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1、10申请公布号CN101948863A43申请公布日20110119CN101948863ACN101948863A21申请号201010289423122申请日20100924C12N15/66200601C12N15/867200601C12Q1/68200601G01N33/5320060171申请人重庆医科大学附属儿童医院地址400014重庆市渝中区中山二路136号72发明人陈洁张贇毕杨龚敏李廷玉魏小平孙五庆74专利代理机构重庆华科专利事务所50123代理人徐先禄54发明名称白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法57摘要本发明公开一种白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法，。
2、其步骤如下（1）白细胞介素6（IL6）基因片段的扩增；（2）重组PSEBRIL6逆转录病毒质粒的构建和鉴定；（3）重组PSEBRIL6逆转录病毒质粒在真核细胞中表达功能的测定。本发明所构建的逆转录病毒PSEBIL6质粒可作为真核表达载体，能够感染多种类型的细胞，既可以应用于体外培养的细胞，也可以用于整体实验动物，应用范围广，感染效率高；所采用的载体逆转录病毒是改造后的一种安全的病毒，该载体不仅带有组蛋白标签，实时检测表达水平；而且可以整合入宿主细胞中，随着细胞的不断分裂而持续表达；构建过程中所需设备要求不高，逆转录病毒载体的理化性质稳定，在制备、储存和应用过程中简单易行，适合推广应用。51IN。
3、TCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页序列表2页附图4页CN101948866A1/1页21白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法，其步骤如下（1）白细胞介素6（IL6）基因片段的扩增；通过逆转录聚合酶链反应（RTPCR）方法，以大鼠骨髓间充质干细胞CDNA为模板，分别在上游引物的5端和下游引物3端设计HIND和BAMH限制性内切酶酶切位点（斜体下划线为酶切位点），即上游引物5ATCAAGCTTACCACCATGGGCATGAAGTTTCTCTCCGC3上游引物5CGTGGATCCGGTTTGCCGAGTAGACCTCATAGTGAC3TOUCHD。
4、OWNPCR扩增获得IL6目的基因片段RIL6；（2）重组PSEBRIL6逆转录病毒质粒的构建和鉴定；采用PSEB逆转录病毒载体系统,该系统具有组蛋白标签、HEFH启动子及开放读码框（ORP）；HEFH启动子可有效启动插入ORP中靶基因的高效表达，同时3组6个连续组蛋白可以作为检测标签，反映ORP中插入靶基因的表达水平；将步骤（1）中所获得的基因片段RIL6的PCR产物及逆转录病毒载体PSEB3H分别经HIND和BAMH双酶切，连接转化进入DH2A感受态菌中，通过氨苄青霉素筛选单克隆，获得具有IL6重组的逆转录病毒质粒PSEBIL6，并进行PCR、双酶切及序列鉴定；（3）重组PSEBRIL6逆。
5、转录病毒质粒在真核细胞中表达功能的测定；针对步骤（2）所获得正确序列的逆转录病毒PSEBIL6质粒在真核细胞中的表达应用,利用脂质体转染系统，将步骤（2）中所获得的逆转录病毒PSEBIL6质粒分别转染到大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞和人胚肾细胞HEK293中，MRNA水平和蛋白水平测定IL6的表达水平。权利要求书CN101948863ACN101948866A1/4页3白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法技术领域0001本发明属于基因工程，具体涉及一种可在细胞内稳定且高效表达的白细胞介素6（INTERLEUKIN6,IL6）基因重组逆转录病毒载体的构建方法。背景技术0002白细胞介素是由多。
6、种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。由于最初是由白细胞产生又在白细胞间发挥作用，所以由此得名。白细胞介素INTERLEUKIN缩写为IL。白细胞介素6（以下缩写为IL6）可由多种细胞合成，包括活化的T淋巴细胞和B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、上皮细胞以及成纤维细胞等。人类IL6基因位于第7号染色体上；IL6分子量在2130KD之间，其差异是由于肽链的糖基化和磷酸程度不同所致。IL6是以单体形式存在，主要功能为刺激细胞成长、促进细胞分化，对维持机体生理平衡具有重要作用。0003IL6作用的靶细胞很多，包括巨噬细胞、肝细胞、静止的T淋巴细胞、活化的B淋巴细胞和浆细胞等；其生物效。
7、应是促进T淋巴细胞表面IL2R的表达，增强IL1（即白细胞介素1）和TNF（肿瘤坏死因子）对T辅助细胞的有丝分裂作用；作为肝细胞刺激因子，在感染或外伤引起的急性炎症反应中，诱导急性期反应蛋白的合成，其中以淀粉状蛋白A和C反应蛋白增加尤为明显；促进B淋巴细胞增殖、分化并产生抗体；多发性骨髓瘤的恶变B淋巴细胞既能产生IL6，又能对IL6发生应答，提示IL6可能作为这些细胞的自分泌性生长因子；IL6还能有效地促进TNF和IL1诱导的恶病质；促进糖皮质激素合成；刺激破骨细胞活性和角质细胞生长；还能促进骨髓造血的功能。0004IL6不能刺激相应细胞分泌其它细胞因子，在生理浓度下对免疫细胞的自分泌作用亦比。
8、较弱，其主要免疫学功能是加强其它细胞因子的效果。0005逆转录病毒是RNA病毒，它有三个结构蛋白基因GAG编码病毒衣壳、基质等结构蛋白的基因；POL编码逆转录酶P66/P51、蛋白水解酶和整合酶；ENV编码GPL20和GP41两种包膜糖蛋白。在逆转录酶的作用下可使RNA转录为CDNA，整合到宿主细胞基因组中，并随着宿主细胞中的DNA复制、转录和翻译等蛋白酶作用下扩增。近年来随着基因工程的不断发展，已设计构建成一些缺陷型病毒，使逆转录病毒成为有用的基因载体，特别是动物基因克隆载体。其最重要的一点是它可以有效的整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达所带的外源基因。病毒基因组以转座的方式整合，其基因组不。
9、会发生重排，因此所携带的外源基因也不会改变。此外，逆转录病毒载体的寄主范围相当广泛，可以感染各种细胞类型，如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等，其中有的还能够在人体细胞中生长；而且逆转录病毒载体的感染效率高，所感染的细胞不会产生病变导致寄主细胞的死亡。目前市场上销售的多为纯化的重组IL6细胞因子，价格非常昂贵，若用于动物体内，则以每公斤微克量来计算，一只成年大鼠体内注射IL6平均需要花上百元，因此，有必要构建重组质粒来满足科学研究的不说明书CN101948863ACN101948866A2/4页4断需求。发明内容0006本发明的目的是提供白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法，该方法对设备要求不。
10、高，逆转录病毒载体的理化性质稳定，在制备、储存和应用过程中简单易行，适合推广应用；得到的白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体能够感染多种类型的细胞，既可以应用于体外培养的细胞，也可以用于整体实验动物，应用范围广，感染效率高；而且价格较低。0007本发明所述的白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法，其步骤如下（1）白细胞介素6（IL6）基因片段的扩增；通过逆转录聚合酶链反应（RTPCR）方法，以大鼠骨髓间充质干细胞CDNA为模板，分别在上游引物的5端和下游引物3端设计HIND和BAMH限制性内切酶酶切位点（斜体下划线为酶切位点），即上游引物5ATCAAGCTTACCACCATGGGCATGA。
11、AGTTTCTCTCCGC3上游引物5CGTGGATCCGGTTTGCCGAGTAGACCTCATAGTGAC3TOUCHDOWNPCR扩增获得IL6目的基因片段RIL6，其序列为ATGAAGTTTCTCTCCGCAAGAGACTTCCAGCCAGTTGCCTTCTTGGGACTGATGTTGTTGACAGCCACTGCCTTCCCTACTTCACAAGTCCGGAGAGGAGACTTCACAGAGGATACCACCCACAACAGACCAGTATATACCACTTCACAAGTCGGAGGCTTAATTACATATGTTCTCAGGGAGATCTTGGAAATGAGAAAAGAGTTGTGC。
12、AATGGCAATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGCACTGTCAGAAAACAATCTGAAACTTCCAGAAATACAAAGAAATGATGGATGCTTCCAAACTGGATATAACCAGGAAATTTGCCTATTGAAAATCTGCTCTGGTCTTCTGGAGTTCCGTTTCTACCTGGAGTTTGTGAAGAACAACTTACAAGATAACAAGAAAGACAAAGCCAGAGTCATTCAGAGCAATACTGAAACCCTAGTTCATATCTTCAAACAAGAGATAAAAGACTCATATAAAATAGTCCTTCCTACCCCAACTTCC。
13、AATGCTCTCCTAATGGAGAAGTTAGAGTCACAGAAGGAGTGGCTAAGGACCAAGACCATCCAACTCATCTTGAAAGCACTTGAAGAATTTCTAAAGGTCACTATGAGGTCTACTCGGCAAACCTAG（2）重组PSEBRIL6逆转录病毒质粒的构建和鉴定；采用PSEB逆转录病毒载体系统,该系统具有组蛋白标签、HEFH启动子及开放读码框（ORP）；HEFH启动子可有效启动插入ORP中靶基因的高效表达，同时3组6个连续组蛋白可以作为检测标签，反映ORP中插入靶基因的表达水平；将步骤（1）中所获得的基因片段RIL6的PCR产物及逆转录病毒载体PSEB。
14、3H分别经HIND和BAMH双酶切，连接转化进入DH2A感受态菌中，通过氨苄青霉素筛选单克隆，获得具有IL6重组的逆转录病毒质粒PSEBIL6，并进行PCR、双酶切及序列鉴定；（3）重组PSEBRIL6逆转录病毒质粒在真核细胞中表达功能的测定；针对步骤（2）所获得正确序列的逆转录病毒PSEBIL6质粒在真核细胞中的表达应用。利用脂质体转染系统，将步骤（2）中所获得的逆转录病毒PSEBIL6质粒分别转染到大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞和人胚肾细胞HEK293中，MRNA水平和蛋白水平测定IL6的表达水平。0008本发明的有益效果是（1）本发明所构建的逆转录病毒PSEBIL6质粒可作为真核表达载体，能。
15、够感染多种类型的细胞，既可以应用于体外培养的细胞，也可以用于整体实验动物，应用范围广，感染效说明书CN101948863ACN101948866A3/4页5率高；（2）本发明所采用的载体逆转录病毒是一种改造后的安全病毒，该载体不仅带有组蛋白标签，实时检测表达水平；而且可以整合入宿主细胞中，随着细胞的不断分裂而持续表达；（3）可以本发明为工具，为研究IL6的免疫调节功能及其相关信号通路提供有用工具。0009（4）本发明的构建方法所需设备要求不高，逆转录病毒载体的理化性质稳定，在制备、储存和应用过程中简单易行，适合推广应用。附图说明0010图1是白细胞介素6PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。0011图2。
16、是PSEB3H逆转录病毒质粒HIND和BAMH双酶切琼脂糖凝胶电泳图。0012图3是PSEBIL6重组逆转录病毒质粒PCR鉴定图。0013图4是PSEBIL6重组逆转录病毒质粒HIND和BAMH双酶切鉴定图。0014图5是PSEBIL6重组逆转录病毒质粒在PC12细胞中IL6MRNA表达水平变化图。0015图6是PSEBIL6重组逆转录病毒质粒在HEK293细胞中IL6MRNA表达水平变化图。0016图7是ELISA检测PC12细胞中IL6分泌蛋白水平变化图。0017图8是ELISA检测HEK293细胞中IL6分泌蛋白水平变化图。具体实施方式0018下面通过具体实施例对本发明做进一步的描述。0。
17、019所述的白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法，步骤如下步骤（1）白细胞介素6（IL6）基因片段的获得。0020从原代培养的大鼠骨髓间充质干细胞中提取RNA，反转录成CDNA，以此为PCR扩增模板。PRIMER50设计软件设计扩增IL6基因全长的引物，并在上游5端添加HIND限制性内切酶位点，下游3端添加BAMH限制性内切酶位点；上游引物5ATCAAGCTTACCACCATGGGCATGAAGTTTCTCTCCGC3上游引物5CGTGGATCCGGTTTGCCGAGTAGACCTCATAGTGAC3利用PFU高保真DNA聚合酶，通过TOUCHDOWNPCR方式扩增（942MIN；93。
18、20S，665620S，721MIN，每一循环降低1,10CYCLES；9320S，5620S，721MIN，28CYCLES；722MIN延伸），获得目的基因片段，经15琼脂糖凝胶电泳在600BP附近有一条特异性电泳条带（参见图1）。0021步骤（2）重组逆转录病毒PSEBIL6质粒的构建及鉴定。0022将步骤（1）中获得IL6的PCR产物纯化，再经HIND和BAMHI（TAKARA公司）双酶切（50UL体系25LHIND，25ULBAMHI，5L10KBUFFER，1GDNA，37过夜），再次纯化后定向连接到同样经HIND和BAMHI酶切处理的逆转录病毒PSEB3H质粒（参见图2），20U。
19、L连接体系10LT4DNA连接酶（TAKARA公司），8LIL6基因PCR产物，2L双酶切PSEB3H质粒，16过夜；连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5中，在氨苄说明书CN101948863ACN101948866A4/4页6青霉素抗性平板上筛选，挑取最小阳性单克隆，含氨苄青霉素（终浓度100G/ML）的LB培养基中37200RPM过夜培养，质粒小抽试剂盒抽提质粒，经08琼脂糖凝胶电泳可见约70KB大小的电泳条带。以此重组质粒为模板PCR扩增（引物及条件同前）出600BP左右特异性片断（参见图3），同时该重组质粒经HIND和BAMHI双酶切可见两条带，一条约7000BP，另一条与上述PCR产物。
20、大小一致的条带（参见图4），表明重组逆转录病毒载体PSEBIL6质粒构建成功，进一步测序结果见SEQNO1，与GENEBANK中NM_012589的CDS序列完全相同。0023SEQNO1ATGAAGTTTCTCTCCGCAAGAGACTTCCAGCCAGTTGCCTTCTTGGGACTGATGTTGTTGACAGCCACTGCCTTCCCTACTTCACAAGTCCGGAGAGGAGACTTCACAGAGGATACCACCCACAACAGACCAGTATATACCACTTCACAAGTCGGAGGCTTAATTACATATGTTCTCAGGGAGATCTTGGAAATGAGAAAAGAGTT。
21、GTGCAATGGCAATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGCACTGTCAGAAAACAATCTGAAACTTCCAGAAATACAAAGAAATGATGGATGCTTCCAAACTGGATATAACCAGGAAATTTGCCTATTGAAAATCTGCTCTGGTCTTCTGGAGTTCCGTTTCTACCTGGAGTTTGTGAAGAACAACTTACAAGATAACAAGAAAGACAAAGCCAGAGTCATTCAGAGCAATACTGAAACCCTAGTTCATATCTTCAAACAAGAGATAAAAGACTCATATAAAATAGTCCTTCCTACCCCAAC。
22、TTCCAATGCTCTCCTAATGGAGAAGTTAGAGTCACAGAAGGAGTGGCTAAGGACCAAGACCATCCAACTCATCTTGAAAGCACTTGAAGAATTTCTAAAGGTCACTATGAGGTCTACTCGGCAAACC步骤（3）重组逆转录病毒PSEBIL6质粒在大鼠PC12细胞及人胚肾HEK293细胞中的表达。0024为了鉴定本发明的功能，我们将实施例二中获得的重组逆转录病毒PSEBIL6质粒分别转染到两种不同来源的真核细胞大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞和人胚肾细胞HEK293中，观察IL6的表达状态。在此过程中，为了排除逆转录病毒载体自身对IL6表达的影响，我。
23、们以转染不含有目的基因的空载体作为IL6过表达对照，并同时转染来自于两个不同克隆的重组逆转录病毒PSEBIL6质粒作为IL6过表达实验组。0025当PC12细胞或HEK293细胞达到60融合时，通过LIPOFECTAMINE2000试剂盒INVITROGEN公司将实施例二获得的序列完全正确的重组逆转录病毒载体PSEBIL6质粒4G或不含有目的基因片段的空载体分别转染细胞，转染48小时后，收集细胞培养上清和转染细胞。0026提取转染细胞的RNA，逆转录为CDNA，并用特异性扩增IL6片段158BP的引物（上游5ACAGCCACTGCCTTCCCTAC3，下游5TTGCCATTGCACAACTCT。
24、TTTC3）进行实时荧光定量PCR扩增，结果显示，重组逆转录病毒载体PSEBIL6质粒的转染显著提高PC12和HEK293细胞中IL6MRNA的表达水平（参见图5和图6），与对照组相比，IL6MRNA表达水平增高10004000多倍。0027将收集的转染细胞培养上清按照IL6ELISA试剂盒（RD公司）中的操作流程进行IL6分泌蛋白的检测，检测结果表明转染重组逆转录病毒载体PSEBIL6质粒的细胞中IL6的分泌显著高于对照组1020倍（参见图7和图8）。0028上述结果提示，本发明成功构建了重组逆转录病毒载体PSEBIL6质粒，并可在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞和人胚肾细胞HEK293等真核细胞。
25、中表达和分泌。说明书CN101948863ACN101948866A1/2页7重庆医科大学附属儿童医院白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法31636DNA大鼠（RATTUSNORVEGICUS）IL6CDS6570011ATGAAGTTTCTCTCCGCAAGAGACTTCCAGCCAGTTGCCTTCTTGGGACTGATGTTGTTG61ACAGCCACTGCCTTCCCTACTTCACAAGTCCGGAGAGGAGACTTCACAGAGGATACCACC121CACAACAGACCAGTATATACCACTTCACAAGTCGGAGGCTTAATTACATATGTTCTCAGG1。
26、81GAGATCTTGGAAATGAGAAAAGAGTTGTGCAATGGCAATTCTGATTGTATGAACAGCGAT241GATGCACTGTCAGAAAACAATCTGAAACTTCCAGAAATACAAAGAAATGATGGATGCTTC301CAAACTGGATATAACCAGGAAATTTGCCTATTGAAAATCTGCTCTGGTCTTCTGGAGTTC361CGTTTCTACCTGGAGTTTGTGAAGAACAACTTACAAGATAACAAGAAAGACAAAGCCAGA421GTCATTCAGAGCAATACTGAAACCCTAGTTCATATCTTCAAACAAG。
27、AGATAAAAGACTCA481TATAAAATAGTCCTTCCTACCCCAACTTCCAATGCTCTCCTAATGGAGAAGTTAGAGTCA541CAGAAGGAGTGGCTAAGGACCAAGACCATCCAACTCATCTTGAAAGCACTTGAAGAATTT601CTAAAGGTCACTATGAGGTCTACTCGGCAAACCTAG238DNA人工序列用于PCR反应的上游引物21ATCAAGCTTACCACCATGGGCATGAAGTTTCTCTCCGC38336DNA人工序列用于PCR反应的下游引物3序列表CN101948863ACN101948866A2/2页81CGTGGATCCGGTTTGCCGAGTAGACCTCATAGTGAC36序列表CN101948863ACN101948866A1/4页9图1说明书附图CN101948863ACN101948866A2/4页10图2图3说明书附图CN101948863ACN101948866A3/4页11图4图5图6说明书附图CN101948863ACN101948866A4/4页12图7图8说明书附图CN101948863A。