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与受干扰的膜结合的化合物及其应用方法
    本申请是 2005 年 1 月 16 日提交的第 200580008225.0 号发明名称为 “与受干扰的 膜结合的化合物及其应用方法” 的中国专利申请的分案申请。
     技术领域 本发明涉及可选择性地与正在经历其正常质膜组织的干扰及改变的细胞相结合 的化合物， 即， 正在经历细胞死亡的细胞、 凋亡 (apoptotic) 细胞或活化的血小板。本发明 进一步提供在医疗实践中利用所述化合物用于诊断及治疗目的的方法。
     背景技术
     完好的真核细胞的质膜 ( 外膜 ) 的特点在于其高度组织的结构。膜组织的高水平 尤其取决于组成所述膜的特定脂质的分子结构 ； 组成所述膜的各种脂质之间的比例 ； 所述 膜的外小叶与内小叶之间的磷脂分布 ； 以及膜蛋白成分。虽然维持质膜组织的高水平对正常细胞生理学很重要， 但细胞质膜的正常组织的 相当的干扰及改变 (PNOM) 存在于许多的生理及病理状况中， 而且表征着许多疾病。这种变 更及干扰可既在形态学水平 ( 在正在经历细胞凋亡的细胞中观察到的膜起泡 (blebbing)) 显著又在分子水平显著。 PNOM 尤其包括随着氨基磷脂——主要是通常几乎全部局限于膜双 分子层的内小叶的磷脂酰丝氨酸 (PS) 及磷脂酰乙醇胺 (PE)——运动至细胞表面以及鞘磷 脂 (SM) 及磷脂酰胆碱 (PC) 从所述膜的外小叶到内小叶的交互运动的膜磷脂的争夺及重新 分配。该重新分配于此处被称作细胞膜脂质不对称性 (CMLA) 的丧失。除 CMLA 丧失之外， PNOM 还经常与膜磷脂堆积 (packing) 水平的降低以及膜流体性的增大有关。
     这些变更在赋予细胞表面用于组装若干凝血因子复合物如 tenase 和凝血酶 原酶蛋白复合物的催化平台方面起重要作用。因此， 血小板活化与正在经历 PNOM 的 血 小 板 膜 有 关， 并 且 这 些 变 更 构 成 正 常 血 液 凝 固 以 及 许 多 疾 病 中 异 常、 过度的血液 凝 固 的 引 发 和 / 或 蔓 延 的 重 要 因 素。 这 些 疾 病 尤 其 包 括 动 脉 或 静 脉 血 栓 或 血 栓 栓 塞 [ 例如脑卒中、 心急梗塞、 深静脉血栓、 弥散性血管内凝血 (DIC)、 血栓性血小板减少 性 紫 癜 (thromboticthrombocytopenic purpura) 等 ]、 不稳定的动脉粥样硬化斑块 (unstableatherosclerotic plaques)、 镰状细胞病、 β- 珠蛋白生成障碍性贫血、 抗磷 脂抗体综合症 [ 包括于系统性红斑狼疮中的 ]、 以及与膜微粒脱落有关的疾病如与旁路 (bypass) 有关的神经功能紊乱。
     凋亡是其中发生细胞膜变更 / 干扰的主要情形。凋亡是每个细胞内固有的细胞 自我破坏或 “自杀” 的内在程序。作为对触发刺激的反应， 细胞经历细胞收缩、 细胞膜起泡、 染色质浓缩以及断裂事件的高度特征性的级联， 并终极于细胞到结合于膜的颗粒簇 ( 凋亡 体 ) 的转化， 其继而被巨噬细胞吞噬。PNOM 是凋亡的普遍现象， 其发生于可能接近细胞投 入死亡过程时的凋亡级联的早期， 并且被证实是凋亡细胞被巨噬细胞识别并清除的重要因 素。
     最近发现 PNOM 与凋亡细胞的有效的促凝血活性间存在高度相关性。凋亡的内皮
     细胞中的 PNOM 例如动脉粥样硬化斑块中发生的 PNOM 可能在病理发生疾病 (pathogenesis plaques) 中起重要的作用。
     由于凋亡和血栓症对大部分医学疾病均具有重要作用， 因此需要有能够探测这些 生物学过程并靶向有关细胞的工具。可选择性地与 PNOM 膜结合的化合物还有可能随后进 入这些具有这种 PNOM 膜的细胞 (PNOM 细胞 ) 中， 因此可用作探测并将造影剂或药物靶向于 正在经历破坏或死亡过程特别是由凋亡引起的破坏或死亡过程的细胞、 或正在经历活化的 血小板。 发明内容 在一个方面中， 本发明提供能够选择性地与正在经历其质膜的正常组织的干扰的 细胞 (PNOM 细胞 ) 结合而与维持其质膜的正常组织的、 于此处定义为 “正常细胞” 的细胞的 结合程度较低的化合物。在本发明的一个具体实施方案中， 所述 PNOM 细胞是正在经历死亡 过程的细胞。 在本发明的一个具体实施方案中， 所述细胞是凋亡细胞， 且在另一具体实施方 案中， 所述细胞可被血小板活化。本发明进一步涉及通过应用这些可选择性地与 PNOM 细胞 结合的化合物以探测 PNOM 细胞的方法。在本发明的另一个具体实施方案中， 所提供化合物 具有如下式 I-XIV 所示的结构。
     术语 “与受干扰的膜结合的化合物” (PMBC) 是指能选择性地靶向于 PNOM 细胞而与 正常细胞结合的程度较低的化合物。根据本发明， PMBC 与 PNOM 细胞的结合应该比其与正 常细胞的结合至少高 30％。
     本发明中术语 “选择性的靶向” 是指化合物与 PNOM 细胞选择性的结合， 即， 以比与 正常细胞结合至少高 30％的程度与 PNOM 细胞结合。
     术语 “诊断型的与受干扰的膜结合的化合物” ( 诊断型 PMBC) 是指能够选择性地靶 向 PNOM 细胞的化合物， 其中所述化合物包含标记物 (marker) 或连接至标记物， 而由本领域 普通技术人员即可探测到所述标记物。
     术语 “治疗型的与受干扰的膜结合的化合物” ( 治疗型 PMBC) 是指可用于治疗疾病 的包含药物的如上所定义的 PMBC。
     术语 “固体载体” 在本发明内容中是指固体基质、 不溶性基质、 或不溶性载体。可 以如微粒、 微过滤器 (micro-filter)、 或微毛细管 (micro-capillara) 的堆叠各种结构形 成本发明的固体载体。
     在本发明的一个具体实施方案中， 所述 PMBC 用于制备用于选择性地靶向 PNOM 细 胞的药物。
     在一个方面中， 本发明提供如式 (I) 结构所示的可选择性地靶向 PNOM 细胞的化合 物 ( 即 PMBC)， 或如式 (I) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 金属螯合物、 溶剂化物和 水合物， 以及所述盐的溶剂化物和水合物 ：
     其中每个 R 和 R’ 基团各自独立地选自氢、 C1、 C2、 C 3、 C4、 C5、 C6、 C7、 C 8、 C9、 C10、 C11、 C12、 C13、 C14、 C15、 C16 直链或支链烷基、 直链或支链羟基烷基、 直链或支链氟代烷基、 由1个 或 2 个环组成的芳基或杂芳基、 或它们的组合 ； n 和 m 分别代表 0、 1、 2、 3 或 4 的整数 ； n和 m 可以相同或不同 ； M 选自不存在、 氢、 -O-、 -S-、 和 -N(U)， 其中 U 代表氢、 或 C 1、 C 2、 C 3 或 C4 烷基 ； x 和 z 分别独立地代表 0、 1 或 2 的整数， 其中 x 和 z 可相同或不同 ； y 是 0、 1或2的 整数， 其中当 y ＝ 2 时各取代基 R’ 可相同或不同 ； 并且 D 是用于诊断的标记物、 氢、 羟基或 药物 ； 其中所述用于诊断的标记物选自用于造影的标记物如 F， 其中所述 F 原子可为 18F 或 19 F， 或放射标记的金属螯合物 ； 所述用于造影的标记物可通过颜色、 荧光、 x 射线、 CT 扫描、 磁共振成像 (MRI)、 或放射性同位素扫描如单光子发射断层扫描 (Single Photon Emission Tomography， SPECT) 或正电子发射断层扫描 (Positron Emission Tomography， PET) 被检 测。或者， D 为要被靶向于所述 PNOM 细胞的药物。
     所述药物可为可用于预防、 改善或治疗特定疾病的医学上有用的物质， 并且可为 例如但不限于 ： 凋亡抑制剂 ( 胱天蛋白酶抑制剂、 抗氧化剂、 Bcl-2 系统调节剂 ) ； 细胞死亡 的活化剂 ( 例如抗癌药物 ) ； 或血液凝固调节剂， 其可为抗凝剂、 抗血栓剂或溶血栓剂。在 这种情况下， 所述药物优选地选自抗血小板剂、 肝素、 低分子量肝素、 糖蛋白 IIb/IIIa 的拮 抗剂、 组织纤溶酶原活化剂 (tPA)、 或凝血因子抑制剂如凝血酶抑制剂或 Xa 因子抑制剂 ； 或 抗炎药或免疫调节剂。 在一个具体实施方案中， 本发明提供改善抗癌治疗的方法， 其通过将 药物靶向于自发地或作为对治疗的反应而发生于肿瘤内的凋亡的中心而将抗癌药物靶向 于肿瘤。 在另一具体实施方案中， 本发明提供通过将抗凝血剂靶向于血栓从而预防、 减少或 中止凝血的治疗血栓形成的方法。
     在本发明的另一具体实施方案中， D 可为固体载体。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (II) 结构所示的可选择性地靶向 PNOM 细胞的化合物， 包括如式 (II) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物 和金属螯合物， 以及所述盐的溶剂化物和水合物 ：
     其中 R 代表氢或 C1、 C2、 C3、 C4、 C5、 C6、 C7、 C8、 C9、 C10、 C11、 C12、 C13、 C14、 C15、 C16 直链或 支链烷基、 直链或支链羟基烷基、 直链或支链氟代烷基、 由 1 个或 2 个环组成的芳基或杂芳基、 或它们的组合 ； n 和 m 分别代表 0、 1、 2、 3 或 4 的整数 ； n 和 m 可以相同或不同 ； M 选自不 存在、 氢、 -O-、 -S-、 和 -N(U)， 其中 U 代表不存在、 氢、 或 C 1、 C 2、 C3 或 C4 烷基 ； D 是氢或用于 诊断的标记物。在本发明的具体实施方案中， 所述用于诊断的标记物可为用于造影的标记 18 19 物如 F， 其中所述 F 原子可为 F 或 F， 或标记的金属螯合物 ； 所述用于造影的标记物可通 过颜色、 荧光、 x 射线、 CT 扫描、 磁共振成像 (MRI)、 或放射性同位素扫描如单光子发射断层 扫描 (SPECT) 或正电子发射断层扫描 (PET) 来检测。或者， D 为要被靶向于所述 PNOM 细胞 的药物。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (III) 结构所示的化合物， 包括如式 (III) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物和金属螯合物， 以及所述 盐的溶剂化物和水合物 ：
     其中 R3 为羟基或 F ； R4 为 C4、 C 5、 C6、 C7、 C 8、 C9 或 C10 直链或支链烷基， 并且 k 为选自 0、 1、 2、 3、 4 和 5 的整数。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (IV) 结构所示的化合物， 包括如式 (IV) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物和金属螯合物， 以及所述盐的溶 剂化物和水合物 ：
     所述化合物被命名为 NST200。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (V) 结构所示的化合物， 包括如式 (V) 结 构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物和金属螯合物， 以及所述盐的溶剂 化物和水合物 ：
     其中 J 是 -F 或 -OH， 并且 r 代表 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 的整数。在 r 为 4 且 J 为 -F 的情况下， 所述化合物被命名为 NST201。在 r 为 5 且 J 为 -F 的情况下， 所述化合物被命名 为 NST-ML-10。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (VI) 结构所示的化合物， 包括如式 (VI) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物和金属螯合物， 以及所述盐的溶 剂化物和水合物 ：
     其中 J 选自氢、 -F 和 -OH。在 J 为 -F 的情况下， 所述化合物被命名为 NST205。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (VII) 结构所示的化合物， 包括如式 (VII) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 和溶剂化物， 以及所述盐的溶剂化 物和水合物 ：
     其中 Q 选自锝、 氧合锝 (oxo-Technetium)、 铼和氧合铼 (oxo-Rhenium)， R4 选自氢、 C1、 C2、 C3、 C4、 C5 和 C6 直链或支链烷基， 并且 p 代表选自 1、 2、 3、 4 和 5 的整数。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (VIII) 结构所示的化合物， 包括如式 (VIII) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 和溶剂化物， 以及所述盐的溶剂化
     物和水合物 ：
     其中 Q 选自锝、 氧合锝、 铼和氧合铼。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (IX) 结构所示的化合物， 包括如式 (IX) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物和金属螯合物， 以及所述盐的溶 剂化物和水合物 ：
     其中 R5 选自氢、 C1、 C 2、 C 3、 C4、 C5 和 C6 直链或支链烷基、 C1、 C 2、 C3、 C4、 C5 和 C6 直链 或支链氟代烷基、 和 C1、 C 2、 C 3、 C4、 C5 和 C6 直链或支链羟基烷基 ； q 代表选自 1、 2、 3、 4和5的 整数 ； 以及 Y 为荧光标记物。在本发明的一个具体实施方案中， Y 选自丹磺酰基 - 酰胺基团 和荧光黄。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (X) 结构所示的化合物， 包括如式 (X) 结 构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物和金属螯合物， 以及所述盐的溶剂 化物和水合物 ：
     所述化合物被命名为 NST203。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (XI) 结构所示的化合物， 包括如式 (XI) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物和金属螯合物， 以及所述盐的溶 剂化物和水合物 ：
     其中 R 代表氢或 C1、 C2、 C3、 C4、 C5、 C6、 C7、 C8、 C9、 C10、 C11、 C12、 C13、 C14、 C15、 C16 直链或 支链烷基、 直链或支链羟基烷基、 直链或支链氟代烷基、 由 1 个或 2 个环组成的芳基或杂芳 基、 或它们的组合。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (XII) 结构所示的化合物， 包括如式 (XII) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物和金属螯合物， 以及所述 盐的溶剂化物和水合物 ：
     其中 F 可为 18F 或 19F。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (XIII) 结构所示的化合物， 包括如式 (XIII) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物和金属螯合物， 以及所述 盐的溶剂化物和水合物 ：
     R 代表氢或 C1、 C 2、 C 3、 C4、 C5、 C6、 C 7、 C8、 C9、 C10、 C11、 C12、 C13、 C14、 C15、 C16 直链或支链 烷基、 直链或支链羟基烷基、 直链或支链氟代烷基、 由 1 个或 2 个环组成的芳基或杂芳基、 或 它们的组合 ； m 代表 0、 1、 2、 3 或 4 的整数 ； D 是用于诊断的标记物， 在本发明的具体实施方案 18 19 中， 其可为用于造影的标记物如 F， 其中所述 F 可为 F 或 F， 或标记的金属螯合物 ； 所述用 于造影的标记物可通过颜色、 荧光、 x 射线、 CT 扫描、 磁共振成像 (MRI)、 或放射性同位素扫 描如单光子发射断层扫描 (SPECT) 或正电子发射断层扫描 (PET) 探测。或者， D 为如上所 定义的要被靶向于所述 PNOM 细胞的药物。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (XIV) 结构所示的化合物， 包括如式 (XIV) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物和金属螯合物， 以及所述 盐的溶剂化物和水合物 ：
     其中 F 可为 18F 或 19F。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供用于将药物靶向于患者中的凋亡中心或血液 凝固中心的药物组合物， 其中所述患者可为人类或非人类的哺乳动物， 其中所述药物组合 物包含如式 I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII、 IX、 X、 XI、 XII、 XIII、 或 XIV 结构所示的化合 物， 其中所述化合物包含药物或连接至药物。
     在一个方面， 本发明提供将医学上有用的化合物选择性地靶向于在细胞群体中的 PNOM 细胞的方法， 所述方法包括 ： 将所述细胞群体与如式 I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII、 IX、 X、 XI、 XII、 XIII、 或 XIV 结构所示的化合物接触， 从而将所述医学上有用的化合物选择 性地靶向于细胞群体中的 PNOM 细胞。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供探测细胞群体中的 PNOM 细胞的方法， 所述方 法包括 ： (i) 将所述细胞群体与如式 I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII、 IX、 X、 XI、 XII、 XIII、
     或 XIV 结构所示的化合物或如式 I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII、 IX、 X、 XI、 XII、 XIII、 或 XIV 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 金属螯合物、 溶剂化物和水合物以及所述盐的 溶剂化物和水合物接触 ； 以及 (ii) 测定与细胞结合的化合物的量， 其中显著量的化合物与 细胞结合提示所述细胞为 PNOM 细胞。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供探测患者或动物中的 PNOM 细胞的方法， 所述 方法包括 ： (i) 向所述患者或动物给药如式 I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII、 IX、 X、 XI、 XII、 XIII、 或 XIV 结构所示的化合物或如式 I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII、 IX、 X、 XI、 XII、 XIII、 或 XIV 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 金属螯合物、 溶剂化物和水合物以及所述 盐的溶剂化物和水合物 ； 以及 (ii) 对受检患者或动物造影， 从而测定与细胞结合的化合物 的量， 其中显著量的化合物与细胞结合提示所述细胞为 PNOM 细胞。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供用于将药物靶向于患者或动物中的凋亡中心 或血液凝固中心或血液凝固中的活化的血小板的药物组合物， 所述药物组合物包含如式 I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII、 IX、 X、 XI、 XII、 XIII、 或 XIV 结构所示的化合物， 其中所述化 合物包含药物或连接至药物。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供探测受检个体中肿瘤内的正在经历死亡过程 的细胞的方法， 所述方法包括 ： (i) 向所述受检患者给药包含如式 (I) 结构所示的化合物或 如式 (I) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 金属螯合物、 溶剂化物和水合物、 以及所 述盐的溶剂化物和水合物的混合物 (compound) 或结合物 ：
     其中 R 或 R’ 之一为氢且 R 或 R’ 中的另一个代表 C1、 C2、 C3、 C4、 C5、 C6、 C7、 C8、 C9、 C10、 C11、 C12、 C13、 C14、 C15、 C16 直链或支链烷基、 直链或支链羟基烷基、 直链或支链氟代烷基、 由1个 或 2 个环组成的芳基或杂芳基、 或它们的组合 ； n 和 m 分别代表 0、 1、 2、 3 或 4 的整数 ； n和m 可以相同或不同 ； M 选自不存在、 氢、 -O-、 -S-、 和 -N(U)， 其中 U 代表氢、 或 C 1、 C 2、 C3 或 C4 烷 基； x 和 z 分别独立地代表 0、 1 或 2 的整数， 其中 x 和 z 可相同或不同 ； y 是 0、 1 或 2 的整 数， 其中当 y ＝ 2 时各取代基 R’ 可相同或不同 ； 并且 D 是用于诊断的标记物。在本发明的 一个具体实施方案中， 所述用于诊断的标记物可为用于造影的标记物如 F， 其中所述 F 可为
     F 或 19F， 或标记的金属螯合物 ； 所述用于造影的标记物选自荧光标记、 放射标记、 x 射线标 记物、 MRI 标记物、 PET 扫描标记物以及能够经历酶促反应而产生可探测的颜色的标记 ； 以 及 (ii) 测定与受检患者的肿瘤结合的化合物的量， 其中探测到显著量的化合物与肿瘤中 的细胞结合提示这些肿瘤细胞正在经历死亡过程。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供探测受检个体肿瘤内正在经历死亡过程的细 胞的方法， 所述方法包括 ： (i) 向所述的受检个体给药如式 I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII、 IX、 X、 XI、 XII、 XIII、 或 XIV 结构所示的化合物， 其中所述化合物包含或连接至用于造影的12标记物或标记的金属螯合物 ； 以及 (ii) 测定与肿瘤内细胞结合的化合物的量， 其中探测到 显著量的化合物与肿瘤内的细胞结合提示这些肿瘤细胞正在经历死亡过程。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供将抗癌药物靶向于具有凋亡细胞中心的肿瘤 的方法， 所述方法包括以下步骤 ： 给药含有细胞毒性药物或连接至细胞毒性药物的如式 I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII、 IX、 X、 XI、 XII、 XIII、 或 XIV 结构所示的化合物， 从而将药物 靶向于肿瘤内细胞死亡的中心。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供将抗凝血剂或纤溶剂靶向于血栓的方法， 其 包括以下步骤 ： 给药包含抗凝血剂或纤溶剂如式 I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII、 IX、 X、 XI、 XII、 XIII、 或 XIV 结构所示的化合物， 从而将药物靶向于血栓。 附图说明
     图 1 所示为本发明化合物的作用机制示意图 ： NST-ML- 作用基元 (motif)。
     图 2(A 和 B) 所示为氚标记的 NST200 与正在经历由 CD95 诱导的凋亡的培养 Jurkat 细胞的选择性结合 (A) 以及氚标记的 NST205 与正在经历由 CD95 诱导的凋亡的培养 Jurkat 细胞的选择性结合 (B)。
     图 3(A 和 B) 为显示 NST203 与正在经历凋亡的培养 HeLa 细胞的选择性结合的荧 光显微图 ( 图 3A)。 具有相同的荧光团但缺乏 NST-ML 作用基元的对照化合物正丁基丹磺酰 基酰胺 (BDA) 未表现出该选择性 ( 图 3B)。
     图 4(A 和 B) 为显示 NST203 与正在经历由小鼠体内化疗导致的细胞死亡的细胞的 选择性结合的荧光显微图 ： (A) 黑素瘤细胞的凋亡 ； (B) 胃肠道上皮细胞的凋亡。
     图 5A-C 所示为由氚标记的 NST200 探测的化疗对黑素瘤细胞死亡的作用。
     图 6 所示为 NST200 在经化疗处理的患有结肠癌的小鼠中的放射自显影图。
     图 7 为显示在化疗前后癌肿瘤与其它身体器官中吸收的比例的表格。
     图 8(A 和 B) 所示为氚标记的 NST200 被结肠癌吸收以及化疗对其的作用 ( 图 8A)。 图 8B 显示结肠重量的变化。
     图 9(A 和 B) 为显示氚标记的 NST200 靶向于脑中凋亡性死亡区域 (A) 以及 H&E 染 色 (B) 的放射自显影图分析。
     图 10(A 和 B) 所示为氚标记的 NST200 的大鼠肾缺血再灌注的放射自显影图 ： (A) 受损肾 ； (B) 完好肾。
     图 11(A 和 B) 所示为在放射性对比剂诱导的急性远端肾小管坏死大鼠模型中氚标 记的 NST205 的放射自显影图 ： (A) 受损肾 ； (B) 完好肾。
     图 12 所示为实验性自身免疫性脑脊髓炎的脑和脊髓中放射自显影图的 3H-200 造 影。 具体实施方案
     本发明涉及能够选择性地与正在经历其质膜的正常组织的干扰的细胞 (PNOM 细 胞 ) 结合而与维持其质膜的正常组织的细胞的结合程度较低的化合物。所述 PNOM 细胞选 自正在经历死亡过程的细胞、 凋亡细胞以及活化的血小板。本发明进一步涉及使用选择性 地与 PNOM 细胞结合的化合物探测 PNOM 细胞的方法。本发明的化合物的优势在于具有选择性地靶向 PNOM 细胞的活性， 其还具有分子 量相对较低以及潜在的有益的药动学性质的特征。在一个具体实施方案中， 本发明提供如 式 (I) 结构所示的可选择性地靶向于 PNOM 细胞的化合物 ( 即 PMBC) 或如式 (I) 结构所示 的化合物的药物学可接受的盐、 金属螯合物、 溶剂化物和水合物， 以及所述盐的溶剂化物和 水合物 ：
     其中每个 R 和 R’ 基团各自独立地选自氢、 C1、 C2、 C 3、 C4、 C5、 C6、 C7、 C 8、 C9、 C10、 C11、 C12、 C13、 C14、 C15、 C16 直链或支链烷基、 直链或支链羟基烷基、 直链或支链氟代烷基、 由 1 个或 2 个环组成的芳基或杂芳基、 或它们的组合 ； n 和 m 分别代表 0、 1、 2、 3 或 4 的整数 ； n和m可 以相同或不同 ； M 选自不存在、 氢、 -O-、 -S-、 和 -N(U)， 其中 U 代表氢、 或 C1、 C2、 C3 或 C4 烷基 ； x 和 z 分别独立地代表 0、 1 或 2 的整数， 其中 x 和 z 可相同或不同 ； y 是 0、 1 或 2 的整数， 其 中当 y ＝ 2 时各取代基 R’ 可相同或不同 ； 并且 D 是用于诊断的标记物， 在本发明的一个具 18 19 体实施方案中， 其可为用于造影的标记物如 F， 其中所述 F 可为 F 或 F， 或标记的金属螯合 物； 所述用于造影的标记物可通过颜色、 荧光、 x 射线、 CT 扫描、 磁共振成像 (MRI)、 或放射性 同位素扫描如单光子发射断层扫描 (SPECT) 或正电子发射断层扫描 (PET) 来探测。在另一 个具体实施方案中， D 为要被靶向于所述 PNOM 细胞的药物。
     所述药物可为可用于预防、 改善或治疗特定疾病的医学上有用的物质， 并且可为 例如但不限于 ： 凋亡抑制剂 ( 胱天蛋白酶抑制剂、 抗氧化剂、 Bcl-2 系统调节剂 ) ； 细胞死亡 的活化剂 ( 例如抗癌药物 ) ； 或血液凝固调节剂， 其可为抗凝剂、 抗血栓剂或溶血栓剂。在 这种情况下， 所述药物优选地选自抗血小板剂、 肝素、 低分子量肝素、 糖蛋白 IIb/IIIa 的拮 抗剂、 组织纤溶酶原活化剂 (tPA)、 或凝血因子抑制剂如凝血酶抑制剂或 Xa 因子抑制剂 ； 或 抗炎药或免疫调节剂。在一个具体实施方案中， 本发明提供将药物靶向于目标区域如肿瘤 内的凋亡中心以杀死肿瘤细胞的方法。在另一具体实施方案中， 本发明提供通过将抗凝血 剂或纤溶剂靶向于血栓形成区域从而预防、 减少或中止凝血的治疗血栓形成的方法。
     在本发明的另一个具体实施方案中， D 可为固体载体。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (II) 结构所示的可选择性地靶向 PNOM 细胞的化合物， 包括如式 (II) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物 和金属螯合物， 以及所述盐的溶剂化物和水合物 ：
     其中 R 代表氢或 C1、 C2、 C3、 C4、 C5、 C6、 C7、 C8、 C9、 C10、 C11、 C12、 C13、 C14、 C15、 C16 直链或 支链烷基、 直链或支链羟基烷基、 直链或支链氟代烷基、 由 1 个或 2 个环组成的芳基或杂芳 基、 或它们的组合 ； n 和 m 分别代表 0、 1、 2、 3 或 4 的整数 ； n 和 m 可以相同或不同 ； M 选自不 存在、 氢、 -O-、 -S-、 和 -N(U)， 其中 U 代表不存在、 氢、 或 C 1、 C 2、 C3 或 C4 烷基 ； D 是氢或用于 18 诊断的标记物， 所述用于诊断的标记物选自用于造影的标记物如 F， 或标记的金属螯合物 ； 所述用于造影的标记物可通过颜色、 荧光、 x 射线、 CT 扫描、 磁共振成像 (MRI)、 或放射性同 位素扫描如单光子发射断层扫描 (SPECT) 或正电子发射断层扫描 (PET) 来探测。 或者， D为 如上所述的要被靶向于所述 PNOM 细胞的药物。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (III) 结构所示的化合物， 包括如式 (III) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物和金属螯合物， 以及所述 盐的溶剂化物和水合物 ：
     其中 R3 为羟基或 F ； R4 为 C4、 C 5、 C6、 C7、 C 8、 C9 或 C10 直链或支链烷基， 并且 k 为选自 0、 1、 2、 3、 4 和 5 的整数。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (IV) 结构所示的化合物， 包括如式 (IV) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物和金属螯合物， 以及所述盐的溶 剂化物和水合物 ：
     所述化合物被命名为 NST200。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (V) 结构所示的化合物， 包括如式 (V) 结 构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物和金属螯合物， 以及所述盐的溶剂 化物和水合物 ：
     其中 J 是 -F 或 -OH， 并且 r 代表 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 的整数。在 r 为 4 且 J 为 -F 的情况下， 所述化合物被命名为 NST201。在 r 为 5 且 J 为 -F 的情况下， 所述化合物被命名 为 NST-ML-10。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (VI) 结构所示的化合物， 包括如式 (VI) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物和金属螯合物， 以及所述盐的溶 剂化物和水合物 ：
     其中 J 选自氢、 -F 和 -OH。在 J 为 -F 的情况下， 所述化合物被命名为 NST205。在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (VII) 结构所示的化合物， 包括如式 (VII) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 和溶剂化物， 以及所述盐的溶剂化 物和水合物 ：
     其中 Q 选自锝、 氧合锝、 铼和氧合铼， R4 选自氢、 C1、 C2、 C3、 C4、 C5 和 C6 直链或支链 烷基， 并且 p 代表选自 1、 2、 3、 4 和 5 的整数。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (VIII) 结构所示的化合物， 包括如式 (VIII) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 和溶剂化物， 以及所述盐的溶剂化 物和水合物 ：
     其中 Q 选自锝、 氧合锝、 铼和氧合铼。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (IX) 结构所示的化合物， 包括如式 (IX) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物和金属螯合物， 以及所述盐的溶 剂化物和水合物 ：
     其中 R5 选自氢、 C1、 C 2、 C 3、 C4、 C5 和 C6 直链或支链烷基、 C1、 C 2、 C 3、 C4、 C5 和 C6 直链 或支链氟代烷基、 和 C1、 C 2、 C 3、 C4、 C5 和 C6 直链或支链羟基烷基 ； q 代表选自 1、 2、 3、 4和5的整数 ； 以及 Y 为荧光标记物。在本发明的一个具体实施方案中， Y 选自丹磺酰基 - 酰胺基团 和荧光黄。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (X) 结构所示的化合物， 包括如式 (X) 结 构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物和金属螯合物， 以及所述盐的溶剂 化物和水合物 ：
     所述化合物被命名为 NST203。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (XI) 结构所示的化合物， 包括如式 (XI) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物和金属螯合物， 以及所述盐的溶 剂化物和水合物 ：
     其中 R 代表氢或 C1、 C2、 C3、 C4、 C5、 C6、 C7、 C8、 C9、 C10、 C11、 C12、 C13、 C14、 C15、 C16 直链或 支链烷基、 直链或支链羟基烷基、 直链或支链氟代烷基、 由 1 个或 2 个环组成的芳基或杂芳 基、 或它们的组合。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (XII) 结构所示的化合物， 包括如式 (XII) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物和金属螯合物， 以及所述 盐的溶剂化物和水合物 ：
     其中 F 可为 18F 或 19F。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (XIII) 结构所示的化合物， 包括如式 (XIII) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物和金属螯合物， 以及所述 盐的溶剂化物和水合物 ：
     R 代表氢或 C1、 C 2、 C 3、 C4、 C5、 C6、 C 7、 C8、 C9、 C10、 C11、 C12、 C13、 C14、 C15、 C16 直链或支链 烷基、 直链或支链羟基烷基、 直链或支链氟代烷基、 由 1 个或 2 个环组成的芳基或杂芳基、 或 它们的组合 ； m 代表 0、 1、 2、 3 或 4 的整数 ； D 是用于诊断的标记物， 在本发明的具体实施方案 18 19 中， 其可为用于造影的标记物如 F， 其中所述 F 可为 F 或 F， 或标记的金属螯合物 ； 所述用 于造影的标记物可通过颜色、 荧光、 x 射线、 CT 扫描、 磁共振成像 (MRI)、 或放射性同位素扫 描如单光子发射断层扫描 (SPECT) 或正电子发射断层扫描 (PET) 来探测。或者， D 为如上 所定义的要被靶向于所述 PNOM 细胞的药物。
     在另一具体实施方案中， 本发明提供如式 (XIV) 结构所示的化合物， 包括如式 (XIV) 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 水合物、 溶剂化物和金属螯合物， 以及所述 盐的溶剂化物和水合物 ：
     其中 F 可为 18F 或 19F。
     在本发明的另一具体实施方案中， 如式 I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII、 IX、 X、 XI、 XII、 XIII、 或 XIV 结构所示的各化合物可包含用于诊断的标记物或连接至用于诊断的标记 物， 所述用于诊断的标记物为例如但不限于 Tc、 Tc ＝ O、 In、 Cu、 Ga、 Xe、 Tl、 Re 及 Re ＝ O、 123 131 18 15 18 11 13 124 13 75 I、 I、 Gd(III)、 Fe(III)、 Fe2O3、 Fe3O4、 Mn(II)、 F、 O、 O、 C、 C、 I、 N、 Br、 Tc-99m 或 In-111。
     在另一方面中， 本发明提供探测细胞群体中的 PNOM 细胞的方法， 所述方法包括 ： (i) 将所述细胞群体与如式 I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII、 IX、 X、 XI、 XII、 XIII、 或 XIV 结 构所示的化合物或如式 I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII、 IX、 X、 XI、 XII、 XIII、 或 XIV 结构所 示的化合物的药物学可接受的盐、 金属螯合物、 溶剂化物和水合物以及所述盐的溶剂化物 和水合物接触 ； 以及 (ii) 测定与细胞结合的化合物的量， 其中显著量的化合物与细胞结合 提示所述细胞为 PNOM 细胞。
     根据本发明， 术语 “显著量的化合物与细胞结合” 是指本发明的包含用于诊断的标 记物或连接至用于诊断的标记物的化合物的量， 其以比与正常细胞结合的量至少高 30％的 量与 PNOM 细胞结合。在另一具体实施方案中， 所述量可为高 50％。在另一具体实施方案 中， 所述量可为高 75％。在另一具体实施方案中， 所述量可为高 150％。在另一具体实施方 案中， 所述量可为高约 2 倍。在另一具体实施方案中， 所述量为高至少 2 倍。在另一具体实 施方案中， 所述量为高至少 5 倍。在另一具体实施方案中， 所述量为高至少 10 倍。
     在另一具体实施方案中， 本发明涉及本发明的化合物在通过经由 PET 或 SPECT 进 行放射性核素成像 (radio-nuclide imaging) 而得到正在经历死亡过程的细胞的图像中的 应用， 通过比较由遭受死亡过程的组织得到信号的幅度或强度与由未遭受所述过程的器官 得到幅度 / 强度比较从而计算同 PNOM 细胞结合的化合物的量与同正常细胞结合的量之间 的比例。
     根据另一个方面， 本发明提供探测患者或动物中的 PNOM 细胞的方法， 所述方法包 括： (i) 向所述患者或动物给药如式 I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII、 IX、 X、 XI、 XII、 XIII、 或 XIV 结构所示的化合物或如式 I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII、 IX、 X、 XI、 XII、 XIII、 或 XIV 结构所示的化合物的药物学可接受的盐、 金属螯合物、 溶剂化物和水合物以及所述盐的 溶剂化物和水合物， 其中所述化合物包含或连接于用于造影的标记物如 18F ； 以及 (ii) 对受
     检患者或动物造影， 从而测定与细胞结合的化合物的量， 其中显著量的化合物与细胞结合 提示所述细胞为 PNOM 细胞。
     本发明化合物的作用机制至少部分包括所有化合物共有的如通式 XV 所示且被命 名为 NST-ML- 作用基元的模块 ：
     其中 R 代表烷基。在本发明的一个具体实施方案中， R 为丁基。
     所述 NST-ML- 作用基元被设计为对应于凋亡细胞的质膜中所经历的将这些膜区 别于健康细胞的膜的结构变化。膜变化的这种复合包括 ：
     (i). 搅乱膜磷脂并将磷脂酰乙醇胺 (PE) 和荷负电的磷酯酰丝氨酸 (PS) 暴露于细 胞表面。PS 暴露于细胞表面导致表面具有负电位， 并且将质子从本体 (bulk) 吸引至膜界 面。
     (ii). 膜的外小叶内氨基磷脂 (PE 和 PS) 分数的增加导致膜外小叶的界面内的质 子流 ( 界面质子流， Interfacial proton currents， IPC) 的增强。该增强归因于易于参与 质子转移反应如 PE 和 PS 替换外膜小叶中的磷酯酰胆碱 (PC) 和鞘磷脂 (SM) 的官能团的数 目显著增加。PE 包含伯胺， 而 PS 包含伯胺以及羧基。相比之下， PC 和 SM 各包含携带有永 久性正电荷的季铵， 因此不能参与质子转移反应。
     (iii). 此外， 凋亡的膜的特征为膜成分堆积水平的降低以及膜流体性的增大。
     在对 NST-ML- 作用基元的作用模式的非限制性假设中， 其包含在接近具有上述特 征的膜即凋亡细胞的质膜时被选择性地活化的开关部分 (switch moiety)( 图 1)。由于所 述作用基元具有两个荷负电的羧酸根 ( 烷基丙二酸盐的 pKa 为约 5.6 和 2.8)， 从而在生理 条件下的形式电荷为 -2， 因此其在生理 pH 中可溶。 然而， 在接近凋亡的膜时， 由于表面酸性 更强， 并且由于起提高羧基 pKa 值作用的界面环境的介电常数降低， 因此质子被丙二酸根 部分捕获。
     质子被丙二酸根的捕获中和了负电荷之一， 从而使得总电荷为 -1 的分子更为疏 水。此外， 质子的捕获进一步导致更为独特的情况， 其包括以下方面 ：
     (i). 形成酸 - 阴离子对， 其中在质子化的羧基与未质子化的羧基之间形成异常强 的氢键。该氢键较强、 对称且经共振及互变异构化稳定化。
     (ii). 这 导 致 负 电 荷 分 布 于 四 个 羧 基 原 子，即 其 部 分 离 开 原 位 (partiallydelocalized)。
     (iii). 强的酸 - 阴离子氢键使分子刚性化， 生成大体积、 刚性、 扁平的六元环， 携 带有部分离开原位的负电荷， 并且在羧基双键上包含 π 电子云。根据对本发明化合物作用 机制的非限制性假设， 这种元件 (element) 能够相对有利地穿透至膜界面之中。然而， 其大 体积、 刚性的结构将其结合选择性地指向松散地堆积的膜， 即凋亡的膜， 而阻止了与高度堆 积的膜如健康细胞的质膜的结合。这些空间特征从而提高了与凋亡膜结合的选择性。
     在所述单质子化的丙二酸盐选择性地穿透入凋亡细胞的膜界面时， 其遭受增强的
     界面质子流的影响， 并在增强的界面氢键网络中整合 (integrated)。丙二酸根部分获得第 二个质子的可能性在这些情况下显著增加。 这将进一步导致电荷的中和以及与相邻磷脂分 子进一步形成酸 - 阴离子对。总之， 这些事件都将稳定化所述分子与凋亡膜的界面的结合。
     质子化的丙二酸根部分穿透入膜界面中以及其与界面的结合的稳定化允许烷基 链 R 穿过膜界面并到达其最佳结合环境， 即膜的烃核， 于此其将通过疏水性相互作用进一 步促进化合物结合 (compound binding) 的自由能增加。
     通过与用于造影的标记物或治疗药物 ( 通式 I 的部分 D) 经由烃连接基 [ 式 I 或 2 的 (CH2)m] 结合， NST-ML- 作用基元被用于有用的诊断或治疗目的。 根据该方法的 NST-ML- 作 用基元起靶向部分的作用， 使得所述用于造影的标记物或连接于其上的所述药物选择性地 靶向于遭受细胞死亡、 特别是凋亡的细胞和组织， 或遭受血小板活化和血栓形成的组织。
     图 1 所示为 NST200( 式 IV)， 并且描述了其在生理条件下接近并与 PNOM 膜结合的 三个阶段 ：
     A： 所述化合物在水溶液中， 从而两个羧基均去质子化即荷负电， 并且所述化合物 为高度水溶性。
     B： 在接近所述荷负电的凋亡膜时， 所述化合物获得质子。阴离子 - 酸二聚体得以 形成， 从而生成稳定的、 经共振稳定化的六元环， 该环透入膜界面。 由于所述大体积、 刚性环 结构的空间特征有利于与凋亡细胞的更松散地堆积的质膜而不是健康细胞的紧密堆积的 质膜的结合， 因此该结构有益于选择性。 C： 在所述化合物透入至所述膜界面中时， 其遭受界面氢键网络以及存在于凋亡膜 的界面的增大的界面质子流的影响。 所导致的质子化以及氢键结合进一步起稳定化所述化 合物与界面结合的作用 ( 箭号 )。 这种穿透进一步允许烷基链到达其在膜中的最佳位置， 从 而通过与膜的烃核形成疏水性相互作用而进一步对结合能作出贡献。
     本发明的化合物可用于以本发明的三种不同的途径将医药学上有用的物质选择 性地靶向于包含 PNOM 细胞的组织和器官 ：
     (i). 根据下文称作 “探测途径” 的第一种途径， 所述选择性的结合可用于将用于造 影的标记物靶向于 PNOM 细胞。如下文将解释的， 这可在体内、 体外或离体的临床实践中用 于其中出现这种细胞的疾病的诊断。
     (ii). 根据下文称作 “治疗途径” 的第二种途径， 选择性结合的性质用于将治疗药 物选择性地靶向于其中出现 PNOM 细胞的身体器官和组织， 例如细胞死亡、 血栓形成或炎症 区域。
     (iii). 根据下文称作 “清除途径” 的第三种途径， 通过将本发明的化合物连接至固 体载体， 所述化合物与 PNOM 细胞的选择性结合被用于自体液如血液中清除由于其促凝血 性质而潜在地有害的 PNOM 细胞。
     根据所述探测途径， 本发明涉及用于体内、 体外或离体探测 PNOM 细胞的包含含有 或连接于用于造影的标记物的 PMBC 作为有效成分的组合物。这种 PMBC 在下文中被称作 “诊断型 PMBC” 。所述诊断型 PMBC 能够与待测样品中存在的 PNOM 细胞选择性地结合。随 后， 所述结合可被本领域公知的手段鉴别。本发明的诊断型 PMBC 使得通过 PMBC 将标记物 以选择性的方式靶向于 PNOM 细胞成为可能。随后， 根据所用的特定标记， 可以本领域公知 的方式例如荧光、 放射性发射 (radioactiveemission) 或生成颜色、 MRI、 x 射线等探测所述
     可探测的标记。在一个具体实施方案中， 所述诊断型 PMBC 通过共价或非共价 ( 例如静电 ) 结合连接至所述可探测的标记。
     在一个具体实施方案中， 所述可探测的标记可为金属离子 Tc、 氧合 Tc、 In、 Cu、 Ga、 Xe、 Tl、 和 Re、 氧合 Re、 以及共价地连接的原子各自的放射性同位素 ； 用于放射性同位素扫 123 131 描如 SPECT 的 I 和 I ； 用于 MRI 的 Gd(III)、 Fe(III) 或 Mn(II) ； 以及用于正电子发射断 18 15 18 11 13 124 13 75 层扫描 (PET) 的 F、 O、 O、 C、 C、 I、 N 和 Br。
     在一个具体实施方案中， 本发明的 PMBC 旨在通过 PET 扫描提供凋亡的临床成像， 18 所述 PMBC 包括 F 原子。
     由于某些用作造影标记物的放射性同位素如 18F 的半衰期短， 可在即将马上向 患者给药所述诊断化合物之前连接这种用于临床 PET 成像的标记物。因此， 合成一种 18 PMBC-PET 前体可以是有益的， 其包括将在向患者给药之前被放射性同位素如 F 取代的部 分。在一个具体实施方案中， 所述将被 18F 取代的部分选自羟基、 硝基、 或卤素原子如溴或 氯。这种 PMBC- 前体 PMBC-PET 前体同样包括在本发明范围之内。
     所述采用用于 PET 成像的 18F 标记可为上述结构的任意 PMBC 的 PMBC 的方法包括 将 18F 原子连接至 PMBC 从而用用于 PET 成像的 18F 放射性标记所述 PMBC 的步骤。任选地， 在所述的连接 18F 原子的步骤之前， 可由适宜的保护基团将所述 PMBC 的官能团加以保护。 18 然后所述保护基团在所述连接 F 原子的步骤之后被任选地除去。 99m
     在所述标记物为金属原子 ( 例如分别用于 MRI 或 SPECT 的 Gd、 Tc 或氧合 99mTc) 的情况下， 所述 PMBC 包括金属螯合剂。所述螯合剂的金属配位原子可为氮、 硫或氧原子。 在本发明的一个具体实施方案中， 所述螯合剂为二氨基二硫醇、 单氨基 - 单酰胺 - 双硫醇 (MAMA)、 三酰胺 - 单硫醇、 以及单氨基 - 二酰胺 - 单硫醇。在这种情况下， 在与金属原子络 合之前为连接至螯合剂或者包含螯合剂的 PMBC 的 PMBC- 螯合剂前体以及包括所述金属原 子的络合物均包括在本发明的范围之内。
     对于荧光探测而言， 所述诊断型 PMBC 可包括选自本领域已知的任意的荧光探针 的荧光基团。这种探针的实例为 5-( 二甲基氨基 ) 萘 -1- 磺酰胺 ( 丹磺酰基 - 酰胺 )、 以及 荧光黄。
     本发明的化合物可用于探测并诊断各种不同的以 PNOM 细胞的生成为特征的医学 状况。以 PNOM 细胞为特征的临床状况的实例如下 ：
     以过度凋亡的发生为特征的疾病， 如退行性疾病 (degenerativedisorder)、 神经 退行性疾病 ( 例如帕金森氏病、 阿尔茨海默氏病、 亨廷顿氏病 )、 AIDS、 ALS、 朊病毒疾病、 骨 髓增生异常综合征、 缺血性或中毒性损伤、 移植排斥过程中的移植细胞损失、 肿瘤、 以及特 别是高度恶性 / 侵蚀性肿瘤不仅以过度的组织增殖为特征还具有凋亡增强的特征。
     本发明实施例 3 以及图 2 例证了本发明化合物在探测正在经历死亡过程的脑细胞 中的性能。所述细胞死亡的诱因为局部缺血 / 再灌注。与对侧未受损的半球相比， 受损的 脑半球表现出明显的高水平的氚标记的 NST200 吸收。
     表现为过度的血液凝结的疾病， 其中 PNOM 存在于血小板活化过程中和 / 或其他细 胞 ( 如内皮细胞 ) 的活化或损伤过程中。这些疾病包括动脉或者静脉血栓形成、 血栓栓塞、 例如心肌梗塞、 脑卒中、 肾静脉血栓形成、 弥漫性血管内凝血 (DIC)、 血栓性血小板减少性紫 癜 (TTP)、 镰状细胞病、 地中海贫血、 抗磷脂抗体综合征、 系统性红斑狼疮。炎症性疾病和 / 或与免疫介导的病因或者发病机制有关的疾病， 自身免疫性疾病 如抗磷脂抗体综合征、 系统性红斑狼疮、 结缔组织疾病如类风湿性关节炎、 硬皮病 ； 甲状腺 炎； 皮肤病如天疱疮或结节性红斑 ； 自身免疫性血液病 ； 自身免疫性神经病如重症肌无力 ； 多发性硬化 ； 炎症性肠疾病如溃疡性结肠炎 ； 血管炎。
     动脉粥样硬化斑块， 以及特别是不稳定、 脆弱以及易于破碎的斑块同样以 PNOM 细 胞为特征， 如凋亡的巨噬细胞、 凋亡的平滑肌细胞、 凋亡的内皮细胞、 以及活化的血小板。 这 种活化的血小板存在于血栓症中， 通常与不稳定的动脉粥样硬化斑块有关。
     所述探测可在已知患有相应的疾病的患者中实施， 以评价疾病的严重性以及监控 疾病进程和 / 或对各种治疗形式的反应。这种监控的非限制性的实例为对抗癌治疗的反 应的评价。由于多数抗癌治疗如化疗或者放疗均通过诱导凋亡发挥作用， 因此通过诊断型 PMBC 探测由治疗诱导的肿瘤细胞的凋亡可提供肿瘤对所述抗肿瘤药物的敏感程度的信息。 这可显著地缩短在给药抗癌治疗与对其效力正确评价之间的延迟期。
     此外， 所述探测还可用于监控抗癌治疗的副作用。大部分的这种副作用是由于不 当的治疗导致正常但是敏感的细胞如胃肠道上皮细胞或者骨髓造血系统细胞的凋亡。
     并且， 所述探测可用于表征通常与肿瘤侵蚀性水平有关的肿瘤内的内在凋亡负荷 (intrinsic apoptotic load) ； 通过探测经常发生于转移瘤中的内在凋亡还可能有助于探 测转移瘤。
     类似地， 由于凋亡在移植排斥过程中的细胞损失中起主要作用， 因此本发明所述 诊断型 PMBC 可用于监控在器官移植后的移植存活 (graftsurvival)。
     此外， 所述探测可用于监控对细胞保护性治疗的反应， 并因此通过使估测细胞死 亡成为可能而有助于筛选和开发能够在 ( 例如如上所述的 ) 各种疾病中抑制细胞损失的药 物。
     动脉粥样硬化斑块的去稳定化使得它们脆弱、 易于破碎、 生成血栓并生成栓塞， 由 于其特征为若干种 PNOM 细胞包括凋亡细胞 ( 凋亡的巨噬细胞、 平滑肌细胞以及内皮细胞 ) 以及活化的血小板的参与， 因此所述探测还可用于探测动脉粥样硬化斑块。
     根据该方法， 本发明涉及一种探测选自全身、 器官、 组织、 组织培养物或任意的其 他细胞种群中的细胞种群中的 PNOM 细胞的方法， 所述方法包括 ： (i) 将所述细胞种群与根 据本发明任意具体实施方式的诊断型 PMBC 相接触 ； (ii) 测定与细胞种群结合的 PMBC 的 量， 其中显著量的化合物与种群内的细胞结合提示所述细胞为 PNOM 细胞。
     实施例部分显示了氚标记的 NST 200、 NST 203 以及 NST 205 与凋亡细胞以比对照 非凋亡细胞更多的量结合的能力， 证明了本发明的化合物在选择性的结合以及探测凋亡细 胞中的性质。
     在另一个具体实施方式中， 本发明进一步涉及一种在患者或动物体内探测 PNOM 细胞的方法， 所述方法包括 ： (i) 向接受检查的患者或动物给药诊断型 PMBC ； 所述给药以本 领域公知的任意方法进行如非胃肠道给药 ( 如静脉内给药 ) 或口服给药 ； 以及 (ii) 通过本 领域公知的方法 ( 例如 PET 扫描、 SPECT、 MRI) 对接受检查的患者或者动物造影， 以探测并测 定与细胞结合的诊断型 PMBC 的量， 其中显著量的化合物与细胞结合提示所述细胞为 PNOM 细胞。
     在本发明的另一个具体实施方式中， 本发明涉及一种用于体外或离体探测组织或者细胞培养物样品中的 PNOM 细胞的方法， 所述方法包括 ： (i) 在使得所述诊断型 PMBC 能够 结合至 PNOM 细胞的生物膜的条件下将所述样品与诊断型 PMBC 接触， 其中所述诊断型 PMBC 可为本发明所述的任意 PMBC 化合物 ； 以及 (ii) 探测与细胞结合的诊断型 PMBC 的量， 存在 显著量的结合的诊断型化合物提示所述组织或者细胞培养物中存在 PNOM 细胞。
     体外或离体试验中的探测步骤例如可为， 在荧光标记的本发明化合物的情况下， 不限于通过应用流式细胞仪分析， 其允许在普遍可商购的仪器上实现细胞可视化。在使用 荧光可视化细胞的实施例中， 单束 15mW 的氩离子激光束 (488nm) 用于激发 FITC 荧光， 且使 用 530nm 带通滤光器采集荧光数据制成柱状图。例如可使用 Lysis II 软件或者其他软件 计算荧光细胞的百分比。 所述探测方法可用于本发明用于筛选治疗药物如抗癌药物的具体 实施方式中。
     根据本发明， 术语 “显著量” 是指与 PNOM 细胞结合的 PMBC 的量比与非 PNOM 细胞 结合的量至少高 30％。实际的量可随所采用的成像方法以及设备、 以及随接受检查的器官 或者组织而变化。在另一个具体实施方式中， 与 PNOM 细胞结合的 PMBC 的量比与非 PNOM 细 胞结合的量至少高 50％。在另一个具体实施方式中， 与 PNOM 细胞结合的 PMBC 的量比与非 PNOM 细胞结合的量至少高 75％。在另一个具体实施方式中， 与 PNOM 细胞结合的 PMBC 的量 是与非 PNOM 细胞结合的量的至少 2 倍。 在另一个具体实施方式中， 与 PNOM 细胞结合的 PMBC 的量是与非 PNOM 细胞结合的量的至少 4 倍。在另一个具体实施方式中， 与 PNOM 细胞结合 的 PMBC 的量是与非 PNOM 细胞结合的量的至少 6 倍。在另一个具体实施方式中， 与 PNOM 细 胞结合的 PMBC 的量是与非 PNOM 细胞结合的量的至少 8 倍。在另一个具体实施方式中， 与 PNOM 细胞结合的 PMBC 的量是与非 PNOM 细胞结合的量的至少 10 倍。
     所述结合作用尤其取决于用于测定结合差异的方法。 本发明的方法可用于诊断以 PNOM 细胞的出现为特征的疾病， 例如但不限于如上所述的任意疾病。
     本发明的方法还可用于监控如上所述用于治疗疾病或者医学状况或者用于基础 科学研究目的的各种治疗形式的作用。
     根据本发明的称作 “治疗途径” 的第二种途径， 本发明涉及用于将活性药物或者前 药靶向 PNOM 细胞的包含 PMBC 的药物组合物。本发明的治疗型 PMBC 是指包含药物的 PMBC 或者与可用于医疗用途的物质相结合的 PMBC。术语 “结合物” 是指两个分子通过本领域公 知的方法连接到一起。
     所述可用于医疗用途的药物与其中包含于所述治疗型 PMBC 或者连接至所述治疗 型 PMBC 的 PMBC 之间的结合可通过共价结合、 非共价结合 ( 例如静电力 ) 或者通过形成包 含药物并在其表面具有将复合物靶向于 PNOM 细胞的 PMBC 的载体颗粒 ( 如脂质体 )。一旦 药物到达靶标， 当其仍为所述 PMBC 结合物的一部分时、 在 ( 例如通过天然酶的断裂、 破坏等 作用 ) 自所述 PMBC 单位脱离后、 通过在其膜上具有 PMBC 的含药脂质体的吞噬作用、 或者通 过任意其他的已知机制， 所述药物应当能够发挥其生理活性。
     应当根据所述组合物即将用于的特定疾病选择所述药物。
     本发明的所述药物组合物以及所述诊断型组合物可通过任意已知的途径给药， 尤 其是口服给药、 静脉内给药、 腹膜内给药、 肌肉内给药、 皮下给药、 舌下给药、 眼内给药、 鼻内 给药或局部给药、 或者脑内给药。 所述载体可根据所需的给药模式选择， 并且包括任意的已 知成分， 例如溶剂、 乳化剂、 赋形剂、 滑石、 矫味剂、 着色剂等。若需要， 所述药物组合物还可包括用于治疗疾病、 消除副作用或增强活性成分的活性的其他药物学活性化合物。
     根据这方面， 本发明进一步涉及一种治疗表现出 PNOM 细胞的疾病的方法， 其包括 向需要这种治疗的个体给药有效量的治疗型 PMBC， 所述治疗型 PMBC 包含具有治疗所述疾 病的活性的药物或者将在靶区域被转化为活性药物的前药。所述治疗型 PMBC 允许将药物 选择性地靶向于包含 PNOM 细胞的组织， 从而增加其局部浓度， 并潜在地提高其在靶部位的 治疗效果。这种医疗疾病为如上所述的疾病。
     在另一个具体实施方式中， 本发明提供一种杀死肿瘤内癌细胞的方法， 其包括通 过给药治疗型 PMBC 而靶向肿瘤内的凋亡细胞从而杀死癌细胞的步骤， 其中所述治疗型 PMBC 包含如式 I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII、 IX、 X、 XI、 XII、 XIII、 或 XIV 结构所示的各 化合物以及细胞毒性药物。 在一个具体实施方式中， 所述杀死肿瘤细胞的方法包括一种 “自 催化机制” (autocatalytic mechanism)， 其中由于细胞毒性药物的细胞毒性作用使肿瘤内 的凋亡细胞负荷增加， 从而为所述治疗型 PMBC 的下一剂量的靶向创造出更多的位点， 因此 靶向于肿瘤的细胞毒性药物的量随连续的剂量而增加。 这种策略可提高抗癌治疗的效力并 增加根除肿瘤的机会。
     术语治疗型 PMBC 的 “有效 ( 的 ) 量” 是指能够将所述疾病的至少一种表现减少至 可测量水平的量， 该量应当根据所使用的药物、 给药方式、 患者的年龄和体重、 疾病的严重 程度等加以选择。
     在另一具体实施方式中， 本发明的治疗型 PMBC 包括或者被连接至具有治疗作用 的放射性同位素。 这种放射性同位素的非限制性实例为钇 90、 碘 131、 铼 188、 钬 166、 铟 111、 镥 (Leutitium)177、 或可用于治疗目的的其他发出辐射的放射性同位素。
     在另一具体实施方式中， 本发明提供一种通过给药治疗型 PMBC 从而将所述治疗 药物靶向于血液凝块中的活化的血小板并减少 / 预防血栓生成的减少 / 预防血液凝结的 方法， 所述治疗型 PMBC 包含被连接至抗凝血剂或纤溶剂的如式 I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII、 IX、 X、 XI、 XII、 XIII、 或 XIV 结构所示的任一化合物。
     该方法还可用于治疗或者预防表现为过度血液凝结的疾病的方法， 其中 PNOM 发 生于血小板活化、 和 / 或其他细胞 ( 例如内皮细胞 ) 的活化或者损伤过程中。这些疾病尤 其包括心肌梗塞、 脑卒中、 深静脉血栓、 弥漫性血管内凝血 (DIC)、 血栓性血小板减少性紫癜 (TTP)、 镰状细胞病、 地中海贫血、 抗磷脂抗体综合症、 系统性红斑狼疮。
     根据本发明称作 “清除途径” 的第三种途径， 本发明的 PMBC 特异性地与 PNOM 细胞 结合的性质被用于将所述细胞自体液中清除。在本发明的一个具体实施方式中， 所述体液 是血液或者血液产品。
     许多需要体外循环的外科手术或者药物干涉与将血液成分暴露于外源性人造环 境有关。这常常导致血细胞的活化及损伤、 系统性炎症、 以及血栓栓塞现象， 在微栓子存在 于脑血管中时可能具有严重的临床后果如神经功能紊乱。 因此探测并自血液中清除所述受 损的、 活化的或者凋亡的细胞是有利的。
     因此， 根据其一方面， 本发明涉及一种固定于固体载体的 PMBC。 该固定可通过直接 连接、 或者通过共价或者非共价连接、 或者通过间隔基连接。所述固定的 PMBC 用于将 PNOM 细胞自体液中清除。
     根据本发明的另一个具体实施方式， 所述固体载体的特征为具有连接有 PMBC 的多个珠粒。优选地， 所述珠粒为由树脂包覆的珠粒。或者所述珠粒可为磁性珠粒。
     在所述固体载体包括体液沿着和 / 或通过其流动的许多纤维或者微毛细管的情 况下， 其内表面和 / 或外表面包覆有所述 PMBC。
     所述固定于固体载体的化合物构成过滤装置的一部分。因此， 根据所述清除途 径， 本发明进一步涉及一种过滤装置， 其包括含有所述固定于固体载体上的 PMBC 的框架 (housing) 以及液体入口及液体出口。 如血液或者血液产品的体液通过入口进入所述框架， 与包含于所述框架中的经固定的 PMBC 接触并与其连接。从而， 自所述体液中清除了具有干 扰的膜的循环着的细胞如受损或者将死的细胞， 或者清除了更大的结构如具有 PNOM 膜的 栓塞物。因此， 自出口出来的液体的 PNOM 细胞含量降低或者基本不含有 PNOM 细胞。
     所述过滤装置可构成体外循环设备的可置换的、 永久的、 或者附加的部分。因此， 本发明还涉及一种包含所述过滤装置的体外循环设备， 其中通过所述设备循环的血液也通 过所述装置。
     这种设备的实例为心肺旁路设备 (cardiopulmonary bypassapparatus)、 血液透 析设备、 血浆去除设备以及输血设备如现有技术中的输血袋。
     实施例 为了理解本发明并了解其如何实际实施， 记载了以下实施例 ： 本发明化合物合成 的实施例、 本发明化合物在与正在经历细胞死亡过程的细胞选择性地结合的性能的实施 例。 为了探测本发明化合物， 将他们用氚放射性标记， 并通过测定受损区域的吸收或者通过 放射自显影方法探测。在某些实施例中， 通过将其连接至荧光标记物即丹磺酰基团标记所 述化合物， 并通过荧光显微术探测。在体外于组织培养物中以及在体内于其中细胞死亡是 由大脑中动脉的闭塞导致的脑卒中的鼠模型中、 在肾缺血性和中毒性损伤的鼠模型中、 在 黑素瘤鼠模型中、 在结肠癌鼠模型中以及在与多发性硬化有关的鼠模型试验自身免疫脑脊 髓炎 (EAE) 中证实了所述化合物与凋亡细胞结合的选择性。
     实施例 1 ：
     NST-ML-F-4(2- 丁基 -2(3- 氟代丙基 )- 丙二酸 ) 的合成 ； NST205( 路线 1)
     用 1eq 二 甲基甲酰 胺中的 NaH 将 丙二 酸二 叔丁 酯 (5mL) 去质 子化， 在氢释 放 (hydrogen evolution) 停止后加入 1eq 正丁基碘。 将反应混合物加热到 50℃， 持续 14 小时。 应用柱色谱以 95％的收率得到 5.8 克丁基丙二酸二叔丁酯 (2)。用 NaOCH3(0.05eq， cat.) 以及甲苯中的丙烯醛 (1.1eq) 处理 2(3.8g) 得到 1.26g 醛 (3)， 收率为 30％。然后将化合 物 3 与乙醚 / 水 (8 ∶ 1v/v) 混合物中的 NaBH4(1.05eq) 反应 2 小时。在精制 (work-up) 以 及快速色谱后， 得到纯的醇 4(93％ )。用 1.1eq 甲磺酰氯 (MsCl) 以及 2.2eq 三乙胺 (Et3N) 处理所得到的产品， 得到甲磺酸酯化合物 5， 收率 97％。该产品基本纯净， 并且未经进一步 纯化而直接用于下一反应。
     在氮气流下将 2mL 乙腈中的 KF(5eq)、 kryptofix(5eq) 以及 K2CO3(2.5eq) 的混合 物气提至干燥 4 次。 然后加入 2mL 乙腈中的甲磺酸酯化合物 5(167mg)。 在 120℃的沙浴中搅 1 拌反应 10 分钟。 在精制时， 粗产物的 H-NMR 显示为所需的化合物 6 与 kryptofix 的混合物。 采用 (474mg) 以及三氟乙酸 (TFA)(17mL) 在 10℃下使二叔丁酯 6 去质子化 30 分钟， 然后蒸 发至干燥。将残余物质自氯仿中蒸发 2 次， 并在真空管道中干燥得到 NST-ML-F-4 白色固体 1 (312mg， 99％ )。 所述化合物的 NMR 数据为 ： H NMR(300MHz， CDCl3)δ4.41(dt， Jt ＝ 5.9Hz， Jd
     ＝ 47.4Hz， 2H)， 1.97-1.91(m， 2H)， 1.89-1.83(m， 2H)， 1.69-1.60(m， 1H)， 1.58-1.52(m， 1H)， 13 1.33(p， J ＝ 6.9Hz， 2H)， 1.25-1.14(m， 2H)， 0.92(t， J ＝ 7.2Hz， 3H) ；CNMR(75MHz， CD3OD) 19 δ175.8， 86.2， 84.1， 58.6， 34.1， 30.1， 30.0， 27.9， 27.3， 27.0， 24.5， 14.6 ；F NMR(282MHz， CD3OD)δ-220.9 ； MS(EI)m/z219(M-H)。
     路线 1 ：
     实施例 2 ：
     NST-ML-F ： 2- 甲基 -2(3- 氟代丙基 )- 丙二酸的合成 ； NST201( 路线 2)
     用 1.5eq 的 3， 4- 二氢 -2H- 吡喃以及 135mL 的 CH2Cl2 中的对甲苯磺酸吡啶 (PPTS) 处理 3g 的 4- 溴 -1- 丁醇 (1)。在精制和提纯后， 得到 1.45g(33％ ) 的产物 2。用 1eq 的 NaH 使 1.0eq 的二乙基甲基丙二酸酯去质子化， 并在 50℃下一同加入催化量的 KI。10 小时 后观察到转化完全， 并得到 90％的收率。在 55℃下采用 PPTS 使四氢吡喃去保护顺利进行。 在精制后， 得到定量收率的醇 4， 并直接用于甲磺酰化反应 ( 如上所述 )。 利用手头的甲磺酸 酯 5 如上所述与 kryptofix 进行反应。以 68％的收率得到化合物 6。在 50℃用 2N NaOH/ EtOH(30mL/5mL) 处理化合物 6(233mg) 得到 NST-ML-F， 收率约为 99％ (190mg)。 1
     所述化合物的 NMR 数据为 ： H NMR(300MHz， CDCl3)δ11.89(bs， 2H)， 4.46(dt， Jt ＝
     5.9Hz， Jd ＝ 47.2Hz， 2H)， 1.99-1.92(m， 2H)， 1.82-1.64(m， 2H)， 1.50(s， 3H)， 1.50-1.40(m， 13 2H) ；C NMR(75MHz， CDCl3)δ178.6， 85.1， 82.9， 54.2， 35.5， 31.0， 30.8， 20.8， 20.7， 20.2 ； 19 F NMR(282MHz， CDCl3)δ-219.0 ； MS(EI)。
     路线 2 ：
     实施例 3 ：
     氚标记的 NST 200 以及 NST 205 与正在经历由 CD95 诱导的凋亡的培养的 Jurkat 细胞的选择性结合
     试验步骤 ：
     使培养的 Jurkat 细胞 ( 人类成年 T 细胞白血病细胞 ) 于补充有 10 ％胎牛血 清 (FCS)、 2mM L- 谷氨酰胺、 1mM 丙酮酸钠、 1mM HEPES 以及抗生素 (100 单位 /ml 青霉素、 100μg/ml 链霉素、 以及 12.5 单位 /ml 制霉菌素 ) 的 RPMI 培养基 (Beit-Haemek， Israel) 7 中的混悬物内生长。然后通过用 CD95(0.1μg/10 细胞 /ml) 处理触发凋亡。结果， 显著百 分比的细胞凋亡。未处理的细胞作为对照。然后在室温下将对照细胞以及凋亡细胞均温育 40 分钟， 然后在冰上与 (2μCi/107 细胞 /0.5ml) 氚标记的 NST 200 以及 NST 205 温育 30 分钟。
     将 细 胞 洗 涤 2 次 后， 向 小 球 中 加 入 1ml 的 SOLVABLETM 试 剂 (GNE9100， Packard Biosciences)。于 60 ℃下温育一小时后， 将萃取物转移至玻璃闪烁瓶中并向各瓶中加入 10ml 闪烁液 (Ultima gold 6013329， Packard Biosciences)。在冷却至室温并适应黑暗 1 小时后对放射性计数。计算放射性值并表示为总共加入的放射性标记的 NST 200 以及 NST 205 的百分比。
     试验结果 ：
     由图 2A 中清晰可见， 与非凋亡细胞相比， 凋亡细胞显示出显著更高的 NST200 吸收 (8 倍以上 )。 该试验证明， NST200 能够与凋亡细胞选择性地结合并可用作探测其的标记物。 相似地， 如图 2B 所示， 与非凋亡细胞相比， 凋亡细胞显示出更高的 NST205 吸收， 而该作用在 加入胱天蛋白酶抑制剂 ZVAD( 氟代甲基酮肽 (V- 缬氨酸、 A- 丙氨酸、 D- 天冬氨酸 ) 胱天蛋 白酶抑制剂 ) 后完全逆转。
     实施例 4 ： NST 203 与正在经历凋亡的培养的 HeLa 细胞的选择性结合
     使 HeLa S3 细胞 (ATCC CCL-2.2) 在补充有 2mM L- 谷氨酰胺、 100 单位 /ml 青霉 素、 100μg/ml 链霉素、 12.5 单位 /ml 制霉菌素以及 10％胎牛血清 (FCS) 的 Dulbecco′ s 改 良的 Eagle′ s 培养基 (DMEM) 中生长。在 10cm3 的培养皿中将细胞以 5×106 细胞 / 皿的密 度播种 10ml 体积， 并通过不更换生长培养基而温育培养物 96 小时使其老化 (age)。结果， 显著百分比的细胞凋亡。使用细胞刮棒收获细胞， 由使其通过具有 18G 针头的注射器而分 6 离为单独的细胞， 并以 10 细胞 /ml 的密度重新混悬于 pH ＝ 7.4 的 PBS 缓冲液中。如前所 示， NST 203 包含能够使单个细胞的荧光可视化的丹磺酰基酰胺基团。图 3A 中所示为 NST 203 与凋亡细胞的选择性结合， 其证明 NST 203 被吸收入凋亡细胞种群之中 ( 绿色、 颜色鲜 艳的 (glowing color) 细胞， 分别以箭号标记 )， 而在非凋亡细胞中观察到非荧光 ( 蓝色、 颜 色不鲜艳的细胞， 以箭头标记 )。
     相比之下， 具有相同荧光团但不具备所述 NST-ML 作用基元的对照化合物正丁及 丹磺酰基酰胺 (BDA) 未表现出这种选择性， 从而证实了所述 NST-ML 作用基元在与凋亡细胞 的选择性结合中的活性。因此， NST203 可用作与凋亡细胞选择性地结合的标记物。
     实施例 5 ：
     NST 203 在小鼠体内与正在经历由化疗诱导的死亡过程的黑素瘤细胞的选择性结 合
     试验步骤 ：
     向小鼠 (c57/ 黑 ； 8 周龄雄性小鼠 ) 侧腹双侧皮下注射源自鼠黑素瘤的 B 16-F10 5 细胞 (ATCC CRL-6475 ； 10 细胞 / 小鼠， 体积 100μl)。在注射之前将细胞系在补充有 4mM L- 谷氨酰胺、 100 单位 /ml 青霉素、 100μg/ml 链霉素、 12.5 单位 /ml 制霉菌素以及 10％胎 牛血清 (FCS) 的 Dulbecco′ s 改良的 Eagle′ s 培养基 (DMEM) 中的培养物内维持。10 天 后， 当肿瘤直径达到 5-7mm 的尺寸时， 对小鼠进行化疗 ( 紫杉醇 (Taxol)20mg/Kg 以及环磷 酰胺 (Cyclophosphomide)300mg/Kg， 腹膜内注射 200μl 体积 )。24 小时后， 静脉内注射 tris 碱缓冲剂内 10％发色团中的 NST-203， 剂量为 2.8mg/ 小鼠。两小时后， 牺牲小鼠并收 获肿瘤以及其他器官， 并立即于液氮中冷冻。通过对各种组织冷冻切片的荧光显微术评价 肿瘤以及其他器官对 NST-203 的吸收。
     试验结果 ：
     图 4A 所示为对肿瘤的荧光显微术。可以观察到 NST203 大量与许多经历凋亡的肿 瘤细胞结合。还证实了所述化合物的细胞内累积 ( 图片右侧 ) 以及选择性的高水平， 其反 映在大量吸收入凋亡细胞中， 而周围的存活细胞却保持未被染色 ( 图片的左上侧 )。
     化疗不仅在肿瘤靶组织导致细胞死亡， 还在非靶组织如胃肠道的上皮诱发细胞死 亡。图 4B 所示为 NST203 选择性地探测这些经历凋亡的细胞的能力 ( 见箭号 )。与肿瘤中 的发现相似， 在胃肠道中的存活细胞未表现出对 NST203 的吸收， 因此保持黑暗。
     因此， 这些结果显示本发明的化合物 NST203 具有在体内特异性地靶向凋亡细胞 的能力， 其中所述死亡过程是由化疗导致。 所述凋亡细胞是以通用的方式得以探测， 与所涉 及的组织无关。相比之下， 所述组织的存活细胞并不表现出这种结合。
     实施例 6 ：
     利用 3H-NST200 通过放射自显影对小鼠结肠癌模型对化疗的反应成像
     试验步骤 ：在 Balb/c 雄性小鼠的腹部建立结肠癌模型。在第 12-14 天当肿瘤大小为直径 6-8mm 时， 在通过静脉内注射两剂量的多柔比星 (20mg/kg， 间隔 72 小时 ) 对结肠癌肿瘤处 理后测定吸收入肿瘤中的 NST200。 化疗后 48 小时， 向对照未处理动物以及化疗处理的动物 均静脉内注射放射标记的 NST200(80μCi/ 动物 )。4 小时后， 牺牲动物。制备 10μm 的冷 冻切片， 风干并暴露于氚敏感型胶片。使胶片暴露 7 周的时间， 显影并通过测量光密度进行 分析。通过 TINA 软件估算从而测定缺血核对对侧半球的信号中光密度 /mm2 形式的 3H-DDC 密度。按照微量放射自显影标准转化信号并以 nCi/mg 单位表示。
     试验结果 ：
     未处理的肿瘤表现出未吸收 NST200， 因此， 不能通过放射自显影探测到图像 ( 图 5A)。然而， 在通过化疗诱导细胞死亡时， NST 200 的吸收显著增加， 提示具有大量经放射诱 导的细胞死亡过程 ( 图 5B 和 C)。可在肿瘤表面多个焦点处探测到强烈的暗斑形式的 NST 200 吸收。NST-200 标记局部化至肿瘤内凋亡区域的特定焦点而不扩散至整个肿瘤。经处 理的肿瘤的其他区域未被标记， 提示为活肿瘤组织。该结果强调了 NST 200 作为大量在濒 死细胞而并非活细胞内选择性地累积的靶向分子的有益之处 ( 图 5B)。 图 5C 中显示了甚至 相同的肿瘤内对治疗的反应的不一致性 (heterogeneous nature) ： NST200 的吸收特别地 在显示出更多的细胞死亡的肿瘤的一片大的区域内累积， 而并不在未对化疗做出反应的其 他肿瘤区域内累积。
     实施例 7 ：
     结肠癌模型对 3H-NST 200 的吸收 ： 化疗的作用
     试验步骤 ：
     将结肠癌模型鼠结肠癌细胞 (CT-26)(ATCC CRL-2638) 维持于 RPMI(Gibco， UK)、 2mM L- 谷氨酰胺、 100 单位 /ml 青霉素、 100μg/ml 链霉素、 12.5 单位 /ml 制霉菌素以及 10％ 加热的未活化的 (inactivation) 胎牛血清 (FCS)。在 8-10 周龄的成年雄性 Balb/C 小鼠中 进行试验 ( 体重 20-25 克 )。
     肿瘤的接种 ：
     将细胞胰蛋白酶化， 用 HBS(140mM NaCl、 0.5M Hepes、 PH 7.4) 洗涤两次， 然后离心 (5 分钟、 1000rpm、 4℃ ) 并浓缩至在甲基纤维素和盐水 (1 ∶ 3) 的混合物 (2％ ) 中 2×106 细 胞 / 毫升。将小鼠麻醉时， 将体积为 0.2ml 的上述溶液 ( 含有 4×105 细胞 / 剂量 ) 皮下注 射如小鼠腹部两侧。 麻醉储备液是由 0.85ml 的氯胺酮 (100mg/ml)+0.15ml Xilazine(2％ ) 以 1 ∶ 10 稀释制备。每 10 克体重注射 (i.p.)0.1ml 稀释的溶液。
     肿瘤追踪 ：
     每日检查小鼠的可触知肿瘤形成。肿瘤注射 7-10 天后， 可见到小肿瘤。 3
     结肠癌肿瘤对 H-NST 200 的吸收的评价
     在 通 过 静 脉 内 注 射 两 剂 量 的 多 柔 比 星 (20mg/kg， 间 隔 72 小 时 ) 对 结 肠 癌 肿 3 瘤处理后测定吸收入肿瘤中的 H-NST200。在第二次剂量 48 小时后， 向小鼠静脉内注 3 射 H-NST200(10μCi/ 动 物 )。4 小 时 后， 收 集 肿 瘤， 称重并加工组织 ： 在 60 ℃ 下， 在 20ml 闪 烁 玻 璃 瓶 中 以 每 150mg 肿 瘤 组 织 1ml 试 剂 的 比 例 用 SOLVABLE 试 剂 (GNE9100， PackardBioscience) 溶解肿瘤。 在 2-4 小时后， 将 1ml 各组织萃取物转移至玻璃闪烁瓶中。 为了减少颜色猝灭 (color quenching) 问题， 用 0.4ml 的 30％ H2O2 在 0.066M EDTA 的存在下处理样品。于室温下温育 15 分钟时间后， 在 60℃下温育萃取物 1 小时， 然后于室温下温 育 15 分钟。将十 (10)ml 闪烁液 (Ultima gold， 6013329， Packard Bioscience) 加入各瓶 中。 在室温下将各瓶温育 1 小时， 然后在 β- 计数仪中分析 (TRI-CARB 2100TR， 液体闪烁分 析仪， Packard Bioscience)。一式三份测定所有样品。计算各样品的注射的剂量的百分比 值 (％ ID/g 组织 )。
     试验结果 ：
     对 3H-NST200 在经多柔比星处理的结肠癌肿瘤中的累积对在未处理的对照肿瘤中 的累积的定量分析揭示， 在处理后 48 小时时 3H-NST200 大量累积。尽管在对照组中， 所有 3 的肿瘤累积了相似的少量的 H-NST200， 但在化疗处理的肿瘤中所述累积值不定， 某些肿瘤 显示出比对照组高 40-50 倍的吸收增长。处理组的吸收平均值为 1.28％ ID/gr， 比对照组 3 的平均值高 12.1 倍 ( 见图 6)。 H-NST200 累积值的宽谱表明不同的肿瘤各自对抗癌治疗 的反应。上述试验清楚地表明 3H-NST200 可用于探测肿瘤并用于探测细胞毒性剂对肿瘤细 胞的作用。
     实施例 8 ： 3
     H-NST200 在带有结肠癌肿瘤的小鼠中的生物分布 试验步骤 ：
     如前述实施例所述， 在 Balb/c 雄性小鼠的腹部建立结肠癌模型， 并向以多柔比星 3 处理的动物注射 H-NST200(10μCi)。四小时后， 牺牲动物， 收集并处理各器官 / 组织以测 3 定 H-NST200 于其中的累积。如所附图 7 所示， 在各器官中的累积表示为注射剂量 (ID) 的 百分比， 并计算肿瘤中的吸收与其他器官中吸收的比例。
     试验结果 ：
     由多柔比星对肿瘤组织造成的损伤的确超过对其他非靶向器官包括心脏和小肠 造成的损伤。 肿瘤中的吸收对表中所有器官的吸收的比例为＞ 1， 表明肿瘤中增加的凋亡以 3 及 H-NST200 在靶向组织相对于非靶向组织中的选择性累积。
     实施例 9 3
     在肿瘤尺寸减小之前， H-NST200 可探测由 BiCNU 处理的肿瘤中发生的细胞死亡
     试验步骤 ：
     如实施例 No.10 所述在 Balb/c 雄性小鼠腹部建立结肠癌模型。在第 12-14 天， 当 肿瘤大小为直径 6-8mm 时， 向小鼠静脉内注射多柔比星。总共给予 2 剂量的多柔比星， 间 隔 3 天 ( 每剂量为 20mg/Kg)。在第二次注射多柔比星 2 天后， 静脉内注射于体积为 0.2ml 3 3 通过过量剂量的三甲基乙烯牺牲小 盐水中的 10μCi H-NST200。注射 H-NST200 四小时后， 鼠。 将肿瘤收集于微量离心管中， 称重并于 -20℃冷冻。 在 60℃下， 在 20ml 闪烁玻璃瓶中以 TM 每 150mg 肿瘤组织 1ml 试剂的比例用 SOLVABLE 试剂 (GNE9100， Packard Bioscience) 溶 解肿瘤。在 2-4 小时后， 将 1ml 各组织萃取物转移至玻璃闪烁瓶中。为了减少颜色猝灭问 题， 用 0.4ml 的 30％ H2O2 在 0.066M EDTA 的存在下处理样品。于室温下温育 15 分钟后， 在 60℃下温育萃取物 1 小时， 然后于室温下温育 15 分钟。将十 (10)ml 闪烁液 (Ultima gold， 6013329， Packard Bioscience) 加入各瓶中。 在室温下将各瓶温育 1 小时， 然后在 β- 计数 仪中分析 (TRI-CARB 2100TR， 液体闪烁分析仪， Packard Bioscience)。计算各样品的注射 的剂量的百分比值 (％ ID/g 组织 )。在 NST200 吸收与肿瘤体积之间进行对比。在各剂量
     后， NST200 的吸收值与肿瘤体积相关， 其通过式 ( 假定为球形肿瘤 )V ＝ πD3/6， 其中 D 为 平均肿瘤直径。
     试验结果 ：
     在用多柔比星处理过程中 ( 最后 5 天 )， 肿瘤质量并未减少 ( 见图 8A)。相反， 肿 瘤继续生长， 与在经处理的肿瘤 5 天之间收集的对照未处理的肿瘤相比， 表现出 50％的体 积增大。该增大经发现为非显著性的。尽管在 2 剂量的多柔比星处理后肿瘤体积发生该非 显著性的变化， 但探测到 3H-NST200 吸收急剧增加 18.5 倍， 表明 3H-NST200 是甚至在不能探 测到肿瘤体积减小的情况下亦可感知到肿瘤内细胞死亡的灵敏工具 ( 见图 8B)。
     实施例 10
     通过放射自显影方法应用氚标记的 NST200 探测小鼠大脑中动脉闭塞后的凋亡损 伤
     试验步骤 ：
     通过颞下途径在 Balb/C 小鼠中诱导 p-MCA， 得到明显的局部缺血性损伤。p-MCA 22 小时后， 评价动物的神经学得分 ( 从 0- 无临床症状到 3- 偏瘫、 转圈以及紧张症 )， 并且在 牺牲动物前连续 2 小时静脉内注射放射标记的 NST200(80μCi/ 动物 )。制备 10μm 的冷冻 切片， 风干并暴露于氚敏感型胶片 (Hyperfilm-3h， RPN535B Amersham-Pharmacia， Eu)。使 胶片暴露 7 周的时间， 显影 (GBX Developer&Fixer， Kodak， USA) 并通过测量光密度进行分 析。通过 TINA 软件估算从而测定缺血核对对侧半球的信号中的光密度 /mm2 形式的 3H-DDC 密度。按照微量放射自显影标准 (RPN510Amersham-Pharmacia， Eu) 转化信号并以 nCi/mg 单位表示。
     试验结果 ：
     如由显示 3H-NST 200(a) 和 H&E 染色 (b) 的累积的图 9 中可见， 放射自显影图片 3 分析揭示了在凋亡 / 坏死性细胞死亡区域内 H-NST 200 靶向损伤的特异性。该结果由 H&E 3 染色进一步证实。 因此， H-NST 200 可用作放射自显影图片分析中脑凋亡性损伤的标记物。
     实施例 11
     大鼠肾缺血性再灌注 (I/R) 的 3H-NST 200 放射自显影
     试验步骤 ：
     在由腹膜内给药氯胺酮 (80mg/kg) 和 Xilazine(10mg/kg) 的组合诱导的全身麻醉 下对大鼠进行手术步骤。肾缺血是由使用小的无创伤血管钳钳夹左侧单侧肾动脉 45 分钟 造成的。同一动物的对侧未处理的肾设计用作伪手术对照。由清除夹钳引起再灌注。肾再 并且在 1 小时后， 灌注时间为 24 小时。在再灌注期间， 静脉内注射 100μCi of 3H-NST205， 切除双肾， 在液氮中冷冻并储存于 -70℃待用。制备 10μm 的冷冻切片， 风干并暴露于氚敏 感型胶片 (Hyperfilm-3h， RPN535B Amersham-Pharmacia， Eu)。使胶片暴露 7 周的时间， 显 影 (GBX Developer&Fixer， Kodak， USA) 并通过测量光密度进行分析。通过 TINA 软件估算 从而测定缺血肾对对侧肾的信号中的光密度 /mm2 形式的 3H-DDC 密度。按照微量放射自显 影标准 (RPN510Amersham-Pharmacia， Eu) 转化信号并以 nCi/mg 单位表示。 试验结果 ：
     如图 10 所示， 在大鼠肾缺血再灌注损伤期间， 在外髓质 (outermedulla， OM) 和皮 质 - 髓质区域 (cortico-medullary region) 的远端小管中观察到凋亡， 而在 OM 的近端小管
     直部观察到严重的坏死。在皮质中观察的较少的损伤。在对侧伪手术肾中未观察到损伤。 放射自显影图片分析揭示了在凋亡 / 坏死性细胞死亡区域内 3H-NST 205 靶向损伤的特异 性， 并由形态学分析进一步证实。相比之下， 证实无 3H-NST 205 被吸收到对侧的肾中， 强调 3 了 H-NST 205 仅吸收入受损肾中的特异性。
     实施例 12 3
     H-NST 205 在由放射性对比剂诱导的急性肾远端小管坏死 (ATN) 大鼠模型中的放 射自显影
     试验步骤 ：
     通 过 给 药 吲 哚 美 辛 (Sigma Chemical Co.)、 10mg/kg、 i.v.， Nω 硝 基 -L- 精 氨 酸 甲 酯 (L-NAME， Sigma Chemical Co.)、 10mg/kg、 i.v. 以 及 放 射 性 对 比 剂 碘 酞 钠 (sodium-iothalamate)80％ (Angio-Conray， MallinckrodtInc)、 6mL/kg、 i.a. 的组合诱导 具有选择性髓质缺氧性肾小管损伤的肾病。向其他大鼠注射载体作为对照。损伤 24 小时 后， 向对照以及试验大鼠静脉内注射 100μCi 3H-NST 205， 在 1 小时后切除肾并与液氮中冷 冻。
     试验结果 ：
     如图 11 所示， 肾形态学分析揭示髓质 ( 即外髓的外部和内部条带 ) 损伤程度范围 较广。 3H
     -NST 205 的自导 (homing) 主要限制于外髓内的受损区域。未在特定无形态学 损伤的区域发现 3H-NST 205 吸收。
     实施例 13
     通过 3H-200 对试验自身免疫脑脊髓炎 (EAE) 的成像 ； 放射自显影
     试验步骤 ：
     通过免疫 6-8 周龄的 C3H.SW/C57/bl 雌性小鼠诱导 EAE。用包含大鼠髓磷脂少突 胶质细胞糖蛋白 (MOG) 的氨基酸 35-55 的肽免疫动物。所述肽是利用固相技术于肽合成器 上合成。 在小鼠肋腹一侧皮下注射在完全弗氏佐剂 (CFA) 中的含有 75μl MOG 肽的 200μl 乳剂以及 200μg 结核分枝杆菌。一周后在另一肋腹的一侧进行相同的注射。在致脑炎刺 激后， 每日观察小鼠并对 EAE 临床表现打分 (0 ＝无临床症状到 5 ＝四肢完全瘫痪 )。在选 定的疾病阶段 ( 症状前或末期 ) 向动物静脉内注射放射标记的 NST200(100μCi/ 动物 )， 在 牺牲动物前温育 1 小时。制备 10μm 的冷冻切片， 风干并暴露于氚敏感型胶片。使胶片暴 露 7-9 周的时间， 显影并通过测量光密度进行分析。通过 TINA 软件估算从而测定缺血肾对 对侧肾的信号中的光密度 /mm2 形式的 3H-DDC 密度。
     试验结果 ：
     多发性硬化疾病的 EAE 动物模型模拟了以中枢神经系统的白质为目标的慢性致 残性自身免疫神经疾病。在如图 12 所示的放射自显影中观察到试验动物中白质的严重损 伤。在大脑水平， 冠状切片表现出大脑底部的锥体束染为暗色并且与染为亮色的对照未免 疫小鼠相比过量的放射性配体在整个大脑中累积。在脊髓水平同样观察到放射性标记的 3 H-200 的明显累积。与对照未处理的动物相比， 脊髓的纵切片显示经免疫的小鼠中白质的 侧束 (lateral tracts) 被高水平标记。