
32.7417
74.9473
R2值
0.9872
0.9845
0.9746
0.9602
96孔板中细胞数目的确定：
细胞数目的多少影响测定的灵敏度。固定其他条件如PDCD5与细胞孵育24h，细胞离心洗涤2次，细胞培养基中的血清含量0％。筛选了每孔1万，2万，4万和8万细胞数目，通过分析比较ED50和R2值(表3，图3)，并考虑0D630值，得到了最佳的细胞密度是40000个/孔。
表3.96孔板中细胞数目对PDCD5ED50的影响
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PDCD5与细胞孵育时间的确定：
蛋白与细胞孵育时间长，则低量的PDCD5的杀伤作用逐渐增强。但是时间越长，各浓度下的杀伤效果差别越不明显，因此固定其他条件如细胞数4万，细胞悬浮时血清浓度为0％，细胞洗涤次数2次。筛选了18h，24h和40h，通过分析比较ED50和R2值(表4，图4)，得到了最佳的孵育时间是24h.
表4.孵育时间对PDCD5ED50的影响
不同时间(h)
18
24
40
ED50(ug/ml)
13.3691
12.1557
12.6478
R2值
0.9940
0.9933
0.7364
比色法检测细胞存活和生长的原理是，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT或WST-8还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。显色染料可用MTT或WST-8，首选MTT。
附图说明
所有图表的横坐标均为PDCD5在96孔板中的浓度，单位是μg/ml。所有的纵坐标均为比色后各孔在630nm处的光吸收值。
图1：分别为每孔1万、2万、4万、8万细胞时的PDCD5剂量效应关系。
图2：分别为孵育细胞培养基血清浓度为0％、0.1％、0.5％、2％时的PDCD5剂量效应关系。
图3：分别为离心洗涤细胞次数为0次，1次，2次，3次时的PDCD5剂量效应关系。
图4：分别为细胞与PDCD5孵育18h，24h，40h时的PDCD5剂量效应关系。所有统计数据见列表。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。应该解释的是，本发明实施例的制备方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1：人白血病细胞株HL-60的培养
HL-60细胞用含有10％胎牛血清(Gibco公司，货号10099-133)的RPMI-1640(Sigma公司，货号为R4130)培养，在T25或T75方瓶中，水平静置于37℃、5％CO2的培养箱中。在48h后，细胞生长到100-150×104个/ml，进行传代。将细胞轻轻吹散悬浮，然后计数细胞密度，控制传代后细胞密度为8-10×104个/ml，仍然用含有10％胎牛血清的RPMI-1640在温箱中继续培养。
实施例2：细胞收集、洗涤及细胞与PDCD5蛋白的孵育
收集足够量的细胞，置于无菌离心管中，1500rpm离心5分钟，弃去上清。加入不含血清的RPMT-1640悬浮细胞，离心洗涤。重复操作，离心洗涤两次后，将细胞最终悬浮于不含血清的RPMI-1640中，进行准确计数。取一定量细胞，用无血清RPMI-1640稀释到40×104个/ml。
用排枪按每孔100μl的体积，往96孔板中加入细胞，这样每孔的细胞量为40000个，每个PDCD5浓度下，3复孔平行。另外，加入2个孔的不含细胞的无血清RPMI-1640，作为调零的空白对照。
在Ep管中，用RPMI-1640稀释PDCD5样品至下列浓度：9600μg/ml、4800μg/ml、1600μg/ml、800μg/ml、600μg/ml、400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、12.5μg/ml、3.125μg/ml、0.78μg/ml，共12个梯度。96孔板，每个样品浓度下，每孔加入10μl PDCD5样品。之后放到37℃培养箱中孵育培养。
实施例3：比色与数据的拟合
蛋白与细胞在培养箱中孵育24h后，每孔加入10μl MTT(上海生工，货号是TB0799)，用pH7.2的PBS配制成5mg/ml，除菌过滤，分装冷冻于-20℃)。在比色3-4h后，每孔加入100μl酸性SDS(SDS购自上海生工，用去离子水配制成10％浓度，加入终浓度为10mM的HCl，pH大约在2.5左右)，溶解细胞里MTT水解的沉淀产物---蓝紫色结晶甲瓒，在温箱中过夜。
次日，在振荡器上将96孔板震荡均匀，在BIO-TECK酶标仪上测定光吸收值0D630，对数据用机器自带软件进行4参数方程拟合，求得方程C值，即为PDCD5的ED50浓度。
实施例4：重组人PDCD5样品的测定
采用实施例1、2和3的方法，对3批重组人PDCD5中试样品分别进行3次不同时间的重复测定，其相对偏差均在15％以内(表5)，符合生物制品活性测定质量规范。
表5.三批样品重复3次测定结果
批号
第一次测定
第二次测定
第三次测定
平均值
标准差
090828
14.746
13.709
16.994
15.14967
1.67929
090905
15.11
14.186
12.693
13.99633
1.21961
090920
13.214
14.838
16.907
14.98667
1.92042
该发明为重组人PDCD5的活性测定提供了一种简便、快速、精密的测定方法。