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CPG 寡核苷酸在治疗丙型肝炎病毒感染中的应用
    本申请是申请号为 200380105159.X 的中国专利申请的分案申请， 原申请是国际 申请 PCT/IB2003/005520 的中国国家阶段申请。
     发明领域 本发明提供了治疗丙型肝炎病毒慢性感染的受试体的方法和产品。
     发明背景
     丙型肝炎病毒 (HCV) 是黄病毒家族的正链 RNA 病毒， 能感染人和一些其它灵长动 物的肝细胞。首次发现是在 1989 年 (1)， HCV 具有 9.5kb 的基因组， 编码三个结构基因 ： 核 和两个包被蛋白 (E1 和 E2)， 以及几个涉及病毒复制和与宿主相互作用的非结构 (NS) 蛋白。
     HCV 严重关系到公共健康， 它引起＞ 90％的肠胃外非甲非乙型肝炎 (1)。 世界人口 有 0.4 到 1.5％被传染 (3， 4)， 包括大约 300,000 加拿大人 ( 加拿大卫生署 )。由于急性感 染中的绝大部分都是无临床症状的， 因此难于进行流行病学统计 ； 然而估计有 50-80％的 HCV 感染个体不能清除病毒， 其中大部分变成终生携带者。大约 50％的携带者发展成慢性 肝炎， 其中 20％发展成肝硬化， 其中一些继续发展成肝细胞性肝癌 (5-9)。在美国估计丙型 肝炎每年引起 8,000 到 10,000 人死亡。
     在美国和加拿大， 治疗丙型肝炎有两种不同的方法 ： 单独用 α 干扰素治疗以及用 α 干扰素和病毒唑组合治疗。组合治疗虽然较昂贵并且具有更多的副作用， 但是通常比单 独治疗产生持续反应的几率较高。
     干扰素具有几种形式 (α-2a， α-2b， 以及复合干扰素 (Alfacon))， 这些干扰素一 般是每周皮下给药三次。聚乙二醇化干扰素， 即加上聚乙二醇进行修饰以增加其在循环系 统中的保持时间的 α 干扰素， 是另一种干扰素， 每周只给药一次。相反， 病毒唑是一种口服 抗病毒制剂， 以 200mg 的胶囊每天给药两次。
     干扰素的副作用包括 ： 疲劳， 肌肉疼痛， 头疼， 恶心和呕吐， 注射部位有皮肤刺激， 低烧， 体重降低， 烦躁， 沮丧， 自杀， 轻微骨髓抑制和脱发 ( 可恢复的 )。 对于病毒唑副作用包 括： 贫血性疲劳和烦躁， 搔痒， 皮疹， 鼻子不通气， 窦炎和咳嗽。
     单独用干扰素治疗或者干扰素和病毒唑组合治疗会使 50-75％的受试体血清 ALT 水平快速升高， 会使 30-50％的受试体血清中可检测到的 HCV RNA 消失。 只有当 HCV RNA 在 治疗中消失并且在治疗结束后至少 6 个月都检测不到才可认为肝病有了长期好转。组合治 疗会使得 HCV RNA 在治疗中更快地消失， 在治疗结束后复发的几率更低。但是， 治疗结果也 强烈依赖于病毒的基因型， 基因型 2 和 3 得到的结果较好 ( 用聚乙二醇化干扰素 -α 和病 毒唑治疗 1 年后为 90％ )， 而基因型 1HCV 的结果较差 ( 大约 40％保持反应 )。目前在北美 大部分 HCV 慢性携带者都是基因型 1。
     治疗的最佳持续时间随使用的是干扰素单独治疗还是组合治疗， 以及 HCV 基因型 的不同而不同， 典型地， 持续时间是 6 到 12 个月。
     目前还没有 HCV 的疫苗， 对于慢性感染也没有显著有效的治疗方法。因此迫切需 要能用于治疗慢性携带者的有效治疗方法。
     发明简述
     本发明部分基于几个令人惊讶的发现， 包括 CpG 免疫刺激核酸可用于治疗乙型肝 炎病毒 (HCV) 慢性感染的并且对于以前的非 CpG 疗法没有反应的受试体。本发明进一步部 分基于发现了在组合使用了 CpG 免疫刺激核酸和抗病毒试剂例如 IFN-α 的受试体中发现 有协同反应。
     在一方面， 本发明提供了一种治疗具有 HCV 感染并且用以前的非 CpG 疗法不能成 功治疗的受试体的方法， 包括给需要治疗的受试体施用有效量的能治疗所述感染的 CpG 免 疫刺激核酸。
     在一个实施方案中， 所述非 CpG 疗法包括干扰素 -α。在一个相关的实施方案中， 所述干扰素 -α 是干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干扰素 -α。 在另一个实施方案中， 所述非 -CpG 疗法包括干扰素 -α 和病毒唑， 或干扰素 -α 和病毒唑和 emantidine。在一些 重要的实施方案中， 所述非 CpG 疗法包括聚乙二醇化的干扰素 -α 和抗病毒剂例如病毒唑。
     在一个实施方案中， CpG 免疫刺激核酸是 A 类 CpG 免疫刺激核酸。在另一个实施 方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是 B 类 CpG 免疫刺激核酸。
     在另一个实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是 C 类 CpG 免疫刺激核酸。 所述方法任选地包括将抗病毒剂例如干扰素 -α 与所述 CpG 免疫刺激核酸一起给 药。所述干扰素 -α 可以是干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干扰素 -α， 但不限于此。 在一个实施方案中， 所述抗病毒剂基本上与所述 CpG 免疫刺激核酸同时给药。
     在一个实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸包括骨架修饰。在一个相关的实施方 案中， 所述骨架修饰是硫代磷酸酯骨架修饰。在一些重要的实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激 核酸包括半柔性骨架。在其它重要的实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是具有半柔性骨 架的 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     因此， 在另一个方面， 提供了一种治疗具有 HCV 感染并且用以前的非 CpG 疗法不能 成功治疗的受试体的方法， 包括给需要治疗的受试体施用有效量的能治疗所述感染的具有 半柔性骨架的 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     在另一个方面， 提供了一种治疗具有 HCV 感染并且用以前的非 -CpG 疗法不能成功 治疗的受试体的方法， 包括使需要治疗的受试体的外周血单核细胞与有效量的能刺激免疫 反应的 CpG 免疫刺激核酸接触， 并将这些细胞重新输入到受试体体内。
     在一个实施方案中， 外周血单核细胞包括树突状细胞。 在另一个实施方案中， 树突 状细胞包括类浆细胞的树突状细胞。 在一个实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是 C 类 CpG 免疫刺激核酸。在一个相关的实施方案中， 所述 C 类 CpG 免疫刺激核酸具有半柔性骨架。
     在另一方面， 本发明提供了一种治疗具有 HCV 感染并且可能对非 CpG 疗法没有反 应的受试体的方法， 包括给需要治疗的受试体施用有效量的能治疗所述感染的 CpG 免疫刺 激核酸。
     在一个实施方案中， 所述方法进一步包括鉴别可能对非 CpG 疗法没有反应的受试 体。在一个实施方案中， 所述受试体是通过检测每个树突状细胞产生的干扰素 -α 鉴别为 可能没有反应。在另一个实施方案中， 所述受试体是根据 HCV 基因型鉴别为可能没有反应。
     在一个实施方案中， 所述非 CpG 疗法包括 IFN-α。 在一个相关的实施方案中， 所述 非 CpG 疗法包括干扰素 -α 和病毒唑。
     在一个实施方案中， 所述方法进一步包括给受试体施用抗病毒试剂。在重要的 实施方案中， 所述抗病毒试剂是干扰素 -α。所述干扰素 -α 可以是干扰素 -α-2b， 干扰 素 -α-2a 或复合干扰素 -α， 但不限于此。 在一个实施方案中， 所述干扰素 -α 以低剂量施 用， 任选地组合使用 CpG 免疫刺激核酸和干扰素 -α 可产生协同作用。
     在一个实施方案中， 用于治疗受试体的 CpG 免疫刺激核酸是 A 类 CpG 免疫刺激核 酸或 B 类 CpG 免疫刺激核酸， 或 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     在一个实施方案中， 用于鉴别受试体是否是可能对非 CpG 疗法没有反应的 CpG 免 疫刺激核酸是 A 类 CpG 免疫刺激核酸或 B 类 CpG 免疫刺激核酸， 或 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     在一个实施方案中， 所述抗病毒剂基本上与所述 CpG 免疫刺激核酸同时给药。在 其它实施方案中， 干扰素 -α 在用所述 CpG 免疫刺激核酸治疗之前一段时间施用。
     在特定的实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸包括骨架修饰。在相关的实施方案 中， 所述骨架修饰是硫代磷酸酯骨架修饰。在一些优选的实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核 酸包括半柔性骨架。在其它更优选的实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是具有半柔性骨 架的 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     在另一个方面， 提供了一种治疗具有 HCV 感染并且可能对非 CpG 疗法没有反应的 受试体的方法， 包括给需要治疗的受试体施用有效量的能治疗所述感染的具有半柔性骨架 的 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     在另一个方面， 本发明提供了一种筛选可用于治疗慢性丙型肝炎病毒感染的 CpG 免疫刺激核酸的方法。 所述方法包括使具有慢性丙型肝炎病毒感染的受试体的外周血单核 细胞与一种 CpG 免疫刺激核酸接触， 在接触以后测量血单核细胞的检测反应。用于获取外 周血单核细胞的受试体用以前的治疗方法不能成功治疗。
     在一个实施方案中， 所述检测反应选自 B 细胞刺激， IL-6 的分泌， IL-10 的分泌， IL-12 的分泌， 干扰素 -γ 的分泌， 1 型干扰素 (α+β) 的分泌， IP-10 的分泌， NK 活性， CD80 的表达， CD86 的表达， CD83 的表达， II 类 MHC 表达的正调控。
     在另一个实施方案中， 所述外周血单核细胞包括树突状细胞。在相关的实施方案 中， 所述树突状细胞包括类浆细胞的树突状细胞。 在另一个实施方案中， 所述细胞是树突状 细胞， 所述检测反应选自 IL-12 的分泌， 1 型干扰素的分泌， CD80 的表达， CD86 的表达， CD83 的表达， 和 II 类 MHC 表达的正调控。
     在一个实施方案中， 所述接触是在体外。 在另一个实施方案中， 所述外周血单核细 胞是培养的。在另一个实施方案中， 将所述 CpG 免疫刺激核酸加入到培养的外周血单核细 胞中。
     在一个实施方案中， 以前的治疗是一种非 CpG 疗法。在另一个实施方案中， 所述非 CpG 疗法包括干扰素 -α。在另一个实施方案中， 所述非 CpG 疗法进一步包括病毒唑。在其 它的实施方案中， 所述干扰素 -α 是聚乙二醇化的 IFN-α。 在一个实施方案中， 以前的治疗 是用具有不同序列或不同类的 CpG 核酸进行的治疗。
     在其它实施方案中， 所述方法进一步包括检测所述 CpG 免疫刺激核酸刺激来自正 常受试体的外周血单核细胞的对照反应的能力。
     所述方法进一步包括使外周血单核细胞与干扰素 -α 和所述 CpG 免疫刺激核酸基 本上同时接触。在一个实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸包括骨架修饰。在一个相关的实施方 案中， 所述骨架修饰是硫代磷酸酯骨架修饰。在重要的实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸 包括半柔性骨架。所述 CpG 免疫刺激核酸可以是 A 类 CpG 免疫刺激核酸， B 类 CpG 免疫刺 激核酸， 或 C 类 CpG 免疫刺激核酸。在一些实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是 C 类 CpG 免疫刺激核酸， 在其它实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是具有半柔性骨架的 C 类 CpG 免 疫刺激核酸。
     在另一个方面， 本发明提供了一种鉴别具有 HCV 感染并且可能对非 CpG 疗法没有 反应的受试体的方法。 所述方法包括使从具有丙型肝炎病毒感染的受试体收集到的外周血 单核细胞暴露于 CpG 免疫刺激核酸中， 检测这些细胞产生的干扰素 -α， 并测定每个树突状 细胞产生的干扰素 -α 的量， 其中该量小于 1.0pg/ml 则表示受试体可能对非 CpG 疗法没有 反应。在一个实施方案中， 该量小于 0.5pg/ml 表示受试体可能对非 CpG 疗法没有反应。
     在一个实施方案中， 所述非 CpG 疗法包括干扰素 -α。在另一个实施方案中， 所述 非 CpG 疗法包括病毒唑。在其它的实施方案中， 所述干扰素 -α 是聚乙二醇化的 IFN-α。
     在一些重要的实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是 A 类或 C 类 CpG 免疫刺激核 酸。 在其它实施方案中， 将所述外周血单核细胞进一步暴露于抗病毒试剂和 CpG 免疫 刺激核酸中。所述抗病毒试剂可以是干扰素 -α， 但不限于此。在一个实施方案中， 所述干 扰素 -α 是干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干扰素 -α。
     在一个实施方案中， 所述外周血单核细胞包括树突状细胞。 在另一个实施方案， 所 述树突状细胞是类浆细胞的树突状细胞。
     在另一个实施方案中， 所述丙型肝炎病毒感染是急性丙型肝炎病毒感染。
     在另一个实施方案中， 所述方法进一步包括确定 HCV 的基因型。
     在另一个方面， 提供了一种鉴别具有 HCV 感染并且可能对非 CpG 疗法没有反应的 受试体的方法， 包括使从具有丙型肝炎病毒感染的受试体收集到的外周血单核细胞暴露于 A 类或 C 类 CpG 免疫刺激核酸中， 测定这些细胞产生的干扰素 -α， 并测定每个树突状细胞 产生的干扰素 -α 的量， 其中该量小于 1.0pg/ml 则表示受试体可能对非 CpG 疗法没有反 应。
     在另一个方面， 本发明提供了一种治疗具有丙型肝炎病毒感染的受试体的方法， 包括给根据上述方法鉴别的受试体施用有效量的能治疗所述感染的 CpG 免疫刺激核酸。
     在一个实施方案中， 所述方法进一步包括给所述受试体施用干扰素 -α。 在一个实 施方案中， 所述干扰素 -α 是干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干扰素 -α。
     在一个实施方案中， 用于治疗所述受试体的 CpG 免疫刺激核酸是 A 类 CpG 免疫刺 激核酸， B 类 CpG 免疫刺激核酸， 或 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     在另一个实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸包括骨架修饰。在一个相关的实施 方案中， 所述骨架修饰是硫代磷酸酯骨架修饰。在另一个实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核 酸包括半柔性骨架。
     在一个实施方案中， 所述丙型肝炎病毒感染是慢性丙型肝炎病毒感染。在另一个 实施方案中， 所述丙型肝炎病毒感染是急性丙型肝炎病毒感染。
     本发明的每一个限定都包括本发明的不同的实施方案。 因此本发明的涉及任何一
     个要素或要素组合的每一个限定都包括在本发明的每一个方面中。
     本发明的这些方面和其它方面将在下面更详细描述。
     附图简述
     图 1 显示了 HCV 感染和正常的 PBMC 在受到 3 类 CpG 刺激以后对 IFN-α 的诱导。 将正常的或 HCV 感染的受试体的 PBMC 与不同类的 CpG 一起培育 48 小时。收集细胞上清， 用商业 ELISA 试剂盒检测 IFN-α 分泌。黑色条显示出了 10 个正常受试体和 10 个 HCV 感 染的受试体的平均 IFN-α 分泌。
     图 2 显示了从慢性 HCV 携带者和正常受试体新鲜分离的 PBMC 的流式细胞分析。 从 HCV 感染受试体和正常健康供体的血液中分离 PBMC 并用荧光标记的抗类浆细胞的树突 细胞 (pDC) 抗体进行免疫染色。用流式细胞仪对细胞进行分析， 将结果与相同受试体受到 CpG 刺激的 IFN-α 分泌进行比较。
     图 3 显示了用 C 类和柔性 C 类寡核苷酸刺激 PBMC 对 IFN-α 的诱导。将来自正 常的或 HCV 感染受试体的 PBMC 与不同类的 CpG 一起培育 48 小时。收集细胞上清， 用商业 ELISA 试剂盒检测 IFN-α 分泌。黑色条显示出了 10 个正常受试体和 10 个 HCV 感染的受试 体的平均 IFN-α 分泌。 图 4 显示了用一组半柔性 C 类 CpG 刺激以后对 IFN-α 的诱导。将分离自 5 个 HCV 感染受试体的 PBMC 与一组半柔性 C 类 CpG 一起培育 48 小时。收集细胞上清， 用商业 ELISA 试剂盒检测 IFN-α 分泌。黑色条显示出了 5 个 HCV 感染受试体的平均 IFN-α 分泌。
     图 5 显示了用三类 CpG 刺激以后的 IFN-γ 分泌。 将来自正常或 HCV 感染受试体的 PBMC 与不同类的 CpG 一起培育 48 小时。收集细胞上清， 用商业 ELISA 试剂盒检测 IFN-γ 分泌。黑色条显示出了 10 个正常受试体和 10 个 HCV 感染的受试体的平均 IFN-γ 分泌。
     图 6 显示了用一组半柔性 C 类 CpG 刺激以后对 IFN-γ 的诱导。将分离自 5 个 HCV 感染受试体的 PBMC 与一组半柔性 C 类 CpG 一起培育 48 小时。收集细胞上清， 用商业 ELISA 试剂盒检测 IFN-γ 分泌。黑色条显示出了 5 个 HCV 感染受试体的平均 IFN-γ 分泌。
     图 7 显示了用三类 CpG 刺激以后的 IP-10 分泌。将来自正常或 HCV 感染受试体的 PBMC 与不同类的 CpG 一起培育 48 小时。收集细胞上清， 用商业 ELISA 试剂盒检测 IP-10 分 泌。黑色条显示出了 10 个正常受试体和 10 个 HCV 感染的受试体的平均 IP-10 分泌。
     图 8 显示了 CpG 对于 B 细胞增殖的作用， 将来自 HCV 感染的或正常的供体的 PBMC 3 与 A 类、 B 类或 C 类 CpG 一起培育 5 天。然后用 H- 胸苷脉冲标记 16 到 18 小时， 然后测定 放射活性。将其值表示成与培养基对照相比的刺激指数 (SI ＝与 CpG 一起培育的 cpm/ 与 培养基单独培育的细胞的 cpm)。
     图 9 显示了半柔性 C 类 CpG 对于 B 细胞增殖的作用。将来自 5 个 HCV 感染受试体 的 PBMC 与 A、 B、 C 和半柔性 C 类 CpG 一起培育 5 天。然后用 3H- 胸苷脉冲标记 16 到 18 小 时， 然后测定放射活性。将其值表示成与培养基对照相比的刺激指数 (SI ＝与 CpG 一起培 育的 cpm/ 与培养基单独培育的细胞的 cpm)。
     图 10 显示了用三类 CpG 刺激以后的 IL-10 分泌。将来自正常或 HCV 感染受试体 的 PBMC 与不同类的 CpG 一起培育 48 小时。收集细胞上清， 用商业 ELISA 试剂盒检测 IL-10 分泌。黑色条显示出了 10 个正常受试体和 10 个 HCV 感染的受试体的平均 IL-10 分泌。
     图 11 显示了病毒唑和 CpG 单独使用或与内含子 A(IntronA) 组合使用刺激 HCV 感
     染细胞以后的 IFN-α 分泌。 将来自 10 个 HCV 感染受试体和 10 个正常健康供体的 PBMC 与内 含子 A(Intron A)， 单独的以及加入或不加内含子 A(Intron A)( 一种纯化的外源 IFN-α) 的病毒唑或 C 类 CpG 一起培育 48 小时。收集细胞上清， 用商业 ELISA 试剂盒检测 IFN-α 分泌。将每个受试体单独使用内含子 A(Intron A) 时检测到的 IFN-α 量设置为背景， 从相 同受试体的内含子 A(Intron A)， 病毒唑 + 内含子 A(Intron A) 和 C 类 + 内含子 A(Intron A) 的数据中减去该背景然后绘图。 正常受试体和 HCV 受试体的平均值分别用黑色和白色条 框表示。
     图 12 显示了 CpG 和内含子 A(Intron A) 一起对 HCV 感染细胞的 IFN-α 分泌的协 同作用。将来自 15 个 HCV 感染受试体的 PBMC 与单独使用的或与内含子 A(Intron A)( 一 种纯化的外源 IFN-α) 一起使用的 C 类 CpG 培育 48 小时。收集细胞上清， 用商业 ELISA 试 剂盒检测 IFN-α 分泌。检测每个受试体单独使用内含子 A(Intron A) 时的 IFN-α 量， 从 相同受试体的 CpG+ 内含子 A(Intron A) 数据中减去该值， 然后绘图。
     应当了解这些附图并不是实施所要求保护的发明所必需的。
     发明详述
     根据本发明， 发现 CpG 寡核苷酸可以以激活健康受试体 PBMC 的类似的方式激活 来自 HCV 慢性感染的受试体， 包括那些用以前的干扰素 -α(IFN-α) 治疗失败的受试体的 PBMC。 发现内源 IFN-α 分泌受到类浆细胞的树突细胞 (PDC) 的强烈诱导， 认为这是由于 HCV 感染导致其丧失功能以及对其它刺激反应的能力降低。 在一些实例中， 发现能在健康志 愿者的 PBMC 中诱导高水平 IFN-α 的 A 和 C 类 CpG 能够在 pDC 中诱导最高水平的 IFN-α。 进一步发现半柔性 C 类 CpG ODN 在这种作用中特别有效。在一些实施方案中这些 ODN 是优 选的， 这是因为它们不会在肾脏中积累， 可以重复给药。
     根据本发明进一步发现外源 IFN-α( 内含子 A(Intron A)) 和病毒唑单独使用或 组合使用时， 对正常受试体或 HCV 慢性携带者都没有可检测到的直接免疫刺激效果。但是， 当内含子 A(Intron A) 和 CpG ODN( 例如 B 类或 C 类 ) 一起使用的时候， 在 IFN-α 的产生 上观察到强烈的协同作用。
     这些结果表明 CpG ODN 单独使用或者和 IFN-α 一起使用都可有效治疗慢性 HCV 感染。基于这些发现， 本发明提供了用于预防和治疗 HCV 感染的方法和产品。
     慢性感染至少部分是由于 HCV 的快速突变， 这导致产生了类物种， 避开了免疫监 测 (10， 11)。在慢性感染的个体中可以同时检测到体液和细胞介导的免疫 (CMI) 反应。虽 然中和抗体对于保护防止感染是非常重要的， 但是当感染发生以后， 细胞介导的免疫 (CMI) 在病毒清除中具有主要作用。
     在一个方面， 本发明提供了一种治疗受到丙型肝炎病毒 (HCV) 感染的并且用以前 的非 CpG 疗法不能成功治疗的受试体的方法。所述方法包括给需要这种治疗的没有反应的 受试体施用有效量的能抑制所述感染的 CpG 免疫刺激核酸。
     这里所说的非 CpG 疗法是一种用非 CpG 免疫刺激核酸的活性或者非活性的化合物 进行的治疗。在不同的实施方案中， 所述非 CpG 疗法包括干扰素 -α。通常是将聚乙二醇化 的 IFN-α 给 HCV 受试体 ( 例如人 HCV 受试体 ) 施用， 优选与病毒唑和任选的金刚胺组合使 用。所述干扰素 -α 可以是干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干扰素 -α。所有上述干
     扰素 -α 治疗都包括在非 CpG 疗法的定义中。
     用以前的非 CpG 疗法不能成功治疗的受试体是指虽然事先进行了治疗但是在治 疗停止后 6 个月在他们的血管中还具有可检测到的病毒的受试体。这些受试体包括那么对 事先的非 CpG 疗法有反应， 但是不能控制感染和后来的复发， 还可以检测到病毒的受试体。 为了简便起见， 这里所说的这些受试体称为 “无反应者” ， 但是应当理解此术语是在本文中 定义的， 并不是临床术语。换句话说， 虽然在临床术语中 “无反应者” 仅仅是指狭义的对治 疗没有任何反应的受试体， 但在本发明中是广义的， 指虽然对或许事先的治疗具有一定水 平的反应， 但是不能成功治疗的受试体。成功治疗的受试体是指在治疗停止后 6 个月在其 血管中没有可检测到的病毒的受试体。成功治疗是指该治疗能够使得在治疗停止后至少 6 个月在血管中都不能检测到病毒。应当理解这里所述的无反应者隐含的也指受到 HCV 的慢 性感染。
     当用 CpG 核酸进行治疗的时候， 所述方法可成功治疗受试体。用 CpG 成功治疗受 试体定义为在停止治疗后 6 个月将血管中的病毒减少到检测不到的水平。 有趣的是， 在 CpG 治疗期间或刚结束时都观察不到病毒的减少， 只是在治疗以后随着时间的推移才减少， 最 终的结果是在治疗停止后 6 个月这些受试体的血管中没有可检测到的病毒。因此治疗感 染是指将受试体血管中的病毒减少到检测不到的水平， 并使此水平在治疗停止后维持 6 个 月。因此施用有效量的试剂以达到此最终效果。
     在一些实施方案中， 可以按预期的鉴别可能的无反应者 ( 即在用非 CpG 疗法进行 体内治疗之前 )， 并且本发明提供了不仅用于鉴别这些受试体而且用于治疗他们的方法。 可 以通过评估他们对 CpG 免疫刺激核酸， 特别是 A 类和 C 类发生反应的能力来鉴别可能的无 反应者。对 CpG 免疫刺激核酸反应的能力可以通过在 HCV 感染受试体中每个 pDC 产生的 干扰素 -α 的量来评估。根据本发明， 发现可以在接受治疗之前鉴别可能对非 CpG 疗法例 如 IFN-α 治疗没有反应的 HCV 感染受试体。在体内治疗之前鉴别这种受试体的可能性避 免了非必需的治疗， 使受试体处于治疗上有利的境况， 用单独使用的或与其它包括但不限 于 IFN-α 的抗 HCV 治疗一起使用的本发明的 CpG 免疫刺激核酸治疗。由于不用经受不成 功的治疗， 这些受试体受到的细胞毒性效果较少， 病毒生长的时间也减少。每个 pDC 诱导的 IFN-α 在合理水平以下的受试体可能无法用 IFN-α 成功治疗， 因此可用本文提供的方法 治疗。对 IFN-α 的诱导和 pDC 数目的测定在实施例中将更详细描述。
     应当理解可成功用本文所述的任何治疗试剂和方法进行治疗的 HCV 感染受试体 可能在其体内还有病毒。但是即使受试体不能完全消除病毒， 也能够控制病毒 ( 至检测不 到的水平 )。 虽然不希望受到任何特定理论的限制， 在受试体中维持检测不到的病毒水平涉 及到能控制病毒复制和传播的免疫系统。
     根据本文的教导本领域普通技术人员能够确定受试体对于 IFN-α 治疗是否是 “无反应者” 。 在一个实施例中， 如果在实施例所述的培养条件下用 A 类核酸例如 SEQ ID NO ： 1 的核酸诱导 IFN-α， 那么具有正常反应表示对 IFN-α 治疗的反应能力至少是 1pg/ml 每 pDC。少于此量则表示一些 pDC 丧失功能。少于 0.5pg/ml 每 pDC 的量表示对 IFN-α 治疗 没有反应的可能性较高。 本领域普通技术人员能够确定检测中使用的特定类型核酸的分界 值， 因而能够 ( 至少 ) 在实际治疗受试体之前鉴别用 IFN-α 治疗不能成功治疗的受试体。
     在其它的实施方案中， 鉴别可能对于非 CpG 疗法 ( 例如 IFN-α 治疗 ) 没有反应的受试体的方法进一步包括鉴别他 / 她所感染的 HCV 的基因型。例如， 很可能感染基因型 1 的 HCV 的受试体用 IFN-α 治疗不能成功治疗。因此， 除了评价受试体中每个 DC 产生的 IFN-α， 还可以确定他们的 HCV 基因型 ( 用本领域已知的方法 )， 这些信息组合起来可用于 鉴别可能对于 IFN-α 治疗没有反应的受试体。
     进一步应当了解在一些方面， 本发明提供了一种鉴别可能用非 CpG 疗法不能成功 治疗 ( 实际上并没有用非 CpG 疗法来治疗受试体 ) 的受试体， 然后用单独使用的或者与抗 病毒试剂例如但不限于 IFN-α 组合使用的 CpG 免疫刺激核酸治疗所述受试体。
     上述方法还可以用于检测受试体对于特定 CpG 免疫刺激核酸的反应性。
     在其它实施方案中， 所述方法进一步可以包括鉴别曾经接受过非 CpG 疗法但没有 成功的受试体的步骤。 根据本文给出的教导， 本领域普通技术人员能够鉴别这些受试体。 在 一个实施例中， 这种受试体在治疗停止之后 6 个月血管中还具有可检测到的病毒。在一些 实施方案中， 还可以证明这些受试体在治疗刚刚结束的时候病毒减少， 但是不能维持这种 减少。
     本发明涉及用单独使用的或者与其它活性试剂例如曾经描述过的用于 HCV 感染 的试剂组合使用的 CpG 免疫刺激核酸治疗那些用以前的非 CpG 疗法不能成功治疗的受试 体。从广义上来讲， CpG 免疫刺激核酸是指具有至少一个 CpG 二核苷酸基序的核酸， 其中 至少所述二核苷酸的 C 是未甲基化的。CpG 免疫刺激核酸包括但不限于 A 类， B 类和 C 类 CpG 免疫刺激核酸， 如本文中以及在本文所引用的并引入作为参考的专利和专利申请中所 述的。这些类的 CpG 免疫刺激核酸具有不同的性质和活化模式。 在重要的实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是 C 类免疫刺激核酸。根据本发明， 令人惊讶地发现， 虽然这类核酸的性质在 A 类和 B 类之间， 但 C 类免疫刺激核酸在一些实施 方案中是优选的。本文提供的实施例证明了虽然用以前非 CpG 疗法不能成功治疗的慢性感 染受试体的 pDC 本身感染了 HCV 因而在某些方面丧失了功能， 但是将这些细胞暴露于 CpG 免疫刺激核酸， 特别是 C 类免疫刺激核酸中， 能保留其功能。在一些实施方案中， 优选所述 C 类免疫刺激核酸是 “柔性” 或 “半柔性” 变体， 本文中将会有详细描述。在一些优选的实施 方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是半柔性 C 类免疫刺激核酸。
     在其它方面， 所述 CpG 免疫刺激核酸可与活性试剂组合使用， 所述活性试剂优选 包括那些曾经描述过的用于 HCV 治疗的。CpG 免疫刺激核酸与干扰素 -α( 例如内含子 A(Intron A)) 的一起使用具有特别重要的意义。 可以与本发明的 CpG 免疫刺激核酸组合使 用的干扰素包括但不限于干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干扰素 -α。其它抗病毒剂 如本文所述。这些组合中可以使用任何类型的 CpG。在一个实施例中， 根据本发明， 出人意 料地发现虽然外源给予干扰素 -α 不能成功治疗这些受试体， 但是当其与 CpG 免疫刺激核 酸一起使用的时候， 却能有效治疗。在一些实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是 C 类免疫 刺激核酸。在一些优选的实施方案中， 其是半柔性 C 类核酸。
     所述 CpG 核酸和抗病毒试剂 ( 例如干扰素 -α) 的给药时间随受试体和感染的严 重性而不同。所述 CpG 核酸可以与所述 CpG 免疫刺激核酸基本上同时给药。这意味着这两 种制剂可以在给药前混和， 或者可以在给药过程中混和 ( 例如都递送到受试体的静脉中 )， 或者它们可以分别给药但是在可以进行两次给药的时间内操作 ( 例如给受试体注射两次 的时间 )。不管所述制剂是基本上同时给药还是以间隔方式给药， 顺序都可以变化。相应
     地， 在一些实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸可以在抗病毒试剂例如 IFN-α 之前给药， 而 在另一些实施方案中可以在抗病毒试剂之后给药。
     当 CpG 核酸和其它抗病毒剂 ( 例如 IFN-α) 一起使用的时候， 这些化合物可以以 治疗有效的组合量给药。因此每种化合物的量都可以是低剂量的或超剂量的 ( 即在单独给 药的治疗有效量之下或之上 )。另外， 所述化合物每种都可以以治疗有效量给药， 而这些制 剂的组合会产生治疗上的好处， 例如减少副作用。在优选的实施方案中， 如果抗病毒剂是 IFN-α， 其以治疗有效量给药。不管实际给药的量是多少， 制剂的组合都具有协同作用。协 同反应是指比制剂的组合所能预期的附加作用还要大的作用。
     在其它方面， 与上述描述一致， 本发明提供了检测 CpG 核酸刺激分离自慢性感染 HCV 并且用非 CpG 疗法不能成功治疗或者对于非 CpG 疗法是无反应者的受试体的免疫细胞 的能力。这种检测方法通常是在体外操作， 使外周血单核细胞 (PBMC) 与有效量的能刺激免 疫反应的 CpG 免疫刺激核酸接触。所述免疫反应可以通过许多标记检测， 例如 IFN-α 的产 生， B 细胞刺激， 细胞因子例如 IL-6， IL-10， IL-12， 干扰素 -γ， 1 类干扰素 (α+β) 的分泌， 趋化因子的分泌例如 IP-10， NK 活性， 共刺激分子 ( 例如 CD80， CD 86) 以及成熟分子 ( 例如 CD83) 的表达以及 II 类 MHC 表达的正调控。 在一些重要的实施方案中， 所述免疫细胞是树突状细胞， 优选是类浆细胞的树突 状细胞 (pDC)， 所述免疫反应标记对这些细胞类型是特异的。其包括但不限于共刺激分子 ( 例如 CD80 和 CD86) 的表达， 成熟分子 ( 例如 CD83) 的表达， IL-12 和 1 类干扰素 (α+β) 的表达和 / 或分泌， 以及 II 类 MHC 表的的正调控。应当理解这些体外检测和树突状细胞例 如 pDC 与 PBMC 其余部分的分离没有关系。 甚至所述检测也可以在均质的 PBMC 群体中进行。
     在另一个方面， 本发明提供了一种鉴别具有丙型肝炎病毒感染的受试体的方法， 以用 CpG 免疫刺激核酸进行治疗。所述方法包括使从具有丙型肝炎病毒感染的受试体中收 集的外周血单核细胞暴露于 i) 一种 CpG 免疫刺激核酸， 和 ii) 一种 CpG 免疫刺激核酸和一 种抗病毒剂 ( 例如干扰素 -α) 中， 并测定外周血单核细胞的反应。对 CpG 免疫刺激核酸产 生反应表明可以在非 CpG 疗法之后对受试体进行 CpG 免疫刺激核酸治疗或者取代之 ( 如上 所述， 但只是在鉴别了对非 CpG 疗法可能没有反应的受试体之后 )。对 CpG 免疫刺激核酸 和抗病毒剂 ( 例如干扰素 -α) 的组合的反应比对单独的 CpG 免疫刺激核酸的反应大表示 受试体应当用这种组合治疗。如本文所述的， 所述抗病毒试剂可以是干扰素 -α， 包括但不 限于干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干扰素 -α。优选所述外周血单核细胞包括树突 状细胞例如类浆细胞的树突状细胞。本发明进一步包括用单独的 CpG 免疫刺激核酸或其与 抗病毒试剂 ( 例如干扰素 -α) 的组合对如上所述鉴别的受试体的治疗， 这取决于检测的结 果。 临床策略包括将这些核酸进行局部的和系统的体内给药， 或者离体策略， 其中分离自没 有反应的 HCV 感染受试体的 pDC 在体外用免疫刺激核酸激活， 然后重新局部地或系统地输 入到受试体中。这些治疗策略可以包括与其它生长因子 (IL-3， GM-CSF， flt3- 配体等 )， 或 者与其它刺激源 ( 超抗原， 病毒产物 ) 的组合。由于天然干扰素 -α 是一个家族， 具有多于 一打的单独的基因产物， 其中每个产物都具有独特的活性模式， 天然干扰素的临床使用优 选与衍生自单一的重组 IFN-α 基因的重组 IFN-α 相比较。
     本发明进一步提供了一种激活来自丙型肝炎感染受试体的 pDC 的方法。所述方法 包括分离需要治疗的受试体的 pDC， 体外培养所述分离的 pDC， 使所述 pDC 在体外与有效量
     的分离的免疫刺激核酸接触， 使接触过的细胞返回到受试体体内。所述细胞还可以在体外 与生长因子或细胞因子接触。根据本发明的这个方面， 用 IFN-α 进行治疗所需的免疫刺激 核酸和条件如上所述。
     IFN-α 本身代表了一个家族， 包括多于一打的相关的同源蛋白 ( 异构体， 参 见下述表 1)， 其中每一个都由不同的基因编码， 每一个都显示出独特的活性模式。不 同种类的 α- 干扰素对于病毒的活性可能会差 20 倍或更多。用于临床使用的 IFN-α 产物是重组蛋白或高度纯化的单纯异构体的天然蛋白。在美国可以获得的 IFN-α 是 重 组 人 IFN-α2a(ROFERON-A)， 重 组 人 IFN-α2b( 内 含 子 A(INTRON A))， 以及纯化 的 天 然 IFN-αn3(ALFERON N)。 在 美 国 之 外， 还 可 以 得 到 的 IFN-α 是 纯 化 的 天 然 IFN-αn1(WELLFERON)。
     表 1. 人 IFN-α 家族
     本发明的一些方法需要检测免疫反应， 包括 IFN-α 的检测。 IFN-α 的检测是本领 域公知的。 包括直接检测， 例如对至少一种 IFN-α 特异的酶联免疫吸附检测 (ELISA)， 以及 间接的检测， 例如功能性检测包括 NK 细胞激活 / 细胞毒性 (Trinchieri G AdvImmunol 47 ： 187-376(1989)) 和用荧光激活细胞分选 (FACS) 分析对 I 型 MHC 进行表型分析。 其它特异性
     检测方法是本领域熟知的， 特别可以用于感兴趣的是 IFN-α 的局部浓度或局部存在的情 况下。这些方法包括， 例如， 免疫组织化学， 核酸杂交 ( 例如 Northern blotting)， Western blotting， 逆转录酶 / 聚合酶链式反应 (RT/PCR)， 以及原位 RT/PCR。细胞内 IFN-α 也可以 用流式细胞术检测。
     本发明在一些方面包括检测 pDC 的激活。pDC 的激活可以用多种方法检测。包括 IFN-α 的产生， 共刺激分子 ( 例如 CD80 和 CD86) 的表达， 成熟分子 ( 例如 CD83) 的表达。 IL-12 的表达， 以及 II 类 MHC 表达的正调控。与外源 IFN-α 的给药不同， pDC 的激活导致 产生多种或是所有形式的 IFN-α， 以及其它 I 型 IFN 例如 IFN-β。在一些实施方案中， 因 此 pDC 的激活是通过检测其产生 I 型干扰素包括 IFN-α 的能力确定。
     本发明提供了多种方法， 包括免疫刺激核酸。 免疫刺激核酸是一种核酸分子， 当与 免疫系统细胞接触的时候， 能够诱导所接触的免疫系统的细胞增殖和 / 或被激活。所述接 触可以是直接的或是间接的， 例如所述免疫刺激核酸可以直接刺激第一种类型的免疫细胞 表达产物， 该产物继续刺激没有暴露于所述免疫刺激核酸或者对所述免疫刺激核酸没有反 应的第二种类型的免疫细胞。 所述免疫刺激核酸的免疫刺激效果与所述免疫刺激核酸序列 可能编码的任何产物都不同。类似地， 所述免疫刺激核酸的免疫刺激效果不同于任何反义 机制， 也不依赖于此。
     只有特定的核酸是免疫刺激核酸。最初认为特定的回文序列具有免疫刺激性。 Tokunaga T et al.Microbiol Immunol 36 ： 55-66(1992) ； Yamamoto T et al.Antisense Res Dev 4 ： 119-22(1994)。进一步的研究证明非回文序列也可以具有免疫刺激性， 只要 它们在特定的序列 (CpG 基序 ) 中包含有 CpG 二核苷酸。Krieg AM et al.Nature 374 ： 546-9(1995)。
     所述免疫刺激核酸可以是单链或双链的。 通常， 双链核酸分子在体内更稳定， 而单 链核酸分子的免疫活性较强。因此在本发明的一些方面优选所述免疫刺激核酸是单链， 在 其它方面优选所述免疫刺激核酸是双链。
     根据本发明提供的方法和产物涉及 CpG 寡核苷酸的应用。CpG ODN 能引发大部分 的 ( ＞ 95％ )B 细胞增殖， 分泌免疫球蛋白 (Ig)， IL-6 和 IL-12， 以及保护其不发生细胞凋 亡。 此外， CpGODN 能使 DC 成熟， 并且可以直接激活 DC， 单核细胞， 以及巨噬细胞分泌 IFN-α/ β， IL-6， IL-12， GM-CSF， 趋化因子和 TNF-α。这些细胞因子可以激活天然杀伤 (NK) 细胞 分泌 IFN-γ 并且具有增强的胞溶活性。总的来说， CpG 诱导强烈的 Th1 样模式的细胞因子 分泌， 主要是 IL-12 和 IFN-γ， 只有极少的 Th2 细胞因子分泌。
     除了诱导天然免疫反应， CpG DNA 还可以增强抗原特异性的反应， 这是由于 (i) 在 通过 B 细胞抗原受体引发的和通过 CpG 引发的 B 细胞信号传导途径之间存在强烈的协同作 用， (ii) 能够取代或增强抗原特异性的 T 辅助的 Th1 样细胞因子增强了 B 和 T 细胞抗原特 异的反应， 以及 (iii) 细胞反应需要有共刺激分子的正调控。
     CpG ODN 在具有明显 Th1 样反应 ( 主要是 IgG2a 抗体和强烈的 CTL) 的 BALB/c 小 鼠中可能是 HBsAg 的佐剂 (49)。发现 CpG ODN 优于其它 Th1 佐剂例如单磷酸脂 A(MPL， Corixa)， 或者甚至完全弗氏佐剂 (CFA) 这些对人使用有很大毒性的佐剂。用 CpG ODN 和其 它不同的抗原也能得到类似的结果 (47， 50-53)。据报道 CpG ODN 还可以改变先前已由 Th2 抗原 ( 即血吸虫病表面抗原 )(54) 或 Th2 佐剂 ( 即明矾 ) 形成的 Th2 反应。已发现至少有三种基本类型的 CpG ODN 可有效刺激健康人的 PBMC( 表 1)。 它们具 有不同的效果， 可能与 CpG ODN 刺激免疫细胞的不同模式有关。
     B 类 CpG ODN 是用可抵抗核酸酶的硫代磷酸酯骨架合成的， 通常可以很好地激活 B 细胞和 DC 使其产生 IL-12 和抗体， 但是只能有限地激活 NK 细胞。这一类 ODN 可有效作为 疫苗佐剂， 并且已经在检测 CpG( 这一类中的一个成员 )(SEQ ID NO ： 2) 作为商业化乙型肝 炎疫苗的佐剂的 I/II 期临床实验中得到了证明 (60)。
     A 类 CpG ODN 是用嵌合骨架合成的， 其中骨架的 5’ 和 3’ 末端是硫代磷酸酯， 中间 CpG 区域是磷酸二酯。这些 ODN 能很好地激活 NK 细胞和 DC 使其大量产生 IFN-α， 但只能 有限地激活 B 细胞。
     C 类 CpG ODN 是用硫代磷酸酯骨架合成的， 具有介于其它两类 CpG ODN 之间的刺激 特性 ( 例如， 很好地激活 B 细胞， 也能很好地激活 NK 细胞和 DC)。
     表1： 三种不同类型的 CpG ODN 诱导的体外免疫激活模式
     类 A B C
     1 2骨架 SOS2 S1 S1B 细胞 + ++++ +++天然杀伤细胞 ++++ ++ +++树突状细胞 ++++ ++++ +++IFN-α ++++ + +++S-ODN 是用硫代磷酸酯骨架制备的
     SOS-ODN 是用嵌合骨架制备的， 其中中间含有 CpG 的区域具有磷酸二酯连接， 而 ODN 的 3’ 和 5’ 末端是硫代磷酸酯连接
     本发明的方法还包括 A 类， B 类和 C 类 CpG 免疫刺激核酸的应用。对于 CpG 核酸， 近来已有描述存在不同种类的 CpG 核酸。一类是能激活 B 细胞但是在诱导 IFN-α 和 NK 细 胞激活方面相对较弱 ； 这一类称为 B 类。B 类 CpG 核酸典型地是完全稳定的并且在特定的 优选的碱基序列中包括未甲基化的 CpG 二核苷酸。参见， 例如美国专利序列号 6,194,388 ； 6,207,646 ； 6,214,806 ； 6,218,371 ； 6,239,116 ； 和 6,339,068。另一类是能诱导 IFN-α 和 NK 细胞激活， 但在刺激 B 细胞方面相对较弱 ； 这一类被称为 A 类。A 类 CpG 核酸典型地在 5’ 和 3’ 末端具有稳定的 poly-G 序列并具有至少 6 个核苷酸的含有磷酸二酯 CpG 二核苷酸的 回文序列。参见， 例如， 公开的专利申请 PCT/US00/26527(WO01/22990)。还有另一类 CpG 核 酸能激活 B 细胞和 NK 细胞并能诱导 IFN-α ； 这一类被称为 C 类。所述 C 类 CpG 核酸如其 首次表征的， 典型地是完全稳定的， 包含 B 类型的序列和富含 GC 的回文结构或近似回文结 构。这一类在 2001 年 8 月 17 日提交的美国临时专利申请 60/313,273， 2002 年 8 月 19 日 提交的 US10/224,523 中有描述， 在此引入其全文作为参考。
     “A 类” CpG 免疫刺激核酸在 2000 年 9 月 27 日提交的美国非临时专利申请序列号 ： 09/672,126 和公开的 PCT 申请 PCT/USOO/26527(WO 01/22990) 中有描述。这些核酸具有 诱导高水平的干扰素 -α 的能力， 但是对 B 细胞激活的作用却很小。A 类 CpG 免疫刺激核 酸不必须含有六聚物的回文序列如 Yamamoto 及其同事所述的 GACGTC， AGCGCT， 或 AACGTT。YamamotoS et al.JImmunol 148 ： 4072-6(1992)。
     A 类免疫刺激核酸的典型序列如 2000 年 9 月 27 日提交的美国非临时专利申请序 列号 09/672,126 和公开的 PCT 申请 PCT/US00/26527(WO 01/22990) 中所述。
     B 类 CpG 免疫刺激核酸强烈激活人 B 细胞但是诱导干扰素 -α 的作用却很小。 B类 CpG 免疫刺激核酸在分别于 2001 年 2 月 27 日和 2001 年 5 月 29 日公开的 USP 6,194,388B1 和 6,239,116 B1 有描述。
     本发明的 CpG 寡核苷酸是包括至少一个未甲基化的 CpG 二核苷酸的寡核苷酸。含 有至少一个未甲基化的 CpG 二核苷酸的寡核苷酸是一种含有未甲基化的胞嘧啶 - 鸟嘌呤二 核苷酸序列 ( 即 “CpG DNA” 或含有 5’ 胞嘧啶和 3’ 鸟嘌呤并且它们是用磷酸键相连的 DNA) 并能激活免疫系统。全部 CpG 寡核苷酸都可以是未甲基化的， 或者部分是未甲基化的但至 少 5’ CG 3’ 的 C 必须是未甲基化的。这里所说的术语 CpG 寡核苷酸或 CpG 核酸指免疫刺激 CpG 寡核苷酸， 除非是另外指出的核酸。
     在本发明的一个实施方案中提供了一种至少由下述通式表示的 B 类 CpG 寡核苷 酸：
     5′ X1X2CGX3X43′ 其中 X1， X 2， X 3， 和 X4 是核苷酸。在一个实施方案中 X2 是腺嘌呤， 鸟嘌呤， 或胸腺嘧 啶。在另一个实施方案中 X3 是胞嘧啶， 腺嘌呤， 或胸腺嘧啶。
     在本发明的另一个实施方案中提供了一种至少由下述通式表示的分离的 B 类 CpG 寡核苷酸 ：
     5′ N1X1X2CGX3X4N23′
     其中 X1， X2， X 3， 和 X4 是核苷酸， N 是任意核苷酸， N1 和 N2 每个都是由大约 0-25 个 核苷酸组成的核酸序列。在一个实施方案中， X1X2 是选自下组的二核苷酸 ： GpT， GpG， GpA， ApA， ApT， ApG， CpT， CpA， CpG， TpA， TpT， 和 TpG ； X3X4 是选自下组的二核苷酸 ： TpT， ApT， TpG， ApG， CpG， TpC， ApC， CpC， TpA， ApA， 和 CpA。优选 X1X2 是 GpA 或 GpT， X3X4 是 TpT。在另一个实 施方案中 X1 或 X2 或两者都是嘌呤， X3 或 X4 或两者都是嘧啶， 或者 X1X2 是 GpA， X3 或 X4 或两 者都是嘧啶。在另一个优选的实施方案中 X1X2 是选自下组的二核苷酸 ： TpA， ApA， ApC， ApG， 和 GpG。在另一个实施方案中 X3X4 是选自下组的二核苷酸 ： TpT， TpA， TpG， ApA， ApG， GpA， 和 CpA。在另一个实施方案中 X1X2 是选自下组的二核苷酸 ： TpT， TpG， ApT， GpC， CpC， CpT， TpC， GpT 和 CpG ； X3 是选自 A 和 T 的核苷酸， X4 是核苷酸， 但是其中当 X1X2 是 TpC， GpT， 或 CpG 的 时候， X3X4 不是 TpC， ApT 或 ApC。
     在另一个优选的实施方案中， 所述 CpG 核酸具有序列 5′ TCN1TX1X2CGX3X43′ (SEQ ID NO. ： 26)。在一些实施方案中， 本发明的 CpG 核酸包括选自 GpT， GpG， GpA 和 ApA 的 X1X2 以及选自 TpT， CpT 和 TpC 的 X3X4。
     本发明的 B 类 CpG 核酸序列在上文以及 PCT 公开专利申请 PCT/US95/01570 和 PCT/ US97/19791， 以及分别于 2001 年 2 月 27 日和 2001 年 5 月 29 日公开的 USP 6,194,388 B1 和 USP6,239,116 B1 中有广泛描述。典型序列包括但不限于那些在这些申请和专利中公开 的序列。
     C 类免疫刺激核酸包括至少两个不同的基序， 对免疫系统的细胞具有独特的和所 希望的刺激效果。这种 ODN 中的一些具有传统的 “刺激性” CpG 序列和 “富含 GC 的” 或 “B
     细胞中和” 基序。这些组合基序核酸具有介于传统的 “B 类” CpG ODN， 其是 B 细胞激活和 树突状细胞 (DC) 激活的强烈诱导剂， 的效果与近来描述的一类免疫刺激核酸 (“A 类” CpG ODN)， 其是 IFN-a 和天然杀伤 (NK) 细胞激活的强烈诱导剂但是对于 B 细胞和 DC 细胞的激活 的诱导作用较弱， 的效果之间的免疫刺激效果。 KriegAM et al.(1995)Nature 374 ： 546-9 ； Ballas ZK et al.(1996)Jlmmunol 157 ： 1840-5 ； Yamamoto S et al.(1992)Immunol 148 ： 4072-6。优选的 B 类 CpG ODN 通常具有硫代磷酸酯骨架， 优选的 A 类 CpG ODN 具有混合或 嵌合骨架， C 类组合基序免疫刺激核酸可以具有稳定的， 例如硫代磷酸酯， 嵌合， 或磷酸二酯 骨架， 在一些优选的实施方案中， 其具有半柔性骨架。
     在本发明的一方面提供了属于这新的一类的组合基序免疫刺激核酸的免疫刺激 核酸。B 细胞刺激域由下述通式定义 ： 5′ X1DCGHX23′。D 是非 C 的核苷酸。C 是胞嘧啶。G 是鸟嘌呤。H 是非 G 的核苷酸。
     X1 和 X2 是任意的 0 到 10 个核苷酸长的核酸序列。X1 可以包括 CG， 其中优选在 CG 之前紧邻 T。在一些实施方案中 DCG 是 TCG。X1 优选长度为 0 到 6 个核苷酸。在一些实施 方案中 X2 不包括任何 poly G 或 poly A 基序。在其它实施方案中所述免疫刺激核酸在 5’ 末端或 3’ 末端具有 poly-T 序列。这里所说的 “poly-A” 或 “poly-T” 分别是指四个或更多 个连续 A 或 T 的延伸链， 例如 5′ AAAA 3′或 5′ TTTT 3′。 这里所说的 “poly-G 末端” 是指四个或更多个连续 G 的延伸链， 例如 5′ GGGG 3′， 位于核酸的 5’ 末端或 3’ 末端。这里所说的 “poly-G 核酸” 是指具有通式 5′ X1X2GGGX3X43′ 的核酸， 其中 X1， X2， X3， 和 X4 是核苷酸， 优选 X3 和 X4 中的至少一个是 G。
     符合此通式的 B 细胞刺激域的一些优选设计包括 TTTTTCG， TCG， TTCG， TTTCG， TTTTCG， TCGT， TTCGT， TTTCGT， TCGTCGT。
     所述的核酸的第二个基序是 P 或 N， 紧邻 X1 的 5’ 或紧邻 X2 的 3’ 。
     N 是 B 细胞中和序列， 起始为 CGG 三核苷酸， 至少是 10 个核苷酸长。B 细胞中和基 序包括至少一个 CpG 序列， 其中 CG 前面是 C， 后面是 G(Krieg AM et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA95 ： 12631-12636) 或是含有 CG 的 DNA 序列， 其中 CG 的 C 是甲基化的。这里所 说的 “CpG” 是指 5’ 胞嘧啶 (C)， 其后是 3’ 鸟嘌呤 (G) 并且用磷酸键连接起来。至少 5′ CG 3′中的 C 必须是未甲基化的。中和基序是当存在于其它非刺激基序中具有一定程度的免 疫刺激能力， 但是当存在于其它免疫刺激基序中减少所述其它基序的免疫刺激活性的基 序。
     P 是含有富含 GC 的回文结构的序列， 至少是 10 个核苷酸长。这里所说的 “回文结 构” 等同于 “回文序列” ， 是指反向重复序列， 即一种序列如 ABCDEE′ D′ C′ B′ A′， 其中 A 和 A’ ， B 和 B’ 等是能形成常规的 Watson-Crick 碱基对的碱基。
     这里所说的 “富含 GC 的回文结构” 是指具有至少三分之二的 G 和 C 的碱基组成的 回文结构。在一些实施方案中， 所述富含 GC 的域优选是在 “B 细胞刺激域” 的 3’ 。在 10 碱 基长的富含 GC 的回文结构中， 所述回文结构通常含有至少 8 个 G 和 C。在 12 个碱基长的富 含 GC 的回文结构中， 所述回文结构也含有至少 8 个 G 和 C。在 14 聚体的富含 GC 的回文结 构中， 所述回文结构中至少有 10 个碱基是 G 和 C。在一些实施方案中所述富含 GC 的回文结 构完全由 G 和 C 组成。
     在一些实施方案中， 所述富含 GC 的回文结构的碱基组成具有至少 81％的 G 和 C。
     在这样的 10 个碱基长的富含 GC 的回文结构中， 所述回文结构完全由 G 和 C 组成。在这样 的 12 个碱基长的富含 GC 的回文结构中， 优选所述回文结构中的至少 10 个碱基 (83％ ) 是 G 和 C。在一些优选的实施方案中， 12 个碱基长的富含 GC 的回文结构完全由 G 和 C 组成。在 14 聚体的富含 GC 的回文结构中， 所述回文结构中的至少 12 个碱基 (86％ ) 是 G 和 C。在一 些优选的实施方案中， 14 个碱基长的富含 GC 的回文结构完全由 G 和 C 组成。富含 GC 的回 文结构的 C 可以是未甲基化的或者它们可以是甲基化的。
     通常这个结构域有至少 3 个 C 和 G， 更优选的是每个都有 4 个， 最优选的是每个 都有 5 个或更多。此结构域中 C 和 G 的数目不必相同。优选 C 和 G 的分布使得它们能够 形成自互补的双链， 或者回文结构， 例如 CCGCGCGG。这种结构可以通过插入 A 或 T 而被 破坏， 但是优选至少保持部分自互补结构， 例如基序 CGACGTTCGTCG(SEQ ID NO ： ___) 或 CGGCGCCGTGCCG(SEQID NO ： ___)。当不能保持互补的时候， 优选非互补碱基是 TG。在一 个优选的实施方案中， 不包括在回文结构中的不超过 3 个连续碱基， 优选不超过 2 个， 最 优选只有 1 个。在一些实施方案中富含 GC 的回文结构包含至少一个 CGG 三聚体， 至少 一个 CCG 三聚体， 或者至少一个 CGCG 四聚体。在其它实施方案中， 富含 GC 的回文结构不 是 CCCCCCGGGGGG(SEQ ID NO ： ____) 或 GGGGGGCCCCCC(SEQ ID NO ： ___)， CCCCCGGGGG(SEQ IDNO ： ____) 或 GGGGGCCCCC(SEQ ID NO ： ____)。
     富含 GC 的区域中至少有一个 G 可以被次黄嘌呤 (I) 取代。在一些实施方案中， P 包括不止一个 I。
     在特定的实施方案中， 所述免疫刺激核酸具有下述通式中的一种 ： 5’ NX1DCGHX23’ ， 5’ X 1DCGHX 2N 3’ ， 5’ PX 1DCGHX 23’ ， 5’ X 1DCGHX 2P 3’ ， 5’ X 1DCGHX 2PX 33’ ， 5’ X 1DCGHPX 33’ ， 5’ DCGHX2PX33’ ， 5’ TCGHX2PX33’ ， 5’ DCGHPX33’ ， 或者 5’ DCGHP 3’ 。
     在本发明的其它方面提供了由下述通式表示的免疫刺激核酸 ： 5’ N1PyGN2P 3’ 。N1 是任意 1 到 6 个核苷酸长的序列。Py 是嘧啶。G 是鸟嘌呤。N2 是任意 0 到 30 个核苷酸长 的序列。P 是富含 GC 的回文结构， 包含至少 10 个核苷酸长的序列。
     N1 和 N2 可以包含多于 50％的嘧啶， 更优选包含多于 50％的 T。N1 可以包含一个 CG， 其中优选在 CG 之前紧邻 T。在一些实施方案中 N1PyG 是 TCG( 例如 ODN 5376， 其中 5’ 端 是 TCGG)， 最优选是 TCGN2， 其中 N2 不是 G。
     N1PyGN2P 可以包含一个或多个次黄嘌呤 (I) 核苷酸。N1 中的 C 或 G 可以被次黄嘌 呤取代， 但是相对于 IpG 来说更优选 CpI。对于次黄嘌呤取代如 IpG， 可以用 “半柔性” 或嵌 合骨架使之达到其最大活性， 其中 IG 或 CI 之间通过磷酸二酯连接。N1 可以包括至少一个 CI， TCI， IG 或 TIG 基序。
     在特定的实施方案中， N1PyGN2 是选自下组的序列 ： TTTTTCG， TCG， TTCG， TTTCG， TTTTCG， TCGT， TTCGT， TTTCGT 和 TCGTCGT。
     一些 C 类核酸的非限制性实例包括 ：
     为了便于细胞吸收， 免疫刺激核酸， 包括含有 CpG 的寡核苷酸， 优选长度为 8 到 100 个碱基。但是， 根据本发明， 只要存在足够的免疫刺激基序， 任意大于 8 个核苷酸大小 ( 甚 至数个 kb 长 ) 的核酸都能够诱导免疫反应， 这是由于较大的核酸在细胞内被降解成为寡核 苷酸。优选所述免疫刺激核酸的长度为在 8 个和 100 个核苷酸之间。在一些优选的实施方 案中所述免疫刺激核酸的长度在 12 个和 40 个核苷酸之间。在更优选的实施方案中所述免 疫刺激核酸的长度在 8 个和 30 个核苷酸之间。在最优选的实施方案中所述免疫刺激核酸 的长度在 8 个和 24 个核苷酸之间。
     “回文序列” 是指反向重复序列， 即一种序列 ABCDEE′ D′ C′ B′ A′， 其中 A 和 A’ ， B 和 B’ ， C 和 C’ ， D 和 D’ ， 以及 E 和 E’ 都是能够形成常规的 Watson-Crick 碱基对的碱 基。在体内， 这种回文序列可以形成双链结构。在一个实施方案中， 所述 CpG 寡核苷酸含有 回文序列。本文中所说的回文序列是指其中 CpG 是回文结构的一部分， 优选是回文结构的 中心的回文结构。在另一个实施方案中， 所述 CpG 寡核苷酸不含回文结构。不含回文结构 的 CpG 寡核苷酸是指其中 CpG 二核苷酸不是回文结构的一部分的寡核苷酸。这种寡核苷酸 可以含有其中 CpG 不是所述回文结构的中心的回文结构。
     在本发明的一些实施方案中， 所述免疫刺激寡核苷酸包括免疫刺激基序， 即 “CpG” 二核苷酸。 CpG 二核苷酸可以是甲基化的或者未甲基化的。 含有至少一个未甲基化的 CpG 二 核苷酸的免疫刺激核酸是其中含有未甲基化的胞嘧啶 - 鸟嘌呤二核苷酸序列 ( 即未甲基化 的 5’ 胞嘧啶核苷后面是 3’ 鸟嘌呤核苷并且以磷酸键相连 ) 并且能激活免疫系统的核酸分 子； 这种免疫刺激核酸是 CpG 核酸。 CpG 核酸在许多公布的专利， 公开的专利申请， 以及其它 6,239,116 ； 出版物， 包括美国专利序列号 6,194,388 ； 6,207,646 ； 6,214,806 ； 6,218,371 ； 和 6,339,068 中有描述。含有至少一个甲基化的 CpG 二核苷酸的免疫刺激核酸是其中含有 甲基化的胞嘧啶 - 鸟嘌呤二核苷酸序列 ( 即甲基化的 5’ 胞嘧啶核苷后面是 3’ 鸟嘌呤核苷 并且以磷酸键相连 ) 并能激活免疫系统的核酸。在其它实施方案中所述免疫刺激寡核苷酸 不含 CpG 二核苷酸。这些不含 CpG 二核苷酸的寡核苷酸称为非 CpG 寡核苷酸， 它们具有非 CpG 免疫刺激基序。 因此本发明还包括具有其它类型免疫刺激基序的核酸， 所述基序可以是
     甲基化的或者未甲基化的。 本发明的免疫刺激寡核苷酸进一步可以包括任何甲基化的和未 甲基化的 CpG 和非 CpG 免疫刺激基序的组合。
     所述免疫刺激核酸分子可以具有嵌合骨架。为本发明的目的， 嵌合骨架是指部 分稳定的骨架， 其中至少一个核苷酸间连接是磷酸二酯或磷酸二酯样连接， 其中至少一 个其它核苷酸间连接是稳定的核苷酸间连接， 其中至少一个磷酸二酯或磷酸二酯样连接 和至少一个稳定的连接是不同的。由于已有报道 boranophosphonate 连接相对于磷酸 二酯连接来说是稳定的， 为所述骨架的嵌合状态的目的， boranophosphonate 连接可以 分类为磷酸二酯样或分类为稳定的， 这取决于其所处环境。例如， 根据本发明， 在一个实 施方案中， 嵌合骨架包括至少一个磷酸二酯 ( 磷酸二酯或磷酸二酯样 ) 连接和至少一个 boranophosphonate( 稳定的 ) 连接。 在另一个实施方案中， 根据本发明， 嵌合骨架可以包括 boranophosphonate( 磷酸二酯或磷酸二酯样 ) 连接和硫代磷酸酯 ( 稳定的 ) 连接。 “稳定 的核苷酸间连接” 是指与磷酸二酯核苷酸间连接相比， 相对能够抵抗体内降解 ( 例如核酸外 切或核酸内切酶 ) 的核苷酸间连接。优选稳定的核苷酸间连接包括但不限于硫代磷酸酯， 二硫代磷酸酯， 膦酸甲酯， 和甲基硫代磷酸酯。其它稳定的核苷酸间连接包括但不限于肽， 烷基， 去磷酸， 和其它上述连接。
     修饰的骨架例如硫代磷酸酯可以用氨基磷酸酯或 H- 膦酸盐化学方法用自动技术 合成。可以用例如美国专利序列号 4,469,863 中描述的方法制备芳基和烷基膦酸盐 ； 烷基 磷酸三酯 ( 其中带电荷的氧用美国专利序列号 5,023,243 和欧洲专利序列号 092,574 中的 方法烷基化 ) 可以使用商业可获得的试剂用自动固相合成方法制备。现有技术中对于制备 其它 DNA 骨架修饰和取代的方法已有描述。Uhlmann E et al.(1990)Chem Rev 90 ： 544 ； Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem 1 ： 165。制备嵌合寡核苷酸的方法也是已知的。例 如 Uhlmann 等的专利中描述了这些技术。
     混和骨架修饰的 ODN 可以使用商业可获得的 DNA 合成仪和标准亚磷酰胺化学 合 成。(F.E.Eckstein， “Oligonucleotides andAnalogues-A Practical Approach” IRL Press ， Oxford ， UK ， 1991 ， and M.D.Matteucci and M.H.Caruthers ， Tetrahedron Lett.21， 719(1980))。 偶 合 以 后， 用 Beaucage 试 剂 (R.P.Iyer， W.Egan， J.B.Regan and S.L.Beaucage， J.Am.Chem.Soc.112， 1253(1990))( 在乙腈中浓度为 0.075M) 或苯乙酰二 硫化物 (PADS) 通过硫化反应， 然后用乙酸酐， 2， 6- 卢剔啶的四氢呋喃溶液 (1 ∶ 1 ∶ 8 ； v ∶ v ∶ v) 和 N- 甲基咪唑 ( 在四氢呋喃中浓度为 16％ ) 加帽， 引入 PS 连接。 该加帽步骤在 硫化反应之后进行以最大程度地减少在应是硫代磷酸酯的部位上形成不希望的磷酸二酯 (PO) 连接。 在磷酸二酯连接的引入过程中， 例如在 CpG 二核苷酸上， 中间的磷 -III 通过碘的 水 / 吡啶溶液处理被氧化。从固体支持物上切割下来以后， 通过浓缩氨的处理进行最后的 去保护 (15 小时， 50℃ )， 用 NaCl 梯度 ( 例如缓冲液 A ： 乙腈 / 水＝ 1 ∶ 4/v ∶ v 中 NaH2PO4 浓度为 10mM， pH6.8 ； 缓冲液 B ： 乙腈 / 水＝ 1 ∶ 4/v ∶ v 中 NaH2PO4 浓度为 10mM， NaCl 浓度 为 1.5M ； 在 30 分钟内 5 到 60％ B， 速度为 1ml/min) 在 Gen-Pak Fax 柱 (Millipore-Waters) 上进行 HPLC 或者用毛细管电泳分析 ODN。可以用 HPLC 或在 Source High Performance 柱 (Amersham Pharmacia) 上用 FPLC 纯化。将 HPLC- 单一级分混和并通过 C18 柱或超滤进行 脱盐。用 MALDI-TOF 质谱对 ODN 进行分析以确定计算质量。
     本发明的核酸还可以包括其它修饰。包括非离子的 DNA 类似物， 例如烷基和芳基磷酸盐 ( 其中带电荷的膦酸盐氧被烷基或芳基取代 )， 磷酸二酯和烷基磷酸三酯， 其中带电 荷的氧被烷基化。 含有二醇的核酸， 例如四乙二醇或六乙二醇， 其每个末端或所有末端基本 上都能抵抗核酸酶的降解。
     在一些实施方案中， 所述寡核苷酸可以是柔性或半柔性寡核苷酸。柔性寡核苷 酸是具有部分稳定骨架的免疫刺激寡核苷酸， 其中只在至少一个内部嘧啶 - 嘌呤二核苷 酸 (YZ) 的内部或其紧邻部位具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接。优选 YZ 是 YG， 嘧 啶 - 鸟嘌呤核苷 (YG) 二核苷酸。所述至少一个内部 YZ 二核苷酸本身具有磷酸二酯或磷酸 二酯样核苷酸间连接。所述至少一个内部 YZ 二核苷酸紧邻部位的磷酸二酯或磷酸二酯样 核苷酸间连接可以是在所述至少一个内部 YZ 二核苷酸的 5’ ， 3’ 或同时在 5’ 和 3’ 。
     特别是， 磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接包括 “内部二核苷酸” 。通常内部二 核苷酸是指任意一对通过核苷酸间连接相连的相邻核苷酸， 其中该对核苷酸中的任何一个 都不是末端核苷酸， 即， 该对核苷酸中没有一个核苷酸是所述寡核苷酸的 5’ 或 3’ 末端。因 此 n 个核苷酸长的线性寡核苷酸具有总共 n-1 个二核苷酸， 只有 n-3 个内部二核苷酸。内 部二核苷酸的每个内部核苷酸间连接都是内部核苷酸间连接。因此 n 个核苷酸长的线性寡 核苷酸具有总共 n-1 个二核苷酸， 只有 n-3 个内部二核苷酸。因此， 策略性放置的磷酸二酯 或磷酸二酯样核苷酸间连接指位于核酸序列中任意一对核苷酸之间的磷酸二酯或磷酸二 酯样核苷酸间连接。 在一些实施方案中所述磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接不位于靠 近 5’ 或 3’ 端的任何一对核苷酸之间。
     优选所述至少一个内部 YZ 二核苷酸紧邻部位的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间 连接本身是内部核苷酸间连接。因此对于序列 N1 YZ N2， 其中 N1 和 N2 每一个独立于另一个 是任意单个核苷酸， 所述 YZ 二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯样连接， 此外 (a) 当 N1 是内 部核苷酸的时候， N1 和 Y 通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连， (b) 当 N2 是内部 核苷酸的时候， Z 和 N2 通过磷酸二酯或磷酸二酯样连接相连， 或者 (c) 当 N1 是内部核苷酸 的时候， N1 和 Y 通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连， 并且当 N2 是内部核苷酸的 时候， Z 和 N2 通过磷酸二酯或磷酸二酯样连接相连。
     根据本发明的柔性寡核苷酸与完全稳定的寡核苷酸相比相对比较容易受到核酸 酶的切割。虽然不受特定理论或机制的限制， 认为本发明的柔性寡核苷酸相对于全长柔性 寡核苷酸可被切割为具有降低的或没有免疫刺激活性的片段。 引入至少一个对核酸酶敏感 的核苷酸间连接， 特别是在所述寡核苷酸中部附近， 可以提供一个 “关闭开关” ， 它可以改变 所述寡核苷酸的药物动力学以至于可以减少所述寡核苷酸的最大免疫刺激活性的持续时 间。这在组织和临床应用中可能具有特殊的价值， 因为它可以避免慢性局部炎症或免疫刺 激相关的伤害， 例如肾。
     半柔性寡核苷酸是具有部分稳定骨架的免疫刺激寡核苷酸， 其中仅仅在至少一个 内部嘧啶 - 嘌呤 (YZ) 二核苷酸的内部具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接。半柔性 寡核苷酸与相应的完全稳定的免疫刺激寡核苷酸相比， 通常具有增强的免疫刺激效果。由 于半柔性寡核苷酸具有更强的能力， 在一些实例中， 半柔性寡核苷酸与传统的完全稳定的 免疫刺激寡核苷酸相比， 为达到所希望的生物效果， 可以用于较低的有效浓度， 并且具有较 低的有效剂量。
     认为半柔性寡核苷酸的上述性质通常随着内部 YZ 二核苷酸中的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接的 “剂量” 的增加而增加。因此认为， 例如， 通常对给定的具有五个内 部 YZ 二核苷酸的寡核苷酸序列来说， 具有五个内部磷酸二酯或磷酸二酯样 YZ 核苷酸间连 接的寡核苷酸比具有四个内部磷酸二酯或磷酸二酯样 YG 核苷酸间连接的寡核苷酸更具免 疫刺激效果， 后者依次也比具有三个内部磷酸二酯或磷酸二酯样 YZ 核苷酸间连接的寡核 苷酸更具免疫刺激效果， 后者依次也比具有两个内部磷酸二酯或磷酸二酯样 YZ 核苷酸间 连接的寡核苷酸更具免疫刺激效果， 后者依次也比具有一个内部磷酸二酯或磷酸二酯样 YZ 核苷酸间连接的寡核苷酸更具免疫刺激效果。重要的是， 甚至只是含有一个内部磷酸二酯 或磷酸二酯样 YZ 核苷酸间连接也认为优于没有内部磷酸二酯或磷酸二酯样 YZ 核苷酸间连 接的。除了磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接的数目， 沿着核酸长度上的位置分布也影 响其功效。
     柔性和半柔性寡核苷酸通常包括， 除了在优选的内部位置上的磷酸二酯或磷酸二 酯样核苷酸间连接之外， 还包括能抵抗降解的 5’ 和 3’ 端。这种抵抗降解的末端可以包括 任何能使得对核酸外切酶切割的抗性比相应的未修饰末端增强的适当的修饰。例如， 所述 5’ 和 3’ 末端可以通过在骨架上的至少包含一个磷酸盐修饰实现稳定。在优选的实施方案 中， 在所述骨架的每个末端的至少一个磷酸盐修饰独立地是硫代磷酸酯， 二硫代磷酸酯， 膦 酸甲酯， 或甲基硫代磷酸酯核苷酸间连接， 在另一个实施方案中， 所述可抵抗降解的末端包 括一个或多个通过肽或 3’ 末端的酰胺键连接起来的核苷酸单位。
     磷酸二酯核苷酸间连接是天然的核酸连接特征类型。如图 20 所示， 所述磷酸二酯 核苷酸间连接包括磷原子， 其侧翼是两个桥接的氧原子， 另外还与两个氧原子相连， 一个带 电荷， 一个不带电荷。 当所述寡核苷酸的组织半衰期的减少非常重要的时候， 磷酸二酯核苷 酸间连接是特别优选的。
     磷酸二酯样核苷酸间连接是含有磷的桥接基团， 在化学性质上和 / 或非对映性质 上与磷酸二酯类似。对其与磷酸二酯相似性的检测包括对核酸酶消化的易感性以及激活 RNAse H 的能力。因此例如磷酸二酯寡核苷酸， 而不是硫代磷酸酯寡核苷酸易被核酸酶消 化， 但是磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸都能够激活 RNAseH。在优选的实施方案中所述磷 酸二酯样核苷酸间连接是 boranophosphate( 或等同的 boranophosphonate) 连接。美国专 利序列号 5,177,198 ； 美国专利序列号 5,859,231 ； 美国专利序列号 6,160,109 ； 美国专利 序列号 6,207,819 ； Sergueev et al.， (1998)JAm Chem Soc 120 ： 9417-27。在另一个优选 的实施方案中所述磷酸二酯样核苷酸间连接是非对映的纯的 Rp 硫代磷酸酯。认为非对映 的纯的 Rp 硫代磷酸酯比混和的或非对映的纯的 Sp 硫代磷酸酯更容易被核酸酶消化， 激活 RNAse H 的能力也更强。CpG 寡核苷酸的立体异构体是 1999 年 7 月 27 日申请的共同未决 的美国专利申请 09/361,575， 公开的 PCT 申请 PCT/US99/17100(WO00/06588) 请求保护的主 题。应当注意， 为本发明的目的， 术语 “磷酸二酯样核苷酸间连接” 特别地不包括二硫代磷 酸酯和膦酸甲酯核苷酸间连接。
     如上所述本发明的柔性和半柔性寡核苷酸在 C 和 G 之间具有磷酸二酯样连接。磷 酸二酯样连接的一个例子是 Rp 构象的硫代磷酸酯连接。 寡核苷酸 p 手性对于 CpG 寡核苷酸 的免疫活性具有明显相反的影响， 这取决于活性测量的时间点。在 40 分钟的早期时间点， 硫代磷酸酯 CpG 寡核苷酸的 Rp 而不是 Sp 立体异构体可在鼠脾细胞中诱导 JNK 磷酸化。相 反， 在 44 小时的晚期时间点， Sp 而不是 Rp 立体异构体具有活性可刺激脾细胞增殖。这种 Rp和 Sp 立体异构体的动力学和生物活性上的差异并不是由于细胞吸收上的任何差异造成的， 更可能是由于 p 手性的两种相反的生物学作用导致的。首先 Rp 立体异构体与 Sp 相比在早 期时间点具有增强的刺激免疫细胞的活性表明 Rp 可能更有效地与 CpG 受体， TLR9 相互作 用， 或诱导下游信号传导途径。另一方面， Rp PS- 寡核苷酸与 Sp 相比其更快的降解导致信 号传导的持续时间更短， 因此 Sp PS- 寡核苷酸在晚期时间点检测的时候表现出更强的生物 活性。
     CpG 二核苷酸本身的 p 手性就可获得令人惊讶的强烈效果。与立体随机的 CpG 寡 核苷酸相比， 其中单个 CpG 二核苷酸与 Rp 相连的同源物活性稍强， 但是含有 Sp 连接的同源 物在诱导脾细胞增殖上几乎没有活性。
     所述免疫刺激寡核苷酸的大小 ( 即沿着核酸长度方向上的核苷酸残基的数目 ) 可 能也影响所述寡核苷酸的刺激活性。为了便于细胞吸收， 免疫刺激寡核苷酸优选最小长度 为 6 个核苷酸残基。根据本发明， 如果存在足够的免疫刺激基序， 任何大于 6 个核苷酸 ( 甚 至数个 kb 长 ) 的核酸都能诱导免疫反应， 这是由于较大的核酸在细胞内部被降解。根据本 发明认为如果可以递送到细胞内部， 短至 4 个核苷酸长的半柔性寡核苷酸也可以具有免疫 刺激效果。根据本发明， 在特定的优选实施方案中， 所述免疫刺激寡核苷酸在 4 到 100 个核 苷酸之间。在典型的实施方案中所述免疫刺激寡核苷酸在 6 到 40 个核苷酸之间。根据本 发明， 在特定的优选实施方案中， 所述免疫刺激寡核苷酸在 6 到 19 个核苷酸之间。 所述免疫刺激寡核苷酸通常长度在 4 到 100 个之间， 在一些实施方案中在 10 到 40 个之间。所述长度也可以在 16 到 24 个核苷酸之间。
     术语 “核酸” 和 “寡核苷酸” 还包括具有取代或修饰， 例如在碱基和 / 或糖上的核 酸或寡核苷酸。例如， 包括具有在 2’ 部位与除羟基以外的， 并且在 5’ 部位与除磷酸盐基 团或羟基以外的低分子量的有机基团共价结合的骨架糖的核酸。因此修饰的核酸可以包 括 2’ -O- 烷基化核糖基团。此外， 修饰的核酸可以包括用糖例如阿拉伯糖或 2’ - 氟代阿拉 伯糖取代核糖。因此所述核酸在骨架组分上可以是异质的， 因而可以含有任何可能的例如 肽 - 核酸相连的聚合物单元 ( 具有氨基酸骨架和核酸碱基 ) 的组合。
     核酸还包括取代的嘌呤和嘧啶例如 C-5 丙炔嘧啶和 7- 去氮杂 -7- 取代的嘌呤修 饰的碱基。Wagner R W et al.(1996)NatBiotechnol 14 ： 840-4. 嘌呤和嘧啶包括但不限 于腺嘌呤胞嘧啶， 鸟嘌呤， 胸腺嘧啶， 5- 甲基胞嘧啶， 5- 羟基胞嘧啶， 5- 氟代胞嘧啶， 2- 氨基 嘌呤， 2- 氨基 -6- 氯嘌呤， 2， 6- 二氨基嘌呤， 次黄嘌呤和其它天然和非天然的核碱基， 取代 的和未取代的芳香部分。其它这种修饰是本领域技术人员所公知的。
     本发明的免疫刺激寡核苷酸与天然 RNA 和 DNA 相比， 可以包括各种化学修饰和取 代， 包括磷酸二酯核苷酸间桥接， β-D- 核糖单位和 / 或天然核苷酸碱基 ( 腺嘌呤， 鸟嘌呤， 胞嘧啶， 胸腺嘧啶， 尿嘧啶 )。化学修饰的实例是技术人员所公知的， 在例如 Uhlmann E et al.(1990)Chem Rev 90 ： 543 “ ；Protocols forOligonucleotides and Analogs” Synthesis and Properties & Synthesisand Analytical Techniques， S.Agrawal， Ed， Humana Press， Totowa， USA 1993 ； Crooke ST et al.(1996)Annu Rev Pharmacol Toxicol36 ： 107-129 ； 和 Hunziker J et al.(1995)Mod Synth Methods 7 ： 331-417 中有描述。根据本发明， 寡核苷 酸可以具有一个或多个修饰， 与具有同样序列的由天然 DNA 或 RNA 组成的寡核苷酸相比， 其 中每个修饰都位于特定的磷酸二酯核苷酸间桥接和 / 或特定的 β-D- 核糖单位和 / 或特定
     的天然核苷酸碱基部位。
     例如， 本发明涉及的寡核苷酸可能含有一个或多个修饰， 其中每个修饰独立地选 自：
     a) 用修饰的核苷酸间桥接代替位于核苷酸 3’ 和 / 或 5’ 端的磷酸二酯核苷酸间桥 接，
     b) 用去磷酸桥接代替位于核苷酸 3’ 和 / 或 5’ 端的磷酸二酯桥接，
     c) 用另一个单元代替糖磷酸盐骨架的糖磷酸盐，
     d) 用修饰的糖单元代替 β-D- 核糖， 以及
     e) 用修饰的核苷酸碱基代替天然核苷酸碱基。
     寡核苷酸的化学修饰的更详细的实施例如下所述。
     位于核苷酸 3’端和 / 或 5’端的磷酸二酯核苷酸间桥接可以被修饰的核苷酸 间桥接取代， 其中所述修饰的核苷酸间桥接例如可以选自硫代磷酸酯， 二硫代磷酸酯， 1 2 NR R - 氨基磷酸酯， boranophosphate， α- 羟苄基膦酸酯， 磷酸盐 -(C1-C21)-O- 烷基酯， 磷酸 盐 -[(C6-C12) 芳基 -(C1-C21)-O- 烷基 ] 酯， (C1-C8) 膦酸烷基酯和 / 或 (C6-C12) 磷酸芳基酯桥 接， (C7-C12)-α- 羟甲基 - 芳基 ( 例如 WO95/01363 中公开的 )， 其中 (C6-C12) 芳基， (C6-C20) 1 2 芳基和 (C6-C14) 芳基可选择地被卤素， 烷基， 烷氧基， 硝基， 氰基取代， 其中 R 和 R 独立地是 氢， (C1-C18)- 烷基， (C6-C20)- 芳基， (C6-C14)- 芳基 -(C1-C8)- 烷基， 优选的是氢， (C1-C8)- 烷 1 2 基， 优选的是 (C1-C4)- 烷基和 / 或甲氧乙基， 或者 R 和 R 与携带它们的氮原子一起形成 5-6- 元杂环， 所述杂环还可以进一步含有选自 O， S 和 N 的杂原子。
     位于核苷酸 3’ 端和 / 或 5’ 端的磷酸二酯桥接被去磷酸桥接取代 ( 去磷酸桥接在 例如 Uhlmann E and Peyman A in“Methods inMolecular Biology” ， Vol.20， “Protocols for Oligonucleotides andAnalogs” ， S.Agrawal， Ed.， Humana Press， Totowa 1993， Chapter16， pp.355ff 有描述 )， 其中去磷酸桥接例如可以选自去磷酸桥接 formacetal， 3’ -thioformacetal， 甲基羟胺， 肟， 亚甲基二甲基肼撑， 二亚甲基砜和 / 或甲硅烷基团。
     糖磷酸盐骨架 ( 即糖磷酸盐骨架由糖磷酸盐单元组成 ) 上的糖磷酸盐单元 ( 即 β-D- 核糖和磷酸二酯核苷酸间桥接一起形成糖磷酸盐单元 ) 可以用另一个单元取代， 其 中另一个单元例如适合于构建 “吗啉代衍生物” 寡聚物 ( 如例如 Stirchak EP et al.(1989) Nucleic Acids Res 17 ： 6129-41 中所述 )， 也就是， 例如用吗啉代衍生物单元取代 ； 或者构 建聚酰胺核酸 ( “PNA” ； 如例如 NielsenPE et al.(1994)Bioconjug Chem 5 ： 3-7 中所述 )， 也就是用 PNA 骨架单元， 例如用 2- 氨乙基甘氨酸取代。
     β- 核糖单元或 β-D-2’ - 脱氧核糖单元可以被修饰的糖单元取代， 其中修饰的糖 单元例如选自 β-D- 核糖， α-D-2’ - 脱氧核糖， L-2’ - 脱氧核糖， 2’ -F’ -2’ - 脱氧核糖， 2’ -F- 阿拉伯糖， 2’ -O-(C1-C6) 烷基 - 核糖， 优选的 2’ -O-(C1-C6) 烷基 - 核糖是 2’ -O- 甲基 核糖， 2’ -O-(C2-C6) 烯基 - 核糖， 2’ -[O-(C1-C6) 烷基 -O-(C1-C6) 烷基 ]- 核糖， 2’ -NH2-2’ -脱 氧核糖， β-D- 木 - 呋喃糖， α- 阿拉伯呋喃糖， 2， 4- 二脱氧 -β-D- 赤 -6- 吡喃糖， 和碳环 ( 如例如 FroehlerJ(1992)Am ChemSoc 114 ： 8320 中所述 ) 和 / 或开环糖类似物 ( 如例如 Vandendriessche et al.(1993)Tetrahedron 49 ： 7223 中所述 ) 和 / 或二环糖类似物 ( 如 例如 Tarkov M et al.(1993)Helv Chim Acta 76 ： 481 中所述 )。
     在一些优选的实施方案中所述糖是 2’ -O- 甲基核糖， 特别是其中一个或全部核苷酸通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连。
     核酸还包括取代的嘌呤和嘧啶例如 C-5 丙炔嘧啶和 7- 去氮杂 -7- 取代的嘌呤修 饰的碱基。Wagner RW et al.(1996)NatBiotechnol 14 ： 840-4。嘌呤和嘧啶包括但不限于 腺嘌呤， 胞嘧啶， 鸟嘌呤， 和胸腺嘧啶， 以及其它天然或非天然存在的核碱基， 取代的和未取 代的芳香部分。
     修饰的碱基可以是与天然存在于 DNA 和 RNA 中的碱基例如 T， C， G， A 和 U 在化学性 质上不同， 但是与这些天然碱基在基本化学结构上相同的任何碱基。修饰的核苷酸碱基可 以是， 例如选自次黄嘌呤， 尿嘧啶， 二氢尿嘧啶， 假尿嘧啶， 2- 硫尿嘧啶， 4- 硫尿嘧啶， 5- 氨 基尿嘧啶， 5-(C1-C6)- 烷基尿嘧啶， 5-(C2-C6)- 烯基尿嘧啶， 5-(C2-C6)- 炔基尿嘧啶， 5-( 羟 甲基 ) 尿嘧啶， 5- 氯尿嘧啶， 5- 氟尿嘧啶， 5- 溴尿嘧啶， 5- 羟基胞嘧啶， 5-(C1-C6)- 烷基胞 嘧啶， 5-(C2-C6)- 烯基胞嘧啶， 5-(C2-C6)- 炔基胞嘧啶， 5- 氯胞嘧啶， 5- 氟胞嘧啶， 5- 溴胞嘧 2 啶， N - 二甲基鸟嘌呤， 2， 4- 二氨基 - 嘌呤， 8- 氮杂嘌呤， 取代的 7- 去氮杂嘌呤， 优选 7- 去 氮杂 -7- 取代的和 / 或 7- 去氮杂 -8- 取代的嘌呤， 5- 羟甲基胞嘧啶， N4- 烷基胞嘧啶， 例如 N4- 乙基胞嘧啶， 5- 羟基脱氧胞苷， 5- 羟甲基脱氧胞苷， N4- 烷基脱氧胞苷， 例如 N4- 乙基脱 氧胞苷， 6- 硫代脱氧鸟苷， 和硝基吡咯的脱氧核苷酸， C5- 丙炔嘧啶， 和二氨基嘌呤， 例如 2， 6- 二氨基嘌呤， 次黄嘌呤核苷， 5- 甲基胞嘧啶， 2- 氨基嘌呤， 2- 氨基 -6- 氯嘌呤， 次黄嘌呤 或其它对天然核苷酸碱基的修饰。这些列表只是举例说明而并非限制。
     在本文所述的特定通式中定义了一组修饰的碱基。例如字母 Y 用于表示含有胞嘧 啶或修饰的胞嘧啶的核苷酸。 这里所说的修饰的胞嘧啶是天然存在的或非天然存在的胞嘧 啶的嘧啶碱基类似物， 它可以取代该碱基而不会破坏所述寡核苷酸的免疫刺激活性。修饰 的胞嘧啶包括但不限于 5- 取代的胞嘧啶 ( 例如 5- 甲基 - 胞嘧啶， 5- 氟代 - 胞嘧啶， 5- 氯 代 - 胞嘧啶， 5- 溴代 - 胞嘧啶， 5- 碘代 - 胞嘧啶， 5- 羟基 - 胞嘧啶， 5- 羟甲基 - 胞嘧啶， 5- 二 氟甲基 - 胞嘧啶， 和未取代的或取代的 5- 炔基 - 胞嘧啶 )， 6- 取代的胞嘧啶， N4- 取代的胞 嘧啶 ( 例如 N4- 乙基 - 胞嘧啶 )， 5- 氮杂 - 胞嘧啶， 2- 巯基 - 胞嘧啶， 异胞嘧啶， 假 - 异胞 嘧啶， 具有稠环系统的胞嘧啶类似物 ( 例如 N， N’ - 丙烯胞嘧啶或吩恶嗪 )， 和尿嘧啶和它 的衍生物 ( 例如 5- 氟代 - 尿嘧啶， 5- 溴代 - 尿嘧啶， 5- 溴乙烯基 - 尿嘧啶， 4- 硫代 - 尿嘧 啶， 5- 羟基 - 尿嘧啶， 5- 丙炔基 - 尿嘧啶 )。一些优选的胞嘧啶包括 5- 甲基 - 胞嘧啶， 5- 氟 代 - 胞嘧啶， 5- 羟基 - 胞嘧啶， 5- 羟甲基 - 胞嘧啶， 和 N4- 乙基 - 胞嘧啶。在本发明的另一 个实施方案中， 所述胞嘧啶碱基被一般的碱基 ( 例如 3- 硝基吡咯， P- 碱基 )， 芳香环系统 ( 例如氟苯或二氟苯 ) 或氢原子 (dSpacer)。
     字母 Z 用于表示鸟嘌呤或修饰的鸟嘌呤碱基。这里所述的修饰的鸟嘌呤是天然存 在的或非天然存在的鸟嘌呤的嘌呤碱基类似物， 它可以取代该碱基而不会破坏所述寡核苷 酸的免疫刺激活性。修饰的鸟嘌呤包括但不限于 7- 去氮杂鸟嘌呤， 7- 去氮杂 -7- 取代的 鸟嘌呤 ( 例如 7- 去氮杂 -7-(C2-C6) 炔基鸟嘌呤 )， 7- 去氮杂 -8- 取代的鸟嘌呤， 次黄嘌呤， N2- 取代的鸟嘌呤 ( 例如 N2- 甲基 - 鸟嘌呤 )， 5- 氨基 -3- 甲基 -3H， 6H-thiazolo[4， 5-d] 嘧啶 -2， 7- 二酮， 2， 6- 二氨基嘌呤， 2- 氨基嘌呤， 嘌呤， 吲哚， 腺嘌呤， 取代的腺嘌呤 ( 例如 N6- 甲基 - 腺嘌呤， 8- 氧代 - 腺嘌呤 )8- 取代的鸟嘌呤 ( 例如 8- 羟基鸟嘌呤和 8- 溴代鸟 嘌呤 )， 和 6- 硫代鸟嘌呤。在本发明的另一个实施方案中， 所述鸟嘌呤碱基被一般的碱基 ( 例如 4- 甲基 - 吲哚， 5- 硝基 - 吲哚， 和 K- 碱基 )， 芳香环系统 ( 例如苯并咪唑或二氯 - 苯并咪唑， 1- 甲基 -1H-[1， 2， 4] 三唑 -3- 羧酸酰胺 ) 或者氢原子 (dSpacer)。
     所述寡核苷酸可以具有一个或多个可及的 5’ 末端。能够制备具有两个这样的 5’ 末端的修饰的寡核苷酸。这可以通过将两个寡核苷酸通过 3’ -3’ 连接相连起来产生 具有一个或两个可及的 5’ 末端的寡核苷酸。所述 3’ -3’ 连接可以是磷酸二酯， 硫代磷 酸酯或任意其它修饰的核苷酸间桥接。获得这种连接的方法是本领域已知的。例如， 这 种连接在 Seliger， H. ； et al.， Oligonucleotide analogswith terminal 3′ -3′ -and 5 ′ -5 ′ -internucleotidic linkages as antisenseinhibitors of viral gene expression， Nucleotides & Nucleotides(1991)， 10(1-3)， 469-77 and Jiang， et al.， Pseudo-cyclicoligonucleotides ： in vitro and in vivo properties， Bioorganic &Medicinal Chemistry(1999)， 7(12)， 2727-2735 中有描述。
     此外， 其中 3’ 末端核苷酸之间的连接并非磷酸二酯， 硫代磷酸酯或其它修饰的桥接 的 3’ -3’ 连接的核酸可以用另外的间隔基团制备， 例如三或四乙二醇磷酸盐部分 (Durand， M.et al， Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one(dA)12and two(dT)12sequences bridged by two hexaethylene glycolchains， Biochemistry(1992)， 31(38)， 9197-204， US Patent No.5658738， 和美国专利序列号 5668265)。另外， 非核苷酸 的连接子可以用标准的亚磷酰胺化学从乙二醇， 丙二醇， 或得自脱碱基脱氧核糖 (dSpacer) 单 元 (Fontanel， Marie Laurence et al.， Stericalrecognition by T4polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties5′ -attached to oligonucleotides ； Nucleic Acids Research(1994)， 22(11)， 2022-7) 获得。 非核苷酸连接子可以一次引入或多次引入， 或者彼此 组合以使要被连接的两个 ODN 的 3’ 末端之间具有任意希望的距离。
     为在本发明中使用， 本发明的寡核苷酸可以用本领域熟知的多种方法中的任何 一种进行合成。例如， b- 氰乙基亚磷酰胺方法 (Beaucage， S.L.， and Caruthers， M.H.， Tet.Let.22 ： 1859， 1981) ； 核苷酸 H- 膦酸盐方法 (Garegg et al.， Tet.Let.27 ： 4051-4054， 1986 ； Froehler et al.， Nucl.Acid.Res.14 ： 5399-5407， 1986， ； Garegg et al.， Tet.Let.27 ： 4055-4058， 1986， Gaffney et al.， Tet.Let.29 ： 2619-2622， 1988)。这些化学方法可以使用各 种市场上可获得的自动核酸合成仪进行操作。 这些寡核苷酸被称为合成寡核苷酸。 分离的寡 核苷酸通常是指从天然状态下与之结合的组分中分离出来的寡核苷酸。作为一个例子， 分离 的寡核苷酸可以是从细胞， 从核， 从线粒体或从染色质中分离出来。
     所述寡核苷酸对降解具有部分抗性 ( 例如是稳定的 )。 “稳定的寡核苷酸分子” 指 对于体内降解 ( 例如通过外切或内切核酸酶 ) 相对具有抗性的寡核苷酸。核酸稳定性可以 通过骨架修饰获得。具有硫代磷酸酯连接的寡核苷酸具有最大的活性， 保护所述寡核苷酸 不被细胞内的外切或内切核酸酶降解。其它修饰的寡核苷酸包括磷酸二酯修饰的核酸， 磷 酸二酯和硫代磷酸酯核酸的组合， 膦酸甲酯， 甲基硫代磷酸酯， 二硫代磷酸酯， 对乙氧基， 及 其组合。
     修饰的骨架例如硫代磷酸酯可以用自动方法用氨基磷酸酯或 H- 膦酸盐化学合 成。芳基和烷基膦酸盐可以用例如美国专利序列号 4,469,863 所述的方法制备 ； 烷基磷酸 三酯 ( 其中带电荷的氧用美国专利序列号 5,023,243 和欧洲专利序列号 092,574 中所述 的方法进行烷基化 ) 可以用商业可获得的试剂用自动固相合成制备。制备其它 DNA 骨架 修饰和取代的方法已有描述 ( 例如 Uhlmann， E.and Peyman， A.， Chem.Rev.90 ： 544， 1990 ；Goodchild， J.， Bioconjugate Chem.1 ： 165， 1990)。
     其它稳定的寡核苷酸包括 ： 非离子的 DNA 类似物， 例如烷基和芳基磷酸盐 ( 其中带 电荷的膦酸盐氧被烷基或芳基基团取代 )， 磷酸二酯和烷基磷酸三酯， 其中带电荷的氧被烷 基化。 含有二醇的核酸， 例如四乙二醇或六乙二醇， 其每个或全部末端都可以抵抗核酸酶降 解。
     所述免疫刺激寡核苷酸还可以在核苷酸或核苷酸类似物部分之间含有一个或多 个通常的连接。所述通常的核苷间连接是 3’ 5’ 连接。所有其它连接都认为是核苷间连接， 例如 2’ 5’ -， 5’ 5’ -， 3’ 3’ -， 2’ 2’ -， 2’ 3’ - 连接。因此， 术语 2’ 到 5’ 是根据核糖的碳原 子选择的。但是， 如果使用的是非天然糖分子， 例如具有扩大环的糖类似物 ( 例如六环糖， 环己烯或吡喃糖 ) 或双环或三环糖类似物， 然后其命名随单体的名称而变化。在 3’ -脱 氧 -β-D- 吡喃核糖类似物 ( 也称为 p-DNA) 中， 单核甘酸例如通过 4’ 2’ - 连接相连。
     如果所述核苷酸含有一个 3’ 3’ - 连接， 那么这种寡核苷酸类似物具有两个未连接 的 5’ - 末端。类似地， 如果所述核苷酸含有一个 5’ 5’ - 连接， 那么这种寡核苷酸类似物具 有两个未连接的 3’ - 末端。这些未连接的核苷酸末端可能更容易被它们的受体捕获。这两 种特殊的连接 (3’ 3’ - 和 5’ 5’ -) 如 Ramalho Ortigao et al. 所述 (Antisense Research and Development(1992)2， 129-46)， 其中具有 3’ 3’ - 连接的寡核苷酸据报道对核酸酶的切 割显示出增强的稳定性。
     在一个分子中也可以组合不同类型的连接， 这可能导致寡聚物的分枝。如果所述 寡核苷酸的一部分在 3’ - 末端通过 3’ 3’ - 连接与第二个寡核苷酸部分相连， 在 2’ - 末端通 过 2’ 3’ - 连接与所述分子的第三个部分相连， 将会得到例如具有三个 5’ - 末端 (3’ 3’ -， 2’ 3’ - 分枝 ) 的分枝的寡核苷酸。
     理论上， 寡核苷酸的不同部分之间或者不同的寡核苷酸之间分别是通过所述分子 的所有部分连接起来的， 只要不会干扰其受体的识别。 根据所述核酸的性质， 所述连接可以 包括糖分子 (Su)， 杂环核碱基 (Ba) 或磷酸骨架 (Ph)。因此 Su-Su， Su-Ph， Su-Ba， Ba-Ba， Ba-Su， Ba-Ph， Ph-Ph， Ph-Su， 和 Ph-Ba 类型的连接都是有可能的。如果所述寡核苷酸进一 步由特定的非核苷酸的取代基修饰， 还可以通过寡核苷酸修饰部分进行连接。这些修饰还 包括修饰的核酸， 例如 PNA， LNA， 或吗啉代寡核苷酸类似物。
     所述连接优选由 C， H， N， O， S， B， P 和卤素组成， 含有 3 到 300 个原子。具有 3 个 原子的实例是乙缩醛连接 (ODN1-3’ -O-CH2-O-3’ -ODN2 ； Froehler and Matteucci)， 将一 个核苷酸的 3’ - 羟基与第二种寡核苷酸的 3’ - 羟基连接起来。具有 300 个原子的实例 是 PEG-40( 聚乙二醇四十 )。优选的连接是磷酸二酯， 硫代磷酸酯， 膦酸甲酯， 氨基磷酸酯， boranophosphoate， 酰胺， 乙醚， 硫醚， 乙缩醛， 硫缩醛， 脲， 硫脲， 磺酰胺， Schiff’ s 碱基和二 硫键。另一种可能是使用 Solulink BioConjugation 系统 (www.trilinkbiotech.com)。
     如果所述寡核苷酸由两个或多个序列部分组成， 这些部分可以是相同的或是不同 的。 因此， 在具有 3’ 3’ - 连接的寡核苷酸种， 序列可以是相同的 5′ -ODN1-3′ 3′ -ODN1-5′ 或是不同的 5′ -ODN1-3′ 3′ -ODN2-5′。而且， 各个寡核苷酸部分的化学修饰以及它们 的连接部分可以是不同的。由于短寡核苷酸的吸收似乎比长寡核苷酸更差， 将两个或多个 短序列连接起来可以获得提高的免疫刺激效果。短寡核苷酸的长度优选是 2-20 个核苷酸， 更优选是 3-16 个核苷酸， 最优选是 5-10 个核苷酸。优选的连接起来的寡核苷酸具有两个或多个未连接的 5’ 末端。
     所 述 寡 核 苷 酸 的 部 分 序 列 还 可 以 用 非 核 苷 酸 连 接 子， 特别是脱碱基连接子 (dSpacer)， 三乙烯单位或六乙二醇单位连接。更优选的连接子是烷氨基连接子， 例如 C3， C6， C12 氨基连接子， 以及烷基硫醇连接子， 例如 C3 或 C6 硫醇连接子。 所述寡核苷酸还可以 通过芳香残基连接起来， 所述芳香残基还可以进一步被烷基或取代的烷基基团取代。所述 寡核苷酸还可以含有二倍体或三倍体单位 (www.genres.com)， 特别是那些具有 3’ 3’ - 连接 的寡核苷酸。由多个二倍体， 三倍体， 或其它多倍体单位造成的寡核苷酸的树枝状大分子， 这也是本发明的一个实施方案。 所述寡核苷酸还可以含有通过肽修饰试剂或寡核苷酸修饰 试剂得到的连接子单位 (www.glenres.com)。 进一步， 它还可以含有一个或多个天然的或非 天然的由肽 ( 酰胺 ) 键连接起来的氨基酸残基。
     另一种寡核苷酸连接是通过杂环碱基的交联 (Verma andEckstein ； Annu.Rev. Biochem.(1998)67 ： 99-134 ； page 124)。还有一种是一个序列部分的糖分子和另一个 序列部分的杂环碱基之间的连接 (Iyer et al.Curr.Opin.Mol.Therapeutics(1999)1 ： 344-358 ； page 352)。
     不同的寡核苷酸可以通过已知方法合成， 可以在固相合成过程中直接连接。 另外， 它们还可以在单个部分的序列合成以后再连接起来。 “受试体” 指人或脊椎动物， 包括但不限于狗， 猫， 马， 牛， 猪， 绵羊， 山羊， 鸡， 非人的 灵长类动物 ( 例如猴 )， 鱼 ( 水产养殖种类， 例如鲑鱼 )， 兔， 大鼠和小鼠。
     “具有病毒感染的受试体” 是指暴露于病毒中并且具有急性或慢性症状或体内具 有可检测到的病毒的受试体。在本发明的优选实施方案中， 所述受试体是具有慢性病毒感 染， 更优选是慢性丙型肝炎感染的受试体。 在本发明的重要方面， 所述受试体是对先前的丙 型肝炎感染治疗没有反应的受试体。例如， 没有反应的受试体包括先前用例如 IFN-a( 例如 内含子 (Intron A)) 治疗丙型肝炎感染但是没有成功的受试体， 如本文所述的。本发明包 括治疗没有反应的受试体， 在一些实施例中包括鉴别没有反应的受试体， 以挑选有效的治 疗方法。
     免疫刺激核酸在任何脊椎动物中都是有效的。 不同的免疫刺激核酸可能产生的最 佳免疫刺激效果随哺乳动物种类的不同而不同。 因此在人中引起最佳刺激效果或抑制的免 疫刺激核酸不一定在小鼠中也能引起最佳刺激效果或抑制， 反之亦然。本领域技术人员能 够通过本文所述的和 / 或本领域公知的常规检测， 根据本文给出的教导确定可用于感兴趣 的特定哺乳动物种类的最合适的免疫刺激核酸。
     所述免疫刺激寡核苷酸可以直接给受试体施用或者可以与核酸递送复合体一起 施用。 “核酸递送复合体” 指核酸分子与靶定工具 ( 例如能导致与靶细胞 ( 例如 pDC 或 B 细 胞 ) 有更高亲和力和 / 或能增强靶细胞吸收的分子 ) 相结合 ( 例如离子或共价结合 ； 或制 成胶囊 )。核酸递送复合体的实例包括核酸与甾醇 ( 例如胆固醇 )， 脂类 ( 例如阳离子脂， 病毒颗粒或脂质体 )， 或靶细胞特异的结合试剂 ( 例如能被靶细胞特异的受体识别的配体 ) 相结合。 优选的复合体在体内应足够稳定， 以防止在被靶细胞内在化以前就显著地解离。 但 是， 复合体在细胞内适当的条件下应当是能解离的， 使得所述寡核苷酸能释放出其功能形 式。
     所述免疫刺激寡核苷酸或其它治疗剂可以单独给药 ( 例如在盐水或缓冲液中 ) 或
     者用本领域已知的任何递送载体给药。例如已有关于下述递送载体的描述 ： 螺旋体 ； 乳化 剂； ISCOM ； 脂质体 ； 活细菌载体 ( 例如沙门氏菌， 大肠杆菌， Bacildzscalfnatte-guerin， 志贺氏菌， 乳酸菌 ) ； 活病毒载体 ( 例如牛痘， 腺病毒， 单纯疱疹 ) ； 微球 ； 核酸疫苗 ； 聚合物 ( 例如羧甲基纤维素， 甲壳素 ) ； 聚合物环 ； 蛋白体 ； 氟化钠 ； 转基因植物 ； 病毒颗粒 ； 病毒样 粒子。本领域技术人员应当认识到其它递送载体是本领域已知的， 也可以使用。
     结合本文所提供的教导， 通过选择各种活性化合物和加权因子例如功效， 相关生 物可获得性， 受试体体重， 副作用的严重程度和优选的给药方式， 可以选择一种有效的治疗 性治疗方案， 不致引起严重的毒性并且还能完全有效地治疗上述的特定受试体。任何特定 应用的有效量随各种因子的不同而不同， 这些因子如要治疗的疾病或状况， 待给药的特定 的免疫刺激寡核苷酸 ( 例如 CpG 免疫刺激核酸的种类， 未甲基化 CpG 基序的数目或它们在 所述核酸中的位置， 所述寡核苷酸的手性程度等 )， 是否也进行抗原给药以及抗原的特性， 受试体的体格大小， 或者所述疾病或状况的严重程度。本领域普通技术人员无需过度的实 验就能够根据经验确定特定免疫刺激寡核苷酸和 / 或其它治疗剂的有效量。
     对于成年人受试体， 本文所述的所述免疫刺激核酸化合物的剂量典型地是大约 50μg/ 剂量到 20mg/ 剂量， 更典型地是大约 80μg/ 剂量到 8mg/ 剂量， 最典型地是大约 800μg/ 剂量到 4mg/ 剂量。按照受试体体重确定的典型剂量是大约 0.5 到 500μg/kg/ 剂 量， 更典型的是大约 1 到 100μg/kg/ 剂量， 最典型地是大约 10 到 50μg/kg/ 剂量。剂量所 依据的因素包括给药方式， 例如口服给药可能比皮下给药需要更大的剂量。
     本发明的配方是以药学可接受的溶液给药， 通常包括药学可接受浓度的盐， 缓冲 试剂， 防腐剂， 相容的载体， 佐剂和任选的其它治疗成分。
     所述免疫刺激核酸可以与本领域公知的其它可用于治疗病毒感染的试剂一起给 药。具有特别重要意义的是免疫刺激核酸与抗病毒试剂例如 IFN-α 的组合， 如实施例部分 所证明的， 产生协同反应。免疫刺激核酸可以用作病毒唑的替代物， 后者目前是与 IFN-α 一起给药。 目前与 IFN-α 一起使用或者正在研究其与 IFN-α 一起使用的试剂包括金刚胺， 和细胞因子， 包括 IL-2， IL-10， IL-12， 和 IFN-γ。
     抗病毒试剂是能防止细胞被病毒感染或病毒在细胞内复制的化合物。 抗病毒药物 比抗细菌药物少的多， 因为病毒复制的过程与宿主细胞内 DNA 的复制非常地接近， 以至于 非特异性的抗病毒剂通常对宿主都有毒性。病毒感染过程中有几个阶段可被抗病毒剂阻 断或抑制。这些阶段包括， 病毒与宿主细胞接触 ( 免疫球蛋白或结合肽 )， 病毒的脱壳 ( 例 如金刚胺 )， 病毒 mRNA 的合成或翻译， 包括翻译起始 ( 例如干扰素， 反义， 和核酶 )， 病毒酶 ( 例如非结构性丝氨酸蛋白酶， RNA 聚合酶， 逆转录酶和解螺旋酶 )， 病毒 RNA 或 DNA 的复 制 ( 例如核苷类似物 )， 新病毒蛋白的成熟 ( 例如蛋白酶抑制剂如 Boehringer Ingelheim 的丝氨酸蛋白酶抑制剂 BILN2061ZW)， 抗氧化剂例如 Livfit(USP6,136,316)， 以及病毒的 出芽和释放。其它抗病毒试剂如 USP6,130,326， 和 6,440,985， 以及公开的美国专利申请 20020095033 中所述。病毒唑类似物也包括在本发明的抗病毒试剂中。
     核苷酸类似物是与核苷酸类似， 但是具有不完整的或异常的脱氧核糖或核糖基团 的合成化合物。一旦细胞中存在核苷酸类似物， 它们会被磷酸化， 产生三磷酸形式， 与正常 的核苷酸竞争加入病毒 DNA 或 RNA。一旦核苷酸类似物的三磷酸形式加入到生长的核酸链 中， 它就会与病毒聚合酶不可逆地结合， 使链终止。免疫球蛋白治疗典型地用于病毒感染的预防， 但也可以用于减少循环的病毒的水 平并防止新形成的细胞被感染。病毒感染的免疫球蛋白治疗与细菌感染不同， 因为免疫球 蛋白并不是抗原特异性的， 而是与细胞外的病毒粒子结合， 防止它们粘附并进入可能被病 毒感染的细胞。所述治疗可用于在宿主中存在抗体的时期减少病毒败血症。通常有两种类 型的免疫球蛋白治疗， 正常的免疫球蛋白治疗和超免疫球蛋白治疗。正常的免疫球蛋白治 疗是用正常血液供体的血清制备并汇集的抗体产物。 这种汇集的产物包含针对多种人体病 毒， 例如甲型肝炎， 细小病毒， 肠道病毒 ( 特别是新生儿 ) 的低滴度的抗体。为了对 HCV 进 行正常免疫球蛋白的治疗， 应当从以前感染过 HCV 但是没有能自发地或是用一些形式的治 疗成功清除感染的人获取血清。 超免疫球蛋白治疗使用由具有针对特定病毒的高滴度抗体 的个体的血清制备的抗体。 然后可将这些抗体用于抵抗特异的病毒。 对于 HCV， 超免疫球蛋 白可以通过给志愿者接种重组 HCV 蛋白以产生丙型肝炎免疫球蛋白来制备。
     其 它 适 用 于 本 发 明 的 方 法 的 抗 病 毒 剂 由 TrianglePharmaceuticals， Inc.， Gilead， ICN， Procter and Gamble andViroPharma Incorporated 制造。
     为在治疗中使用， 所述免疫刺激寡核苷酸的有效量可以以任何能将所述寡核苷酸 递送到所希望的表面， 例如粘膜， 系统的方式给予受试体。 本发明的药物组合物的 “给药” 可 以使用任何技术人员所公知的方法。给药的优选方法包括但不限于口服， 肠胃外， 肌肉内， 鼻内， 舌下， 气管内， 吸入， 眼内， 阴道内， 和直肠内。
     口服给药的时候， 所述化合物 ( 即免疫刺激寡核苷酸， 或其它治疗剂 ) 可以容易地 通过将活性化合物与本领域熟知的药学可接收的载体混合起来配制。 这种载体使本发明的 化合物可配制成片剂， 丸剂， 糖衣丸， 胶囊， 液体， 凝胶， 糖浆， 淤浆， 悬液等等， 可使受到治疗 的受试体口服吸收。 口服使用的药物制剂可以用固体赋形剂， 任选地研磨成最终的混合物， 处理各个微粒的混合物， 加入合适的助剂， 如果希望的话， 可以获得片剂或糖衣丸。合适的 赋形剂特别可以是填充剂例如糖， 包括乳糖， 蔗糖， 甘露醇， 或山梨醇 ； 纤维素制剂例如玉米 淀粉， 小麦淀粉， 稻淀粉， 马铃薯淀粉， 白明胶， 黄蓍胶， 甲基纤维素， 羟丙基甲基纤维素， 羧 甲基纤维素钠， 和 / 或聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)。 如果希望的话， 还可以加入分解剂， 例如交联 聚乙烯吡咯烷酮， 琼脂， 或褐藻酸或其盐， 例如褐藻酸钠。 任选地， 口服配方还可以配制在盐 水或缓冲液中以中和内部的酸性条件， 或者也可以不用任何载体给药。
     糖衣药丸核具有合适的包覆层。为此目的可使用浓缩的糖溶液， 其任选地含有阿 拉伯胶， 滑石粉， 聚乙烯吡咯烷酮， 聚羰乙烯凝胶， 聚乙二醇， 和 / 或二氧化钛， 漆溶液， 和合 适的有机溶剂或溶剂混合物。 还可以向片剂或糖衣药丸包覆层中加入染料或色素以识别或 表征不同的活性化合物剂量的组合。
     可以口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推入配合的胶囊， 以及由明胶制成的 软的密封的胶囊和增塑剂， 例如甘油或山梨醇。推入配合的胶囊包括混合物中的活性成分 以及填充物例如乳糖， 粘合剂例如淀粉， 和 / 或润滑剂例如滑石或硬脂酸镁以及任选地稳 定剂。 在软胶囊中， 活性化合物可以在合适的液体， 例如脂肪油， 液体石蜡， 或液体聚乙二醇 中溶解或悬浮。此外， 可以加入稳定剂。口服给药可以配制成微球。本领域中已知这种微 球。口服给药的所有配方的剂量应当适用于这种给药方式。
     对于颊给药， 所述组合物可用传统方法配制成片剂或锭剂。
     对于吸入式给药， 根据本发明可使用的化合物可以方便地以压力罐或喷雾器中产生的喷雾剂的形式递送， 并使用合适的推进剂， 例如二氯二氟甲烷， 三氯氟甲烷， 二氯四氟 乙烷， 二氧化碳或其它合适的气体。 使用压力喷雾剂的时候， 剂量单位可以用泵确定并递送 计量好的量。 吸入器或吹入器中使用的例如明胶的胶囊和药筒可以配制为含有化合物的粉 末混合物和适当的粉末基底例如乳糖或淀粉。
     当希望系统递送的时候， 所述化合物可以配制成通过注射， 例如通过高剂量注射 或连续输注进行肠胃外给药。 注射的配方可以制成单位剂型， 例如安瓿瓶或多剂量容器， 并 加入防腐剂。 所述组合物可以制成油质载体或水质载体中的悬液， 溶液或乳液的形式， 可以 含有配方剂例如悬浮， 稳定和 / 或分散试剂。
     肠胃外给药的药物配方包括水溶形式的活性化合物的水溶液。此外， 活性化合物 的悬液可以制成适当的油质注射悬液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油例如芝麻油， 或合成的脂肪酸酯， 例如油酸乙酯或甘油三酸酯， 或脂质体。 水质注射悬液可以含有能增加 悬液粘性的物质， 例如羧甲基纤维素钠， 山梨醇， 或右旋糖苷。 任选地， 所述悬液还可以含有 合适的稳定剂或能增强所述化合物的溶解性以制备高浓度溶液的试剂。
     可选择地， 所述活性化合物可以是粉末形式， 在使用前与合适的载体， 例如无菌的 不含热源的水组合。
     所述化合物还可以制成直肠或阴道组合物例如栓剂或保留灌肠， 例如含有传统的 栓剂基剂例如可可油或其它甘油酯。
     除了上述的配方， 所述化合物还可以制成长效制剂。这种长期作用的配方可以用 合适的聚合物或疏水物质 ( 例如在可接收的油中作为乳化剂 ) 或离子交换树脂配制， 或制 成微溶的衍生物， 例如微溶的盐。
     所述药物组合物还可以包括合适的固体或凝胶相的载体或赋形剂。 这种载体或赋 形剂的实例包括但不限于碳酸钙， 磷酸钙， 各种糖， 淀粉， 纤维素衍生物， 明胶， 和聚合物例 如聚乙二醇。
     合适的液体或固体药物制剂形式是， 例如吸入用的水或盐溶液， 微胶囊， 螺旋体， 被微金颗粒包裹， 包含在脂质体中， 喷雾剂， 气溶胶， 植入皮肤的小球， 或在尖锐物体上干燥 以擦入皮肤。所述药物组合物还可以包括微粒， 粉末， 片剂， 包衣片剂， ( 微 ) 胶囊， 栓剂， 糖浆， 乳液， 悬液， 霜剂， 液滴或延长活性化合物释放的制剂， 如上所述， 在这些制剂中照例 使用赋形剂和添加剂和 / 或助剂例如分解剂， 粘合剂， 包覆剂， 溶胀剂， 润滑剂， 调味剂， 甜 味剂或增溶剂。所述药物组合物适用于各种药物递送系统。药物递送的方法综述， 参见 Langer， Science 249 ： 1527(1990)， 在此引入其全文作为参考。
     所述免疫刺激寡核苷酸可以用其本身 ( 纯的 ) 或以药学可接收的盐的形式给 药。当用于药物的时候， 盐应当是药学可接收的， 但是非药学可接收的盐也可以用于制备 药学可接收的盐。这种盐包括但不限于那些用下述酸制备的盐 ： 盐酸， 氢溴酸， 磺酸， 硝酸， 磷酸， 马来酸， 乙酸， 水杨酸， 对甲苯硫酸， 酒石酸， 柠檬酸甲烷磺酸， 甲酸， 丙二酸， 琥珀酸， 萘 -2- 磺酸， 和苯磺酸。而且， 这些盐可以制成碱金属或碱土金属盐， 例如羧酸基团的钠， 钾 或钙盐。
     合适的缓冲剂包括 ： 乙酸及其盐 (1-2 ％ w/v) ； 柠檬酸及其盐 (1-3 ％ w/v) ； 硼 酸及其盐 (0.5-2.5 ％ w/v) ； 和磷酸及其盐 (0.8-2 ％ w/v)。合适的防腐剂包括苯扎氯铵 (0.003-0.03％ w/v) ； 氯代丁醇 (0.3-0.9％ w/v) ； 对羟基苯甲酸酯类 (0.01-0.25％ w/v) 和硫柳汞 (0.004-0.02％ w/v)。
     本发明的药物组合物含有药学可接收的载体。 术语 “药学可接收的载体” 是指一种 或多种适用于给人和其它脊椎动物施用的相容的固体或液体填充剂， 稀释剂或封装物质。 术语 “载体” 指有机或无机成分， 天然的或是合成的， 它们与活性成分组合在一起有利于使 用。所述药物组合物的组分还可以与本发明的化合物互相混和， 条件是它们之间没有能破 坏所需的药物功效的相互作用。
     可以使用各种给药方式。特定给药方式的选择取决于所选择的特定佐剂或抗原， 要治疗的特定状况以及疗效所需要的剂量。 本发明的方法， 总的来说， 可以使用医药上可接 受的任何给药方式实施， 就是指任何能产生有效水平的免疫反应而不引起临床上不可接受 的副作用的任何方式。优选的给药方式如上所述。
     所述组合物可以方便地制成单位剂量的形式， 可以用药学领域熟知的方法制备。 所有方法都包括将所述化合物与组成一种或多种附属成分的载体结合的步骤。通常， 所述 组合物的制备是通过均匀紧密地将所述化合物与液体载体， 粒状的固体载体， 或二者结合， 然后， 如果需要的话， 使产品成形。液体剂量单位是小药水瓶或安瓿瓶。固体剂量单位是片 剂， 胶囊和栓剂。为了治疗受试体， 依据所述化合物的活性， 给药的方式， 免疫的目的 ( 即预 防性的或是治疗性的 )， 疾病的特征和严重程度， 受试体的年龄和体重不同， 需要不同的剂 量。给定剂量的给药可以以单次剂量单位的形式单次给药或者几次小剂量单位给药。
     其它递送系统包括定时释放， 延迟释放或持续释放递送系统。这种系统可以避免 所述化合物重复给药， 为受试体和医师提供方便。许多类型的释放递送系统都是可用的也 是本领域普通技术人员公知的。 包括基于聚合物的系统例如聚 ( 丙交酯 - 乙交酯 )， 共聚草 酸盐， 聚酐。 含有上述聚合物的微胶囊的药物如例如美国专利 5,075,109 中所述。 递送载体 还包括非聚合物系统 ： 脂类包括固醇例如胆固醇， 胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪例如单， 双 和三甘油酯 ； 水凝胶释放系统 ； 硅橡胶系统 ； 基于肽的系统 ； 蜡包覆层 ； 用传统的粘合剂和 赋形剂制作的压缩片剂 ； 部分融合的植入物 ； 等等。特定的例子包括但不限于 ： (a) 侵蚀系 统， 其中本发明的试剂包含在如美国专利序列号 4,452,775， 4,675,189， 和 5,736,152 所述 的基质中， (b) 扩散系统， 其中所述活性组分以可控速度从如美国专利序列号 3,854,480， 5,133,974 和 5,407,686 所述的聚合物中透出。此外， 还可以使用基于泵的硬件递送系统， 其中一些适于植入。
     在一些实施方案中， 所述免疫刺激核酸被修饰。 在特定的实施方案中， 所述免疫刺 激核酸具有具有至少一个可抵抗核酸酶降解的核苷酸间连接的修饰的骨架。 可抵抗核酸酶 降解的核苷酸间连接可选自硫代磷酸酯连接， 二硫代磷酸酯连接， 膦酸甲酯连接和肽连接。 在特定的实施方案中修饰的免疫刺激核酸包括至少一个核苷酸类似物或者至少一个核苷 酸类似物。 在特定的实施方案中所述免疫刺激核酸是回文结构， 在其它实施方案中， 所述免 疫刺激核酸不是回文结构。在一些优选的实施方案中所述免疫刺激核酸的长度在 8 到 100 个核苷酸之间， 在其它优选的实施方案中， 所述免疫刺激核酸的长度在 12 到 40 个核苷酸之 间。优选的大小， 序列和修饰将在下面详细讨论。
     下述实施例是为了举例说明而并非限制本发明的范围。 实施例本研究的目的是为了评价不同类型的 CpG ODN 刺激 HCV 慢性携带者的 PBMC 的能 力。PBMC 是从正常的健康的志愿者以及 HCV 慢性携带者的全血中分离的， 评价不同类型 的 CpG ODN 以及柔性和半柔性分子在体外刺激 B 细胞增殖， 细胞因子分泌 (IFN-g， TNF-α， IL-10 和 IFN-α) 和趋化因子分泌 (IP-10) 的能力。
     还评价了外源 IFN-α-2b( 内含子 A(Intron A)) 和病毒唑分别单独， 以及互相组 合， 以及与 CpG ODN(B 和 C 类 ) 组合的免疫刺激效果。
     材料与方法
     寡核苷酸
     所 有 的 寡 核 苷 酸 原 料 重 悬 于 pH 8.0 的 TE 缓 冲 液 (OmniPerg ； EM Science， Gibbstown， NJ) 中。不同的 ODN 在用于细胞检测之前稀释于含有 10％加热灭活的正常人 AB 血清 (Wisent Inc， St.Bruno， QC) 和 1％青霉素 / 链霉素 (Gibco BRL， Grand Island， NY) 的 RPMI 1640 完全培养基 (Gibco BRL， Grand Island， NY) 中。对于外源 IFN-α 协同实 验， 将内含子 A(Intron A)(InterferonAlfa-2b， DIN 02223406， Schering Canada Inc.， Pointe-Claire， Quebec， Canada) 加入到 ODN 溶液中使其终浓度为 125 或 1000IU/ml。病毒 唑 (CAS 36791-04-5， Calbiochem， CN Biosciences Inc.， La Jolla， CA， USA) 用无菌蒸馏 水重新配制得到 500μm 储液， 在上述培养基中稀释， 使其在孔中的终浓度为 5μm。将细胞 在 37℃与 5％ CO2 一起培育。48 小时后收集每个孔中的细胞上清， 冷冻于 -80℃。
     实验中所用的 ODN 如下表所示 ： 表2： 实验中所用的寡核苷酸序列
     在寡核苷酸骨架中用磷酸二酯键代替硫代磷酸酯键则用 (-) 表示
     PBMC 的分离
     用静脉穿刺从十个 (10) 正常的健康的成年人和十五个 (15) 具有慢性 HCV 感 染 并 且 以 前 有 过 6 个 月 的 IFN-α 治 疗 但 治 疗 失 败 或 复 发 的 成 年 人 受 试 体 中 收 集 全 血 (200ml) 并 存 于 肝 素 化 的 绿 色 盖 子 的 真 空 容 器 中。 在 Ficoll-Hypaque(Amersham PhannaciaBiotech， Uppsala， Sweden) 上以 400×g 的速度离心 35 分钟纯化外周血单核细 胞 (PBMC)。将细胞重悬于含有 10％正常人 AB 血清 ( 加热灭活 ) 和 1％青霉素 / 链霉素的 RPMI 完全培养基中， 浓度为 10×106/ml。
     B 细胞增殖
     如上所述分离细胞并重悬于完全 RPMI 培养基中， 浓度为 1×106/ml， 向圆底 96 孔 板的每个孔中加入 100μl 细胞。 向孔中加入 ODN(100μl) 以得到所选范围的终浓度 (1， 3， 3 6μg/ml)。将细胞培养 5 天， 然后用 H- 胸腺嘧啶核苷 (1μCi/ 孔 ) 脉冲标记 18 小时， 然 后收集到滤纸上检测放射活性。结果表示为与未处理培养基对照相比的刺激指数 (SI)。
     细胞因子检测
     将新分离的 PBMC 以 10×106/ml 的浓度 (2× 终浓度 ) 重悬， 向含有等体积的 ODN 溶液 (2× 最终希望的浓度 ) 的平底 96 孔板的每个孔中加入 100μl 细胞。每种 ODN 在一 定范围的浓度 (1， 3， 6μg/ml) 下检测。将细胞在 37℃与 5％ CO2 一起培育。48 小时后收集
     33*101948835 A CN 101948837说明书32/43 页每个孔中的细胞上清， 冷冻于 -80℃直至检测。
     用商业 ELISA 试剂盒 (R & D Systems， Minneapolis， MN， USA ； IP-10， Cat# ； DIP 100， IL-10， Cat#D1000， IFN-g Cat#DIF50 或 PBL Biomedical， IFN-αCat#4110S) 检测上清 中 IFN-α， IP-10， IL-10 和 IFN 的水平。当检测的 ELISA 值低于制造商说明的试剂盒的检 测下限的时候， 数据表中将其表示为等同于可检测到的下限的值。
     结果
     将从 15 个慢性 HCV 感染受试体和 10 个正常的健康志愿者中收集到的血液中分离 的 PBMC 在 37℃与不同类型的 CpG( 例如 A 类， B 类， C 类， 柔性 C 类， 半柔性 B 类和半柔性 C 类 ) 一起培育， 检测细胞上清液中是否存在细胞因子， 以表明培育期间是否分泌细胞因子。 这些实验的结果如下所示。
     PBMC 对 IFN-α 分泌的诱导
     当检测三类 CpG ODN 对于正常志愿者的 PBMC 的作用的时候， A 类 (CpG SEQ ID NO ： 1) 产生非常高水平的 IFN-α， C 类 (CpG SEQ ID NO ： 4) 产生中等高水平， B 类 (CpG SEQ ID NO ： 2) 仅诱导低水平 ( 图 1)。IFN-α 的主要细胞来源是 pDC。
     对于从 HCV 慢性携带者获得的 PBMC， 所有三类 CpG 都能诱导 IFN-α 分泌。B 类和 C 类诱导的水平与正常 PBMC 的结果相同。相反， A 类诱导的水平仅有正常水平的 50％ ( 图 1)， 这表明 HCV 感染的 pDC 的功能的丧失对 A 类 CpG 诱导 IFN-α 的效果有些影响， 但是不 影响 C 类。因此， A 或 C 类 CpG 可用于治疗 HCV 慢性携带者， 但是在某些实施例中优选使用 C 类。
     用 FACS 分析测定 pDC 的数目。对此进行线性退化分析， 并与 A 和 C 类 CpG ODN 诱 导的 IFN-α 分泌的量比较， 发现正常受试体具有合理的相关性 ( 例如分别是 R ＝ 0.43 和 0.58)。进一步发现 C 类 ODN 的相关性略好。相反， 在 HCV 感染受试体中 pDC 数目与 IFN-α 分泌的量之间没有观察到相关性 ( 分别是 R ＝ 0.02 和 0.08)( 图 3)。但是 HCV 感染的 DC 仍然能够对 CpG ODN 做出反应， 分泌 IFN-α。
     还分析了这些 ODN 的柔性和半柔性变化形式的效果。柔性分子的合成是在该分子 的中间区域具有一排磷酸二酯键。半柔性分子的合成是在 CpG 基序的胞嘧啶和鸟嘌呤核苷 酸之间具有一个或多个单个的磷酸二酯键。柔性 ( 图 3) 和半柔性 ( 图 4)C 类 CpG ODN 都 能够以与原始 C 类 CpG ODN 类似的方式刺激正常或 HCV PBMC 的 IFN-α 分泌。几种半柔性 C 类 CpG ODN 甚至比常规的 C 类 CpG SEQ ID NO ： 4 更有效 ( 图 4)。这可能是因为该分子仍 然足够稳定， 可以有最大的免疫刺激效果， CpG 基序中部的磷酸二酯增加了其活性。
     PBMC 对 IFN-γ 的诱导
     图 5 比较了不同类的 CpG 诱导 Th1 细胞因子， IFN-γ 的分泌的能力。A 类诱导较 低水平的 IFN-γ， 相比之下， B 类产生中等量， C 类 CpG 刺激高浓度的 IFN-γ。HCV 感染的 和正常的 PBMC 对所有三类 CpG 都显示出相似的 Th1 反应。半柔性 C 类 CpG ODN 也得到了 类似的结果 ( 图 6)。
     PBMC 对 IP-10 分泌的诱导
     IP-10， 一种与 1 型和 2 型干扰素的产生相关的趋化因子， 也能被 CpG ODN 诱导。A 类 CpG ODN 诱导最高水平， C 类 CpGODN 诱导次高水平， B 类 CpG ODN 诱导最低水平。不管 CpGODN 的类型如何， 正常受试体和 HCV 慢性携带者的 PBMC 中诱导的 IP-10 水平类似 ( 图7)。 CpG ODN 对 B 细胞的刺激
     还研究了 CpG 对 B 细胞刺激的效果。如图 8 和 9 所示， A 类 CpG 对 HCV 感染的和 正常的人群的 B 细胞的刺激效果都较弱。相反， B 类， C 类和半柔性 C 类 CpG 强烈激活 B 细 胞。在正常的和 HCV 感染的受试体之间没有差别。
     CpG ODN 刺激之后 PBMC 的 IL-10 分泌
     还评价了 CpG 刺激后细胞因子 IL-10 的产生， 结果如图 10 所示。对于 HCV 感染的 和正常的受试体， 所有类型的 CpG 都能显著诱导 IL-10 的分泌， 在正常志愿者的 PBMC 和 HCV 慢性携带者的 PBMC 之间没有差异。几种细胞类型在和 CpG 培育以后都能产生 IL-10 ； 但是 由于 B 细胞是这种细胞因子的主要产生者， IL-10 的产生可以用于指示 B 细胞激活的水平。
     内含子 A(Intron A) 和病毒唑的效果
     对于 HCV 感染的细胞检测了病毒唑和外源 IFN-α 内含子 A(Intron A) 单独或与 CpG 组合使用的体外效果。病毒唑和内含子 A(Intron A) 无论是单独使用或是一起使用都 不能诱导 HCV 感染的 PBMC 分泌 IFN-α( 图 11)。
     如上所述， A 和 C 类 CpG ODN 可强烈诱导正常的和 HCV 感染的受试体的 pDC 分泌 IFN-α。进一步， 当 CpG 和 Intron-A 一起使用的时候， 大部分 (60％ ) 受试体都具有协同反 应 ( 图 12)。
     讨论
     CpG ODN 能够诱导慢性 HCV 感染的受试体的 DC 分泌 IFN-α， A 类和 C 类 CpG 诱导 水平较高， B 类 CpG ODN 诱导水平较低。分泌的 IFN-α 的水平与正常健康志愿者的细胞观 察到的结果相当。而且， 刺激的 HCV PBMC 诱导 IP-10， 进一步表明是 Th1 类型的免疫激活。
     HCV 抗原特异性免疫反应在慢性 HCV 感染的人中已经存在。 这是偏向 Th2 的， 因此 导致不能清除 HCV 感染的细胞。Th1 类型的反应是病毒清除所必需的。不需要其它抗原， Th1 细胞因子的系统水平的升高就能使慢性 HCV 感染的人发生 Th1 类型的 HCV 特异的免疫 反应， 这有助于病毒的清除。所有类型的 CpG(A， B 和 C) 都能够导致形成 Th1 类型的反应。 这些 Th1 类型的反应是 HCV 慢性感染的长期清除所必要的， 但是它们很难被外源 IFN-α 治 疗诱导， 这种治疗只有直接的抗病毒作用而对免疫系统没有直接作用。因此 CpG ODN 可以 与外源 IFN-α 组合使用治疗 HCV 慢性携带者。
     另外， CpG ODN 也可以单独使用。由于能诱导细胞因子如 IFN-α 和 IFN-γ， CpG ODN 独自使用除了能诱导 Th1 类型的 HCV 特异的免疫反应之外， 还具有直接的抗病毒作用。 在一些实施例中， 优选 A 和 C 类分子， 因为它们能诱导较高水平的 IFN。根据它们的特征序 列， CpG ODN 优先刺激 pDC 功能， 成熟和 1 型 IFN 产生 (Krug， A et al.， Eur J Immunol， 2001 ； 31 ： 2154-2163)。虽然根据本发明， 有两类 CpG ODN 都能很好地刺激 IFN-α 产生， 但 任何 CpG ODN， 不管其骨架或 CpG 序列如何， 都可以用于治疗慢性 HCV。由特异 CpG ODN 控 制的不同 I 型 IFN 异构体在体内的释放可以很好地进行单个亚型的重组 I 型 IFN( 例如内 含子 A(Intron A) 就是 IFN-α-2b) 的系统给药。 CpG ODN 的柔性和半柔性形式能够刺激与 它们的母本分子类似的 IFN-α 水平。CpGODN 的柔性和半柔性形式， 特别是 C 类， 优选用于 治疗慢性 HCV， 这是由于它们更容易降解因而不会在器官中积累， 特别是在肝， 脾和肾中。
     至少有 50％的 HCV 受试体对外源 IFN-α 治疗没有反应， 而 CpG ODN( 特别是 A 和
     C 类 ) 在所有受试体中都能够在体外以与正常健康的志愿者相当的水平诱导 IFN-α 分泌。 因此 CpG ODN 可用于治疗对外源 IFN-α 治疗没有反应的受试体， 不管 IFN 是否是聚乙二醇 化的， 不管所述治疗是否包括病毒唑。可诱导高水平 IFN-α 的 CpG ODN 类型是优选的， 更 优选的能长期治疗的是半柔性形式。
     商业的 Intron-A(IFN-α-2b) 和病毒唑， 不管单独使用还是组合式用都不能诱导 正常或 HCV 感染的受试体的 PBMC 在体外分泌 IFN-α。但是当 CpG ODN 与 Intron-A 组合使 用的时候， 观察到在 HCV 感染受试体的 PBMC 的 IFN-α 分泌中具有协同作用。C 类 ODN 与外 源 IFN-α 能发生协同作用 ； 用其它类型的 CpG ODN 和商业的 α- 干扰素一起治疗也是有效 的。如前所述的， 由于其相对较容易降解成无刺激效果的代谢物， CpG ODN 的半柔性形式可 用于长期治疗而不用担心会在末梢器官中积聚。
     病毒唑具有 Th1 作用， 但是在本项研究中它对人 PBMC 没有免疫刺激活性。甚至是 与内含子 A(Intron A) 组合使用， 病毒唑也并没有增强外源 IFN-α 的产生。因此在 HCV 的 组合治疗中用 CpG ODN 代替病毒唑会增加持续病毒反应的部分。当与 CpGODN 组合使用的 时候， 病毒唑降低了 CpG 的功效。因此 CpG.ODN 应当与 α- 干扰素组合式用而不加入病毒 唑。
     CpG ODN 以 IM， SC 和 IV 的方式给予人受试体， 并确定其耐受性较好并且安全 ( 临 床研究， 正在进行中 )。 任何有效的给药方式都是可接受的， 例如 SC， IM， IV， 吸入等。 但是所 选择的给药方式是皮下给药。 将 CpG ODN 在 TE 缓冲液中稀释， 并加入到 PBMC 中， CpG ODN 还 可以配制在递送系统例如生物附着性聚合物 (Sha et al.， 1999)， 螺旋体 (Gould-Fogerite et al.， 1994， 1996) ； dendrimer(Kukowska-Latallo et al.， 1996， Qin et al， 1998)， 肠溶 包衣的胶囊 (Czerlcinsky et al.， 1987， Levine et al.， 1987)， 乳化剂 (Vancott et al.， 1998， Lowell et al.， 1997)， ISCOM(Mowat et al.， 1993， Morein et al.， 1999， Hu et al.， 1998， Carlssonet al.， 1991)， 脂质体 (Childers et al.， 1999， Michalek et al.， 1989， 1992)， 微球 (Gupta et al.， 1998， Maloy et al.， 1994， Eldridgeet al.， 1989)， 纳米球 (Roy et al.， 1999)， 聚合物环 (Wyatt et al.， 1998)， 蛋白体 (Lowell et al.， 1988， 1996)， 和病 毒颗粒 (Gluck etal.， 1992， Mengiardi et al.， 1995， Cryz et al.， 1998) 中。
     为了治疗 HCV 慢性携带者， CpG ODN 的重复给药可为每日一次到每月一次， 优选每 3-10 天一次， 更优选每周一次， 持续较长时期。所述时期可以是一个月到两年， 优选 3 到 12 个月， 最优选 6 个月。因此最佳的治疗是每周两次或每周一次， 持续 6 个月。在诱发期也可 以给药的更频繁 ( 第 1-3 个月每天或每隔一天或每周两次或每周一次给药 )， 然后在维持期 间降低频率 ( 在其余几个月中每周一次， 或者每隔一周， 或者每个月一次给药 )。
     为了进行组合治疗， CpG 和 α- 干扰素 ( 聚乙二醇化或者没有聚乙二醇化 ) 可以 (i) 混合在一起， 在同一时间以同样的方式 ( 皮下 ) 给药， (ii) 在同一时间以同样的方式给 药， 但是不混合， (iii) 在同一时间但是以不同的方式 ( 例如 α- 干扰素以 SC 方式给药， 而 CpG 以 IV， IM， ID， 口服或局部方式给药 ) 给药， (iv) 以不同的次数和时间安排以及相同或 不同的方式给药， 或者 (v) 顺序给药。在后一种情况下， 优选首先给予 IFN-α 以减少病毒， 然后给予 CpG ODN 以诱导持续的 Th1 类型的适应性免疫， 以进行长期控制。
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     等同方式
     应当理解可以对本文公开的实施方案进行各种修改。 因此上述说明书不应当理解 为限制， 而仅仅是对优选的实施方案的示例。本领域技术人员能够预见其它修改也在本发 明权利要求范围之内。
     本文公开的所有参考文献， 专利和专利申请都引入其全文作为参考。
     以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书， 现作为说明书的一部分并入此 处：
     1. 一种治疗具有 HCV 感染并且用以前的非 CpG 疗法不能成功治疗的受试体的方 法， 包括
     给需要治疗的受试体施用有效量的能治疗所述感染的 CpG 免疫刺激核酸。
     2. 项 1 的方法， 其中所述非 CpG 疗法包括干扰素 -α。
     3. 项 2 的方法， 其中所述干扰素 -α 是干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干扰 素 -α。
     4. 项 2 的方法， 其中所述非 CpG 疗法包括干扰素 -α 和病毒唑。
     5. 项 2 的方法， 其中所述非 CpG 疗法包括聚乙二醇化的干扰素 -α 和病毒唑。
     6. 项 1 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸是 A 类 CpG 免疫刺激核酸。
     7. 项 1 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸是 B 类 CpG 免疫刺激核酸。
     8. 项 1 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸是 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     9. 项 1 的方法， 进一步包括将干扰素 -α 给予受试体的步骤。
     10. 项 9 的方法， 其中所述干扰素 -α 是干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干 扰素 -α。
     11. 项 9 的方法， 其中所述干扰素 -α 与所述 CpG 免疫刺激核酸基本上同时给药。
     12. 项 1 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸含有骨架修饰。
     13. 项 12 的方法， 其中所述骨架修饰是硫代磷酸酯骨架修饰。
     14. 项 1 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸含有半柔性骨架。
     15. 一种治疗具有 HCV 感染并且可能对非 CpG 疗法没有反应的受试体的方法， 包括
     给需要治疗的受试体施用有效量的能治疗所述感染的 CpG 免疫刺激核酸。
     16. 项 15 的方法， 进一步包括鉴别可能对非 CpG 疗法没有反应的受试体。
     17. 项 16 的方法， 其中基于每个树突状细胞产生的干扰素 -α 的检测鉴别所述可 能没有反应的受试体。
     18. 项 16 的方法， 其中基于 HCV 表型鉴别所述可能没有反应的受试体。
     19. 项 15 的方法， 其中所述非 CpG 疗法包括干扰素 -α。
     20. 项 15 的方法， 其中所述非 CpG 疗法包括干扰素 -α 和病毒唑。
     21. 项 20 的方法， 进一步包括给受试体施用抗病毒试剂。
     22. 项 21 的方法， 其中所述抗病毒试剂是干扰素 -α。
     23. 项 22 的方法， 其中所述干扰素 -α 是干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干 扰素 -α。
     24. 项 21 的方法， 其中所述干扰素 -α 以低剂量给药。25. 项 15 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸是 C 类 CpG 免疫刺激核酸。 26. 项 15 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸含有半柔性骨架。 27. 一种筛选可用于治疗慢性丙型肝炎病毒感染的 CpG 免疫刺激核酸的方法， 包括 使来自具有慢性丙型肝炎病毒感染受试体的外周血单核细胞与 CpG 免疫刺激核 酸接触， 并
     测量暴露以后血单核细胞的检测反应， 其中所述受试体用以前的疗法不能成功治 疗。
     28. 项 27 的方法， 其中所述检测反应选自 B 细胞刺激， IL-6 的分泌， IL-10 的分 泌， IL-12 的分泌， 干扰素 -γ 的分泌， 1 型干扰素 (α+β) 的分泌， IP-10 的分泌， NK 活性， CD80 的表达， CD86 的表达， CD83 的表达， 和 II 型 MHC 表达的正调控。
     29. 项 27 的方法， 其中所述外周血单核细胞含有树突状细胞。
     30. 项 29 的方法， 其中所述树突状细胞含有类浆细胞的树突状细胞。
     31. 项 29 的方法， 其中所述检测反应选自 IL-12 的分泌， 1 型干扰素的分泌， CD80 的表达， CD86 的表达， CD83 的表达， 和 II 类 MHC 表达的正调控。
     32. 项 29 的方法， 其中所述接触是在体外。 33. 项 32 的方法， 其中所述外周血单核细胞是培养的。 34. 项 33 的方法， 其中将所述 CpG 免疫刺激核酸加入到培养的外周血单核细胞中。 35. 项 29 的方法， 其中所述以前的治疗是非 CpG 疗法。 36. 项 29 的方法， 其中所述以前的治疗是用不同序列或不同类的 CpG 核酸进行的治疗。 37. 项 29 的方法， 进一步包括检测所述 CpG 免疫刺激核酸刺激正常受试体的外周 血单核细胞的对照反应的能力。
     38. 项 29 的方法， 进一步包括使外周血单核细胞与干扰素 -α 和所述 CpG 免疫刺 激核酸基本上同时接触。
     39. 项 29 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸是 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     40. 一种鉴别具有 HCV 感染并且可能对非 CpG 疗法没有反应的受试体的方法， 包括
     使从具有丙型肝炎病毒感染的受试体收集到的外周血单核细胞与 CpG 免疫刺激 核酸接触，
     测定细胞分泌的干扰素 -α， 并且
     测定每个树突状细胞产生的干扰素 -α 的量， 其中该量小于 1.0pg/ml 表示受试体 可能对非 CpG 疗法没有反应。
     41. 项 40 的方法， 其中量小于 0.5pg/ml 表示受试体可能对非 CpG 疗法没有反应。
     42. 项 40 的方法， 其中所述非 CpG 疗法包括干扰素 -α。
     43. 项 42 的方法， 其中所述非 CpG 疗法包括病毒唑。
     44. 项 42 的方法， 其中所述 IFN-α 是聚乙二醇化的干扰素 -α。
     45. 项 40 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸是 A 类或 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     46. 项 40 的方法， 其中所述将外周血单核细胞进一步暴露于抗病毒试剂与 CpG 免 疫刺激核酸中。
     47. 项 46 的方法， 其中所述抗病毒试剂是干扰素 -α。 48. 项 47 的方法， 其中干扰素 -α 是干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干扰 49. 项 40 的方法， 其中所述外周血单核细胞包括树突状细胞。 50. 项 49 的方法， 其中所述树突状细胞包括类浆细胞的树突状细胞。 51. 项 40 的方法， 其中所述丙型肝炎病毒感染是急性丙型肝炎病毒感染。 52. 项 40 的方法， 进一步包括确定 HCV 的基因型。 53. 一种治疗具有丙型肝炎病毒感染的受试体的方法， 包括 给根据项 40 的方法鉴别的受试体施用有效量的能治疗所述感染的 CpG 免疫刺激素 -α。
     核酸。 54. 项 53 的方法， 进一步包括给受试体施用干扰素 -α。
     55. 项 54 的方法， 其中所述干扰素 -α 是干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干 扰素 -α。
     56. 项 53 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸是 A 类 CpG 免疫刺激核酸。
     57. 项 53 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸是 B 类 CpG 免疫刺激核酸。
     58. 项 53 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸是 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     59. 项 53 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸含有骨架修饰。
     60. 项 59 的方法， 其中所述骨架修饰是硫代磷酸酯骨架修饰。
     61. 项 53 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸含有半柔性骨架。
     62. 项 53 的方法， 其中所述丙型肝炎病毒感染是慢性丙型肝炎病毒感染。
     63. 项 53 的方法， 其中所述丙型肝炎病毒感染是急性丙型肝炎病毒感染。
     64. 一种治疗具有 HCV 感染并且用以前的非 CpG 疗法不能成功治疗的受试体的方 法， 包括
     给需要治疗的受试体施用有效量的能治疗所述感染的具有半柔性骨架的 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     65. 一种治疗具有 HCV 感染并且可能对非 CpG 疗法没有反应的受试体的方法， 包括
     给需要治疗的受试体施用有效量的能治疗所述感染的具有半柔性骨架的 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     66. 一种鉴别具有 HCV 感染并且可能对非 CpG 疗法没有反应的受试体的方法， 包括
     使从具有丙型肝炎病毒感染的受试体收集到的外周血单核细胞与 A 类或 C 类 CpG 免疫刺激核酸接触，
     测定细胞分泌的干扰素 -α， 并且
     测定每个树突状细胞产生的干扰素 -α 的量， 其中该量小于 1.0pg/ml 表示受试体 可能对非 CpG 疗法没有反应。
     67. 一种治疗具有 HCV 感染并且用以前的非 CpG 疗法不能成功治疗的受试体的方 法， 包括
     使来自需要治疗的受试体的外周血单核细胞与有效量的能刺激免疫反应的 CpG 免疫刺激核酸接触， 并且
     将这些细胞重新输入到受试体体内。
     发明领域 本发明提供了治疗丙型肝炎病毒慢性感染的受试体的方法和产品。
     发明背景
     丙型肝炎病毒 (HCV) 是黄病毒家族的正链 RNA 病毒， 能感染人和一些其它灵长动 物的肝细胞。首次发现是在 1989 年 (1)， HCV 具有 9.5kb 的基因组， 编码三个结构基因 ： 核 和两个包被蛋白 (E1 和 E2)， 以及几个涉及病毒复制和与宿主相互作用的非结构 (NS) 蛋白。
     HCV 严重关系到公共健康， 它引起＞ 90％的肠胃外非甲非乙型肝炎 (1)。 世界人口 有 0.4 到 1.5％被传染 (3， 4)， 包括大约 300,000 加拿大人 ( 加拿大卫生署 )。由于急性感 染中的绝大部分都是无临床症状的， 因此难于进行流行病学统计 ； 然而估计有 50-80％的 HCV 感染个体不能清除病毒， 其中大部分变成终生携带者。大约 50％的携带者发展成慢性 肝炎， 其中 20％发展成肝硬化， 其中一些继续发展成肝细胞性肝癌 (5-9)。在美国估计丙型 肝炎每年引起 8,000 到 10,000 人死亡。
     在美国和加拿大， 治疗丙型肝炎有两种不同的方法 ： 单独用 α 干扰素治疗以及用 α 干扰素和病毒唑组合治疗。组合治疗虽然较昂贵并且具有更多的副作用， 但是通常比单 独治疗产生持续反应的几率较高。
     干扰素具有几种形式 (α-2a， α-2b， 以及复合干扰素 (Alfacon))， 这些干扰素一 般是每周皮下给药三次。聚乙二醇化干扰素， 即加上聚乙二醇进行修饰以增加其在循环系 统中的保持时间的 α 干扰素， 是另一种干扰素， 每周只给药一次。相反， 病毒唑是一种口服 抗病毒制剂， 以 200mg 的胶囊每天给药两次。
     干扰素的副作用包括 ： 疲劳， 肌肉疼痛， 头疼， 恶心和呕吐， 注射部位有皮肤刺激， 低烧， 体重降低， 烦躁， 沮丧， 自杀， 轻微骨髓抑制和脱发 ( 可恢复的 )。 对于病毒唑副作用包 括： 贫血性疲劳和烦躁， 搔痒， 皮疹， 鼻子不通气， 窦炎和咳嗽。
     单独用干扰素治疗或者干扰素和病毒唑组合治疗会使 50-75％的受试体血清 ALT 水平快速升高， 会使 30-50％的受试体血清中可检测到的 HCV RNA 消失。 只有当 HCV RNA 在 治疗中消失并且在治疗结束后至少 6 个月都检测不到才可认为肝病有了长期好转。组合治 疗会使得 HCV RNA 在治疗中更快地消失， 在治疗结束后复发的几率更低。但是， 治疗结果也 强烈依赖于病毒的基因型， 基因型 2 和 3 得到的结果较好 ( 用聚乙二醇化干扰素 -α 和病 毒唑治疗 1 年后为 90％ )， 而基因型 1HCV 的结果较差 ( 大约 40％保持反应 )。目前在北美 大部分 HCV 慢性携带者都是基因型 1。
     治疗的最佳持续时间随使用的是干扰素单独治疗还是组合治疗， 以及 HCV 基因型 的不同而不同， 典型地， 持续时间是 6 到 12 个月。
     目前还没有 HCV 的疫苗， 对于慢性感染也没有显著有效的治疗方法。因此迫切需 要能用于治疗慢性携带者的有效治疗方法。
     发明背景
     丙型肝炎病毒 (HCV) 是黄病毒家族的正链 RNA 病毒， 能感染人和一些其它灵长动 物的肝细胞。首次发现是在 1989 年 (1)， HCV 具有 9.5kb 的基因组， 编码三个结构基因 ： 核 和两个包被蛋白 (E1 和 E2)， 以及几个涉及病毒复制和与宿主相互作用的非结构 (NS) 蛋白。
     HCV 严重关系到公共健康， 它引起＞ 90％的肠胃外非甲非乙型肝炎 (1)。 世界人口 有 0.4 到 1.5％被传染 (3， 4)， 包括大约 300,000 加拿大人 ( 加拿大卫生署 )。由于急性感 染中的绝大部分都是无临床症状的， 因此难于进行流行病学统计 ； 然而估计有 50-80％的 HCV 感染个体不能清除病毒， 其中大部分变成终生携带者。大约 50％的携带者发展成慢性 肝炎， 其中 20％发展成肝硬化， 其中一些继续发展成肝细胞性肝癌 (5-9)。在美国估计丙型 肝炎每年引起 8,000 到 10,000 人死亡。
     在美国和加拿大， 治疗丙型肝炎有两种不同的方法 ： 单独用 α 干扰素治疗以及用 α 干扰素和病毒唑组合治疗。组合治疗虽然较昂贵并且具有更多的副作用， 但是通常比单 独治疗产生持续反应的几率较高。
     干扰素具有几种形式 (α-2a， α-2b， 以及复合干扰素 (Alfacon))， 这些干扰素一 般是每周皮下给药三次。聚乙二醇化干扰素， 即加上聚乙二醇进行修饰以增加其在循环系 统中的保持时间的 α 干扰素， 是另一种干扰素， 每周只给药一次。相反， 病毒唑是一种口服 抗病毒制剂， 以 200mg 的胶囊每天给药两次。
     干扰素的副作用包括 ： 疲劳， 肌肉疼痛， 头疼， 恶心和呕吐， 注射部位有皮肤刺激， 低烧， 体重降低， 烦躁， 沮丧， 自杀， 轻微骨髓抑制和脱发 ( 可恢复的 )。 对于病毒唑副作用包 括： 贫血性疲劳和烦躁， 搔痒， 皮疹， 鼻子不通气， 窦炎和咳嗽。
     单独用干扰素治疗或者干扰素和病毒唑组合治疗会使 50-75％的受试体血清 ALT 水平快速升高， 会使 30-50％的受试体血清中可检测到的 HCV RNA 消失。 只有当 HCV RNA 在 治疗中消失并且在治疗结束后至少 6 个月都检测不到才可认为肝病有了长期好转。组合治 疗会使得 HCV RNA 在治疗中更快地消失， 在治疗结束后复发的几率更低。但是， 治疗结果也 强烈依赖于病毒的基因型， 基因型 2 和 3 得到的结果较好 ( 用聚乙二醇化干扰素 -α 和病 毒唑治疗 1 年后为 90％ )， 而基因型 1HCV 的结果较差 ( 大约 40％保持反应 )。目前在北美 大部分 HCV 慢性携带者都是基因型 1。
     治疗的最佳持续时间随使用的是干扰素单独治疗还是组合治疗， 以及 HCV 基因型 的不同而不同， 典型地， 持续时间是 6 到 12 个月。
     目前还没有 HCV 的疫苗， 对于慢性感染也没有显著有效的治疗方法。因此迫切需 要能用于治疗慢性携带者的有效治疗方法。
     发明简述
     本发明部分基于几个令人惊讶的发现， 包括 CpG 免疫刺激核酸可用于治疗乙型肝 炎病毒 (HCV) 慢性感染的并且对于以前的非 CpG 疗法没有反应的受试体。本发明进一步部 分基于发现了在组合使用了 CpG 免疫刺激核酸和抗病毒试剂例如 IFN-α 的受试体中发现 有协同反应。
     在一方面， 本发明提供了一种治疗具有 HCV 感染并且用以前的非 CpG 疗法不能成 功治疗的受试体的方法， 包括给需要治疗的受试体施用有效量的能治疗所述感染的 CpG 免 疫刺激核酸。
     在一个实施方案中， 所述非 CpG 疗法包括干扰素 -α。在一个相关的实施方案中， 所述干扰素 -α 是干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干扰素 -α。 在另一个实施方案中， 所述非 -CpG 疗法包括干扰素 -α 和病毒唑， 或干扰素 -α 和病毒唑和 emantidine。在一些 重要的实施方案中， 所述非 CpG 疗法包括聚乙二醇化的干扰素 -α 和抗病毒剂例如病毒唑。
     在一个实施方案中， CpG 免疫刺激核酸是 A 类 CpG 免疫刺激核酸。在另一个实施 方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是 B 类 CpG 免疫刺激核酸。
     在另一个实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是 C 类 CpG 免疫刺激核酸。 所述方法任选地包括将抗病毒剂例如干扰素 -α 与所述 CpG 免疫刺激核酸一起给 药。所述干扰素 -α 可以是干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干扰素 -α， 但不限于此。 在一个实施方案中， 所述抗病毒剂基本上与所述 CpG 免疫刺激核酸同时给药。
     在一个实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸包括骨架修饰。在一个相关的实施方 案中， 所述骨架修饰是硫代磷酸酯骨架修饰。在一些重要的实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激 核酸包括半柔性骨架。在其它重要的实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是具有半柔性骨 架的 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     因此， 在另一个方面， 提供了一种治疗具有 HCV 感染并且用以前的非 CpG 疗法不能 成功治疗的受试体的方法， 包括给需要治疗的受试体施用有效量的能治疗所述感染的具有 半柔性骨架的 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     在另一个方面， 提供了一种治疗具有 HCV 感染并且用以前的非 -CpG 疗法不能成功 治疗的受试体的方法， 包括使需要治疗的受试体的外周血单核细胞与有效量的能刺激免疫 反应的 CpG 免疫刺激核酸接触， 并将这些细胞重新输入到受试体体内。
     在一个实施方案中， 外周血单核细胞包括树突状细胞。 在另一个实施方案中， 树突 状细胞包括类浆细胞的树突状细胞。 在一个实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是 C 类 CpG 免疫刺激核酸。在一个相关的实施方案中， 所述 C 类 CpG 免疫刺激核酸具有半柔性骨架。
     在另一方面， 本发明提供了一种治疗具有 HCV 感染并且可能对非 CpG 疗法没有反 应的受试体的方法， 包括给需要治疗的受试体施用有效量的能治疗所述感染的 CpG 免疫刺 激核酸。
     在一个实施方案中， 所述方法进一步包括鉴别可能对非 CpG 疗法没有反应的受试 体。在一个实施方案中， 所述受试体是通过检测每个树突状细胞产生的干扰素 -α 鉴别为 可能没有反应。在另一个实施方案中， 所述受试体是根据 HCV 基因型鉴别为可能没有反应。
     在一个实施方案中， 所述非 CpG 疗法包括 IFN-α。 在一个相关的实施方案中， 所述 非 CpG 疗法包括干扰素 -α 和病毒唑。
     在一个实施方案中， 所述方法进一步包括给受试体施用抗病毒试剂。在重要的 实施方案中， 所述抗病毒试剂是干扰素 -α。所述干扰素 -α 可以是干扰素 -α-2b， 干扰 素 -α-2a 或复合干扰素 -α， 但不限于此。 在一个实施方案中， 所述干扰素 -α 以低剂量施 用， 任选地组合使用 CpG 免疫刺激核酸和干扰素 -α 可产生协同作用。
     在一个实施方案中， 用于治疗受试体的 CpG 免疫刺激核酸是 A 类 CpG 免疫刺激核 酸或 B 类 CpG 免疫刺激核酸， 或 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     在一个实施方案中， 用于鉴别受试体是否是可能对非 CpG 疗法没有反应的 CpG 免 疫刺激核酸是 A 类 CpG 免疫刺激核酸或 B 类 CpG 免疫刺激核酸， 或 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     在一个实施方案中， 所述抗病毒剂基本上与所述 CpG 免疫刺激核酸同时给药。在 其它实施方案中， 干扰素 -α 在用所述 CpG 免疫刺激核酸治疗之前一段时间施用。
     在特定的实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸包括骨架修饰。在相关的实施方案 中， 所述骨架修饰是硫代磷酸酯骨架修饰。在一些优选的实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核 酸包括半柔性骨架。在其它更优选的实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是具有半柔性骨 架的 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     在另一个方面， 提供了一种治疗具有 HCV 感染并且可能对非 CpG 疗法没有反应的 受试体的方法， 包括给需要治疗的受试体施用有效量的能治疗所述感染的具有半柔性骨架 的 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     在另一个方面， 本发明提供了一种筛选可用于治疗慢性丙型肝炎病毒感染的 CpG 免疫刺激核酸的方法。 所述方法包括使具有慢性丙型肝炎病毒感染的受试体的外周血单核 细胞与一种 CpG 免疫刺激核酸接触， 在接触以后测量血单核细胞的检测反应。用于获取外 周血单核细胞的受试体用以前的治疗方法不能成功治疗。
     在一个实施方案中， 所述检测反应选自 B 细胞刺激， IL-6 的分泌， IL-10 的分泌， IL-12 的分泌， 干扰素 -γ 的分泌， 1 型干扰素 (α+β) 的分泌， IP-10 的分泌， NK 活性， CD80 的表达， CD86 的表达， CD83 的表达， II 类 MHC 表达的正调控。
     在另一个实施方案中， 所述外周血单核细胞包括树突状细胞。在相关的实施方案 中， 所述树突状细胞包括类浆细胞的树突状细胞。 在另一个实施方案中， 所述细胞是树突状 细胞， 所述检测反应选自 IL-12 的分泌， 1 型干扰素的分泌， CD80 的表达， CD86 的表达， CD83 的表达， 和 II 类 MHC 表达的正调控。
     在一个实施方案中， 所述接触是在体外。 在另一个实施方案中， 所述外周血单核细 胞是培养的。在另一个实施方案中， 将所述 CpG 免疫刺激核酸加入到培养的外周血单核细 胞中。
     在一个实施方案中， 以前的治疗是一种非 CpG 疗法。在另一个实施方案中， 所述非 CpG 疗法包括干扰素 -α。在另一个实施方案中， 所述非 CpG 疗法进一步包括病毒唑。在其 它的实施方案中， 所述干扰素 -α 是聚乙二醇化的 IFN-α。 在一个实施方案中， 以前的治疗 是用具有不同序列或不同类的 CpG 核酸进行的治疗。
     在其它实施方案中， 所述方法进一步包括检测所述 CpG 免疫刺激核酸刺激来自正 常受试体的外周血单核细胞的对照反应的能力。
     所述方法进一步包括使外周血单核细胞与干扰素 -α 和所述 CpG 免疫刺激核酸基 本上同时接触。在一个实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸包括骨架修饰。在一个相关的实施方 案中， 所述骨架修饰是硫代磷酸酯骨架修饰。在重要的实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸 包括半柔性骨架。所述 CpG 免疫刺激核酸可以是 A 类 CpG 免疫刺激核酸， B 类 CpG 免疫刺 激核酸， 或 C 类 CpG 免疫刺激核酸。在一些实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是 C 类 CpG 免疫刺激核酸， 在其它实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是具有半柔性骨架的 C 类 CpG 免 疫刺激核酸。
     在另一个方面， 本发明提供了一种鉴别具有 HCV 感染并且可能对非 CpG 疗法没有 反应的受试体的方法。 所述方法包括使从具有丙型肝炎病毒感染的受试体收集到的外周血 单核细胞暴露于 CpG 免疫刺激核酸中， 检测这些细胞产生的干扰素 -α， 并测定每个树突状 细胞产生的干扰素 -α 的量， 其中该量小于 1.0pg/ml 则表示受试体可能对非 CpG 疗法没有 反应。在一个实施方案中， 该量小于 0.5pg/ml 表示受试体可能对非 CpG 疗法没有反应。
     在一个实施方案中， 所述非 CpG 疗法包括干扰素 -α。在另一个实施方案中， 所述 非 CpG 疗法包括病毒唑。在其它的实施方案中， 所述干扰素 -α 是聚乙二醇化的 IFN-α。
     在一些重要的实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是 A 类或 C 类 CpG 免疫刺激核 酸。 在其它实施方案中， 将所述外周血单核细胞进一步暴露于抗病毒试剂和 CpG 免疫 刺激核酸中。所述抗病毒试剂可以是干扰素 -α， 但不限于此。在一个实施方案中， 所述干 扰素 -α 是干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干扰素 -α。
     在一个实施方案中， 所述外周血单核细胞包括树突状细胞。 在另一个实施方案， 所 述树突状细胞是类浆细胞的树突状细胞。
     在另一个实施方案中， 所述丙型肝炎病毒感染是急性丙型肝炎病毒感染。
     在另一个实施方案中， 所述方法进一步包括确定 HCV 的基因型。
     在另一个方面， 提供了一种鉴别具有 HCV 感染并且可能对非 CpG 疗法没有反应的 受试体的方法， 包括使从具有丙型肝炎病毒感染的受试体收集到的外周血单核细胞暴露于 A 类或 C 类 CpG 免疫刺激核酸中， 测定这些细胞产生的干扰素 -α， 并测定每个树突状细胞 产生的干扰素 -α 的量， 其中该量小于 1.0pg/ml 则表示受试体可能对非 CpG 疗法没有反 应。
     在另一个方面， 本发明提供了一种治疗具有丙型肝炎病毒感染的受试体的方法， 包括给根据上述方法鉴别的受试体施用有效量的能治疗所述感染的 CpG 免疫刺激核酸。
     在一个实施方案中， 所述方法进一步包括给所述受试体施用干扰素 -α。 在一个实 施方案中， 所述干扰素 -α 是干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干扰素 -α。
     在一个实施方案中， 用于治疗所述受试体的 CpG 免疫刺激核酸是 A 类 CpG 免疫刺 激核酸， B 类 CpG 免疫刺激核酸， 或 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     在另一个实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸包括骨架修饰。在一个相关的实施 方案中， 所述骨架修饰是硫代磷酸酯骨架修饰。在另一个实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核 酸包括半柔性骨架。
     在一个实施方案中， 所述丙型肝炎病毒感染是慢性丙型肝炎病毒感染。在另一个 实施方案中， 所述丙型肝炎病毒感染是急性丙型肝炎病毒感染。
     本发明的每一个限定都包括本发明的不同的实施方案。 因此本发明的涉及任何一
     个要素或要素组合的每一个限定都包括在本发明的每一个方面中。
     本发明的这些方面和其它方面将在下面更详细描述。
     附图简述
     图 1 显示了 HCV 感染和正常的 PBMC 在受到 3 类 CpG 刺激以后对 IFN-α 的诱导。 将正常的或 HCV 感染的受试体的 PBMC 与不同类的 CpG 一起培育 48 小时。收集细胞上清， 用商业 ELISA 试剂盒检测 IFN-α 分泌。黑色条显示出了 10 个正常受试体和 10 个 HCV 感 染的受试体的平均 IFN-α 分泌。
     图 2 显示了从慢性 HCV 携带者和正常受试体新鲜分离的 PBMC 的流式细胞分析。 从 HCV 感染受试体和正常健康供体的血液中分离 PBMC 并用荧光标记的抗类浆细胞的树突 细胞 (pDC) 抗体进行免疫染色。用流式细胞仪对细胞进行分析， 将结果与相同受试体受到 CpG 刺激的 IFN-α 分泌进行比较。
     图 3 显示了用 C 类和柔性 C 类寡核苷酸刺激 PBMC 对 IFN-α 的诱导。将来自正 常的或 HCV 感染受试体的 PBMC 与不同类的 CpG 一起培育 48 小时。收集细胞上清， 用商业 ELISA 试剂盒检测 IFN-α 分泌。黑色条显示出了 10 个正常受试体和 10 个 HCV 感染的受试 体的平均 IFN-α 分泌。 图 4 显示了用一组半柔性 C 类 CpG 刺激以后对 IFN-α 的诱导。将分离自 5 个 HCV 感染受试体的 PBMC 与一组半柔性 C 类 CpG 一起培育 48 小时。收集细胞上清， 用商业 ELISA 试剂盒检测 IFN-α 分泌。黑色条显示出了 5 个 HCV 感染受试体的平均 IFN-α 分泌。
     图 5 显示了用三类 CpG 刺激以后的 IFN-γ 分泌。 将来自正常或 HCV 感染受试体的 PBMC 与不同类的 CpG 一起培育 48 小时。收集细胞上清， 用商业 ELISA 试剂盒检测 IFN-γ 分泌。黑色条显示出了 10 个正常受试体和 10 个 HCV 感染的受试体的平均 IFN-γ 分泌。
     图 6 显示了用一组半柔性 C 类 CpG 刺激以后对 IFN-γ 的诱导。将分离自 5 个 HCV 感染受试体的 PBMC 与一组半柔性 C 类 CpG 一起培育 48 小时。收集细胞上清， 用商业 ELISA 试剂盒检测 IFN-γ 分泌。黑色条显示出了 5 个 HCV 感染受试体的平均 IFN-γ 分泌。
     图 7 显示了用三类 CpG 刺激以后的 IP-10 分泌。将来自正常或 HCV 感染受试体的 PBMC 与不同类的 CpG 一起培育 48 小时。收集细胞上清， 用商业 ELISA 试剂盒检测 IP-10 分 泌。黑色条显示出了 10 个正常受试体和 10 个 HCV 感染的受试体的平均 IP-10 分泌。
     图 8 显示了 CpG 对于 B 细胞增殖的作用， 将来自 HCV 感染的或正常的供体的 PBMC 3 与 A 类、 B 类或 C 类 CpG 一起培育 5 天。然后用 H- 胸苷脉冲标记 16 到 18 小时， 然后测定 放射活性。将其值表示成与培养基对照相比的刺激指数 (SI ＝与 CpG 一起培育的 cpm/ 与 培养基单独培育的细胞的 cpm)。
     图 9 显示了半柔性 C 类 CpG 对于 B 细胞增殖的作用。将来自 5 个 HCV 感染受试体 的 PBMC 与 A、 B、 C 和半柔性 C 类 CpG 一起培育 5 天。然后用 3H- 胸苷脉冲标记 16 到 18 小 时， 然后测定放射活性。将其值表示成与培养基对照相比的刺激指数 (SI ＝与 CpG 一起培 育的 cpm/ 与培养基单独培育的细胞的 cpm)。
     图 10 显示了用三类 CpG 刺激以后的 IL-10 分泌。将来自正常或 HCV 感染受试体 的 PBMC 与不同类的 CpG 一起培育 48 小时。收集细胞上清， 用商业 ELISA 试剂盒检测 IL-10 分泌。黑色条显示出了 10 个正常受试体和 10 个 HCV 感染的受试体的平均 IL-10 分泌。
     图 11 显示了病毒唑和 CpG 单独使用或与内含子 A(IntronA) 组合使用刺激 HCV 感
     染细胞以后的 IFN-α 分泌。 将来自 10 个 HCV 感染受试体和 10 个正常健康供体的 PBMC 与内 含子 A(Intron A)， 单独的以及加入或不加内含子 A(Intron A)( 一种纯化的外源 IFN-α) 的病毒唑或 C 类 CpG 一起培育 48 小时。收集细胞上清， 用商业 ELISA 试剂盒检测 IFN-α 分泌。将每个受试体单独使用内含子 A(Intron A) 时检测到的 IFN-α 量设置为背景， 从相 同受试体的内含子 A(Intron A)， 病毒唑 + 内含子 A(Intron A) 和 C 类 + 内含子 A(Intron A) 的数据中减去该背景然后绘图。 正常受试体和 HCV 受试体的平均值分别用黑色和白色条 框表示。
     图 12 显示了 CpG 和内含子 A(Intron A) 一起对 HCV 感染细胞的 IFN-α 分泌的协 同作用。将来自 15 个 HCV 感染受试体的 PBMC 与单独使用的或与内含子 A(Intron A)( 一 种纯化的外源 IFN-α) 一起使用的 C 类 CpG 培育 48 小时。收集细胞上清， 用商业 ELISA 试 剂盒检测 IFN-α 分泌。检测每个受试体单独使用内含子 A(Intron A) 时的 IFN-α 量， 从 相同受试体的 CpG+ 内含子 A(Intron A) 数据中减去该值， 然后绘图。
     应当了解这些附图并不是实施所要求保护的发明所必需的。
     发明详述
     根据本发明， 发现 CpG 寡核苷酸可以以激活健康受试体 PBMC 的类似的方式激活 来自 HCV 慢性感染的受试体， 包括那些用以前的干扰素 -α(IFN-α) 治疗失败的受试体的 PBMC。 发现内源 IFN-α 分泌受到类浆细胞的树突细胞 (PDC) 的强烈诱导， 认为这是由于 HCV 感染导致其丧失功能以及对其它刺激反应的能力降低。 在一些实例中， 发现能在健康志 愿者的 PBMC 中诱导高水平 IFN-α 的 A 和 C 类 CpG 能够在 pDC 中诱导最高水平的 IFN-α。 进一步发现半柔性 C 类 CpG ODN 在这种作用中特别有效。在一些实施方案中这些 ODN 是优 选的， 这是因为它们不会在肾脏中积累， 可以重复给药。
     根据本发明进一步发现外源 IFN-α( 内含子 A(Intron A)) 和病毒唑单独使用或 组合使用时， 对正常受试体或 HCV 慢性携带者都没有可检测到的直接免疫刺激效果。但是， 当内含子 A(Intron A) 和 CpG ODN( 例如 B 类或 C 类 ) 一起使用的时候， 在 IFN-α 的产生 上观察到强烈的协同作用。
     这些结果表明 CpG ODN 单独使用或者和 IFN-α 一起使用都可有效治疗慢性 HCV 感染。基于这些发现， 本发明提供了用于预防和治疗 HCV 感染的方法和产品。
     慢性感染至少部分是由于 HCV 的快速突变， 这导致产生了类物种， 避开了免疫监 测 (10， 11)。在慢性感染的个体中可以同时检测到体液和细胞介导的免疫 (CMI) 反应。虽 然中和抗体对于保护防止感染是非常重要的， 但是当感染发生以后， 细胞介导的免疫 (CMI) 在病毒清除中具有主要作用。
     在一个方面， 本发明提供了一种治疗受到丙型肝炎病毒 (HCV) 感染的并且用以前 的非 CpG 疗法不能成功治疗的受试体的方法。所述方法包括给需要这种治疗的没有反应的 受试体施用有效量的能抑制所述感染的 CpG 免疫刺激核酸。
     这里所说的非 CpG 疗法是一种用非 CpG 免疫刺激核酸的活性或者非活性的化合物 进行的治疗。在不同的实施方案中， 所述非 CpG 疗法包括干扰素 -α。通常是将聚乙二醇化 的 IFN-α 给 HCV 受试体 ( 例如人 HCV 受试体 ) 施用， 优选与病毒唑和任选的金刚胺组合使 用。所述干扰素 -α 可以是干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干扰素 -α。所有上述干
     扰素 -α 治疗都包括在非 CpG 疗法的定义中。
     用以前的非 CpG 疗法不能成功治疗的受试体是指虽然事先进行了治疗但是在治 疗停止后 6 个月在他们的血管中还具有可检测到的病毒的受试体。这些受试体包括那么对 事先的非 CpG 疗法有反应， 但是不能控制感染和后来的复发， 还可以检测到病毒的受试体。 为了简便起见， 这里所说的这些受试体称为 “无反应者” ， 但是应当理解此术语是在本文中 定义的， 并不是临床术语。换句话说， 虽然在临床术语中 “无反应者” 仅仅是指狭义的对治 疗没有任何反应的受试体， 但在本发明中是广义的， 指虽然对或许事先的治疗具有一定水 平的反应， 但是不能成功治疗的受试体。成功治疗的受试体是指在治疗停止后 6 个月在其 血管中没有可检测到的病毒的受试体。成功治疗是指该治疗能够使得在治疗停止后至少 6 个月在血管中都不能检测到病毒。应当理解这里所述的无反应者隐含的也指受到 HCV 的慢 性感染。
     当用 CpG 核酸进行治疗的时候， 所述方法可成功治疗受试体。用 CpG 成功治疗受 试体定义为在停止治疗后 6 个月将血管中的病毒减少到检测不到的水平。 有趣的是， 在 CpG 治疗期间或刚结束时都观察不到病毒的减少， 只是在治疗以后随着时间的推移才减少， 最 终的结果是在治疗停止后 6 个月这些受试体的血管中没有可检测到的病毒。因此治疗感 染是指将受试体血管中的病毒减少到检测不到的水平， 并使此水平在治疗停止后维持 6 个 月。因此施用有效量的试剂以达到此最终效果。
     在一些实施方案中， 可以按预期的鉴别可能的无反应者 ( 即在用非 CpG 疗法进行 体内治疗之前 )， 并且本发明提供了不仅用于鉴别这些受试体而且用于治疗他们的方法。 可 以通过评估他们对 CpG 免疫刺激核酸， 特别是 A 类和 C 类发生反应的能力来鉴别可能的无 反应者。对 CpG 免疫刺激核酸反应的能力可以通过在 HCV 感染受试体中每个 pDC 产生的 干扰素 -α 的量来评估。根据本发明， 发现可以在接受治疗之前鉴别可能对非 CpG 疗法例 如 IFN-α 治疗没有反应的 HCV 感染受试体。在体内治疗之前鉴别这种受试体的可能性避 免了非必需的治疗， 使受试体处于治疗上有利的境况， 用单独使用的或与其它包括但不限 于 IFN-α 的抗 HCV 治疗一起使用的本发明的 CpG 免疫刺激核酸治疗。由于不用经受不成 功的治疗， 这些受试体受到的细胞毒性效果较少， 病毒生长的时间也减少。每个 pDC 诱导的 IFN-α 在合理水平以下的受试体可能无法用 IFN-α 成功治疗， 因此可用本文提供的方法 治疗。对 IFN-α 的诱导和 pDC 数目的测定在实施例中将更详细描述。
     应当理解可成功用本文所述的任何治疗试剂和方法进行治疗的 HCV 感染受试体 可能在其体内还有病毒。但是即使受试体不能完全消除病毒， 也能够控制病毒 ( 至检测不 到的水平 )。 虽然不希望受到任何特定理论的限制， 在受试体中维持检测不到的病毒水平涉 及到能控制病毒复制和传播的免疫系统。
     根据本文的教导本领域普通技术人员能够确定受试体对于 IFN-α 治疗是否是 “无反应者” 。 在一个实施例中， 如果在实施例所述的培养条件下用 A 类核酸例如 SEQ ID NO ： 1 的核酸诱导 IFN-α， 那么具有正常反应表示对 IFN-α 治疗的反应能力至少是 1pg/ml 每 pDC。少于此量则表示一些 pDC 丧失功能。少于 0.5pg/ml 每 pDC 的量表示对 IFN-α 治疗 没有反应的可能性较高。 本领域普通技术人员能够确定检测中使用的特定类型核酸的分界 值， 因而能够 ( 至少 ) 在实际治疗受试体之前鉴别用 IFN-α 治疗不能成功治疗的受试体。
     在其它的实施方案中， 鉴别可能对于非 CpG 疗法 ( 例如 IFN-α 治疗 ) 没有反应的受试体的方法进一步包括鉴别他 / 她所感染的 HCV 的基因型。例如， 很可能感染基因型 1 的 HCV 的受试体用 IFN-α 治疗不能成功治疗。因此， 除了评价受试体中每个 DC 产生的 IFN-α， 还可以确定他们的 HCV 基因型 ( 用本领域已知的方法 )， 这些信息组合起来可用于 鉴别可能对于 IFN-α 治疗没有反应的受试体。
     进一步应当了解在一些方面， 本发明提供了一种鉴别可能用非 CpG 疗法不能成功 治疗 ( 实际上并没有用非 CpG 疗法来治疗受试体 ) 的受试体， 然后用单独使用的或者与抗 病毒试剂例如但不限于 IFN-α 组合使用的 CpG 免疫刺激核酸治疗所述受试体。
     上述方法还可以用于检测受试体对于特定 CpG 免疫刺激核酸的反应性。
     在其它实施方案中， 所述方法进一步可以包括鉴别曾经接受过非 CpG 疗法但没有 成功的受试体的步骤。 根据本文给出的教导， 本领域普通技术人员能够鉴别这些受试体。 在 一个实施例中， 这种受试体在治疗停止之后 6 个月血管中还具有可检测到的病毒。在一些 实施方案中， 还可以证明这些受试体在治疗刚刚结束的时候病毒减少， 但是不能维持这种 减少。
     本发明涉及用单独使用的或者与其它活性试剂例如曾经描述过的用于 HCV 感染 的试剂组合使用的 CpG 免疫刺激核酸治疗那些用以前的非 CpG 疗法不能成功治疗的受试 体。从广义上来讲， CpG 免疫刺激核酸是指具有至少一个 CpG 二核苷酸基序的核酸， 其中 至少所述二核苷酸的 C 是未甲基化的。CpG 免疫刺激核酸包括但不限于 A 类， B 类和 C 类 CpG 免疫刺激核酸， 如本文中以及在本文所引用的并引入作为参考的专利和专利申请中所 述的。这些类的 CpG 免疫刺激核酸具有不同的性质和活化模式。 在重要的实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是 C 类免疫刺激核酸。根据本发明， 令人惊讶地发现， 虽然这类核酸的性质在 A 类和 B 类之间， 但 C 类免疫刺激核酸在一些实施 方案中是优选的。本文提供的实施例证明了虽然用以前非 CpG 疗法不能成功治疗的慢性感 染受试体的 pDC 本身感染了 HCV 因而在某些方面丧失了功能， 但是将这些细胞暴露于 CpG 免疫刺激核酸， 特别是 C 类免疫刺激核酸中， 能保留其功能。在一些实施方案中， 优选所述 C 类免疫刺激核酸是 “柔性” 或 “半柔性” 变体， 本文中将会有详细描述。在一些优选的实施 方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是半柔性 C 类免疫刺激核酸。
     在其它方面， 所述 CpG 免疫刺激核酸可与活性试剂组合使用， 所述活性试剂优选 包括那些曾经描述过的用于 HCV 治疗的。CpG 免疫刺激核酸与干扰素 -α( 例如内含子 A(Intron A)) 的一起使用具有特别重要的意义。 可以与本发明的 CpG 免疫刺激核酸组合使 用的干扰素包括但不限于干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干扰素 -α。其它抗病毒剂 如本文所述。这些组合中可以使用任何类型的 CpG。在一个实施例中， 根据本发明， 出人意 料地发现虽然外源给予干扰素 -α 不能成功治疗这些受试体， 但是当其与 CpG 免疫刺激核 酸一起使用的时候， 却能有效治疗。在一些实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸是 C 类免疫 刺激核酸。在一些优选的实施方案中， 其是半柔性 C 类核酸。
     所述 CpG 核酸和抗病毒试剂 ( 例如干扰素 -α) 的给药时间随受试体和感染的严 重性而不同。所述 CpG 核酸可以与所述 CpG 免疫刺激核酸基本上同时给药。这意味着这两 种制剂可以在给药前混和， 或者可以在给药过程中混和 ( 例如都递送到受试体的静脉中 )， 或者它们可以分别给药但是在可以进行两次给药的时间内操作 ( 例如给受试体注射两次 的时间 )。不管所述制剂是基本上同时给药还是以间隔方式给药， 顺序都可以变化。相应
     地， 在一些实施方案中， 所述 CpG 免疫刺激核酸可以在抗病毒试剂例如 IFN-α 之前给药， 而 在另一些实施方案中可以在抗病毒试剂之后给药。
     当 CpG 核酸和其它抗病毒剂 ( 例如 IFN-α) 一起使用的时候， 这些化合物可以以 治疗有效的组合量给药。因此每种化合物的量都可以是低剂量的或超剂量的 ( 即在单独给 药的治疗有效量之下或之上 )。另外， 所述化合物每种都可以以治疗有效量给药， 而这些制 剂的组合会产生治疗上的好处， 例如减少副作用。在优选的实施方案中， 如果抗病毒剂是 IFN-α， 其以治疗有效量给药。不管实际给药的量是多少， 制剂的组合都具有协同作用。协 同反应是指比制剂的组合所能预期的附加作用还要大的作用。
     在其它方面， 与上述描述一致， 本发明提供了检测 CpG 核酸刺激分离自慢性感染 HCV 并且用非 CpG 疗法不能成功治疗或者对于非 CpG 疗法是无反应者的受试体的免疫细胞 的能力。这种检测方法通常是在体外操作， 使外周血单核细胞 (PBMC) 与有效量的能刺激免 疫反应的 CpG 免疫刺激核酸接触。所述免疫反应可以通过许多标记检测， 例如 IFN-α 的产 生， B 细胞刺激， 细胞因子例如 IL-6， IL-10， IL-12， 干扰素 -γ， 1 类干扰素 (α+β) 的分泌， 趋化因子的分泌例如 IP-10， NK 活性， 共刺激分子 ( 例如 CD80， CD 86) 以及成熟分子 ( 例如 CD83) 的表达以及 II 类 MHC 表达的正调控。 在一些重要的实施方案中， 所述免疫细胞是树突状细胞， 优选是类浆细胞的树突 状细胞 (pDC)， 所述免疫反应标记对这些细胞类型是特异的。其包括但不限于共刺激分子 ( 例如 CD80 和 CD86) 的表达， 成熟分子 ( 例如 CD83) 的表达， IL-12 和 1 类干扰素 (α+β) 的表达和 / 或分泌， 以及 II 类 MHC 表的的正调控。应当理解这些体外检测和树突状细胞例 如 pDC 与 PBMC 其余部分的分离没有关系。 甚至所述检测也可以在均质的 PBMC 群体中进行。
     在另一个方面， 本发明提供了一种鉴别具有丙型肝炎病毒感染的受试体的方法， 以用 CpG 免疫刺激核酸进行治疗。所述方法包括使从具有丙型肝炎病毒感染的受试体中收 集的外周血单核细胞暴露于 i) 一种 CpG 免疫刺激核酸， 和 ii) 一种 CpG 免疫刺激核酸和一 种抗病毒剂 ( 例如干扰素 -α) 中， 并测定外周血单核细胞的反应。对 CpG 免疫刺激核酸产 生反应表明可以在非 CpG 疗法之后对受试体进行 CpG 免疫刺激核酸治疗或者取代之 ( 如上 所述， 但只是在鉴别了对非 CpG 疗法可能没有反应的受试体之后 )。对 CpG 免疫刺激核酸 和抗病毒剂 ( 例如干扰素 -α) 的组合的反应比对单独的 CpG 免疫刺激核酸的反应大表示 受试体应当用这种组合治疗。如本文所述的， 所述抗病毒试剂可以是干扰素 -α， 包括但不 限于干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干扰素 -α。优选所述外周血单核细胞包括树突 状细胞例如类浆细胞的树突状细胞。本发明进一步包括用单独的 CpG 免疫刺激核酸或其与 抗病毒试剂 ( 例如干扰素 -α) 的组合对如上所述鉴别的受试体的治疗， 这取决于检测的结 果。 临床策略包括将这些核酸进行局部的和系统的体内给药， 或者离体策略， 其中分离自没 有反应的 HCV 感染受试体的 pDC 在体外用免疫刺激核酸激活， 然后重新局部地或系统地输 入到受试体中。这些治疗策略可以包括与其它生长因子 (IL-3， GM-CSF， flt3- 配体等 )， 或 者与其它刺激源 ( 超抗原， 病毒产物 ) 的组合。由于天然干扰素 -α 是一个家族， 具有多于 一打的单独的基因产物， 其中每个产物都具有独特的活性模式， 天然干扰素的临床使用优 选与衍生自单一的重组 IFN-α 基因的重组 IFN-α 相比较。
     本发明进一步提供了一种激活来自丙型肝炎感染受试体的 pDC 的方法。所述方法 包括分离需要治疗的受试体的 pDC， 体外培养所述分离的 pDC， 使所述 pDC 在体外与有效量
     的分离的免疫刺激核酸接触， 使接触过的细胞返回到受试体体内。所述细胞还可以在体外 与生长因子或细胞因子接触。根据本发明的这个方面， 用 IFN-α 进行治疗所需的免疫刺激 核酸和条件如上所述。
     IFN-α 本身代表了一个家族， 包括多于一打的相关的同源蛋白 ( 异构体， 参 见下述表 1)， 其中每一个都由不同的基因编码， 每一个都显示出独特的活性模式。不 同种类的 α- 干扰素对于病毒的活性可能会差 20 倍或更多。用于临床使用的 IFN-α 产物是重组蛋白或高度纯化的单纯异构体的天然蛋白。在美国可以获得的 IFN-α 是 重 组 人 IFN-α2a(ROFERON-A)， 重 组 人 IFN-α2b( 内 含 子 A(INTRON A))， 以及纯化 的 天 然 IFN-αn3(ALFERON N)。 在 美 国 之 外， 还 可 以 得 到 的 IFN-α 是 纯 化 的 天 然 IFN-αn1(WELLFERON)。
     表 1. 人 IFN-α 家族
    本发明的一些方法需要检测免疫反应， 包括 IFN-α 的检测。 IFN-α 的检测是本领 域公知的。 包括直接检测， 例如对至少一种 IFN-α 特异的酶联免疫吸附检测 (ELISA)， 以及 间接的检测， 例如功能性检测包括 NK 细胞激活 / 细胞毒性 (Trinchieri G AdvImmunol 47 ： 187-376(1989)) 和用荧光激活细胞分选 (FACS) 分析对 I 型 MHC 进行表型分析。 其它特异性
     检测方法是本领域熟知的， 特别可以用于感兴趣的是 IFN-α 的局部浓度或局部存在的情 况下。这些方法包括， 例如， 免疫组织化学， 核酸杂交 ( 例如 Northern blotting)， Western blotting， 逆转录酶 / 聚合酶链式反应 (RT/PCR)， 以及原位 RT/PCR。细胞内 IFN-α 也可以 用流式细胞术检测。
     本发明在一些方面包括检测 pDC 的激活。pDC 的激活可以用多种方法检测。包括 IFN-α 的产生， 共刺激分子 ( 例如 CD80 和 CD86) 的表达， 成熟分子 ( 例如 CD83) 的表达。 IL-12 的表达， 以及 II 类 MHC 表达的正调控。与外源 IFN-α 的给药不同， pDC 的激活导致 产生多种或是所有形式的 IFN-α， 以及其它 I 型 IFN 例如 IFN-β。在一些实施方案中， 因 此 pDC 的激活是通过检测其产生 I 型干扰素包括 IFN-α 的能力确定。
     本发明提供了多种方法， 包括免疫刺激核酸。 免疫刺激核酸是一种核酸分子， 当与 免疫系统细胞接触的时候， 能够诱导所接触的免疫系统的细胞增殖和 / 或被激活。所述接 触可以是直接的或是间接的， 例如所述免疫刺激核酸可以直接刺激第一种类型的免疫细胞 表达产物， 该产物继续刺激没有暴露于所述免疫刺激核酸或者对所述免疫刺激核酸没有反 应的第二种类型的免疫细胞。 所述免疫刺激核酸的免疫刺激效果与所述免疫刺激核酸序列 可能编码的任何产物都不同。类似地， 所述免疫刺激核酸的免疫刺激效果不同于任何反义 机制， 也不依赖于此。
     只有特定的核酸是免疫刺激核酸。最初认为特定的回文序列具有免疫刺激性。 Tokunaga T et al.Microbiol Immunol 36 ： 55-66(1992) ； Yamamoto T et al.Antisense Res Dev 4 ： 119-22(1994)。进一步的研究证明非回文序列也可以具有免疫刺激性， 只要 它们在特定的序列 (CpG 基序 ) 中包含有 CpG 二核苷酸。Krieg AM et al.Nature 374 ： 546-9(1995)。
     所述免疫刺激核酸可以是单链或双链的。 通常， 双链核酸分子在体内更稳定， 而单 链核酸分子的免疫活性较强。因此在本发明的一些方面优选所述免疫刺激核酸是单链， 在 其它方面优选所述免疫刺激核酸是双链。
     根据本发明提供的方法和产物涉及 CpG 寡核苷酸的应用。CpG ODN 能引发大部分 的 ( ＞ 95％ )B 细胞增殖， 分泌免疫球蛋白 (Ig)， IL-6 和 IL-12， 以及保护其不发生细胞凋 亡。 此外， CpGODN 能使 DC 成熟， 并且可以直接激活 DC， 单核细胞， 以及巨噬细胞分泌 IFN-α/ β， IL-6， IL-12， GM-CSF， 趋化因子和 TNF-α。这些细胞因子可以激活天然杀伤 (NK) 细胞 分泌 IFN-γ 并且具有增强的胞溶活性。总的来说， CpG 诱导强烈的 Th1 样模式的细胞因子 分泌， 主要是 IL-12 和 IFN-γ， 只有极少的 Th2 细胞因子分泌。
     除了诱导天然免疫反应， CpG DNA 还可以增强抗原特异性的反应， 这是由于 (i) 在 通过 B 细胞抗原受体引发的和通过 CpG 引发的 B 细胞信号传导途径之间存在强烈的协同作 用， (ii) 能够取代或增强抗原特异性的 T 辅助的 Th1 样细胞因子增强了 B 和 T 细胞抗原特 异的反应， 以及 (iii) 细胞反应需要有共刺激分子的正调控。
     CpG ODN 在具有明显 Th1 样反应 ( 主要是 IgG2a 抗体和强烈的 CTL) 的 BALB/c 小 鼠中可能是 HBsAg 的佐剂 (49)。发现 CpG ODN 优于其它 Th1 佐剂例如单磷酸脂 A(MPL， Corixa)， 或者甚至完全弗氏佐剂 (CFA) 这些对人使用有很大毒性的佐剂。用 CpG ODN 和其 它不同的抗原也能得到类似的结果 (47， 50-53)。据报道 CpG ODN 还可以改变先前已由 Th2 抗原 ( 即血吸虫病表面抗原 )(54) 或 Th2 佐剂 ( 即明矾 ) 形成的 Th2 反应。已发现至少有三种基本类型的 CpG ODN 可有效刺激健康人的 PBMC( 表 1)。 它们具 有不同的效果， 可能与 CpG ODN 刺激免疫细胞的不同模式有关。
     B 类 CpG ODN 是用可抵抗核酸酶的硫代磷酸酯骨架合成的， 通常可以很好地激活 B 细胞和 DC 使其产生 IL-12 和抗体， 但是只能有限地激活 NK 细胞。这一类 ODN 可有效作为 疫苗佐剂， 并且已经在检测 CpG( 这一类中的一个成员 )(SEQ ID NO ： 2) 作为商业化乙型肝 炎疫苗的佐剂的 I/II 期临床实验中得到了证明 (60)。
     A 类 CpG ODN 是用嵌合骨架合成的， 其中骨架的 5’ 和 3’ 末端是硫代磷酸酯， 中间 CpG 区域是磷酸二酯。这些 ODN 能很好地激活 NK 细胞和 DC 使其大量产生 IFN-α， 但只能 有限地激活 B 细胞。
     C 类 CpG ODN 是用硫代磷酸酯骨架合成的， 具有介于其它两类 CpG ODN 之间的刺激 特性 ( 例如， 很好地激活 B 细胞， 也能很好地激活 NK 细胞和 DC)。
     表1： 三种不同类型的 CpG ODN 诱导的体外免疫激活模式
    类 A B C
    1 2骨架 SOS2 S1 S1B 细胞 + ++++ +++天然杀伤细胞 ++++ ++ +++树突状细胞 ++++ ++++ +++IFN-α ++++ + +++S-ODN 是用硫代磷酸酯骨架制备的
     SOS-ODN 是用嵌合骨架制备的， 其中中间含有 CpG 的区域具有磷酸二酯连接， 而 ODN 的 3’ 和 5’ 末端是硫代磷酸酯连接
     本发明的方法还包括 A 类， B 类和 C 类 CpG 免疫刺激核酸的应用。对于 CpG 核酸， 近来已有描述存在不同种类的 CpG 核酸。一类是能激活 B 细胞但是在诱导 IFN-α 和 NK 细 胞激活方面相对较弱 ； 这一类称为 B 类。B 类 CpG 核酸典型地是完全稳定的并且在特定的 优选的碱基序列中包括未甲基化的 CpG 二核苷酸。参见， 例如美国专利序列号 6,194,388 ； 6,207,646 ； 6,214,806 ； 6,218,371 ； 6,239,116 ； 和 6,339,068。另一类是能诱导 IFN-α 和 NK 细胞激活， 但在刺激 B 细胞方面相对较弱 ； 这一类被称为 A 类。A 类 CpG 核酸典型地在 5’ 和 3’ 末端具有稳定的 poly-G 序列并具有至少 6 个核苷酸的含有磷酸二酯 CpG 二核苷酸的 回文序列。参见， 例如， 公开的专利申请 PCT/US00/26527(WO01/22990)。还有另一类 CpG 核 酸能激活 B 细胞和 NK 细胞并能诱导 IFN-α ； 这一类被称为 C 类。所述 C 类 CpG 核酸如其 首次表征的， 典型地是完全稳定的， 包含 B 类型的序列和富含 GC 的回文结构或近似回文结 构。这一类在 2001 年 8 月 17 日提交的美国临时专利申请 60/313,273， 2002 年 8 月 19 日 提交的 US10/224,523 中有描述， 在此引入其全文作为参考。
     “A 类” CpG 免疫刺激核酸在 2000 年 9 月 27 日提交的美国非临时专利申请序列号 ： 09/672,126 和公开的 PCT 申请 PCT/USOO/26527(WO 01/22990) 中有描述。这些核酸具有 诱导高水平的干扰素 -α 的能力， 但是对 B 细胞激活的作用却很小。A 类 CpG 免疫刺激核 酸不必须含有六聚物的回文序列如 Yamamoto 及其同事所述的 GACGTC， AGCGCT， 或 AACGTT。YamamotoS et al.JImmunol 148 ： 4072-6(1992)。
     A 类免疫刺激核酸的典型序列如 2000 年 9 月 27 日提交的美国非临时专利申请序 列号 09/672,126 和公开的 PCT 申请 PCT/US00/26527(WO 01/22990) 中所述。
     B 类 CpG 免疫刺激核酸强烈激活人 B 细胞但是诱导干扰素 -α 的作用却很小。 B类 CpG 免疫刺激核酸在分别于 2001 年 2 月 27 日和 2001 年 5 月 29 日公开的 USP 6,194,388B1 和 6,239,116 B1 有描述。
     本发明的 CpG 寡核苷酸是包括至少一个未甲基化的 CpG 二核苷酸的寡核苷酸。含 有至少一个未甲基化的 CpG 二核苷酸的寡核苷酸是一种含有未甲基化的胞嘧啶 - 鸟嘌呤二 核苷酸序列 ( 即 “CpG DNA” 或含有 5’ 胞嘧啶和 3’ 鸟嘌呤并且它们是用磷酸键相连的 DNA) 并能激活免疫系统。全部 CpG 寡核苷酸都可以是未甲基化的， 或者部分是未甲基化的但至 少 5’ CG 3’ 的 C 必须是未甲基化的。这里所说的术语 CpG 寡核苷酸或 CpG 核酸指免疫刺激 CpG 寡核苷酸， 除非是另外指出的核酸。
     在本发明的一个实施方案中提供了一种至少由下述通式表示的 B 类 CpG 寡核苷 酸：
     5′ X1X2CGX3X43′ 其中 X1， X 2， X 3， 和 X4 是核苷酸。在一个实施方案中 X2 是腺嘌呤， 鸟嘌呤， 或胸腺嘧 啶。在另一个实施方案中 X3 是胞嘧啶， 腺嘌呤， 或胸腺嘧啶。
     在本发明的另一个实施方案中提供了一种至少由下述通式表示的分离的 B 类 CpG 寡核苷酸 ：
     5′ N1X1X2CGX3X4N23′
     其中 X1， X2， X 3， 和 X4 是核苷酸， N 是任意核苷酸， N1 和 N2 每个都是由大约 0-25 个 核苷酸组成的核酸序列。在一个实施方案中， X1X2 是选自下组的二核苷酸 ： GpT， GpG， GpA， ApA， ApT， ApG， CpT， CpA， CpG， TpA， TpT， 和 TpG ； X3X4 是选自下组的二核苷酸 ： TpT， ApT， TpG， ApG， CpG， TpC， ApC， CpC， TpA， ApA， 和 CpA。优选 X1X2 是 GpA 或 GpT， X3X4 是 TpT。在另一个实 施方案中 X1 或 X2 或两者都是嘌呤， X3 或 X4 或两者都是嘧啶， 或者 X1X2 是 GpA， X3 或 X4 或两 者都是嘧啶。在另一个优选的实施方案中 X1X2 是选自下组的二核苷酸 ： TpA， ApA， ApC， ApG， 和 GpG。在另一个实施方案中 X3X4 是选自下组的二核苷酸 ： TpT， TpA， TpG， ApA， ApG， GpA， 和 CpA。在另一个实施方案中 X1X2 是选自下组的二核苷酸 ： TpT， TpG， ApT， GpC， CpC， CpT， TpC， GpT 和 CpG ； X3 是选自 A 和 T 的核苷酸， X4 是核苷酸， 但是其中当 X1X2 是 TpC， GpT， 或 CpG 的 时候， X3X4 不是 TpC， ApT 或 ApC。
     在另一个优选的实施方案中， 所述 CpG 核酸具有序列 5′ TCN1TX1X2CGX3X43′ (SEQ ID NO. ： 26)。在一些实施方案中， 本发明的 CpG 核酸包括选自 GpT， GpG， GpA 和 ApA 的 X1X2 以及选自 TpT， CpT 和 TpC 的 X3X4。
     本发明的 B 类 CpG 核酸序列在上文以及 PCT 公开专利申请 PCT/US95/01570 和 PCT/ US97/19791， 以及分别于 2001 年 2 月 27 日和 2001 年 5 月 29 日公开的 USP 6,194,388 B1 和 USP6,239,116 B1 中有广泛描述。典型序列包括但不限于那些在这些申请和专利中公开 的序列。
     C 类免疫刺激核酸包括至少两个不同的基序， 对免疫系统的细胞具有独特的和所 希望的刺激效果。这种 ODN 中的一些具有传统的 “刺激性” CpG 序列和 “富含 GC 的” 或 “B
     细胞中和” 基序。这些组合基序核酸具有介于传统的 “B 类” CpG ODN， 其是 B 细胞激活和 树突状细胞 (DC) 激活的强烈诱导剂， 的效果与近来描述的一类免疫刺激核酸 (“A 类” CpG ODN)， 其是 IFN-a 和天然杀伤 (NK) 细胞激活的强烈诱导剂但是对于 B 细胞和 DC 细胞的激活 的诱导作用较弱， 的效果之间的免疫刺激效果。 KriegAM et al.(1995)Nature 374 ： 546-9 ； Ballas ZK et al.(1996)Jlmmunol 157 ： 1840-5 ； Yamamoto S et al.(1992)Immunol 148 ： 4072-6。优选的 B 类 CpG ODN 通常具有硫代磷酸酯骨架， 优选的 A 类 CpG ODN 具有混合或 嵌合骨架， C 类组合基序免疫刺激核酸可以具有稳定的， 例如硫代磷酸酯， 嵌合， 或磷酸二酯 骨架， 在一些优选的实施方案中， 其具有半柔性骨架。
     在本发明的一方面提供了属于这新的一类的组合基序免疫刺激核酸的免疫刺激 核酸。B 细胞刺激域由下述通式定义 ： 5′ X1DCGHX23′。D 是非 C 的核苷酸。C 是胞嘧啶。G 是鸟嘌呤。H 是非 G 的核苷酸。
     X1 和 X2 是任意的 0 到 10 个核苷酸长的核酸序列。X1 可以包括 CG， 其中优选在 CG 之前紧邻 T。在一些实施方案中 DCG 是 TCG。X1 优选长度为 0 到 6 个核苷酸。在一些实施 方案中 X2 不包括任何 poly G 或 poly A 基序。在其它实施方案中所述免疫刺激核酸在 5’ 末端或 3’ 末端具有 poly-T 序列。这里所说的 “poly-A” 或 “poly-T” 分别是指四个或更多 个连续 A 或 T 的延伸链， 例如 5′ AAAA 3′或 5′ TTTT 3′。 这里所说的 “poly-G 末端” 是指四个或更多个连续 G 的延伸链， 例如 5′ GGGG 3′， 位于核酸的 5’ 末端或 3’ 末端。这里所说的 “poly-G 核酸” 是指具有通式 5′ X1X2GGGX3X43′ 的核酸， 其中 X1， X2， X3， 和 X4 是核苷酸， 优选 X3 和 X4 中的至少一个是 G。
     符合此通式的 B 细胞刺激域的一些优选设计包括 TTTTTCG， TCG， TTCG， TTTCG， TTTTCG， TCGT， TTCGT， TTTCGT， TCGTCGT。
     所述的核酸的第二个基序是 P 或 N， 紧邻 X1 的 5’ 或紧邻 X2 的 3’ 。
     N 是 B 细胞中和序列， 起始为 CGG 三核苷酸， 至少是 10 个核苷酸长。B 细胞中和基 序包括至少一个 CpG 序列， 其中 CG 前面是 C， 后面是 G(Krieg AM et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA95 ： 12631-12636) 或是含有 CG 的 DNA 序列， 其中 CG 的 C 是甲基化的。这里所 说的 “CpG” 是指 5’ 胞嘧啶 (C)， 其后是 3’ 鸟嘌呤 (G) 并且用磷酸键连接起来。至少 5′ CG 3′中的 C 必须是未甲基化的。中和基序是当存在于其它非刺激基序中具有一定程度的免 疫刺激能力， 但是当存在于其它免疫刺激基序中减少所述其它基序的免疫刺激活性的基 序。
     P 是含有富含 GC 的回文结构的序列， 至少是 10 个核苷酸长。这里所说的 “回文结 构” 等同于 “回文序列” ， 是指反向重复序列， 即一种序列如 ABCDEE′ D′ C′ B′ A′， 其中 A 和 A’ ， B 和 B’ 等是能形成常规的 Watson-Crick 碱基对的碱基。
     这里所说的 “富含 GC 的回文结构” 是指具有至少三分之二的 G 和 C 的碱基组成的 回文结构。在一些实施方案中， 所述富含 GC 的域优选是在 “B 细胞刺激域” 的 3’ 。在 10 碱 基长的富含 GC 的回文结构中， 所述回文结构通常含有至少 8 个 G 和 C。在 12 个碱基长的富 含 GC 的回文结构中， 所述回文结构也含有至少 8 个 G 和 C。在 14 聚体的富含 GC 的回文结 构中， 所述回文结构中至少有 10 个碱基是 G 和 C。在一些实施方案中所述富含 GC 的回文结 构完全由 G 和 C 组成。
     在一些实施方案中， 所述富含 GC 的回文结构的碱基组成具有至少 81％的 G 和 C。
     在这样的 10 个碱基长的富含 GC 的回文结构中， 所述回文结构完全由 G 和 C 组成。在这样 的 12 个碱基长的富含 GC 的回文结构中， 优选所述回文结构中的至少 10 个碱基 (83％ ) 是 G 和 C。在一些优选的实施方案中， 12 个碱基长的富含 GC 的回文结构完全由 G 和 C 组成。在 14 聚体的富含 GC 的回文结构中， 所述回文结构中的至少 12 个碱基 (86％ ) 是 G 和 C。在一 些优选的实施方案中， 14 个碱基长的富含 GC 的回文结构完全由 G 和 C 组成。富含 GC 的回 文结构的 C 可以是未甲基化的或者它们可以是甲基化的。
     通常这个结构域有至少 3 个 C 和 G， 更优选的是每个都有 4 个， 最优选的是每个 都有 5 个或更多。此结构域中 C 和 G 的数目不必相同。优选 C 和 G 的分布使得它们能够 形成自互补的双链， 或者回文结构， 例如 CCGCGCGG。这种结构可以通过插入 A 或 T 而被 破坏， 但是优选至少保持部分自互补结构， 例如基序 CGACGTTCGTCG(SEQ ID NO ： ___) 或 CGGCGCCGTGCCG(SEQID NO ： ___)。当不能保持互补的时候， 优选非互补碱基是 TG。在一 个优选的实施方案中， 不包括在回文结构中的不超过 3 个连续碱基， 优选不超过 2 个， 最 优选只有 1 个。在一些实施方案中富含 GC 的回文结构包含至少一个 CGG 三聚体， 至少 一个 CCG 三聚体， 或者至少一个 CGCG 四聚体。在其它实施方案中， 富含 GC 的回文结构不 是 CCCCCCGGGGGG(SEQ ID NO ： ____) 或 GGGGGGCCCCCC(SEQ ID NO ： ___)， CCCCCGGGGG(SEQ IDNO ： ____) 或 GGGGGCCCCC(SEQ ID NO ： ____)。
     富含 GC 的区域中至少有一个 G 可以被次黄嘌呤 (I) 取代。在一些实施方案中， P 包括不止一个 I。
     在特定的实施方案中， 所述免疫刺激核酸具有下述通式中的一种 ： 5’ NX1DCGHX23’ ， 5’ X 1DCGHX 2N 3’ ， 5’ PX 1DCGHX 23’ ， 5’ X 1DCGHX 2P 3’ ， 5’ X 1DCGHX 2PX 33’ ， 5’ X 1DCGHPX 33’ ， 5’ DCGHX2PX33’ ， 5’ TCGHX2PX33’ ， 5’ DCGHPX33’ ， 或者 5’ DCGHP 3’ 。
     在本发明的其它方面提供了由下述通式表示的免疫刺激核酸 ： 5’ N1PyGN2P 3’ 。N1 是任意 1 到 6 个核苷酸长的序列。Py 是嘧啶。G 是鸟嘌呤。N2 是任意 0 到 30 个核苷酸长 的序列。P 是富含 GC 的回文结构， 包含至少 10 个核苷酸长的序列。
     N1 和 N2 可以包含多于 50％的嘧啶， 更优选包含多于 50％的 T。N1 可以包含一个 CG， 其中优选在 CG 之前紧邻 T。在一些实施方案中 N1PyG 是 TCG( 例如 ODN 5376， 其中 5’ 端 是 TCGG)， 最优选是 TCGN2， 其中 N2 不是 G。
     N1PyGN2P 可以包含一个或多个次黄嘌呤 (I) 核苷酸。N1 中的 C 或 G 可以被次黄嘌 呤取代， 但是相对于 IpG 来说更优选 CpI。对于次黄嘌呤取代如 IpG， 可以用 “半柔性” 或嵌 合骨架使之达到其最大活性， 其中 IG 或 CI 之间通过磷酸二酯连接。N1 可以包括至少一个 CI， TCI， IG 或 TIG 基序。
     在特定的实施方案中， N1PyGN2 是选自下组的序列 ： TTTTTCG， TCG， TTCG， TTTCG， TTTTCG， TCGT， TTCGT， TTTCGT 和 TCGTCGT。
     一些 C 类核酸的非限制性实例包括 ：
    为了便于细胞吸收， 免疫刺激核酸， 包括含有 CpG 的寡核苷酸， 优选长度为 8 到 100 个碱基。但是， 根据本发明， 只要存在足够的免疫刺激基序， 任意大于 8 个核苷酸大小 ( 甚 至数个 kb 长 ) 的核酸都能够诱导免疫反应， 这是由于较大的核酸在细胞内被降解成为寡核 苷酸。优选所述免疫刺激核酸的长度为在 8 个和 100 个核苷酸之间。在一些优选的实施方 案中所述免疫刺激核酸的长度在 12 个和 40 个核苷酸之间。在更优选的实施方案中所述免 疫刺激核酸的长度在 8 个和 30 个核苷酸之间。在最优选的实施方案中所述免疫刺激核酸 的长度在 8 个和 24 个核苷酸之间。
     “回文序列” 是指反向重复序列， 即一种序列 ABCDEE′ D′ C′ B′ A′， 其中 A 和 A’ ， B 和 B’ ， C 和 C’ ， D 和 D’ ， 以及 E 和 E’ 都是能够形成常规的 Watson-Crick 碱基对的碱 基。在体内， 这种回文序列可以形成双链结构。在一个实施方案中， 所述 CpG 寡核苷酸含有 回文序列。本文中所说的回文序列是指其中 CpG 是回文结构的一部分， 优选是回文结构的 中心的回文结构。在另一个实施方案中， 所述 CpG 寡核苷酸不含回文结构。不含回文结构 的 CpG 寡核苷酸是指其中 CpG 二核苷酸不是回文结构的一部分的寡核苷酸。这种寡核苷酸 可以含有其中 CpG 不是所述回文结构的中心的回文结构。
     在本发明的一些实施方案中， 所述免疫刺激寡核苷酸包括免疫刺激基序， 即 “CpG” 二核苷酸。 CpG 二核苷酸可以是甲基化的或者未甲基化的。 含有至少一个未甲基化的 CpG 二 核苷酸的免疫刺激核酸是其中含有未甲基化的胞嘧啶 - 鸟嘌呤二核苷酸序列 ( 即未甲基化 的 5’ 胞嘧啶核苷后面是 3’ 鸟嘌呤核苷并且以磷酸键相连 ) 并且能激活免疫系统的核酸分 子； 这种免疫刺激核酸是 CpG 核酸。 CpG 核酸在许多公布的专利， 公开的专利申请， 以及其它 6,239,116 ； 出版物， 包括美国专利序列号 6,194,388 ； 6,207,646 ； 6,214,806 ； 6,218,371 ； 和 6,339,068 中有描述。含有至少一个甲基化的 CpG 二核苷酸的免疫刺激核酸是其中含有 甲基化的胞嘧啶 - 鸟嘌呤二核苷酸序列 ( 即甲基化的 5’ 胞嘧啶核苷后面是 3’ 鸟嘌呤核苷 并且以磷酸键相连 ) 并能激活免疫系统的核酸。在其它实施方案中所述免疫刺激寡核苷酸 不含 CpG 二核苷酸。这些不含 CpG 二核苷酸的寡核苷酸称为非 CpG 寡核苷酸， 它们具有非 CpG 免疫刺激基序。 因此本发明还包括具有其它类型免疫刺激基序的核酸， 所述基序可以是
     甲基化的或者未甲基化的。 本发明的免疫刺激寡核苷酸进一步可以包括任何甲基化的和未 甲基化的 CpG 和非 CpG 免疫刺激基序的组合。
     所述免疫刺激核酸分子可以具有嵌合骨架。为本发明的目的， 嵌合骨架是指部 分稳定的骨架， 其中至少一个核苷酸间连接是磷酸二酯或磷酸二酯样连接， 其中至少一 个其它核苷酸间连接是稳定的核苷酸间连接， 其中至少一个磷酸二酯或磷酸二酯样连接 和至少一个稳定的连接是不同的。由于已有报道 boranophosphonate 连接相对于磷酸 二酯连接来说是稳定的， 为所述骨架的嵌合状态的目的， boranophosphonate 连接可以 分类为磷酸二酯样或分类为稳定的， 这取决于其所处环境。例如， 根据本发明， 在一个实 施方案中， 嵌合骨架包括至少一个磷酸二酯 ( 磷酸二酯或磷酸二酯样 ) 连接和至少一个 boranophosphonate( 稳定的 ) 连接。 在另一个实施方案中， 根据本发明， 嵌合骨架可以包括 boranophosphonate( 磷酸二酯或磷酸二酯样 ) 连接和硫代磷酸酯 ( 稳定的 ) 连接。 “稳定 的核苷酸间连接” 是指与磷酸二酯核苷酸间连接相比， 相对能够抵抗体内降解 ( 例如核酸外 切或核酸内切酶 ) 的核苷酸间连接。优选稳定的核苷酸间连接包括但不限于硫代磷酸酯， 二硫代磷酸酯， 膦酸甲酯， 和甲基硫代磷酸酯。其它稳定的核苷酸间连接包括但不限于肽， 烷基， 去磷酸， 和其它上述连接。
     修饰的骨架例如硫代磷酸酯可以用氨基磷酸酯或 H- 膦酸盐化学方法用自动技术 合成。可以用例如美国专利序列号 4,469,863 中描述的方法制备芳基和烷基膦酸盐 ； 烷基 磷酸三酯 ( 其中带电荷的氧用美国专利序列号 5,023,243 和欧洲专利序列号 092,574 中的 方法烷基化 ) 可以使用商业可获得的试剂用自动固相合成方法制备。现有技术中对于制备 其它 DNA 骨架修饰和取代的方法已有描述。Uhlmann E et al.(1990)Chem Rev 90 ： 544 ； Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem 1 ： 165。制备嵌合寡核苷酸的方法也是已知的。例 如 Uhlmann 等的专利中描述了这些技术。
     混和骨架修饰的 ODN 可以使用商业可获得的 DNA 合成仪和标准亚磷酰胺化学 合 成。(F.E.Eckstein， “Oligonucleotides andAnalogues-A Practical Approach” IRL Press ， Oxford ， UK ， 1991 ， and M.D.Matteucci and M.H.Caruthers ， Tetrahedron Lett.21， 719(1980))。 偶 合 以 后， 用 Beaucage 试 剂 (R.P.Iyer， W.Egan， J.B.Regan and S.L.Beaucage， J.Am.Chem.Soc.112， 1253(1990))( 在乙腈中浓度为 0.075M) 或苯乙酰二 硫化物 (PADS) 通过硫化反应， 然后用乙酸酐， 2， 6- 卢剔啶的四氢呋喃溶液 (1 ∶ 1 ∶ 8 ； v ∶ v ∶ v) 和 N- 甲基咪唑 ( 在四氢呋喃中浓度为 16％ ) 加帽， 引入 PS 连接。 该加帽步骤在 硫化反应之后进行以最大程度地减少在应是硫代磷酸酯的部位上形成不希望的磷酸二酯 (PO) 连接。 在磷酸二酯连接的引入过程中， 例如在 CpG 二核苷酸上， 中间的磷 -III 通过碘的 水 / 吡啶溶液处理被氧化。从固体支持物上切割下来以后， 通过浓缩氨的处理进行最后的 去保护 (15 小时， 50℃ )， 用 NaCl 梯度 ( 例如缓冲液 A ： 乙腈 / 水＝ 1 ∶ 4/v ∶ v 中 NaH2PO4 浓度为 10mM， pH6.8 ； 缓冲液 B ： 乙腈 / 水＝ 1 ∶ 4/v ∶ v 中 NaH2PO4 浓度为 10mM， NaCl 浓度 为 1.5M ； 在 30 分钟内 5 到 60％ B， 速度为 1ml/min) 在 Gen-Pak Fax 柱 (Millipore-Waters) 上进行 HPLC 或者用毛细管电泳分析 ODN。可以用 HPLC 或在 Source High Performance 柱 (Amersham Pharmacia) 上用 FPLC 纯化。将 HPLC- 单一级分混和并通过 C18 柱或超滤进行 脱盐。用 MALDI-TOF 质谱对 ODN 进行分析以确定计算质量。
     本发明的核酸还可以包括其它修饰。包括非离子的 DNA 类似物， 例如烷基和芳基磷酸盐 ( 其中带电荷的膦酸盐氧被烷基或芳基取代 )， 磷酸二酯和烷基磷酸三酯， 其中带电 荷的氧被烷基化。 含有二醇的核酸， 例如四乙二醇或六乙二醇， 其每个末端或所有末端基本 上都能抵抗核酸酶的降解。
     在一些实施方案中， 所述寡核苷酸可以是柔性或半柔性寡核苷酸。柔性寡核苷 酸是具有部分稳定骨架的免疫刺激寡核苷酸， 其中只在至少一个内部嘧啶 - 嘌呤二核苷 酸 (YZ) 的内部或其紧邻部位具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接。优选 YZ 是 YG， 嘧 啶 - 鸟嘌呤核苷 (YG) 二核苷酸。所述至少一个内部 YZ 二核苷酸本身具有磷酸二酯或磷酸 二酯样核苷酸间连接。所述至少一个内部 YZ 二核苷酸紧邻部位的磷酸二酯或磷酸二酯样 核苷酸间连接可以是在所述至少一个内部 YZ 二核苷酸的 5’ ， 3’ 或同时在 5’ 和 3’ 。
     特别是， 磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接包括 “内部二核苷酸” 。通常内部二 核苷酸是指任意一对通过核苷酸间连接相连的相邻核苷酸， 其中该对核苷酸中的任何一个 都不是末端核苷酸， 即， 该对核苷酸中没有一个核苷酸是所述寡核苷酸的 5’ 或 3’ 末端。因 此 n 个核苷酸长的线性寡核苷酸具有总共 n-1 个二核苷酸， 只有 n-3 个内部二核苷酸。内 部二核苷酸的每个内部核苷酸间连接都是内部核苷酸间连接。因此 n 个核苷酸长的线性寡 核苷酸具有总共 n-1 个二核苷酸， 只有 n-3 个内部二核苷酸。因此， 策略性放置的磷酸二酯 或磷酸二酯样核苷酸间连接指位于核酸序列中任意一对核苷酸之间的磷酸二酯或磷酸二 酯样核苷酸间连接。 在一些实施方案中所述磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接不位于靠 近 5’ 或 3’ 端的任何一对核苷酸之间。
     优选所述至少一个内部 YZ 二核苷酸紧邻部位的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间 连接本身是内部核苷酸间连接。因此对于序列 N1 YZ N2， 其中 N1 和 N2 每一个独立于另一个 是任意单个核苷酸， 所述 YZ 二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯样连接， 此外 (a) 当 N1 是内 部核苷酸的时候， N1 和 Y 通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连， (b) 当 N2 是内部 核苷酸的时候， Z 和 N2 通过磷酸二酯或磷酸二酯样连接相连， 或者 (c) 当 N1 是内部核苷酸 的时候， N1 和 Y 通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连， 并且当 N2 是内部核苷酸的 时候， Z 和 N2 通过磷酸二酯或磷酸二酯样连接相连。
     根据本发明的柔性寡核苷酸与完全稳定的寡核苷酸相比相对比较容易受到核酸 酶的切割。虽然不受特定理论或机制的限制， 认为本发明的柔性寡核苷酸相对于全长柔性 寡核苷酸可被切割为具有降低的或没有免疫刺激活性的片段。 引入至少一个对核酸酶敏感 的核苷酸间连接， 特别是在所述寡核苷酸中部附近， 可以提供一个 “关闭开关” ， 它可以改变 所述寡核苷酸的药物动力学以至于可以减少所述寡核苷酸的最大免疫刺激活性的持续时 间。这在组织和临床应用中可能具有特殊的价值， 因为它可以避免慢性局部炎症或免疫刺 激相关的伤害， 例如肾。
     半柔性寡核苷酸是具有部分稳定骨架的免疫刺激寡核苷酸， 其中仅仅在至少一个 内部嘧啶 - 嘌呤 (YZ) 二核苷酸的内部具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接。半柔性 寡核苷酸与相应的完全稳定的免疫刺激寡核苷酸相比， 通常具有增强的免疫刺激效果。由 于半柔性寡核苷酸具有更强的能力， 在一些实例中， 半柔性寡核苷酸与传统的完全稳定的 免疫刺激寡核苷酸相比， 为达到所希望的生物效果， 可以用于较低的有效浓度， 并且具有较 低的有效剂量。
     认为半柔性寡核苷酸的上述性质通常随着内部 YZ 二核苷酸中的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接的 “剂量” 的增加而增加。因此认为， 例如， 通常对给定的具有五个内 部 YZ 二核苷酸的寡核苷酸序列来说， 具有五个内部磷酸二酯或磷酸二酯样 YZ 核苷酸间连 接的寡核苷酸比具有四个内部磷酸二酯或磷酸二酯样 YG 核苷酸间连接的寡核苷酸更具免 疫刺激效果， 后者依次也比具有三个内部磷酸二酯或磷酸二酯样 YZ 核苷酸间连接的寡核 苷酸更具免疫刺激效果， 后者依次也比具有两个内部磷酸二酯或磷酸二酯样 YZ 核苷酸间 连接的寡核苷酸更具免疫刺激效果， 后者依次也比具有一个内部磷酸二酯或磷酸二酯样 YZ 核苷酸间连接的寡核苷酸更具免疫刺激效果。重要的是， 甚至只是含有一个内部磷酸二酯 或磷酸二酯样 YZ 核苷酸间连接也认为优于没有内部磷酸二酯或磷酸二酯样 YZ 核苷酸间连 接的。除了磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接的数目， 沿着核酸长度上的位置分布也影 响其功效。
     柔性和半柔性寡核苷酸通常包括， 除了在优选的内部位置上的磷酸二酯或磷酸二 酯样核苷酸间连接之外， 还包括能抵抗降解的 5’ 和 3’ 端。这种抵抗降解的末端可以包括 任何能使得对核酸外切酶切割的抗性比相应的未修饰末端增强的适当的修饰。例如， 所述 5’ 和 3’ 末端可以通过在骨架上的至少包含一个磷酸盐修饰实现稳定。在优选的实施方案 中， 在所述骨架的每个末端的至少一个磷酸盐修饰独立地是硫代磷酸酯， 二硫代磷酸酯， 膦 酸甲酯， 或甲基硫代磷酸酯核苷酸间连接， 在另一个实施方案中， 所述可抵抗降解的末端包 括一个或多个通过肽或 3’ 末端的酰胺键连接起来的核苷酸单位。
     磷酸二酯核苷酸间连接是天然的核酸连接特征类型。如图 20 所示， 所述磷酸二酯 核苷酸间连接包括磷原子， 其侧翼是两个桥接的氧原子， 另外还与两个氧原子相连， 一个带 电荷， 一个不带电荷。 当所述寡核苷酸的组织半衰期的减少非常重要的时候， 磷酸二酯核苷 酸间连接是特别优选的。
     磷酸二酯样核苷酸间连接是含有磷的桥接基团， 在化学性质上和 / 或非对映性质 上与磷酸二酯类似。对其与磷酸二酯相似性的检测包括对核酸酶消化的易感性以及激活 RNAse H 的能力。因此例如磷酸二酯寡核苷酸， 而不是硫代磷酸酯寡核苷酸易被核酸酶消 化， 但是磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸都能够激活 RNAseH。在优选的实施方案中所述磷 酸二酯样核苷酸间连接是 boranophosphate( 或等同的 boranophosphonate) 连接。美国专 利序列号 5,177,198 ； 美国专利序列号 5,859,231 ； 美国专利序列号 6,160,109 ； 美国专利 序列号 6,207,819 ； Sergueev et al.， (1998)JAm Chem Soc 120 ： 9417-27。在另一个优选 的实施方案中所述磷酸二酯样核苷酸间连接是非对映的纯的 Rp 硫代磷酸酯。认为非对映 的纯的 Rp 硫代磷酸酯比混和的或非对映的纯的 Sp 硫代磷酸酯更容易被核酸酶消化， 激活 RNAse H 的能力也更强。CpG 寡核苷酸的立体异构体是 1999 年 7 月 27 日申请的共同未决 的美国专利申请 09/361,575， 公开的 PCT 申请 PCT/US99/17100(WO00/06588) 请求保护的主 题。应当注意， 为本发明的目的， 术语 “磷酸二酯样核苷酸间连接” 特别地不包括二硫代磷 酸酯和膦酸甲酯核苷酸间连接。
     如上所述本发明的柔性和半柔性寡核苷酸在 C 和 G 之间具有磷酸二酯样连接。磷 酸二酯样连接的一个例子是 Rp 构象的硫代磷酸酯连接。 寡核苷酸 p 手性对于 CpG 寡核苷酸 的免疫活性具有明显相反的影响， 这取决于活性测量的时间点。在 40 分钟的早期时间点， 硫代磷酸酯 CpG 寡核苷酸的 Rp 而不是 Sp 立体异构体可在鼠脾细胞中诱导 JNK 磷酸化。相 反， 在 44 小时的晚期时间点， Sp 而不是 Rp 立体异构体具有活性可刺激脾细胞增殖。这种 Rp和 Sp 立体异构体的动力学和生物活性上的差异并不是由于细胞吸收上的任何差异造成的， 更可能是由于 p 手性的两种相反的生物学作用导致的。首先 Rp 立体异构体与 Sp 相比在早 期时间点具有增强的刺激免疫细胞的活性表明 Rp 可能更有效地与 CpG 受体， TLR9 相互作 用， 或诱导下游信号传导途径。另一方面， Rp PS- 寡核苷酸与 Sp 相比其更快的降解导致信 号传导的持续时间更短， 因此 Sp PS- 寡核苷酸在晚期时间点检测的时候表现出更强的生物 活性。
     CpG 二核苷酸本身的 p 手性就可获得令人惊讶的强烈效果。与立体随机的 CpG 寡 核苷酸相比， 其中单个 CpG 二核苷酸与 Rp 相连的同源物活性稍强， 但是含有 Sp 连接的同源 物在诱导脾细胞增殖上几乎没有活性。
     所述免疫刺激寡核苷酸的大小 ( 即沿着核酸长度方向上的核苷酸残基的数目 ) 可 能也影响所述寡核苷酸的刺激活性。为了便于细胞吸收， 免疫刺激寡核苷酸优选最小长度 为 6 个核苷酸残基。根据本发明， 如果存在足够的免疫刺激基序， 任何大于 6 个核苷酸 ( 甚 至数个 kb 长 ) 的核酸都能诱导免疫反应， 这是由于较大的核酸在细胞内部被降解。根据本 发明认为如果可以递送到细胞内部， 短至 4 个核苷酸长的半柔性寡核苷酸也可以具有免疫 刺激效果。根据本发明， 在特定的优选实施方案中， 所述免疫刺激寡核苷酸在 4 到 100 个核 苷酸之间。在典型的实施方案中所述免疫刺激寡核苷酸在 6 到 40 个核苷酸之间。根据本 发明， 在特定的优选实施方案中， 所述免疫刺激寡核苷酸在 6 到 19 个核苷酸之间。 所述免疫刺激寡核苷酸通常长度在 4 到 100 个之间， 在一些实施方案中在 10 到 40 个之间。所述长度也可以在 16 到 24 个核苷酸之间。
     术语 “核酸” 和 “寡核苷酸” 还包括具有取代或修饰， 例如在碱基和 / 或糖上的核 酸或寡核苷酸。例如， 包括具有在 2’ 部位与除羟基以外的， 并且在 5’ 部位与除磷酸盐基 团或羟基以外的低分子量的有机基团共价结合的骨架糖的核酸。因此修饰的核酸可以包 括 2’ -O- 烷基化核糖基团。此外， 修饰的核酸可以包括用糖例如阿拉伯糖或 2’ - 氟代阿拉 伯糖取代核糖。因此所述核酸在骨架组分上可以是异质的， 因而可以含有任何可能的例如 肽 - 核酸相连的聚合物单元 ( 具有氨基酸骨架和核酸碱基 ) 的组合。
     核酸还包括取代的嘌呤和嘧啶例如 C-5 丙炔嘧啶和 7- 去氮杂 -7- 取代的嘌呤修 饰的碱基。Wagner R W et al.(1996)NatBiotechnol 14 ： 840-4. 嘌呤和嘧啶包括但不限 于腺嘌呤胞嘧啶， 鸟嘌呤， 胸腺嘧啶， 5- 甲基胞嘧啶， 5- 羟基胞嘧啶， 5- 氟代胞嘧啶， 2- 氨基 嘌呤， 2- 氨基 -6- 氯嘌呤， 2， 6- 二氨基嘌呤， 次黄嘌呤和其它天然和非天然的核碱基， 取代 的和未取代的芳香部分。其它这种修饰是本领域技术人员所公知的。
     本发明的免疫刺激寡核苷酸与天然 RNA 和 DNA 相比， 可以包括各种化学修饰和取 代， 包括磷酸二酯核苷酸间桥接， β-D- 核糖单位和 / 或天然核苷酸碱基 ( 腺嘌呤， 鸟嘌呤， 胞嘧啶， 胸腺嘧啶， 尿嘧啶 )。化学修饰的实例是技术人员所公知的， 在例如 Uhlmann E et al.(1990)Chem Rev 90 ： 543 “ ；Protocols forOligonucleotides and Analogs” Synthesis and Properties & Synthesisand Analytical Techniques， S.Agrawal， Ed， Humana Press， Totowa， USA 1993 ； Crooke ST et al.(1996)Annu Rev Pharmacol Toxicol36 ： 107-129 ； 和 Hunziker J et al.(1995)Mod Synth Methods 7 ： 331-417 中有描述。根据本发明， 寡核苷 酸可以具有一个或多个修饰， 与具有同样序列的由天然 DNA 或 RNA 组成的寡核苷酸相比， 其 中每个修饰都位于特定的磷酸二酯核苷酸间桥接和 / 或特定的 β-D- 核糖单位和 / 或特定
     的天然核苷酸碱基部位。
     例如， 本发明涉及的寡核苷酸可能含有一个或多个修饰， 其中每个修饰独立地选 自：
     a) 用修饰的核苷酸间桥接代替位于核苷酸 3’ 和 / 或 5’ 端的磷酸二酯核苷酸间桥 接，
     b) 用去磷酸桥接代替位于核苷酸 3’ 和 / 或 5’ 端的磷酸二酯桥接，
     c) 用另一个单元代替糖磷酸盐骨架的糖磷酸盐，
     d) 用修饰的糖单元代替 β-D- 核糖， 以及
     e) 用修饰的核苷酸碱基代替天然核苷酸碱基。
     寡核苷酸的化学修饰的更详细的实施例如下所述。
     位于核苷酸 3’端和 / 或 5’端的磷酸二酯核苷酸间桥接可以被修饰的核苷酸 间桥接取代， 其中所述修饰的核苷酸间桥接例如可以选自硫代磷酸酯， 二硫代磷酸酯， 1 2 NR R - 氨基磷酸酯， boranophosphate， α- 羟苄基膦酸酯， 磷酸盐 -(C1-C21)-O- 烷基酯， 磷酸 盐 -[(C6-C12) 芳基 -(C1-C21)-O- 烷基 ] 酯， (C1-C8) 膦酸烷基酯和 / 或 (C6-C12) 磷酸芳基酯桥 接， (C7-C12)-α- 羟甲基 - 芳基 ( 例如 WO95/01363 中公开的 )， 其中 (C6-C12) 芳基， (C6-C20) 1 2 芳基和 (C6-C14) 芳基可选择地被卤素， 烷基， 烷氧基， 硝基， 氰基取代， 其中 R 和 R 独立地是 氢， (C1-C18)- 烷基， (C6-C20)- 芳基， (C6-C14)- 芳基 -(C1-C8)- 烷基， 优选的是氢， (C1-C8)- 烷 1 2 基， 优选的是 (C1-C4)- 烷基和 / 或甲氧乙基， 或者 R 和 R 与携带它们的氮原子一起形成 5-6- 元杂环， 所述杂环还可以进一步含有选自 O， S 和 N 的杂原子。
     位于核苷酸 3’ 端和 / 或 5’ 端的磷酸二酯桥接被去磷酸桥接取代 ( 去磷酸桥接在 例如 Uhlmann E and Peyman A in“Methods inMolecular Biology” ， Vol.20， “Protocols for Oligonucleotides andAnalogs” ， S.Agrawal， Ed.， Humana Press， Totowa 1993， Chapter16， pp.355ff 有描述 )， 其中去磷酸桥接例如可以选自去磷酸桥接 formacetal， 3’ -thioformacetal， 甲基羟胺， 肟， 亚甲基二甲基肼撑， 二亚甲基砜和 / 或甲硅烷基团。
     糖磷酸盐骨架 ( 即糖磷酸盐骨架由糖磷酸盐单元组成 ) 上的糖磷酸盐单元 ( 即 β-D- 核糖和磷酸二酯核苷酸间桥接一起形成糖磷酸盐单元 ) 可以用另一个单元取代， 其 中另一个单元例如适合于构建 “吗啉代衍生物” 寡聚物 ( 如例如 Stirchak EP et al.(1989) Nucleic Acids Res 17 ： 6129-41 中所述 )， 也就是， 例如用吗啉代衍生物单元取代 ； 或者构 建聚酰胺核酸 ( “PNA” ； 如例如 NielsenPE et al.(1994)Bioconjug Chem 5 ： 3-7 中所述 )， 也就是用 PNA 骨架单元， 例如用 2- 氨乙基甘氨酸取代。
     β- 核糖单元或 β-D-2’ - 脱氧核糖单元可以被修饰的糖单元取代， 其中修饰的糖 单元例如选自 β-D- 核糖， α-D-2’ - 脱氧核糖， L-2’ - 脱氧核糖， 2’ -F’ -2’ - 脱氧核糖， 2’ -F- 阿拉伯糖， 2’ -O-(C1-C6) 烷基 - 核糖， 优选的 2’ -O-(C1-C6) 烷基 - 核糖是 2’ -O- 甲基 核糖， 2’ -O-(C2-C6) 烯基 - 核糖， 2’ -[O-(C1-C6) 烷基 -O-(C1-C6) 烷基 ]- 核糖， 2’ -NH2-2’ -脱 氧核糖， β-D- 木 - 呋喃糖， α- 阿拉伯呋喃糖， 2， 4- 二脱氧 -β-D- 赤 -6- 吡喃糖， 和碳环 ( 如例如 FroehlerJ(1992)Am ChemSoc 114 ： 8320 中所述 ) 和 / 或开环糖类似物 ( 如例如 Vandendriessche et al.(1993)Tetrahedron 49 ： 7223 中所述 ) 和 / 或二环糖类似物 ( 如 例如 Tarkov M et al.(1993)Helv Chim Acta 76 ： 481 中所述 )。
     在一些优选的实施方案中所述糖是 2’ -O- 甲基核糖， 特别是其中一个或全部核苷酸通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连。
     核酸还包括取代的嘌呤和嘧啶例如 C-5 丙炔嘧啶和 7- 去氮杂 -7- 取代的嘌呤修 饰的碱基。Wagner RW et al.(1996)NatBiotechnol 14 ： 840-4。嘌呤和嘧啶包括但不限于 腺嘌呤， 胞嘧啶， 鸟嘌呤， 和胸腺嘧啶， 以及其它天然或非天然存在的核碱基， 取代的和未取 代的芳香部分。
     修饰的碱基可以是与天然存在于 DNA 和 RNA 中的碱基例如 T， C， G， A 和 U 在化学性 质上不同， 但是与这些天然碱基在基本化学结构上相同的任何碱基。修饰的核苷酸碱基可 以是， 例如选自次黄嘌呤， 尿嘧啶， 二氢尿嘧啶， 假尿嘧啶， 2- 硫尿嘧啶， 4- 硫尿嘧啶， 5- 氨 基尿嘧啶， 5-(C1-C6)- 烷基尿嘧啶， 5-(C2-C6)- 烯基尿嘧啶， 5-(C2-C6)- 炔基尿嘧啶， 5-( 羟 甲基 ) 尿嘧啶， 5- 氯尿嘧啶， 5- 氟尿嘧啶， 5- 溴尿嘧啶， 5- 羟基胞嘧啶， 5-(C1-C6)- 烷基胞 嘧啶， 5-(C2-C6)- 烯基胞嘧啶， 5-(C2-C6)- 炔基胞嘧啶， 5- 氯胞嘧啶， 5- 氟胞嘧啶， 5- 溴胞嘧 2 啶， N - 二甲基鸟嘌呤， 2， 4- 二氨基 - 嘌呤， 8- 氮杂嘌呤， 取代的 7- 去氮杂嘌呤， 优选 7- 去 氮杂 -7- 取代的和 / 或 7- 去氮杂 -8- 取代的嘌呤， 5- 羟甲基胞嘧啶， N4- 烷基胞嘧啶， 例如 N4- 乙基胞嘧啶， 5- 羟基脱氧胞苷， 5- 羟甲基脱氧胞苷， N4- 烷基脱氧胞苷， 例如 N4- 乙基脱 氧胞苷， 6- 硫代脱氧鸟苷， 和硝基吡咯的脱氧核苷酸， C5- 丙炔嘧啶， 和二氨基嘌呤， 例如 2， 6- 二氨基嘌呤， 次黄嘌呤核苷， 5- 甲基胞嘧啶， 2- 氨基嘌呤， 2- 氨基 -6- 氯嘌呤， 次黄嘌呤 或其它对天然核苷酸碱基的修饰。这些列表只是举例说明而并非限制。
     在本文所述的特定通式中定义了一组修饰的碱基。例如字母 Y 用于表示含有胞嘧 啶或修饰的胞嘧啶的核苷酸。 这里所说的修饰的胞嘧啶是天然存在的或非天然存在的胞嘧 啶的嘧啶碱基类似物， 它可以取代该碱基而不会破坏所述寡核苷酸的免疫刺激活性。修饰 的胞嘧啶包括但不限于 5- 取代的胞嘧啶 ( 例如 5- 甲基 - 胞嘧啶， 5- 氟代 - 胞嘧啶， 5- 氯 代 - 胞嘧啶， 5- 溴代 - 胞嘧啶， 5- 碘代 - 胞嘧啶， 5- 羟基 - 胞嘧啶， 5- 羟甲基 - 胞嘧啶， 5- 二 氟甲基 - 胞嘧啶， 和未取代的或取代的 5- 炔基 - 胞嘧啶 )， 6- 取代的胞嘧啶， N4- 取代的胞 嘧啶 ( 例如 N4- 乙基 - 胞嘧啶 )， 5- 氮杂 - 胞嘧啶， 2- 巯基 - 胞嘧啶， 异胞嘧啶， 假 - 异胞 嘧啶， 具有稠环系统的胞嘧啶类似物 ( 例如 N， N’ - 丙烯胞嘧啶或吩恶嗪 )， 和尿嘧啶和它 的衍生物 ( 例如 5- 氟代 - 尿嘧啶， 5- 溴代 - 尿嘧啶， 5- 溴乙烯基 - 尿嘧啶， 4- 硫代 - 尿嘧 啶， 5- 羟基 - 尿嘧啶， 5- 丙炔基 - 尿嘧啶 )。一些优选的胞嘧啶包括 5- 甲基 - 胞嘧啶， 5- 氟 代 - 胞嘧啶， 5- 羟基 - 胞嘧啶， 5- 羟甲基 - 胞嘧啶， 和 N4- 乙基 - 胞嘧啶。在本发明的另一 个实施方案中， 所述胞嘧啶碱基被一般的碱基 ( 例如 3- 硝基吡咯， P- 碱基 )， 芳香环系统 ( 例如氟苯或二氟苯 ) 或氢原子 (dSpacer)。
     字母 Z 用于表示鸟嘌呤或修饰的鸟嘌呤碱基。这里所述的修饰的鸟嘌呤是天然存 在的或非天然存在的鸟嘌呤的嘌呤碱基类似物， 它可以取代该碱基而不会破坏所述寡核苷 酸的免疫刺激活性。修饰的鸟嘌呤包括但不限于 7- 去氮杂鸟嘌呤， 7- 去氮杂 -7- 取代的 鸟嘌呤 ( 例如 7- 去氮杂 -7-(C2-C6) 炔基鸟嘌呤 )， 7- 去氮杂 -8- 取代的鸟嘌呤， 次黄嘌呤， N2- 取代的鸟嘌呤 ( 例如 N2- 甲基 - 鸟嘌呤 )， 5- 氨基 -3- 甲基 -3H， 6H-thiazolo[4， 5-d] 嘧啶 -2， 7- 二酮， 2， 6- 二氨基嘌呤， 2- 氨基嘌呤， 嘌呤， 吲哚， 腺嘌呤， 取代的腺嘌呤 ( 例如 N6- 甲基 - 腺嘌呤， 8- 氧代 - 腺嘌呤 )8- 取代的鸟嘌呤 ( 例如 8- 羟基鸟嘌呤和 8- 溴代鸟 嘌呤 )， 和 6- 硫代鸟嘌呤。在本发明的另一个实施方案中， 所述鸟嘌呤碱基被一般的碱基 ( 例如 4- 甲基 - 吲哚， 5- 硝基 - 吲哚， 和 K- 碱基 )， 芳香环系统 ( 例如苯并咪唑或二氯 - 苯并咪唑， 1- 甲基 -1H-[1， 2， 4] 三唑 -3- 羧酸酰胺 ) 或者氢原子 (dSpacer)。
     所述寡核苷酸可以具有一个或多个可及的 5’ 末端。能够制备具有两个这样的 5’ 末端的修饰的寡核苷酸。这可以通过将两个寡核苷酸通过 3’ -3’ 连接相连起来产生 具有一个或两个可及的 5’ 末端的寡核苷酸。所述 3’ -3’ 连接可以是磷酸二酯， 硫代磷 酸酯或任意其它修饰的核苷酸间桥接。获得这种连接的方法是本领域已知的。例如， 这 种连接在 Seliger， H. ； et al.， Oligonucleotide analogswith terminal 3′ -3′ -and 5 ′ -5 ′ -internucleotidic linkages as antisenseinhibitors of viral gene expression， Nucleotides & Nucleotides(1991)， 10(1-3)， 469-77 and Jiang， et al.， Pseudo-cyclicoligonucleotides ： in vitro and in vivo properties， Bioorganic &Medicinal Chemistry(1999)， 7(12)， 2727-2735 中有描述。
     此外， 其中 3’ 末端核苷酸之间的连接并非磷酸二酯， 硫代磷酸酯或其它修饰的桥接 的 3’ -3’ 连接的核酸可以用另外的间隔基团制备， 例如三或四乙二醇磷酸盐部分 (Durand， M.et al， Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one(dA)12and two(dT)12sequences bridged by two hexaethylene glycolchains， Biochemistry(1992)， 31(38)， 9197-204， US Patent No.5658738， 和美国专利序列号 5668265)。另外， 非核苷酸 的连接子可以用标准的亚磷酰胺化学从乙二醇， 丙二醇， 或得自脱碱基脱氧核糖 (dSpacer) 单 元 (Fontanel， Marie Laurence et al.， Stericalrecognition by T4polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties5′ -attached to oligonucleotides ； Nucleic Acids Research(1994)， 22(11)， 2022-7) 获得。 非核苷酸连接子可以一次引入或多次引入， 或者彼此 组合以使要被连接的两个 ODN 的 3’ 末端之间具有任意希望的距离。
     为在本发明中使用， 本发明的寡核苷酸可以用本领域熟知的多种方法中的任何 一种进行合成。例如， b- 氰乙基亚磷酰胺方法 (Beaucage， S.L.， and Caruthers， M.H.， Tet.Let.22 ： 1859， 1981) ； 核苷酸 H- 膦酸盐方法 (Garegg et al.， Tet.Let.27 ： 4051-4054， 1986 ； Froehler et al.， Nucl.Acid.Res.14 ： 5399-5407， 1986， ； Garegg et al.， Tet.Let.27 ： 4055-4058， 1986， Gaffney et al.， Tet.Let.29 ： 2619-2622， 1988)。这些化学方法可以使用各 种市场上可获得的自动核酸合成仪进行操作。 这些寡核苷酸被称为合成寡核苷酸。 分离的寡 核苷酸通常是指从天然状态下与之结合的组分中分离出来的寡核苷酸。作为一个例子， 分离 的寡核苷酸可以是从细胞， 从核， 从线粒体或从染色质中分离出来。
     所述寡核苷酸对降解具有部分抗性 ( 例如是稳定的 )。 “稳定的寡核苷酸分子” 指 对于体内降解 ( 例如通过外切或内切核酸酶 ) 相对具有抗性的寡核苷酸。核酸稳定性可以 通过骨架修饰获得。具有硫代磷酸酯连接的寡核苷酸具有最大的活性， 保护所述寡核苷酸 不被细胞内的外切或内切核酸酶降解。其它修饰的寡核苷酸包括磷酸二酯修饰的核酸， 磷 酸二酯和硫代磷酸酯核酸的组合， 膦酸甲酯， 甲基硫代磷酸酯， 二硫代磷酸酯， 对乙氧基， 及 其组合。
     修饰的骨架例如硫代磷酸酯可以用自动方法用氨基磷酸酯或 H- 膦酸盐化学合 成。芳基和烷基膦酸盐可以用例如美国专利序列号 4,469,863 所述的方法制备 ； 烷基磷酸 三酯 ( 其中带电荷的氧用美国专利序列号 5,023,243 和欧洲专利序列号 092,574 中所述 的方法进行烷基化 ) 可以用商业可获得的试剂用自动固相合成制备。制备其它 DNA 骨架 修饰和取代的方法已有描述 ( 例如 Uhlmann， E.and Peyman， A.， Chem.Rev.90 ： 544， 1990 ；Goodchild， J.， Bioconjugate Chem.1 ： 165， 1990)。
     其它稳定的寡核苷酸包括 ： 非离子的 DNA 类似物， 例如烷基和芳基磷酸盐 ( 其中带 电荷的膦酸盐氧被烷基或芳基基团取代 )， 磷酸二酯和烷基磷酸三酯， 其中带电荷的氧被烷 基化。 含有二醇的核酸， 例如四乙二醇或六乙二醇， 其每个或全部末端都可以抵抗核酸酶降 解。
     所述免疫刺激寡核苷酸还可以在核苷酸或核苷酸类似物部分之间含有一个或多 个通常的连接。所述通常的核苷间连接是 3’ 5’ 连接。所有其它连接都认为是核苷间连接， 例如 2’ 5’ -， 5’ 5’ -， 3’ 3’ -， 2’ 2’ -， 2’ 3’ - 连接。因此， 术语 2’ 到 5’ 是根据核糖的碳原 子选择的。但是， 如果使用的是非天然糖分子， 例如具有扩大环的糖类似物 ( 例如六环糖， 环己烯或吡喃糖 ) 或双环或三环糖类似物， 然后其命名随单体的名称而变化。在 3’ -脱 氧 -β-D- 吡喃核糖类似物 ( 也称为 p-DNA) 中， 单核甘酸例如通过 4’ 2’ - 连接相连。
     如果所述核苷酸含有一个 3’ 3’ - 连接， 那么这种寡核苷酸类似物具有两个未连接 的 5’ - 末端。类似地， 如果所述核苷酸含有一个 5’ 5’ - 连接， 那么这种寡核苷酸类似物具 有两个未连接的 3’ - 末端。这些未连接的核苷酸末端可能更容易被它们的受体捕获。这两 种特殊的连接 (3’ 3’ - 和 5’ 5’ -) 如 Ramalho Ortigao et al. 所述 (Antisense Research and Development(1992)2， 129-46)， 其中具有 3’ 3’ - 连接的寡核苷酸据报道对核酸酶的切 割显示出增强的稳定性。
     在一个分子中也可以组合不同类型的连接， 这可能导致寡聚物的分枝。如果所述 寡核苷酸的一部分在 3’ - 末端通过 3’ 3’ - 连接与第二个寡核苷酸部分相连， 在 2’ - 末端通 过 2’ 3’ - 连接与所述分子的第三个部分相连， 将会得到例如具有三个 5’ - 末端 (3’ 3’ -， 2’ 3’ - 分枝 ) 的分枝的寡核苷酸。
     理论上， 寡核苷酸的不同部分之间或者不同的寡核苷酸之间分别是通过所述分子 的所有部分连接起来的， 只要不会干扰其受体的识别。 根据所述核酸的性质， 所述连接可以 包括糖分子 (Su)， 杂环核碱基 (Ba) 或磷酸骨架 (Ph)。因此 Su-Su， Su-Ph， Su-Ba， Ba-Ba， Ba-Su， Ba-Ph， Ph-Ph， Ph-Su， 和 Ph-Ba 类型的连接都是有可能的。如果所述寡核苷酸进一 步由特定的非核苷酸的取代基修饰， 还可以通过寡核苷酸修饰部分进行连接。这些修饰还 包括修饰的核酸， 例如 PNA， LNA， 或吗啉代寡核苷酸类似物。
     所述连接优选由 C， H， N， O， S， B， P 和卤素组成， 含有 3 到 300 个原子。具有 3 个 原子的实例是乙缩醛连接 (ODN1-3’ -O-CH2-O-3’ -ODN2 ； Froehler and Matteucci)， 将一 个核苷酸的 3’ - 羟基与第二种寡核苷酸的 3’ - 羟基连接起来。具有 300 个原子的实例 是 PEG-40( 聚乙二醇四十 )。优选的连接是磷酸二酯， 硫代磷酸酯， 膦酸甲酯， 氨基磷酸酯， boranophosphoate， 酰胺， 乙醚， 硫醚， 乙缩醛， 硫缩醛， 脲， 硫脲， 磺酰胺， Schiff’ s 碱基和二 硫键。另一种可能是使用 Solulink BioConjugation 系统 (www.trilinkbiotech.com)。
     如果所述寡核苷酸由两个或多个序列部分组成， 这些部分可以是相同的或是不同 的。 因此， 在具有 3’ 3’ - 连接的寡核苷酸种， 序列可以是相同的 5′ -ODN1-3′ 3′ -ODN1-5′ 或是不同的 5′ -ODN1-3′ 3′ -ODN2-5′。而且， 各个寡核苷酸部分的化学修饰以及它们 的连接部分可以是不同的。由于短寡核苷酸的吸收似乎比长寡核苷酸更差， 将两个或多个 短序列连接起来可以获得提高的免疫刺激效果。短寡核苷酸的长度优选是 2-20 个核苷酸， 更优选是 3-16 个核苷酸， 最优选是 5-10 个核苷酸。优选的连接起来的寡核苷酸具有两个或多个未连接的 5’ 末端。
     所 述 寡 核 苷 酸 的 部 分 序 列 还 可 以 用 非 核 苷 酸 连 接 子， 特别是脱碱基连接子 (dSpacer)， 三乙烯单位或六乙二醇单位连接。更优选的连接子是烷氨基连接子， 例如 C3， C6， C12 氨基连接子， 以及烷基硫醇连接子， 例如 C3 或 C6 硫醇连接子。 所述寡核苷酸还可以 通过芳香残基连接起来， 所述芳香残基还可以进一步被烷基或取代的烷基基团取代。所述 寡核苷酸还可以含有二倍体或三倍体单位 (www.genres.com)， 特别是那些具有 3’ 3’ - 连接 的寡核苷酸。由多个二倍体， 三倍体， 或其它多倍体单位造成的寡核苷酸的树枝状大分子， 这也是本发明的一个实施方案。 所述寡核苷酸还可以含有通过肽修饰试剂或寡核苷酸修饰 试剂得到的连接子单位 (www.glenres.com)。 进一步， 它还可以含有一个或多个天然的或非 天然的由肽 ( 酰胺 ) 键连接起来的氨基酸残基。
     另一种寡核苷酸连接是通过杂环碱基的交联 (Verma andEckstein ； Annu.Rev. Biochem.(1998)67 ： 99-134 ； page 124)。还有一种是一个序列部分的糖分子和另一个 序列部分的杂环碱基之间的连接 (Iyer et al.Curr.Opin.Mol.Therapeutics(1999)1 ： 344-358 ； page 352)。
     不同的寡核苷酸可以通过已知方法合成， 可以在固相合成过程中直接连接。 另外， 它们还可以在单个部分的序列合成以后再连接起来。 “受试体” 指人或脊椎动物， 包括但不限于狗， 猫， 马， 牛， 猪， 绵羊， 山羊， 鸡， 非人的 灵长类动物 ( 例如猴 )， 鱼 ( 水产养殖种类， 例如鲑鱼 )， 兔， 大鼠和小鼠。
     “具有病毒感染的受试体” 是指暴露于病毒中并且具有急性或慢性症状或体内具 有可检测到的病毒的受试体。在本发明的优选实施方案中， 所述受试体是具有慢性病毒感 染， 更优选是慢性丙型肝炎感染的受试体。 在本发明的重要方面， 所述受试体是对先前的丙 型肝炎感染治疗没有反应的受试体。例如， 没有反应的受试体包括先前用例如 IFN-a( 例如 内含子 (Intron A)) 治疗丙型肝炎感染但是没有成功的受试体， 如本文所述的。本发明包 括治疗没有反应的受试体， 在一些实施例中包括鉴别没有反应的受试体， 以挑选有效的治 疗方法。
     免疫刺激核酸在任何脊椎动物中都是有效的。 不同的免疫刺激核酸可能产生的最 佳免疫刺激效果随哺乳动物种类的不同而不同。 因此在人中引起最佳刺激效果或抑制的免 疫刺激核酸不一定在小鼠中也能引起最佳刺激效果或抑制， 反之亦然。本领域技术人员能 够通过本文所述的和 / 或本领域公知的常规检测， 根据本文给出的教导确定可用于感兴趣 的特定哺乳动物种类的最合适的免疫刺激核酸。
     所述免疫刺激寡核苷酸可以直接给受试体施用或者可以与核酸递送复合体一起 施用。 “核酸递送复合体” 指核酸分子与靶定工具 ( 例如能导致与靶细胞 ( 例如 pDC 或 B 细 胞 ) 有更高亲和力和 / 或能增强靶细胞吸收的分子 ) 相结合 ( 例如离子或共价结合 ； 或制 成胶囊 )。核酸递送复合体的实例包括核酸与甾醇 ( 例如胆固醇 )， 脂类 ( 例如阳离子脂， 病毒颗粒或脂质体 )， 或靶细胞特异的结合试剂 ( 例如能被靶细胞特异的受体识别的配体 ) 相结合。 优选的复合体在体内应足够稳定， 以防止在被靶细胞内在化以前就显著地解离。 但 是， 复合体在细胞内适当的条件下应当是能解离的， 使得所述寡核苷酸能释放出其功能形 式。
     所述免疫刺激寡核苷酸或其它治疗剂可以单独给药 ( 例如在盐水或缓冲液中 ) 或
     者用本领域已知的任何递送载体给药。例如已有关于下述递送载体的描述 ： 螺旋体 ； 乳化 剂； ISCOM ； 脂质体 ； 活细菌载体 ( 例如沙门氏菌， 大肠杆菌， Bacildzscalfnatte-guerin， 志贺氏菌， 乳酸菌 ) ； 活病毒载体 ( 例如牛痘， 腺病毒， 单纯疱疹 ) ； 微球 ； 核酸疫苗 ； 聚合物 ( 例如羧甲基纤维素， 甲壳素 ) ； 聚合物环 ； 蛋白体 ； 氟化钠 ； 转基因植物 ； 病毒颗粒 ； 病毒样 粒子。本领域技术人员应当认识到其它递送载体是本领域已知的， 也可以使用。
     结合本文所提供的教导， 通过选择各种活性化合物和加权因子例如功效， 相关生 物可获得性， 受试体体重， 副作用的严重程度和优选的给药方式， 可以选择一种有效的治疗 性治疗方案， 不致引起严重的毒性并且还能完全有效地治疗上述的特定受试体。任何特定 应用的有效量随各种因子的不同而不同， 这些因子如要治疗的疾病或状况， 待给药的特定 的免疫刺激寡核苷酸 ( 例如 CpG 免疫刺激核酸的种类， 未甲基化 CpG 基序的数目或它们在 所述核酸中的位置， 所述寡核苷酸的手性程度等 )， 是否也进行抗原给药以及抗原的特性， 受试体的体格大小， 或者所述疾病或状况的严重程度。本领域普通技术人员无需过度的实 验就能够根据经验确定特定免疫刺激寡核苷酸和 / 或其它治疗剂的有效量。
     对于成年人受试体， 本文所述的所述免疫刺激核酸化合物的剂量典型地是大约 50μg/ 剂量到 20mg/ 剂量， 更典型地是大约 80μg/ 剂量到 8mg/ 剂量， 最典型地是大约 800μg/ 剂量到 4mg/ 剂量。按照受试体体重确定的典型剂量是大约 0.5 到 500μg/kg/ 剂 量， 更典型的是大约 1 到 100μg/kg/ 剂量， 最典型地是大约 10 到 50μg/kg/ 剂量。剂量所 依据的因素包括给药方式， 例如口服给药可能比皮下给药需要更大的剂量。
     本发明的配方是以药学可接受的溶液给药， 通常包括药学可接受浓度的盐， 缓冲 试剂， 防腐剂， 相容的载体， 佐剂和任选的其它治疗成分。
     所述免疫刺激核酸可以与本领域公知的其它可用于治疗病毒感染的试剂一起给 药。具有特别重要意义的是免疫刺激核酸与抗病毒试剂例如 IFN-α 的组合， 如实施例部分 所证明的， 产生协同反应。免疫刺激核酸可以用作病毒唑的替代物， 后者目前是与 IFN-α 一起给药。 目前与 IFN-α 一起使用或者正在研究其与 IFN-α 一起使用的试剂包括金刚胺， 和细胞因子， 包括 IL-2， IL-10， IL-12， 和 IFN-γ。
     抗病毒试剂是能防止细胞被病毒感染或病毒在细胞内复制的化合物。 抗病毒药物 比抗细菌药物少的多， 因为病毒复制的过程与宿主细胞内 DNA 的复制非常地接近， 以至于 非特异性的抗病毒剂通常对宿主都有毒性。病毒感染过程中有几个阶段可被抗病毒剂阻 断或抑制。这些阶段包括， 病毒与宿主细胞接触 ( 免疫球蛋白或结合肽 )， 病毒的脱壳 ( 例 如金刚胺 )， 病毒 mRNA 的合成或翻译， 包括翻译起始 ( 例如干扰素， 反义， 和核酶 )， 病毒酶 ( 例如非结构性丝氨酸蛋白酶， RNA 聚合酶， 逆转录酶和解螺旋酶 )， 病毒 RNA 或 DNA 的复 制 ( 例如核苷类似物 )， 新病毒蛋白的成熟 ( 例如蛋白酶抑制剂如 Boehringer Ingelheim 的丝氨酸蛋白酶抑制剂 BILN2061ZW)， 抗氧化剂例如 Livfit(USP6,136,316)， 以及病毒的 出芽和释放。其它抗病毒试剂如 USP6,130,326， 和 6,440,985， 以及公开的美国专利申请 20020095033 中所述。病毒唑类似物也包括在本发明的抗病毒试剂中。
     核苷酸类似物是与核苷酸类似， 但是具有不完整的或异常的脱氧核糖或核糖基团 的合成化合物。一旦细胞中存在核苷酸类似物， 它们会被磷酸化， 产生三磷酸形式， 与正常 的核苷酸竞争加入病毒 DNA 或 RNA。一旦核苷酸类似物的三磷酸形式加入到生长的核酸链 中， 它就会与病毒聚合酶不可逆地结合， 使链终止。免疫球蛋白治疗典型地用于病毒感染的预防， 但也可以用于减少循环的病毒的水 平并防止新形成的细胞被感染。病毒感染的免疫球蛋白治疗与细菌感染不同， 因为免疫球 蛋白并不是抗原特异性的， 而是与细胞外的病毒粒子结合， 防止它们粘附并进入可能被病 毒感染的细胞。所述治疗可用于在宿主中存在抗体的时期减少病毒败血症。通常有两种类 型的免疫球蛋白治疗， 正常的免疫球蛋白治疗和超免疫球蛋白治疗。正常的免疫球蛋白治 疗是用正常血液供体的血清制备并汇集的抗体产物。 这种汇集的产物包含针对多种人体病 毒， 例如甲型肝炎， 细小病毒， 肠道病毒 ( 特别是新生儿 ) 的低滴度的抗体。为了对 HCV 进 行正常免疫球蛋白的治疗， 应当从以前感染过 HCV 但是没有能自发地或是用一些形式的治 疗成功清除感染的人获取血清。 超免疫球蛋白治疗使用由具有针对特定病毒的高滴度抗体 的个体的血清制备的抗体。 然后可将这些抗体用于抵抗特异的病毒。 对于 HCV， 超免疫球蛋 白可以通过给志愿者接种重组 HCV 蛋白以产生丙型肝炎免疫球蛋白来制备。
     其 它 适 用 于 本 发 明 的 方 法 的 抗 病 毒 剂 由 TrianglePharmaceuticals， Inc.， Gilead， ICN， Procter and Gamble andViroPharma Incorporated 制造。
     为在治疗中使用， 所述免疫刺激寡核苷酸的有效量可以以任何能将所述寡核苷酸 递送到所希望的表面， 例如粘膜， 系统的方式给予受试体。 本发明的药物组合物的 “给药” 可 以使用任何技术人员所公知的方法。给药的优选方法包括但不限于口服， 肠胃外， 肌肉内， 鼻内， 舌下， 气管内， 吸入， 眼内， 阴道内， 和直肠内。
     口服给药的时候， 所述化合物 ( 即免疫刺激寡核苷酸， 或其它治疗剂 ) 可以容易地 通过将活性化合物与本领域熟知的药学可接收的载体混合起来配制。 这种载体使本发明的 化合物可配制成片剂， 丸剂， 糖衣丸， 胶囊， 液体， 凝胶， 糖浆， 淤浆， 悬液等等， 可使受到治疗 的受试体口服吸收。 口服使用的药物制剂可以用固体赋形剂， 任选地研磨成最终的混合物， 处理各个微粒的混合物， 加入合适的助剂， 如果希望的话， 可以获得片剂或糖衣丸。合适的 赋形剂特别可以是填充剂例如糖， 包括乳糖， 蔗糖， 甘露醇， 或山梨醇 ； 纤维素制剂例如玉米 淀粉， 小麦淀粉， 稻淀粉， 马铃薯淀粉， 白明胶， 黄蓍胶， 甲基纤维素， 羟丙基甲基纤维素， 羧 甲基纤维素钠， 和 / 或聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)。 如果希望的话， 还可以加入分解剂， 例如交联 聚乙烯吡咯烷酮， 琼脂， 或褐藻酸或其盐， 例如褐藻酸钠。 任选地， 口服配方还可以配制在盐 水或缓冲液中以中和内部的酸性条件， 或者也可以不用任何载体给药。
     糖衣药丸核具有合适的包覆层。为此目的可使用浓缩的糖溶液， 其任选地含有阿 拉伯胶， 滑石粉， 聚乙烯吡咯烷酮， 聚羰乙烯凝胶， 聚乙二醇， 和 / 或二氧化钛， 漆溶液， 和合 适的有机溶剂或溶剂混合物。 还可以向片剂或糖衣药丸包覆层中加入染料或色素以识别或 表征不同的活性化合物剂量的组合。
     可以口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推入配合的胶囊， 以及由明胶制成的 软的密封的胶囊和增塑剂， 例如甘油或山梨醇。推入配合的胶囊包括混合物中的活性成分 以及填充物例如乳糖， 粘合剂例如淀粉， 和 / 或润滑剂例如滑石或硬脂酸镁以及任选地稳 定剂。 在软胶囊中， 活性化合物可以在合适的液体， 例如脂肪油， 液体石蜡， 或液体聚乙二醇 中溶解或悬浮。此外， 可以加入稳定剂。口服给药可以配制成微球。本领域中已知这种微 球。口服给药的所有配方的剂量应当适用于这种给药方式。
     对于颊给药， 所述组合物可用传统方法配制成片剂或锭剂。
     对于吸入式给药， 根据本发明可使用的化合物可以方便地以压力罐或喷雾器中产生的喷雾剂的形式递送， 并使用合适的推进剂， 例如二氯二氟甲烷， 三氯氟甲烷， 二氯四氟 乙烷， 二氧化碳或其它合适的气体。 使用压力喷雾剂的时候， 剂量单位可以用泵确定并递送 计量好的量。 吸入器或吹入器中使用的例如明胶的胶囊和药筒可以配制为含有化合物的粉 末混合物和适当的粉末基底例如乳糖或淀粉。
     当希望系统递送的时候， 所述化合物可以配制成通过注射， 例如通过高剂量注射 或连续输注进行肠胃外给药。 注射的配方可以制成单位剂型， 例如安瓿瓶或多剂量容器， 并 加入防腐剂。 所述组合物可以制成油质载体或水质载体中的悬液， 溶液或乳液的形式， 可以 含有配方剂例如悬浮， 稳定和 / 或分散试剂。
     肠胃外给药的药物配方包括水溶形式的活性化合物的水溶液。此外， 活性化合物 的悬液可以制成适当的油质注射悬液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油例如芝麻油， 或合成的脂肪酸酯， 例如油酸乙酯或甘油三酸酯， 或脂质体。 水质注射悬液可以含有能增加 悬液粘性的物质， 例如羧甲基纤维素钠， 山梨醇， 或右旋糖苷。 任选地， 所述悬液还可以含有 合适的稳定剂或能增强所述化合物的溶解性以制备高浓度溶液的试剂。
     可选择地， 所述活性化合物可以是粉末形式， 在使用前与合适的载体， 例如无菌的 不含热源的水组合。
     所述化合物还可以制成直肠或阴道组合物例如栓剂或保留灌肠， 例如含有传统的 栓剂基剂例如可可油或其它甘油酯。
     除了上述的配方， 所述化合物还可以制成长效制剂。这种长期作用的配方可以用 合适的聚合物或疏水物质 ( 例如在可接收的油中作为乳化剂 ) 或离子交换树脂配制， 或制 成微溶的衍生物， 例如微溶的盐。
     所述药物组合物还可以包括合适的固体或凝胶相的载体或赋形剂。 这种载体或赋 形剂的实例包括但不限于碳酸钙， 磷酸钙， 各种糖， 淀粉， 纤维素衍生物， 明胶， 和聚合物例 如聚乙二醇。
     合适的液体或固体药物制剂形式是， 例如吸入用的水或盐溶液， 微胶囊， 螺旋体， 被微金颗粒包裹， 包含在脂质体中， 喷雾剂， 气溶胶， 植入皮肤的小球， 或在尖锐物体上干燥 以擦入皮肤。所述药物组合物还可以包括微粒， 粉末， 片剂， 包衣片剂， ( 微 ) 胶囊， 栓剂， 糖浆， 乳液， 悬液， 霜剂， 液滴或延长活性化合物释放的制剂， 如上所述， 在这些制剂中照例 使用赋形剂和添加剂和 / 或助剂例如分解剂， 粘合剂， 包覆剂， 溶胀剂， 润滑剂， 调味剂， 甜 味剂或增溶剂。所述药物组合物适用于各种药物递送系统。药物递送的方法综述， 参见 Langer， Science 249 ： 1527(1990)， 在此引入其全文作为参考。
     所述免疫刺激寡核苷酸可以用其本身 ( 纯的 ) 或以药学可接收的盐的形式给 药。当用于药物的时候， 盐应当是药学可接收的， 但是非药学可接收的盐也可以用于制备 药学可接收的盐。这种盐包括但不限于那些用下述酸制备的盐 ： 盐酸， 氢溴酸， 磺酸， 硝酸， 磷酸， 马来酸， 乙酸， 水杨酸， 对甲苯硫酸， 酒石酸， 柠檬酸甲烷磺酸， 甲酸， 丙二酸， 琥珀酸， 萘 -2- 磺酸， 和苯磺酸。而且， 这些盐可以制成碱金属或碱土金属盐， 例如羧酸基团的钠， 钾 或钙盐。
     合适的缓冲剂包括 ： 乙酸及其盐 (1-2 ％ w/v) ； 柠檬酸及其盐 (1-3 ％ w/v) ； 硼 酸及其盐 (0.5-2.5 ％ w/v) ； 和磷酸及其盐 (0.8-2 ％ w/v)。合适的防腐剂包括苯扎氯铵 (0.003-0.03％ w/v) ； 氯代丁醇 (0.3-0.9％ w/v) ； 对羟基苯甲酸酯类 (0.01-0.25％ w/v) 和硫柳汞 (0.004-0.02％ w/v)。
     本发明的药物组合物含有药学可接收的载体。 术语 “药学可接收的载体” 是指一种 或多种适用于给人和其它脊椎动物施用的相容的固体或液体填充剂， 稀释剂或封装物质。 术语 “载体” 指有机或无机成分， 天然的或是合成的， 它们与活性成分组合在一起有利于使 用。所述药物组合物的组分还可以与本发明的化合物互相混和， 条件是它们之间没有能破 坏所需的药物功效的相互作用。
     可以使用各种给药方式。特定给药方式的选择取决于所选择的特定佐剂或抗原， 要治疗的特定状况以及疗效所需要的剂量。 本发明的方法， 总的来说， 可以使用医药上可接 受的任何给药方式实施， 就是指任何能产生有效水平的免疫反应而不引起临床上不可接受 的副作用的任何方式。优选的给药方式如上所述。
     所述组合物可以方便地制成单位剂量的形式， 可以用药学领域熟知的方法制备。 所有方法都包括将所述化合物与组成一种或多种附属成分的载体结合的步骤。通常， 所述 组合物的制备是通过均匀紧密地将所述化合物与液体载体， 粒状的固体载体， 或二者结合， 然后， 如果需要的话， 使产品成形。液体剂量单位是小药水瓶或安瓿瓶。固体剂量单位是片 剂， 胶囊和栓剂。为了治疗受试体， 依据所述化合物的活性， 给药的方式， 免疫的目的 ( 即预 防性的或是治疗性的 )， 疾病的特征和严重程度， 受试体的年龄和体重不同， 需要不同的剂 量。给定剂量的给药可以以单次剂量单位的形式单次给药或者几次小剂量单位给药。
     其它递送系统包括定时释放， 延迟释放或持续释放递送系统。这种系统可以避免 所述化合物重复给药， 为受试体和医师提供方便。许多类型的释放递送系统都是可用的也 是本领域普通技术人员公知的。 包括基于聚合物的系统例如聚 ( 丙交酯 - 乙交酯 )， 共聚草 酸盐， 聚酐。 含有上述聚合物的微胶囊的药物如例如美国专利 5,075,109 中所述。 递送载体 还包括非聚合物系统 ： 脂类包括固醇例如胆固醇， 胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪例如单， 双 和三甘油酯 ； 水凝胶释放系统 ； 硅橡胶系统 ； 基于肽的系统 ； 蜡包覆层 ； 用传统的粘合剂和 赋形剂制作的压缩片剂 ； 部分融合的植入物 ； 等等。特定的例子包括但不限于 ： (a) 侵蚀系 统， 其中本发明的试剂包含在如美国专利序列号 4,452,775， 4,675,189， 和 5,736,152 所述 的基质中， (b) 扩散系统， 其中所述活性组分以可控速度从如美国专利序列号 3,854,480， 5,133,974 和 5,407,686 所述的聚合物中透出。此外， 还可以使用基于泵的硬件递送系统， 其中一些适于植入。
     在一些实施方案中， 所述免疫刺激核酸被修饰。 在特定的实施方案中， 所述免疫刺 激核酸具有具有至少一个可抵抗核酸酶降解的核苷酸间连接的修饰的骨架。 可抵抗核酸酶 降解的核苷酸间连接可选自硫代磷酸酯连接， 二硫代磷酸酯连接， 膦酸甲酯连接和肽连接。 在特定的实施方案中修饰的免疫刺激核酸包括至少一个核苷酸类似物或者至少一个核苷 酸类似物。 在特定的实施方案中所述免疫刺激核酸是回文结构， 在其它实施方案中， 所述免 疫刺激核酸不是回文结构。在一些优选的实施方案中所述免疫刺激核酸的长度在 8 到 100 个核苷酸之间， 在其它优选的实施方案中， 所述免疫刺激核酸的长度在 12 到 40 个核苷酸之 间。优选的大小， 序列和修饰将在下面详细讨论。
     下述实施例是为了举例说明而并非限制本发明的范围。 实施例本研究的目的是为了评价不同类型的 CpG ODN 刺激 HCV 慢性携带者的 PBMC 的能 力。PBMC 是从正常的健康的志愿者以及 HCV 慢性携带者的全血中分离的， 评价不同类型 的 CpG ODN 以及柔性和半柔性分子在体外刺激 B 细胞增殖， 细胞因子分泌 (IFN-g， TNF-α， IL-10 和 IFN-α) 和趋化因子分泌 (IP-10) 的能力。
     还评价了外源 IFN-α-2b( 内含子 A(Intron A)) 和病毒唑分别单独， 以及互相组 合， 以及与 CpG ODN(B 和 C 类 ) 组合的免疫刺激效果。
     材料与方法
     寡核苷酸
     所 有 的 寡 核 苷 酸 原 料 重 悬 于 pH 8.0 的 TE 缓 冲 液 (OmniPerg ； EM Science， Gibbstown， NJ) 中。不同的 ODN 在用于细胞检测之前稀释于含有 10％加热灭活的正常人 AB 血清 (Wisent Inc， St.Bruno， QC) 和 1％青霉素 / 链霉素 (Gibco BRL， Grand Island， NY) 的 RPMI 1640 完全培养基 (Gibco BRL， Grand Island， NY) 中。对于外源 IFN-α 协同实 验， 将内含子 A(Intron A)(InterferonAlfa-2b， DIN 02223406， Schering Canada Inc.， Pointe-Claire， Quebec， Canada) 加入到 ODN 溶液中使其终浓度为 125 或 1000IU/ml。病毒 唑 (CAS 36791-04-5， Calbiochem， CN Biosciences Inc.， La Jolla， CA， USA) 用无菌蒸馏 水重新配制得到 500μm 储液， 在上述培养基中稀释， 使其在孔中的终浓度为 5μm。将细胞 在 37℃与 5％ CO2 一起培育。48 小时后收集每个孔中的细胞上清， 冷冻于 -80℃。
    
    
    实验中所用的 ODN 如下表所示 ： 表2： 实验中所用的寡核苷酸序列
    在寡核苷酸骨架中用磷酸二酯键代替硫代磷酸酯键则用 (-) 表示
     PBMC 的分离
     用静脉穿刺从十个 (10) 正常的健康的成年人和十五个 (15) 具有慢性 HCV 感 染 并 且 以 前 有 过 6 个 月 的 IFN-α 治 疗 但 治 疗 失 败 或 复 发 的 成 年 人 受 试 体 中 收 集 全 血 (200ml) 并 存 于 肝 素 化 的 绿 色 盖 子 的 真 空 容 器 中。 在 Ficoll-Hypaque(Amersham PhannaciaBiotech， Uppsala， Sweden) 上以 400×g 的速度离心 35 分钟纯化外周血单核细 胞 (PBMC)。将细胞重悬于含有 10％正常人 AB 血清 ( 加热灭活 ) 和 1％青霉素 / 链霉素的 RPMI 完全培养基中， 浓度为 10×106/ml。
     B 细胞增殖
     如上所述分离细胞并重悬于完全 RPMI 培养基中， 浓度为 1×106/ml， 向圆底 96 孔 板的每个孔中加入 100μl 细胞。 向孔中加入 ODN(100μl) 以得到所选范围的终浓度 (1， 3， 3 6μg/ml)。将细胞培养 5 天， 然后用 H- 胸腺嘧啶核苷 (1μCi/ 孔 ) 脉冲标记 18 小时， 然 后收集到滤纸上检测放射活性。结果表示为与未处理培养基对照相比的刺激指数 (SI)。
     细胞因子检测
     将新分离的 PBMC 以 10×106/ml 的浓度 (2× 终浓度 ) 重悬， 向含有等体积的 ODN 溶液 (2× 最终希望的浓度 ) 的平底 96 孔板的每个孔中加入 100μl 细胞。每种 ODN 在一 定范围的浓度 (1， 3， 6μg/ml) 下检测。将细胞在 37℃与 5％ CO2 一起培育。48 小时后收集
     33*101948835 A CN 101948837说明书32/43 页每个孔中的细胞上清， 冷冻于 -80℃直至检测。
     用商业 ELISA 试剂盒 (R & D Systems， Minneapolis， MN， USA ； IP-10， Cat# ； DIP 100， IL-10， Cat#D1000， IFN-g Cat#DIF50 或 PBL Biomedical， IFN-αCat#4110S) 检测上清 中 IFN-α， IP-10， IL-10 和 IFN 的水平。当检测的 ELISA 值低于制造商说明的试剂盒的检 测下限的时候， 数据表中将其表示为等同于可检测到的下限的值。
     结果
     将从 15 个慢性 HCV 感染受试体和 10 个正常的健康志愿者中收集到的血液中分离 的 PBMC 在 37℃与不同类型的 CpG( 例如 A 类， B 类， C 类， 柔性 C 类， 半柔性 B 类和半柔性 C 类 ) 一起培育， 检测细胞上清液中是否存在细胞因子， 以表明培育期间是否分泌细胞因子。 这些实验的结果如下所示。
     PBMC 对 IFN-α 分泌的诱导
     当检测三类 CpG ODN 对于正常志愿者的 PBMC 的作用的时候， A 类 (CpG SEQ ID NO ： 1) 产生非常高水平的 IFN-α， C 类 (CpG SEQ ID NO ： 4) 产生中等高水平， B 类 (CpG SEQ ID NO ： 2) 仅诱导低水平 ( 图 1)。IFN-α 的主要细胞来源是 pDC。
     对于从 HCV 慢性携带者获得的 PBMC， 所有三类 CpG 都能诱导 IFN-α 分泌。B 类和 C 类诱导的水平与正常 PBMC 的结果相同。相反， A 类诱导的水平仅有正常水平的 50％ ( 图 1)， 这表明 HCV 感染的 pDC 的功能的丧失对 A 类 CpG 诱导 IFN-α 的效果有些影响， 但是不 影响 C 类。因此， A 或 C 类 CpG 可用于治疗 HCV 慢性携带者， 但是在某些实施例中优选使用 C 类。
     用 FACS 分析测定 pDC 的数目。对此进行线性退化分析， 并与 A 和 C 类 CpG ODN 诱 导的 IFN-α 分泌的量比较， 发现正常受试体具有合理的相关性 ( 例如分别是 R ＝ 0.43 和 0.58)。进一步发现 C 类 ODN 的相关性略好。相反， 在 HCV 感染受试体中 pDC 数目与 IFN-α 分泌的量之间没有观察到相关性 ( 分别是 R ＝ 0.02 和 0.08)( 图 3)。但是 HCV 感染的 DC 仍然能够对 CpG ODN 做出反应， 分泌 IFN-α。
     还分析了这些 ODN 的柔性和半柔性变化形式的效果。柔性分子的合成是在该分子 的中间区域具有一排磷酸二酯键。半柔性分子的合成是在 CpG 基序的胞嘧啶和鸟嘌呤核苷 酸之间具有一个或多个单个的磷酸二酯键。柔性 ( 图 3) 和半柔性 ( 图 4)C 类 CpG ODN 都 能够以与原始 C 类 CpG ODN 类似的方式刺激正常或 HCV PBMC 的 IFN-α 分泌。几种半柔性 C 类 CpG ODN 甚至比常规的 C 类 CpG SEQ ID NO ： 4 更有效 ( 图 4)。这可能是因为该分子仍 然足够稳定， 可以有最大的免疫刺激效果， CpG 基序中部的磷酸二酯增加了其活性。
     PBMC 对 IFN-γ 的诱导
     图 5 比较了不同类的 CpG 诱导 Th1 细胞因子， IFN-γ 的分泌的能力。A 类诱导较 低水平的 IFN-γ， 相比之下， B 类产生中等量， C 类 CpG 刺激高浓度的 IFN-γ。HCV 感染的 和正常的 PBMC 对所有三类 CpG 都显示出相似的 Th1 反应。半柔性 C 类 CpG ODN 也得到了 类似的结果 ( 图 6)。
     PBMC 对 IP-10 分泌的诱导
     IP-10， 一种与 1 型和 2 型干扰素的产生相关的趋化因子， 也能被 CpG ODN 诱导。A 类 CpG ODN 诱导最高水平， C 类 CpGODN 诱导次高水平， B 类 CpG ODN 诱导最低水平。不管 CpGODN 的类型如何， 正常受试体和 HCV 慢性携带者的 PBMC 中诱导的 IP-10 水平类似 ( 图7)。 CpG ODN 对 B 细胞的刺激
     还研究了 CpG 对 B 细胞刺激的效果。如图 8 和 9 所示， A 类 CpG 对 HCV 感染的和 正常的人群的 B 细胞的刺激效果都较弱。相反， B 类， C 类和半柔性 C 类 CpG 强烈激活 B 细 胞。在正常的和 HCV 感染的受试体之间没有差别。
     CpG ODN 刺激之后 PBMC 的 IL-10 分泌
     还评价了 CpG 刺激后细胞因子 IL-10 的产生， 结果如图 10 所示。对于 HCV 感染的 和正常的受试体， 所有类型的 CpG 都能显著诱导 IL-10 的分泌， 在正常志愿者的 PBMC 和 HCV 慢性携带者的 PBMC 之间没有差异。几种细胞类型在和 CpG 培育以后都能产生 IL-10 ； 但是 由于 B 细胞是这种细胞因子的主要产生者， IL-10 的产生可以用于指示 B 细胞激活的水平。
     内含子 A(Intron A) 和病毒唑的效果
     对于 HCV 感染的细胞检测了病毒唑和外源 IFN-α 内含子 A(Intron A) 单独或与 CpG 组合使用的体外效果。病毒唑和内含子 A(Intron A) 无论是单独使用或是一起使用都 不能诱导 HCV 感染的 PBMC 分泌 IFN-α( 图 11)。
     如上所述， A 和 C 类 CpG ODN 可强烈诱导正常的和 HCV 感染的受试体的 pDC 分泌 IFN-α。进一步， 当 CpG 和 Intron-A 一起使用的时候， 大部分 (60％ ) 受试体都具有协同反 应 ( 图 12)。
     讨论
     CpG ODN 能够诱导慢性 HCV 感染的受试体的 DC 分泌 IFN-α， A 类和 C 类 CpG 诱导 水平较高， B 类 CpG ODN 诱导水平较低。分泌的 IFN-α 的水平与正常健康志愿者的细胞观 察到的结果相当。而且， 刺激的 HCV PBMC 诱导 IP-10， 进一步表明是 Th1 类型的免疫激活。
     HCV 抗原特异性免疫反应在慢性 HCV 感染的人中已经存在。 这是偏向 Th2 的， 因此 导致不能清除 HCV 感染的细胞。Th1 类型的反应是病毒清除所必需的。不需要其它抗原， Th1 细胞因子的系统水平的升高就能使慢性 HCV 感染的人发生 Th1 类型的 HCV 特异的免疫 反应， 这有助于病毒的清除。所有类型的 CpG(A， B 和 C) 都能够导致形成 Th1 类型的反应。 这些 Th1 类型的反应是 HCV 慢性感染的长期清除所必要的， 但是它们很难被外源 IFN-α 治 疗诱导， 这种治疗只有直接的抗病毒作用而对免疫系统没有直接作用。因此 CpG ODN 可以 与外源 IFN-α 组合使用治疗 HCV 慢性携带者。
     另外， CpG ODN 也可以单独使用。由于能诱导细胞因子如 IFN-α 和 IFN-γ， CpG ODN 独自使用除了能诱导 Th1 类型的 HCV 特异的免疫反应之外， 还具有直接的抗病毒作用。 在一些实施例中， 优选 A 和 C 类分子， 因为它们能诱导较高水平的 IFN。根据它们的特征序 列， CpG ODN 优先刺激 pDC 功能， 成熟和 1 型 IFN 产生 (Krug， A et al.， Eur J Immunol， 2001 ； 31 ： 2154-2163)。虽然根据本发明， 有两类 CpG ODN 都能很好地刺激 IFN-α 产生， 但 任何 CpG ODN， 不管其骨架或 CpG 序列如何， 都可以用于治疗慢性 HCV。由特异 CpG ODN 控 制的不同 I 型 IFN 异构体在体内的释放可以很好地进行单个亚型的重组 I 型 IFN( 例如内 含子 A(Intron A) 就是 IFN-α-2b) 的系统给药。 CpG ODN 的柔性和半柔性形式能够刺激与 它们的母本分子类似的 IFN-α 水平。CpGODN 的柔性和半柔性形式， 特别是 C 类， 优选用于 治疗慢性 HCV， 这是由于它们更容易降解因而不会在器官中积累， 特别是在肝， 脾和肾中。
     至少有 50％的 HCV 受试体对外源 IFN-α 治疗没有反应， 而 CpG ODN( 特别是 A 和
     C 类 ) 在所有受试体中都能够在体外以与正常健康的志愿者相当的水平诱导 IFN-α 分泌。 因此 CpG ODN 可用于治疗对外源 IFN-α 治疗没有反应的受试体， 不管 IFN 是否是聚乙二醇 化的， 不管所述治疗是否包括病毒唑。可诱导高水平 IFN-α 的 CpG ODN 类型是优选的， 更 优选的能长期治疗的是半柔性形式。
     商业的 Intron-A(IFN-α-2b) 和病毒唑， 不管单独使用还是组合式用都不能诱导 正常或 HCV 感染的受试体的 PBMC 在体外分泌 IFN-α。但是当 CpG ODN 与 Intron-A 组合使 用的时候， 观察到在 HCV 感染受试体的 PBMC 的 IFN-α 分泌中具有协同作用。C 类 ODN 与外 源 IFN-α 能发生协同作用 ； 用其它类型的 CpG ODN 和商业的 α- 干扰素一起治疗也是有效 的。如前所述的， 由于其相对较容易降解成无刺激效果的代谢物， CpG ODN 的半柔性形式可 用于长期治疗而不用担心会在末梢器官中积聚。
     病毒唑具有 Th1 作用， 但是在本项研究中它对人 PBMC 没有免疫刺激活性。甚至是 与内含子 A(Intron A) 组合使用， 病毒唑也并没有增强外源 IFN-α 的产生。因此在 HCV 的 组合治疗中用 CpG ODN 代替病毒唑会增加持续病毒反应的部分。当与 CpGODN 组合使用的 时候， 病毒唑降低了 CpG 的功效。因此 CpG.ODN 应当与 α- 干扰素组合式用而不加入病毒 唑。
     CpG ODN 以 IM， SC 和 IV 的方式给予人受试体， 并确定其耐受性较好并且安全 ( 临 床研究， 正在进行中 )。 任何有效的给药方式都是可接受的， 例如 SC， IM， IV， 吸入等。 但是所 选择的给药方式是皮下给药。 将 CpG ODN 在 TE 缓冲液中稀释， 并加入到 PBMC 中， CpG ODN 还 可以配制在递送系统例如生物附着性聚合物 (Sha et al.， 1999)， 螺旋体 (Gould-Fogerite et al.， 1994， 1996) ； dendrimer(Kukowska-Latallo et al.， 1996， Qin et al， 1998)， 肠溶 包衣的胶囊 (Czerlcinsky et al.， 1987， Levine et al.， 1987)， 乳化剂 (Vancott et al.， 1998， Lowell et al.， 1997)， ISCOM(Mowat et al.， 1993， Morein et al.， 1999， Hu et al.， 1998， Carlssonet al.， 1991)， 脂质体 (Childers et al.， 1999， Michalek et al.， 1989， 1992)， 微球 (Gupta et al.， 1998， Maloy et al.， 1994， Eldridgeet al.， 1989)， 纳米球 (Roy et al.， 1999)， 聚合物环 (Wyatt et al.， 1998)， 蛋白体 (Lowell et al.， 1988， 1996)， 和病 毒颗粒 (Gluck etal.， 1992， Mengiardi et al.， 1995， Cryz et al.， 1998) 中。
     为了治疗 HCV 慢性携带者， CpG ODN 的重复给药可为每日一次到每月一次， 优选每 3-10 天一次， 更优选每周一次， 持续较长时期。所述时期可以是一个月到两年， 优选 3 到 12 个月， 最优选 6 个月。因此最佳的治疗是每周两次或每周一次， 持续 6 个月。在诱发期也可 以给药的更频繁 ( 第 1-3 个月每天或每隔一天或每周两次或每周一次给药 )， 然后在维持期 间降低频率 ( 在其余几个月中每周一次， 或者每隔一周， 或者每个月一次给药 )。
     为了进行组合治疗， CpG 和 α- 干扰素 ( 聚乙二醇化或者没有聚乙二醇化 ) 可以 (i) 混合在一起， 在同一时间以同样的方式 ( 皮下 ) 给药， (ii) 在同一时间以同样的方式给 药， 但是不混合， (iii) 在同一时间但是以不同的方式 ( 例如 α- 干扰素以 SC 方式给药， 而 CpG 以 IV， IM， ID， 口服或局部方式给药 ) 给药， (iv) 以不同的次数和时间安排以及相同或 不同的方式给药， 或者 (v) 顺序给药。在后一种情况下， 优选首先给予 IFN-α 以减少病毒， 然后给予 CpG ODN 以诱导持续的 Th1 类型的适应性免疫， 以进行长期控制。
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     等同方式
     应当理解可以对本文公开的实施方案进行各种修改。 因此上述说明书不应当理解 为限制， 而仅仅是对优选的实施方案的示例。本领域技术人员能够预见其它修改也在本发 明权利要求范围之内。
     本文公开的所有参考文献， 专利和专利申请都引入其全文作为参考。
     以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书， 现作为说明书的一部分并入此 处：
     1. 一种治疗具有 HCV 感染并且用以前的非 CpG 疗法不能成功治疗的受试体的方 法， 包括
     给需要治疗的受试体施用有效量的能治疗所述感染的 CpG 免疫刺激核酸。
     2. 项 1 的方法， 其中所述非 CpG 疗法包括干扰素 -α。
     3. 项 2 的方法， 其中所述干扰素 -α 是干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干扰 素 -α。
     4. 项 2 的方法， 其中所述非 CpG 疗法包括干扰素 -α 和病毒唑。
     5. 项 2 的方法， 其中所述非 CpG 疗法包括聚乙二醇化的干扰素 -α 和病毒唑。
     6. 项 1 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸是 A 类 CpG 免疫刺激核酸。
     7. 项 1 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸是 B 类 CpG 免疫刺激核酸。
     8. 项 1 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸是 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     9. 项 1 的方法， 进一步包括将干扰素 -α 给予受试体的步骤。
     10. 项 9 的方法， 其中所述干扰素 -α 是干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干 扰素 -α。
     11. 项 9 的方法， 其中所述干扰素 -α 与所述 CpG 免疫刺激核酸基本上同时给药。
     12. 项 1 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸含有骨架修饰。
     13. 项 12 的方法， 其中所述骨架修饰是硫代磷酸酯骨架修饰。
     14. 项 1 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸含有半柔性骨架。
     15. 一种治疗具有 HCV 感染并且可能对非 CpG 疗法没有反应的受试体的方法， 包括
     给需要治疗的受试体施用有效量的能治疗所述感染的 CpG 免疫刺激核酸。
     16. 项 15 的方法， 进一步包括鉴别可能对非 CpG 疗法没有反应的受试体。
     17. 项 16 的方法， 其中基于每个树突状细胞产生的干扰素 -α 的检测鉴别所述可 能没有反应的受试体。
     18. 项 16 的方法， 其中基于 HCV 表型鉴别所述可能没有反应的受试体。
     19. 项 15 的方法， 其中所述非 CpG 疗法包括干扰素 -α。
     20. 项 15 的方法， 其中所述非 CpG 疗法包括干扰素 -α 和病毒唑。
     21. 项 20 的方法， 进一步包括给受试体施用抗病毒试剂。
     22. 项 21 的方法， 其中所述抗病毒试剂是干扰素 -α。
     23. 项 22 的方法， 其中所述干扰素 -α 是干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干 扰素 -α。
     24. 项 21 的方法， 其中所述干扰素 -α 以低剂量给药。25. 项 15 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸是 C 类 CpG 免疫刺激核酸。 26. 项 15 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸含有半柔性骨架。 27. 一种筛选可用于治疗慢性丙型肝炎病毒感染的 CpG 免疫刺激核酸的方法， 包括 使来自具有慢性丙型肝炎病毒感染受试体的外周血单核细胞与 CpG 免疫刺激核 酸接触， 并
     测量暴露以后血单核细胞的检测反应， 其中所述受试体用以前的疗法不能成功治 疗。
     28. 项 27 的方法， 其中所述检测反应选自 B 细胞刺激， IL-6 的分泌， IL-10 的分 泌， IL-12 的分泌， 干扰素 -γ 的分泌， 1 型干扰素 (α+β) 的分泌， IP-10 的分泌， NK 活性， CD80 的表达， CD86 的表达， CD83 的表达， 和 II 型 MHC 表达的正调控。
     29. 项 27 的方法， 其中所述外周血单核细胞含有树突状细胞。
     30. 项 29 的方法， 其中所述树突状细胞含有类浆细胞的树突状细胞。
     31. 项 29 的方法， 其中所述检测反应选自 IL-12 的分泌， 1 型干扰素的分泌， CD80 的表达， CD86 的表达， CD83 的表达， 和 II 类 MHC 表达的正调控。
    
    
    
    
    
    32. 项 29 的方法， 其中所述接触是在体外。 33. 项 32 的方法， 其中所述外周血单核细胞是培养的。 34. 项 33 的方法， 其中将所述 CpG 免疫刺激核酸加入到培养的外周血单核细胞中。 35. 项 29 的方法， 其中所述以前的治疗是非 CpG 疗法。 36. 项 29 的方法， 其中所述以前的治疗是用不同序列或不同类的 CpG 核酸进行的治疗。 37. 项 29 的方法， 进一步包括检测所述 CpG 免疫刺激核酸刺激正常受试体的外周 血单核细胞的对照反应的能力。
     38. 项 29 的方法， 进一步包括使外周血单核细胞与干扰素 -α 和所述 CpG 免疫刺 激核酸基本上同时接触。
     39. 项 29 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸是 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     40. 一种鉴别具有 HCV 感染并且可能对非 CpG 疗法没有反应的受试体的方法， 包括
     使从具有丙型肝炎病毒感染的受试体收集到的外周血单核细胞与 CpG 免疫刺激 核酸接触，
     测定细胞分泌的干扰素 -α， 并且
     测定每个树突状细胞产生的干扰素 -α 的量， 其中该量小于 1.0pg/ml 表示受试体 可能对非 CpG 疗法没有反应。
     41. 项 40 的方法， 其中量小于 0.5pg/ml 表示受试体可能对非 CpG 疗法没有反应。
     42. 项 40 的方法， 其中所述非 CpG 疗法包括干扰素 -α。
     43. 项 42 的方法， 其中所述非 CpG 疗法包括病毒唑。
     44. 项 42 的方法， 其中所述 IFN-α 是聚乙二醇化的干扰素 -α。
    45. 项 40 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸是 A 类或 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     46. 项 40 的方法， 其中所述将外周血单核细胞进一步暴露于抗病毒试剂与 CpG 免 疫刺激核酸中。
     47. 项 46 的方法， 其中所述抗病毒试剂是干扰素 -α。 48. 项 47 的方法， 其中干扰素 -α 是干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干扰 49. 项 40 的方法， 其中所述外周血单核细胞包括树突状细胞。 50. 项 49 的方法， 其中所述树突状细胞包括类浆细胞的树突状细胞。 51. 项 40 的方法， 其中所述丙型肝炎病毒感染是急性丙型肝炎病毒感染。 52. 项 40 的方法， 进一步包括确定 HCV 的基因型。 53. 一种治疗具有丙型肝炎病毒感染的受试体的方法， 包括 给根据项 40 的方法鉴别的受试体施用有效量的能治疗所述感染的 CpG 免疫刺激素 -α。
    
    
    
    
    
    核酸。 54. 项 53 的方法， 进一步包括给受试体施用干扰素 -α。
     55. 项 54 的方法， 其中所述干扰素 -α 是干扰素 -α-2b， 干扰素 -α-2a 或复合干 扰素 -α。
     56. 项 53 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸是 A 类 CpG 免疫刺激核酸。
     57. 项 53 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸是 B 类 CpG 免疫刺激核酸。
     58. 项 53 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸是 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     59. 项 53 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸含有骨架修饰。
     60. 项 59 的方法， 其中所述骨架修饰是硫代磷酸酯骨架修饰。
     61. 项 53 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸含有半柔性骨架。
     62. 项 53 的方法， 其中所述丙型肝炎病毒感染是慢性丙型肝炎病毒感染。
     63. 项 53 的方法， 其中所述丙型肝炎病毒感染是急性丙型肝炎病毒感染。
     64. 一种治疗具有 HCV 感染并且用以前的非 CpG 疗法不能成功治疗的受试体的方 法， 包括
     给需要治疗的受试体施用有效量的能治疗所述感染的具有半柔性骨架的 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     65. 一种治疗具有 HCV 感染并且可能对非 CpG 疗法没有反应的受试体的方法， 包括
     给需要治疗的受试体施用有效量的能治疗所述感染的具有半柔性骨架的 C 类 CpG 免疫刺激核酸。
     66. 一种鉴别具有 HCV 感染并且可能对非 CpG 疗法没有反应的受试体的方法， 包括
     使从具有丙型肝炎病毒感染的受试体收集到的外周血单核细胞与 A 类或 C 类 CpG 免疫刺激核酸接触，
     测定细胞分泌的干扰素 -α， 并且
     测定每个树突状细胞产生的干扰素 -α 的量， 其中该量小于 1.0pg/ml 表示受试体 可能对非 CpG 疗法没有反应。
     67. 一种治疗具有 HCV 感染并且用以前的非 CpG 疗法不能成功治疗的受试体的方 法， 包括
     使来自需要治疗的受试体的外周血单核细胞与有效量的能刺激免疫反应的 CpG 免疫刺激核酸接触， 并且
     将这些细胞重新输入到受试体体内。
     68. 项 67 的方法， 其中所述外周血单核细胞包括树突状细胞。 69. 项 68 的方法， 其中所述树突状细胞包括类浆细胞的树突状细胞。 70. 项 67 的方法， 其中所述 CpG 免疫刺激核酸是 C 类免疫刺激核酸。 71. 项 70 的方法， 其中所述 C 类免疫刺激核酸具有半柔性骨架。45101948835 A CN 101948837
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