雄激素依赖性1F芳香酶报道基因.pdf

本发明涉及雄激素依赖性1-f-芳香酶报道基因和用于产生该1-f-芳香酶-报道基因的方法和该报道基因在用于鉴定雄激素受体的配体的方法中的用途。

1.  启动子-报道基因融合物，由根据Seq ID#1的1f-芳香酶启动子和报道基因组成。

2.  权利要求1的启动子-报道基因融合物，其特征在于所述报道基因可以选自包含萤火虫或海肾萤光素酶基因的组并且该融合产物可以在细胞系中稳定或瞬时表达。

3.  权利要求1或2的启动子-报道基因融合物的用途，其特征在于可以在细胞培养系统中鉴定通过结合至雄激素受体来影响神经元组织中芳香酶调节作用的物质。

4.  权利要求3的用途，其特征在于使用与Seq ID#1所示序列具有＞90％、优选＞95％同源性的序列在细胞培养系统中鉴定通过结合至雄激素受体来影响脑中芳香酶调节作用的物质。

5.  确定与雄激素受体结合的物质的组织选择作用，包括以下步骤：
a.在用于鉴定激动活性和拮抗活性的细胞培养系统中，使用启动子-报道基因融合物以报道基因测定法确定对芳香酶调节作用的调变，
b.确定对另一种雄激素调节型启动子的调变，和
c.比较步骤a和b，以便就AR选择性调变1f-芳香酶启动子方面或与其他AR调节型启动子直接比较而对物质进行完整的体外表征。

6.  权利要求5的确定物质的组织选择性作用，其特征在于在步骤a)中使用与Seq ID#1所示序列具有＞90％、优选＞95％同源性的序列。

7.  用于鉴定和表征选择性地引起中枢神经系统中芳香酶表达增加和/或适合对AR活性施加组织选择性影响的物质的体外测试系统，其特征在于该测试系统含有权利要求1或2的报道基因和芳香酶启动子的融合物。

雄激素依赖性1-f-芳香酶报道基因
本发明涉及雄激素依赖性1-f-芳香酶报道基因和用于产生该1-f-芳香酶-报道基因的方法和该报道基因在用于鉴定雄激素受体的配体的方法中的用途。
中枢神经系统中由雄激素诱导的芳香酶表达并且因而形成雌激素对于建立包括性别身份铭记在内的性别特异性行为反应和调节性欲(尤其在雄性中)具有异乎寻常的重要性。此外，脑中由雄激素诱导的芳香酶表达似乎在诸如学习和记忆的过程中发挥重要作用(Wickelgren，I.；Science，第276卷：675-678，1997)。已经在神经再生过程中描述了来自雌激素的积极作用(Abe-Dohmae等人，J.Neurochem.，第67卷：2087-2095，1996；I.Azcoitia等人，2001，J.Neurobiol.47：318-329)。对雌激素受体和神经元雌激素生产的诱导或上调似乎是多种神经元损伤中修复机制的一部分(Dubal等人，1999，J Neurosci 19：6385-6393；Garcia-Segura等人，1999，Neuroscience 89：567-578；Peterson等人，2001，J Neuroendocrinol 13：317-323；Carswell等人，2005，J.Steroid Biochem.Mol.Biol.96：89-91)。雌激素因而代表一项治疗或预防神经退行性疾病的重要药理学选项。然而，它们在雄性和雌性中的用途均受限制，这归因于在其他器官中可能的副作用。
目前，没有体外测试系统可用于确定由雄激素诱导的芳香酶表达并因而确定雌激素的脑特异性合成和可用于鉴定并表征影响芳香酶活性的物质。
以雌激素浓度、脑中芳香酶表达、脑样品中芳香酶活性或雄性和雌性中行为试验等作为脑中终点的体内研究是现有技术中已知的。
如已经提及，雄激素通过结合至雄激素受体(AR)而诱导芳香酶表达。AR可以被激活或失活。在雄激素缺乏情况下的激活例子例如出现在肌肉减少症、性腺功能减退症、年龄相关性性腺功能减退症中和以性欲紊乱形式和在男性勃起功能障碍中。
AR的药理学失活在一些情况中具有重要作用，例如在良性或恶性前列腺疾病或与雄激素过多相关的疾病如某些形式的痤疮、脱发或女性多囊卵巢和多毛症。
然而，完全激活或灭活雄激素受体一般是不希望的，而是希望组织选择性作用。例如，在雄性性腺功能减退症的情况下，AR介导激活性欲、气质(temperamen)和骨或肌肉合成代谢作用是希望的，但是对前列腺或皮肤无激活作用，而是中性或衰减作用。在想要灭活AR的情况下(例如在恶性前列腺癌或秃发中)，AR的灭活就性欲、骨代谢等方面而言是不利的(S.S.Wolf和M.Obendorf，2004，″Selective androgen receptor modulators(SARMs)″；在E.Nieschlag和H.M.Behre：′Testosterone′3版；CambridgeUniversity Press，ISBN 0521833809；623-640中)。
迄今，基于细胞培养或体外的测定系统不足以找到并表征这些组织选择性雄激素或抗雄激素物质。这对于确定芳香酶表达同样如此。
因而，本发明的目的是提供可以籍此鉴定并表征药理学活性物质的方法，所述物质的特征在于它们
-引起芳香酶的表达在CNS中选择性增加
和/或
-对AR的活性具有组织选择性影响。
以下述方法实现这个目的，在所述方法中通过在报道基因测定法中刺激芳香酶表达，可以鉴定选择性调节脑中雌激素合成并对雄激素受体施加组织选择性影响的物质。已经证明存在对1f-芳香酶启动子的雄激素依赖性调节作用。
人芳香酶在位于第15号染色体的基因中编码(Chen，S.等人，(1988)：Molec.Biol.，第7卷：27-38)。
人P450_arom基因(CYP19)包含一个30kb编码区和一个大约93kb的调节区(Bulun，S.E.等人，Semin Reprod Med.第22卷：5-9，2004)。转录物由10个外显子组成，其中外显子I是非编码的。编码性外显子II至X同等地表达于全部组织中。迄今，仍没有在人类中找到在编码区内的剪接变体。
对于外显子I，在对源自多种组织的mRNA测序期间发现几种变体(综述，见：Harada，N.；Utsumi，T.和Takagi，Y.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：11312-11316，1993，和Simpson，E.R.；Endocrine Reviews，15：341-355，1994)，所述变体以组织特异性方式表达并且均可以与位于外显子II起点处的相同剪接位点连接(图1)。mRNA中外显子-I序列的组织特异性可以由位于所述基因中外显子-I相应变体之前的可选启动子解释。这些各异启动子的激活是如何受到调控的这一点仍未充分阐明。
根据Harada等人(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第90卷：11312-11316)，表1列出了多种组织中人芳香酶的某些5′-非翻译性外显子的目前已知用途的例子。
通过对芳香酶-mRNA测序，迄今研究，尤其Harada(Harada，N.等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第90卷：11312-11316)和Simpson(Simpson，E.R.；Endocrine Reviews，第15卷：341-355，1994)的两个团队的研究证实，可以在大多数组织中使用几种启动子，并且反之也可以在不同组织中使用一种启动子(表1)。
对此，一个例外是启动子1f，迄今已知，该启动子仅在人类中的神经元组织中使用。
在脑中，雄激素尤其影响芳香酶表达(Abdelgadir，S.E.等人，Endocrinol.，第135卷：395-401，1994；Rosselli，C.E.等人，(1996)Endocrine，第5卷：59-65；Rosselli，C.E.等人，(1997，Brain Research，第44卷：351-357)。尽管有这个研究结果，雄激素受体(AR)调节脑中芳香酶表达的精确机制仍未知。文献中虽提到了1f-芳香酶启动子的推定性AR应答元件，然而仍没有证实1f-启动子功能性地参与调节AR-介导的神经元芳香酶表达(Honda，S.等人，Biochem Biophys Res Commun 198(1994)，1153-1160)。相反，首次描述1f-芳香酶启动子的团队(S.Honda，等人，BiochemBiophys Res Commun.198(1994)，1153-1160)在随后的工作中却指出了其他调节物，但也没有进一步表征(Honda，S.I.等人，J Steroid Biochem MolBiol.79：255-60，2001；Honda，S.等人，Brain Res Mol Brain Res.66：122-32，1999)。
本发明的基础是观察到对1f-芳香酶外显子的控制仅受1f-芳香酶启动子活性调节并且不依赖于细胞环境。借助体外测试系统，现在可以证实药理学活性物质影响对神经元芳香酶表达的调节，而没有必要使用神经元组织、神经元细胞、完整动物或来自完整动物的提取物。
这种测试系统的使用有可能发现并表征药理学活性物质并且简化这个过程，其中所述的药理学活性物质选择性地引起中枢神经系统中芳香酶表达增加或适合对AR活性施加组织选择性影响。
本发明的目标因而是用于鉴定和表征选择性地引起中枢神经系统中芳香酶表达增加和/或适合对AR活性施加组织选择性影响的物质的体外测试系统，该测试系统含有报道基因和芳香酶启动子的融合物。
对芳香酶(即雌激素合成中的关键酶)的组织特异性调节最终导致在多种组织中定向地提供雌激素。
为了表征受激素控制的芳香酶表达，建立了适用于这些体外试验的人细胞系，与此相关的是通过使用多种启动子确保组织特异性体内表达。在芳香酶启动子的情况下，报道基因测定法的开发有可能简单且精细地通过激活单个启动子而测试特定物质对表达的组织特异性影响。在想要脑特异性表达的情况下，启动子是本发明的1f-芳香酶启动子。
通过比较神经元组织中受AR调节的1f-芳香酶启动子(1f-aro-启动子)的活性与另一种组织中受AR调节或通常受AR调节的启动子的活性，有可能就组织选择性方面体外表征对AR有活性的物质。1f-芳香酶启动子的启动子活性随后充当神经元组织中AR-介导活性的代用标记或以一种甚至更概括形式在除性腺组织之外(例如在男性中，除睾丸和前列腺之外；在女性中，除卵巢之外)的组织中充当AR-介导活性的代用标记。
借助具有人芳香酶1f启动子的报道基因测定法，有可能确定对神经元芳香酶表达的调节。
将已知其序列(Seq ID #1)的神经元1f-芳香酶启动子安置在报道基因之前。将该启动子-报道基因融合物以瞬时方式或稳定方式转染至靶细胞系内。1f-启动子的功能引起萤光素酶表达，并且可以从该报道基因所编码酶的量确定该芳香酶启动子的活性。在本实施例中，选择萤火虫萤光素酶基因和海肾萤光素酶(Renilla luciferase)基因作为报道基因的例子。
本发明涉及由根据Seq ID #1的1f-芳香酶启动子和报道基因组成的启动子-报道基因融合物，并且该报道基因可以选自包含萤火虫萤光素酶基因或海肾萤光素酶基因的组，不过这种选择不是限制性的，并且其中所述融合产物可以在细胞系中以稳定或瞬时方式表达。
此外，若AR在细胞中表达，则有AR活性的试验物质通过AR施加对芳香酶启动子活性的影响。随后可以基于改变的萤光素酶酶活性确定所述试验物质的作用。因而，可以搜寻或表征药理学活性物质，而无必要运用原代神经元组织或原代神经元细胞或完整动物或来自它们的提取物。
本发明涉及启动子-报道基因融合物在体外测试系统中的用途，其中该启动子-报道基因融合物由根据Seq ID #1的1f-芳香酶启动子和报道基因组成，并且其中在细胞培养中以高通量报道基因测定法确定试验物质的影响并且可以获得关于神经元组织中调节芳香酶的信息。这种方法用于鉴定通过结合至雄激素受体来影响芳香酶表达的物质。
本发明也涉及启动子-报道基因融合物的用途，其中使用与Seq ID #1中所给出序列具有＞90％、优选＞95％同源性的序列在细胞培养系统中鉴定通过结合至雄激素受体对脑中芳香酶调节作用施加影响的物质。
另外，使用本发明的测试模型，还可以表征包括AR激动剂、拮抗剂和SARM在内的雄激素性物的属性，其中1f-芳香酶启动子的活性与另一种组织中受AR调节的或通常受AR调节的启动子的活性比较。1f-芳香酶启动子的启动子活性随后充当神经元组织中AR-介导活性的代用标记或以一种甚至更概括形式在除性腺组织之外(例如在男性中，除睾丸和前列腺之外；在女性中，除卵巢之外)的组织中充当AR-介导活性的代用标记。
为此，具有神经元1f-芳香酶启动子的本发明测试系统与受AR调节的另一种启动子组合。后一种启动子反映广泛促雄性性状作用(例如MMTV-启动子)或在另一个促雄性性状靶器官中的促雄性性状作用(例如在前列腺中被雄激素受体激活的启动子)。同时使用两种不同的报道基因例如在1f-芳香酶启动子上使用海肾萤光素酶基因和在第二启动子上使用萤火虫萤光素酶基因允许同时测量两种启动子活性。这简单且精细地提供有关通过AR而发挥药理学作用的试验物质的组织选择性活性方面的信息。或者，也可以将两种启动子相继插在相同的报道基因前面，这相对于通常是动物试验的现有技术，再次代表可观的简化。神经元启动子活性可以按照更概括的形式抽象为启动子在除性腺之外的器官中的代用活性。
本发明也涉及用于确定与雄激素受体结合的物质的组织选择作用的方法，包括以下步骤：
a.在用于鉴定激动活性和拮抗活性的细胞培养系统中，使用启动子-报道基因融合物以报道基因测定法确定对芳香酶调节作用的调变，
b.确定对另一种雄激素依赖性启动子的调变，和
c.比较步骤a和b，以便就AR选择性调变1f-芳香酶启动子方面或与例如前列腺特异性或广泛作用性AR调节型启动子直接比较而提供对物质的完整的体外表征。这种方法可以用于鉴定对AR施加组织选择性影响的物质。
本发明也涉及启动子-报道基因融合物在报道基因测定法中的用途，其中使用与Seq ID #1所示序列具有＞90％、优选＞95％同源性的序列以报道基因测定法在细胞培养系统中鉴定下述物质，所述物质调变雄激素受体的活性并对通过雄激素受体而被调节的基因调节作用提供组织选择性调变。
“拮抗剂”意图理解为与其对应受体结合并抑制通过天然存在配体与该受体偶联的信号转导途径或诸途径启动的分子。通常，拮抗剂与受体的天然存在配体竞争对该受体的结合。然而，也可能通过下述分子对该受体进行另外调节(例如对该受体的非竞争性位阻调节)，其中所述分子阻止偶联于该受体的信号转导途径被天然存在配体激活。
受体拮抗剂一般选择性地与它们的特定受体结合并且不与其他受体结合。通常，它们显示比天然配体更大的结合亲和力。尽管优选对该受体具有比天然配体更大的结合亲和力的拮抗剂，然而也可以使用具有较小亲和力的拮抗剂。优选地，拮抗剂可逆地与其对应受体结合。
“激动剂”将理解为这样的分子，所述分子与其对应受体结合且通常与该受体的天然存在配体竞争与该受体结合并且刺激与该受体偶联的信号转导途径启动。激动剂也可以支持天然配体的结合作用。
受体激动剂一般选择性地与它们的特定受体结合并且不与其他受体结合。通常，它们具有比天然配体更大的结合亲和力。尽管优选对受体具有比天然配体更大的结合亲和力的激动剂，然而也可以使用具有较小亲和力的激动剂。
优选地，激动剂可逆地与其对应受体结合。
通过启动对应受体所介导的信号转导和/或生理作用检验激动剂。
″配体″指与受体结合的化合物或小分子物质。它们的结合通常是可逆的。配体与对应受体的结合激活或失活与该受体偶联的信号转导途径。配体便是这样发挥其胞内作用的。
配体意图理解为受体的激动剂和拮抗剂。
生物学实施例
1.将人1f-芳香酶启动子克隆至报道基因质粒中
对于报道基因测定法，从源自人SH-SY5Y细胞的基因组DNA扩增人芳香酶的1f-启动子。使用QIAamp血液试剂盒(Qiagen)，根据制造商详述的方案，实施基因组DNA的分离。从出版物(S.Honda，等人，BiochemBiophys Res Commun 198(1994)，第1153-1160页)和从基因库(CYP19A1)中可了解芳香酶的1f-启动子。
使用特异性引物对(表2)，通过PCR扩增包含1f-启动子的人芳香酶启动子区域的部分。
为了通过PCR扩增DNA-片段，在每种情况下，使用1μl的基因组DNA样品。该样品在94℃变性2分钟并用所述DNA引物EbrainB4和Ebrain-c670以35个循环扩增，通过凝胶电泳法分析(图2)并通过DNA提取法从琼脂糖凝胶中纯化去掉副产物。
1f-启动子片段的PCR产物拥有3′-A突出端并且与线性pTAdv克隆载体连接(图3)。pTAdv载体从Clontech获得。将所得1f-pTAdv2载体(图4)的插入物测序并且证实了扩增的人1f-芳香酶启动子的序列(Seq ID #1)。该序列不同于先前公开的序列(S.Honda等人，N Biochem Biophys ResCommun 198(1994)，1153-1160)，而是与更近期的基因库条目符合。
所用报道基因例如是来自Promega的pGl3载体的萤光素酶基因。为了产生带1f-启动子的启动子-报道基因构建体，用HindIII和XhoI切下对照载体pGl3-(图5)的长度213bp的对照启动子(SV40)。如此线性化并缩短的pGl3载体通过凝胶电泳和DNA提取法纯化、去磷酸化，随后将使用HindIII和XhoI从1f-pTAdv2载体(图4)切下并纯化的1f-启动子片段剪接至其中，并且产生报道基因质粒1f-pGl3(图6)。
2.用于在细胞培养中以报道基因测定法确定激素活性化合物对1f-启动子影响的转染实验
PC3(人前列腺癌)细胞(来自DSMZ GmbH，Braunschweig)在含酚红的RPMI 1640培养基(订单号：31870-025，来自Gibco)中传代，培养基中添加了10％胎牛血清(FCS)并含200mM谷氨酰胺和5mg/l青霉素/链霉素，并在培养箱(Heraeus)中于37℃以5％CO₂和100％相对湿度培育。在试验前，PC3-细胞用测试培养基传代两次；该培养基不含酚红(订单号：32404-014，来自Gibco)和胎牛血清，其事先用活性炭纯化以去除激素残留物(DCS)。
为了基于萤光素酶活性确定激素对pGl3融合物载体1f-pGl3中克隆的1f-芳香酶启动子的影响，用0.2μg这种质粒连同0.5μg的pSG5AR质粒共转染6孔板中每孔200000个细胞。pSG5AR载体以pSG5载体为基础，其中所述的pSG5载体拥有在人细胞中引起基本基因(在本例中引起AR基因)组成型表达的SV40早期基因(Breathnach，R.和Harris，B.A.1983，NucleicAcids Res.11：7119-36)。使用lipofectin根据GibcoBRL的说明书[Lipofectin-试剂包装插页，目录号：18292-037]实施报道基因质粒和pSG5AR质粒的瞬时转染。转染后20小时，添加雄激素二氢睾酮(DHT)。在培养箱中孵育另外24小时后，细胞用PBS洗涤，裂解，并且测定报道基因活性。使用萤光素酶测定底物，根据Promega的说明书[萤光素酶测定底物包装插页，目录号：E151A；来自带有报道分子裂解缓冲液的萤光素酶测定系统；Part TB161，USA 3/98]，测定萤光素酶活性。为标准化以光度单位描述的测量值，测量值可以除以按μg使用的蛋白质的数量，从而以相对光度单位(RLU)描述结果。
1f-报道基因产物显示，在前列腺细胞系PC3中实施的转染中，用DHT诱导报道基因表达达2.6倍(图7)。这里可以体外确定雄激素的调节作用。
3.1f-芳香酶启动子的雄激素依赖性调节作用
除了前列腺PC3细胞之外，神经元细胞系也用于借助1f-芳香酶启动子分析雄激素调节的报道基因表达。
人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y(来自DSMZ GmbH，Braunschweig)在含酚红的Dulbecco′s MOD Eagle培养基(订单号：31885-023，来自Gibco)中传代，培养基添加了15％胎牛血清(FCS)并含200mM谷氨酰胺和5mg/l青霉素/链霉素，并在培养箱(Heraeus)中于37℃以5％CO₂和100％相对湿度培育。在试验前，SH-SY5Y细胞用测试培养基传代两次；该培养基不含酚红(订单号：11880-028，来自Gibco)和胎牛血清，其事先用活性炭纯化以去除激素残留物(DCS)。
为了基于萤光素酶活性确定激素对pGl3融合物载体1f-pGl3中克隆的1f-芳香酶启动子的影响，用0.2μg这种质粒连同0.5μg的pSG5AR质粒共转染6孔板中每孔300000个细胞。pSG5AR载体以pSG5载体为基础，其中所述的pSG5载体拥有在人细胞中引起基本基因(在本例中引起AR基因)组成型表达的SV40早期基因(Breathnach，R.和Harris，B.A.1983；“Plasmids for the cloning and expression of full-length double-stranded cDNAsunder control of the SV40 early or late gene promoter(用于克隆并在SV40早期或晚期基因启动子控制下表达全长双链cDNA的质粒)”，Nucleic AcidsRes.11：7119-36)。使用lipofectin根据GibcoBRL的说明书[Lipofectin-试剂包装插页，目录号：18292-037]实施报道基因质粒和pSG5AR质粒的瞬时转染。转染后20小时，添加雄激素二氢睾酮(DHT)。在培养箱中孵育另外24小时后，细胞用PBS洗涤，裂解，并且测定报道基因活性。使用萤光素酶测定法底物，根据Promega的说明书[萤光素酶测定法底物包装插页，目录号：E151A；来自带有报道分子裂解缓冲液的萤光素酶测定系统；Part TB161，USA 3/98]，测定萤光素酶活性。为标准化以光度单位描述的测量值，测量值可以除以按μg使用的蛋白质的数量，从而以相对光度单位(RLU)描述结果。
1f-报道基因产物显示，在神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中实施的转染中，用DHT以浓度依赖方式诱导报道基因表达(图8)。
由于在所用的两种细胞系中测量到相似作用，故而这些测试系统中1f-启动子的活性受雄激素刺激，不取决于细胞环境。
4.用于通过药理学活性物质表征激素1f-芳香酶启动子的调节作用的转染实验
如同DHT一样，以1f-萤光素酶报道基因构建体(1f-pGl3)作为其他药理学活性物质为基础，我们测试了雌二醇对神经元组织中人芳香酶表达的影响(图9)。
PC3(人前列腺癌)细胞(来自DSMZ GmbH，Braunschweig)在含酚红的RPMI 1640培养基(订单号：31870-025，来自Gibco)中传代，培养基添加了10％胎牛血清(FCS)并含200mM谷氨酰胺和5mg/l青霉素/链霉素，并在培养箱(Heraeus)中于37℃以5％CO₂和100％相对湿度培育。在试验前，PC3-细胞用测试培养基传代两次；该培养基不含酚红(订单号：32404-014，来自Gibco)和胎牛血清，其事先用活性炭纯化以去除激素残留物(DCS)。
为了基于萤光素酶活性确定雌二醇(E2)对pGl3融合物载体1f-pGl3中克隆的1f-芳香酶启动子的影响，用0.2μg这种质粒连同0.5μg的pSG5-ER质粒共转染6孔板中每孔200000个细胞。pSG5-ER载体以pSG5载体为基础，其中所述的pSG5载体拥有在人细胞中引起基本基因(在本例中为人雌激素受体α(ERα)基因)组成型表达的SV40早期基因(Breathnach，R.和Harris，B.A.1983；“Plasmids for the cloning and expression of full-lengthdouble-stranded cDNAs under control of the SV40 early or late gene promoter(用于克隆并在SV40早期或晚期基因启动子控制下表达全长双链cDNA的质粒)”，Nucleic Acids Res.11：7119-36)。使用lipofectin根据GibcoBRL的说明书[Lipofectin-试剂包装插页，目录号：18292-037]实施报道基因质粒和pSG5-ER质粒的瞬时转染。转染后20小时，添加雄激素二氢睾酮(DHT)。在培养箱中孵育另外24小时后，细胞用PBS洗涤，裂解，并且测定报道基因活性。使用萤光素酶测定法底物，根据Promega的说明书[萤光素酶测定法底物包装插页，目录号：E151A；来自带有报道分子裂解缓冲液的萤光素酶测定系统；Part TB 161，USA 3/98]，测定萤光素酶活性。为标准化以光度单位描述的测量值，测量值可以除以按μg使用的蛋白质的数量，从而以相对光度单位(RLU)描述结果。
在文献中没有描述借助雌激素直接影响神经元芳香酶表达或活性。同样在本发明的1f-报道基因测定法中，未能测量到雌二醇对1f-启动子活性的影响(图9)。该研究结果也与其中至少不含有已知ERE序列的1f-启动子的序列分析相符。在文献中讨论了雌激素浓度对脑中芳香酶活性的影响(Rosselli，C.E.和Resko，J.A.(1993)：Aromatase activity in the rat brain：hormonal regulation and sex differences(大鼠脑中的芳香酶活性：激素调节作用和性别差异)；J.Steroid.Biochem.，第44卷：499-508)，不过意思是这种影响由一种反馈机制介导。由芳香酶产生的雌激素降低雄激素受体表达并且因而还间接地降低芳香酶表达，因为雄激素受体的存在是促雄性性状作用生效必需的。这种反馈调节作用不存在于本发明的体外报道基因测定法中，因为基于pSG5载体的受体基因质粒导致所述受体表达，与雌激素浓度无关。复杂体内系统中存在的所述反馈机制的这种关闭允许在所实施的反式激活测定法中研究对启动子水平上芳香酶表达的直接调节作用。本发明的报道基因测定法因而最适合进一步详细阐明用于直接调节神经元芳香酶表达的必需刺激。
5.用于鉴定和表征调节神经元芳香酶表达的药理学活性物质的转染实验
如同DHT一样，以1f-萤光素酶报道基因构建体(1f-pGl3)测试其他药理学活性雄激素(图10)。
人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y(来自DSMZ GmbH，Braunschweig)在含酚红的Dulbecco′s MOD Eagle培养基(订单号：31885-023，来自Gibco)中传代，培养基添加了15％胎牛血清(FCS)并含200mM谷氨酰胺和5mg/l青霉素/链霉素，并在培养箱(Heraeus)中于37℃以5％CO₂和100％相对湿度培育。在试验前，SH-SY5Y细胞用测试培养基传代两次；该培养基不含酚红(订单号：11880-028，来自Gibco)和胎牛血清，其事先用活性炭纯化以去除激素残留物(DCS)。
为了基于萤光素酶活性确定激素对pGl3融合物载体1f-pGl3中克隆的1f-芳香酶启动子的影响，用0.4μg这种质粒连同0.5μg的pSG5AR质粒共转染6孔板中每孔300000个细胞。pSG5AR载体以pSG5载体为基础，其中所述的pSG5载体拥有在人细胞中引起基本基因(在本例中引起AR基因)组成型表达的SV40早期基因(Breathnach，R.和Harris，B.A.1983；“Plasmids for the cloning and expression of full-length double-stranded cDNAsunder control of the SV40 early or late gene promoter(用于克隆并在SV40早期或晚期基因启动子控制下表达全长双链cDNA的质粒)”，Nucleic AcidsRes.11：7119-36)。使用lipofectin根据GibcoBRL的说明书[Lipofectin-试剂包装插页，目录号：18292-037]实施报道基因质粒和pSG5AR质粒的瞬时转染。转染后20小时，添加试验物质。在培养箱中孵育另外24小时后，细胞用PBS洗涤，裂解，并且测定报道基因活性。使用萤光素酶测定法底物，根据Promega的说明书[萤光素酶测定法底物包装插页，目录号：E151A；来自带有报道分子裂解缓冲液的萤光素酶测定系统；PartTB161，USA 3/98]，测定萤光素酶活性。为标准化以光度单位描述的测量值，测量值可以除以按μg使用的蛋白质的数量，从而以相对光度单位(RLU)描述结果。
在所实施的转染中，1f-报道基因质粒显示用DHT以浓度依赖性方式诱导报道基因表达(图8)。如同DHT一样，以1f-萤光素酶报道基因构建体(1f-pGl3)测试其他雄激素(图10)。全部雄激素均刺激1f-启动子，不过在每种情况下以略微不同的能力刺激1f-启动子。也可以随MENT和丙酸睾酮观察到激活。丙酸睾酮在相对比较中的极强烈刺激作用符合睾酮衍生物对雄性性欲的良好临床作用(Gooren，1987，Arch.Sex.Beh.16：463-473；Bancroft 1988，在Handbook of Sexology 6，297-315 Elsevier，Amsterdam，Buna等人.1993，Fertil.Steril.59：1118-1123)，所述雄性性欲在灵长类中主要通过激活神经元芳香酶表达进行控制(Zumpe等人，1993，Horm.Behav.27：200-215)。
6.用于鉴定和表征组织选择件雄激素的转染实验，所述的组织选择性雄激素与其他组织相比在神经元组织中差异地调节AR调节型基因
带神经元1f-芳香酶启动子的本发明测试系统与反映广泛促雄性性状作用的MMTV-启动子组合(Parker，M.G.等人，J Cell Biochem.1987，35：285-92)。将激素调节型MMTV-启动子克隆在来自Promega的pGL3对照载体的萤火虫萤光素酶基因之前，以产生载体MMTV-luc。
人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y(来自DSMZ GmbH，Braunschweig)在含酚红的Dulbecco′s MOD Eagle培养基(订单号：31885-023，来自Gibco)中传代，培养基添加了15％胎牛血清(FCS)并含200mM谷氨酰胺和5mg/l青霉素/链霉素，并在培养箱(Heraeus)中于37℃以5％CO₂和100％相对湿度培育。在试验前，SH-SY5Y细胞用测试培养基传代两次；该培养基不含酚红(订单号：11880-028，来自Gibco)和胎牛血清，其事先用活性炭纯化以去除激素残留物(DCS)。
为了基于萤光素酶活性，与MMTV-启动子相比确定激素对pGl3融合物载体1f-pGl3中克隆的1f-芳香酶启动子的影响，在平行的转染实验中，用1.5μg的1f-pGl3质粒或1.5μg的MMTV-luc质粒与0.75μg的pSG5AR质粒一起转染6孔板中每孔300000个细胞。使用lipofectin根据GibcoBRL的说明书[Lipofectin-试剂包装插页，目录号：18292-037]实施报道基因质粒的瞬时转染。转染后20小时，添加试验物质。在培养箱中孵育另外24小时后，细胞用PBS洗涤，裂解，并且测定报道基因活性。使用萤光素酶测定法底物，根据Promega的说明书[萤光素酶测定法底物包装插页，目录号：E151A；来自带有报道分子裂解缓冲液的萤光素酶测定系统；Part TB161，USA 3/98]，测定萤光素酶活性。为标准化以光度单位描述的测量值，测量值可以除以按μg使用的蛋白质的数量，并且将所用蛋白质的每μg相对光度单位描述为最大刺激作用的百分数。
在神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y上所实施的转染中，1f-报道基因质粒显示用所测试的雄激素(在该实施例中DHT和羟甲烯龙)诱导了报道基因表达。MMTV-报道基因质粒在两种情况下也显示诱导报道基因表达(图12)。如预期那样，羟甲烯龙弱于DHT。令人吃惊且出人意料地，所述物质在这两种启动子构建体的诱导作用方面不同，有时明显不同(图11)。尽管羟甲烯龙对测试的两种启动子产生极相似的激活作用，不过DHT显示在这两种启动子之间的明显差异，并且与MMTV启动子相比，对神经元1f-芳香酶启动子作用更弱。这些差异表明了可能的体内的(并且因此在人的体内的)组织选择性差异。从动物试验已知，例如与睾酮相比，DHT对雄性性行为具有明显更小的作用，而它作为极强烈的雄激素对前列腺发挥作用(Arteaga-Silva，M.等人，2005，Physiol Behav.85：571-80)。在为时4个月的扩大体内实验中，与氧雄龙相比，也证实了DHT的这种作用(图12)。本发明的体外测试系统因而允许简单而精细地快速鉴定和表征具有潜在组织选择作用的雄激素。因而它是可能用于高通量测试的理想测试系统。
7.用于就部分激动作用和部分拮抗作用方面同时鉴定和表征组织选择件雄激素的转染实验，所述的组织选择性雄激素提供对AR调节型基因的组织选择性差异性调节作用
带神经元1f-芳香酶启动子的本发明测试系统与反映广泛促雄性性状作用的MMTV-启动子联合(Parker，M.G.等人，J Cell Biochem.1987，35：285-92)。使用两种不同的报道基因构建体，可以在转染测定法中或任选地在稳定转染的细胞系中同时测量两种雄激素调节型启动子的活性。在本实施例中，将激素调节型MMTV-启动子克隆在来自Promega的pGL3对照载体的萤火虫萤光素酶基因之前，以产生载体MMTV-luc，同时将1f-芳香酶启动子克隆在来自Promega的pRL载体的海肾萤光素酶基因之前，以产生载体载体1f-芳香酶-pRL。
为任选地简化实验设置，首先将AR稳定地转染于细胞系中。将AR的cDNA克隆到表达质粒pSG5中，以产生质粒pSG5AR。pSG5载体拥有在人细胞中引起基本基因(在本例中引起AR基因)组成型表达的SV40早期基因(Breathnach，R.和Harris，B.A.1983，Nucleic Acids Res.11：7119-36)。使用pSG5AR载体并额外地使用编码抗生素G418抗性基因的质粒稳定转染PC3(人前列腺癌)细胞(来自DSMZ GmbH，Braunschweig)，所得PC3-AR+细胞稳定表达人AR。PC3AR+细胞(来自DSMZ GmbH，Braunschweig)在含酚红的RPMI 1640培养基(订单号：31870-025，来自Gibco)中传代，葡萄酒添加了10％胎牛血清(FCS)并含200mM谷氨酰胺和5mg/l青霉素/链霉素和200μg/ml遗传霉素，并在培养箱(Heraeus)中于37℃以5％CO₂和100％相对湿度培育。在试验前，PC3AR+细胞用测试培养基传代两次；该培养基不含遗传霉素、不含酚红(订单号：32404-014，来自Gibco)和胎牛血清，其事先用活性炭纯化以去除激素残留物(DCS)。
为了基于海肾萤光素酶活性与MMTV-启动子的萤火虫萤光素酶活性相比，确定激素对pRL融合物载体中克隆的1f-芳香酶启动子的影响，在转染实验中，用8μg的1f-芳香酶-pRL质粒和20μg的MMTV-luc质粒转染每175ml瓶300000个PC3-AR+细胞。使用lipofectin根据GibcoBRL的说明书[Lipofectin-试剂包装插页，目录号：18292-037]实施报道基因质粒的瞬时转染。转染6小时后，将细胞洗涤并分配于96孔微量滴定平板中，每孔10000个细胞。转移至96孔平板16小时后，添加选择性雄激素受体调变剂(SARM)，用于测量本身的激动活性和在10xe^-10M睾酮存在下用于测量拮抗活性。在培养箱中孵育另外24小时后，细胞用PBS洗涤，裂解，并且测定报道基因活性。用双重萤光素酶测定法试剂盒(订单号：E 1960，来自Promega)，根据制造商的说明书[Promega；萤光素酶测定法底物包装插页，目录号：E151A；来自带有报道分子裂解缓冲液的萤光素酶测定系统；Part TB161，USA 3/98]以相对光度单位确定萤火虫萤光素酶活性和海肾萤光素酶活性。为任选地标准化以光度单位描述的测量值，测量值可以除以按μg使用的蛋白质的数量，从而以相对光度单位(RLU)描述结果。
在激动作用的试验中，这里测试的SARM，与已经在前述实施例中描述的DHT类似，极不相同地作用于所述两种AR依赖性启动子(图13)。然而，与DHT相反，在这种情况下，不激活通用MMTV启动子，而激活了神经元1f-芳香酶启动子，其中神经元1f-芳香酶启动子充当在性腺之外的器官中AR调节型启动子的启动子例子。如同采用DHT的先前实施例，这也表明了体内并且在人中可能的组织选择性。另外，平行测量拮抗作用可以提供可能组织选择性调变AR活性的指示。也就是说，除了现有技术以外，可以就可能的组织选择性作用方面获得SARM活性的指示。
如已经在本实施例中也清楚地证明，测量可以在微量滴定模式下进行，所述的微量滴定模式突出了本发明测试系统的根本高通量能力。SARM对于很多种适应症是有特别意义的，其中SARM如本实施例中那样通常清楚地具有拮抗作用，然而在特定组织中也表现某种激动作用(S.S.Wolf和M.Obendorf，2004，在E.Nieschlag和H.M.Behre：′Testosterone′3版；CambridgeUniversity Press，ISBN 0521833809；623-640)。
附图说明
图1：
人芳香酶基因的基因组启动子区域，带有可变外显子-I变体的已知剪接变体(简化示意图)。为了更加清晰，已经将5′-区域的位置截去并显示为省略(改编自Harada，N.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第90卷：11312-11316，1993和Simpson，E.R.Endocrine Reviews，第15卷：341-355，1994)。
图2：
从源自SH-SY5Y细胞的基因组DNA中扩增的带1f-aro-启动子PCR产物。a：长度标准；b：1f-芳香酶启动子的PCR扩增物。
图3：
pTAdv载体图这种在两个末端均有3′-T突出端的线性化载体用于与PCR片段连接。
图4：
带有扩增的pTAdv载体中1f-芳香酶启动子-DNA的1f-pTadv″载体的载体图。HindIII和XhoI标出了用于进一步克隆的切割位点。
图5：
pGl3-对照载体的载体图。HindIII和XhoI标出了用于进一步克隆的切割位点。
图6：
1f-pGl3载体的载体图。HindIII和XhoI标出了用于产生该载体的切割位点。
图7：
PC3-细胞中1f-启动子激活对二氢睾酮(DHT)浓度的依赖性。使用0.2μg的1f-pGl3质粒和0.5μg的pSG5-AR质粒转染。与DHT孵育20小时。两次测定的均值以每μg总蛋白的相对光度单位(RLU)显示。
图8：
1f-启动子激活对SH-SY5Y细胞中二氢睾酮(DHT)浓度的依赖性。使用0.2μg的1f-pGl3质粒和0.5μg的pSG5-AR质粒转染。与DHT孵育20小时。两次测定的均值以每μg总蛋白的相对光度单位(RLU)显示。
图9：
该图显示PC3-细胞中1f-启动子的激活独立于雌二醇(E2)浓度。使用0.2μg的1f-pGl3质粒和0.5μg的pSG5-ER质粒转染。与E2孵育20小时。两次测定的均值以每μg总蛋白的相对光度单位(RLU)显示。
图10：
多种雄激素对神经元SH-SY5Y细胞中1f-启动子的影响。将0.4μg的1f-pGl3质粒和0.5μg的pSG5-AR质粒转染。与a)T(丙酸睾酮)、b)MENT(7-甲基-19-去甲睾酮)和c)DHT(二氢睾酮)孵育20小时。来自两次测定的均值以每μg总蛋白的相对光度单位(RLU)显示。
图11：
多种雄激素对神经元SH-SY5Y细胞中1f-启动子和MMTV-启动子的影响。将1.5μg的1f-pGl3和1.5μg的MMTV-luc启动子及0.75μg的pSG5-AR质粒转染。与羟甲烯龙或DHT(二氢睾酮)孵育20小时。相对光度单位(RLU)的标准化均值显示为带标准差的来自四重测定的百分数。
图12：
多种雄激素对代表促雄性性状作用的神经终点的雄性性行为(A)和对代表促雄性性状作用的性腺终点的前列腺重量(B)的体内影响。选择有性经验的完整雄性大鼠并阉割。在7周和丧失性活动后，将所述动物分成3组，每组9-10动物，并且用1050μg羟甲烯龙、DHT或载体处理1周。从第8日至第120日，所述动物每日接受70μg羟甲烯龙(黑色)、DHT(深色)或载体(浅灰色)。测试每只动物的性行为7次(爬跨行为)。在开始研究4个月后，取出器官并确定前列腺重量和体重。
图13：
在pC3AR+细胞中测试选择性AR调变剂(SARM)同时对非特异性MMTV-启动子(A+B)和对神经元1f-芳香酶启动子(C+D)的激动作用(A+C)和拮抗作用(B+D)。将1.5μg的1f-pGl3和1.5μg的MMTV-luc启动子及0.75μg的pSG5-AR质粒转染。
与SARM孵育20小时。在拮抗作用(B+D)试验中，将SARM在所述浓度于4x10e^-10M睾酮存在下孵育。各个值显示为矩形并且源自四重测定的相对光度单位的均值显示为带标准差的圆圈。不添加SARM情况下的睾酮值显示为三角形。对于非特异性MMTV-启动子(A+B)，这里测试的SARM作为AR介导反式激活作用的纯粹拮抗剂发挥作用，而对于神经元1f-芳香酶启动子(C+D)，发挥部分激动作用/部分拮抗作用。
序列表
<110>拜耳先灵医药股份有限公司
<120>雄激素依赖性1-f-芳香酶报道基因
<130>52571
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>670
<212>DNA
<213>Homo Sapiens
<400>1
ggctcctctc cccaagtcaa accttacctt acttaaccga ttgtatttcc tccctcagag     60
gatgccatat ctcagtacag gagagaaaat agaaggtaga gagactttta cccaagcacc    120
ccctgaaccc caggtgtaca caactgaacc tgatgcagtg acaatcacgt tcacacataa    180
aacatctggc taaaggctaa gatcacttcg gatttccgac atacattttc ctaagcagtg    240
catttttctt taattttcct tagaaaaaga ctgtaaagta gccccacaat tcccacatct    300
tcatactcca ccctgcattc aagttttcct gggacaggta tctatgtgtg tgcatgaatc    360
tatttttacg gcatatgtct aggaccccct acgaggagcc aaagtttcag agagcccagc    420
aactatgtaa ctccatggaa gggaggcatg atattactct ctgttcacag gagcgtacgc    480
acagatcttt tctcctcctc atggtcagtt ttctatttgt gattagtaat tagcttctct    540
tggtacgcta cgatctatta caaaagccaa acattcaggg ggcgagctga aatgacaaaa    600
tttggctata atttatgttg gcccctgaca tatatatttt tttaatggtt tggtctctaa    660
gcaactgatc                                                           670