一种预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法 技术领域 本发明属于动物分子遗传学领域， 特别是涉及一种用分子标记检测绵羊毛纤维直 径的方法。
背景技术 我国是一个农业大国， 畜牧业是我国农业的重要组成部分， 畜牧业在国民经济中 占有举足轻重的地位。 据统计， 2010 年畜牧业收入的增长速度已超过种植业， 成为农民收入 的主要来源之一。大力发展畜牧业仍然是我国农业产业结构调整、 农业和农村经济发展以 及农民增收的重点。
养羊业是我国畜牧业的传统产业， 细毛羊在我国养羊业中占重要位置， 细毛羊是 兵团畜牧业的主要畜种， 也是兵团畜牧经济中最具特色和代表性的优势产业。我国人口众 多， 又是世界服装出口大国， 细毛羊业的发展与我国畜牧业和纺织业的经济效益和市场竞 争力密切相关， 影响着区域经济的发展和社会稳定。培育成功的中国美利奴细毛羊享誉国 内外。细毛羊业的发展为优化兵团农业结构， 促进毛纺工业发展， 提高畜牧业整体效益， 以
及加快养羊良种化进程都做出了重大贡献。
我国是世界上消耗羊毛最多的国家， 羊毛的自给率仅为 1/3， 供求缺口很大， 每年 需要从国外进口大批细羊毛， 总价值达到 60 亿美元左右， 其中大部分是细绵羊毛和超细绵 羊毛。近年来， 随着毛纺产品向自然、 舒适、 轻薄、 柔软的方向发展， 世界羊毛品质也出现了 划时代的变革， 主要表现在羊毛细度上。 中国对进口羊毛品质和细度的要求越来越高， 我国 和澳大利亚双边羊毛贸易的品质结构以羊毛细度作为标准， 羊毛细度是体现加工价值的一 个重要的指标， 过去毛纺部门需求毛细度以 60 ～ 64 支为主， 近年来 66 ～ 70 支羊毛的需求 不断增加， 羊毛越细， 加工附加值越高。
中国美利奴羊 （新疆军垦型） 的培育从 1972 年开始， 刘守仁等在新疆生产建设兵团 协作组以紫泥泉种羊场为育种场在短期内通过级进杂交方法成功培育中国美利奴羊 （新疆 军垦型） 。分为六个品系， 分别为军垦 A 型品系、 军垦 B 型品系、 超细型品系、 肉用多胎品系、 毛用多胎品系、 U 品系。A 品系具有体格大， 产毛量高， 毛密的特点。B 品系具有毛长， 羊毛 品质好的特点。超细毛品系具有毛细的特点， 主体细度达到 15 ～ 18μm（80 ～ 90 支） 。肉 用多胎品系兼具肉品质好和繁殖率高的特点。 毛用多胎品系兼具毛品质好和繁殖率高的特 点。截止 2002 年已向全国 23 个省、 自治区推广优质种羊 12 万只， 为我国细毛羊事业的发 展和改良工作做出了重大贡献。但是， 如何进一步提高羊毛细度， 培育超细毛种羊， 以及快 速扩大种群规模仍然是一个重要问题。 分子标记技术能够在种羊选育中避免年龄、 性别、 环 境的干扰， 实现早期、 快速、 准确的选择优质细毛羊， 组建并扩大优质细毛羊种群。因此， 寻 找羊毛细度 （毛纤维直径） 相关基因及分子标记， 应用现代分子育种新技术快速培育超细毛 羊、 快速扩大优质细毛羊种质规模势在必行。
研究表明， 羊毛纤维的复杂结构主要由角蛋白家族组成。这些蛋白对于羊毛纤维 的机械性能和主要构造起主要作用。羊毛纤维主要由三部分组成 ： 角质层、 皮质层和一少部分有髓粗毛组成。羊毛纤维的 90% 由皮质层组成， 皮质层由嵌入角蛋白关联蛋白 -KAPs 里面的丝状的微纤维组成。微纤维包括角蛋白中间丝蛋白， 而角蛋白中间丝蛋白是我们已 知的 “硬” ａ - 角蛋白。这些角蛋白是低硫蛋白， 由两个蛋白家族构成， 分别是Ⅰ型角蛋白 和Ⅱ型角蛋白。 根据氨基酸组成， KAPs 分成三类 ： 高硫角蛋白关联蛋白 （KAP1.n、 KAP2.n、 KAP3.n） ， 超高硫角蛋白关联蛋白 （KAP4.n、 KAP5.n、 KAP10.n） 和高甘氨酸 - 酪氨酸角蛋白关 联蛋白 （KAP6.n、 KAP7.n、 KAP8.n） 。KAP 基因大多为小片段， 大小一般在 0.6Kb ～ 1.5Kb 之 间， 并且都不含内含子。
在羊毛纤维蛋白中有很多变异， 尤其对于基质蛋白， 尽管在数千年针对羊毛纤维 的品质选育中， 变异逐渐减少， 但是， 毛纤维异质性仍然存在。很多研究报道角蛋白和 KAP 基因家族存在多态性。角蛋白及亚家族编码基因存在多个插入／缺失和单核苷酸 （SNP） 突变， 这些基因多样性与羊毛性状 （细度、 强度、 弹性和弯曲度等） 存在相关关系 （管峰等， 2007） 。羊毛细度是一个高遗传力性状， 达到 0.59， 但在不同绵羊品种间略有差异 （Safari 等， 2007） ， 同时羊毛纤维的细度是一个复杂的调控过程， 受到多种影响因素的调控和制约， 与体重、 体脂含量、 繁殖率等也存在相互制约关系。最近在 KAP1.1、 KAP1.3 基因编码区发现 了多个 SNP 位点， 但是和羊毛性状之间的关系尚需进一步研究 （Itenge-Mweza 等， 2007） 。 刘 桂芬等 （2005） 用微卫星标记对新疆优质细毛羊进行专门的遗传多样性及羊毛细度候选基 因进行分析， 选择 21 号染色体上高硫蛋白家族中 KAP1.1、 KAP1.3 中的部分序列和 1 号染色 体高甘氨酸一酪氨酸蛋白 KAP6.1 的外显子进行研究， 结果发现 KAP1.1、 KAP1.3 所在区域中 位点 W08667 与羊毛细度相关 （P<0.05） 。张亚妮等研究了 KAP 基因与内蒙古绒山羊经济性 状的关系得出 KAP 基因的部分位点与绒细度存在相关。 发明内容 本发明的目的在于提供一种操作简单、 成本低、 精确度高的采用 PCR 和聚丙烯酰 胺凝胶电泳来检测绵羊毛纤维直径， 从而预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方 法。
本发明通过以下技术方案实现 ： 一种预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法， 其特征主要包括以下步骤 ： （1） 根据绵羊 KAP1.1 基因序列设计一对引物 ： KF1: <210>1 ； KR1: <210>2。
（2） 从绵羊血液中提取基因组 DNA， 利用该引物对绵羊的基因组 DNA 进行 PCR 扩 增； （3） 使用聚丙烯酰胺凝胶对 PCR 产物进行电泳分离， 检测出 KAP1.1 基因外显子中的 60bp 和 30bp 插入 / 缺失的变异位点 ； （4） 多态性分析 ： 当绵羊 KAP1.1 基因外显子缺失 60bp 时， PCR 扩增片段长度为 281bp， 将其命名为 CC 基因型 ； 当绵羊 KAP1.1 基因外显子缺失 30bp 时， PCR 扩增片段长度为 311bp， 将其命名为 BB 基因型 ； 当绵羊 KAP1.1 基因外显子含有 60bp 和 30bp 插入时， PCR 扩增片 段长度为 341bp， 将其命名为 AA 基因型 ； 该位点杂合的个体 PCR 扩增产物为两条带， 分别为 341bp 和 311bp， 将其命名为 AB 基因型 ； 341bp 和 281bp， 将其命名为 AC 基因型 ； 311bp 和
281bp， 将其命名为 BC 基因型。
实验证明具有 BB 基因型绵羊的平均毛纤维直径显著小于具有 AA、 BC、 AC、 AB 和 CC 基因型绵羊的平均毛纤维直径 （P<0.05） 。
其中用于分析多态性的位点选自绵羊 KAP1.1 基因如下序列中的 60 个和 30 个碱 基的插入 / 缺失， 1 caaccctcct ctcaacccaa ctcctgacac catggcctgc tgttccacca gcttctgtgg 61 atttcccatc tgttccactg gtgggacctg tggctccagt ccctgccagc agacctgctg 121 ccagaccagc tgctgccagc caacctccat ccagaccagc tgctgccagc caacttccat 181 ccagaccagc tgctgccaac cga(tctccat ccagaccagc tgctgccagc caa)cctccat 241 ccagaccagc tgctgccagc caacctgcct ccagaccagt ggctgtgaga cgggctgtgg 301 cattggtggc agcattggct atggccaggt gggtagcagc g， 以上序列下划线部分为 60 个碱基的插入 / 缺失， 单划线部分为 30 个碱基的插入 / 缺 失。
其中分析基因多态性的方法是通过检测碱基的插入 / 缺失而分类的基因型 , 其中 用于分析基因多态性的部位是外显子。而且是由 KF1 和 KR1 表示的引物扩增的部分外显子 区。 其中用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的丙烯酰胺凝胶浓度为 12% 或 14% 任一种均可。
所述的 PCR 扩增退火温度最好为 65℃。其中绵羊毛纤维直径是绵羊的毛细度。
本发明巧妙地采用 PCR 扩增和凝胶分离的方法检测绵羊 KAP1.1 基因外显子中的 60bp 和 30bp 插入 / 缺失的变异位点。由于 AA 基因型和 BB 基因型的 KAP1.1 基因片段长度 仅差 30 个碱基， 由于 BB 基因型和 CC 基因型的 KAP1.1 基因片段长度也仅差 30 个碱基， 使 用琼脂糖凝胶电泳很难将两种基因型分离， 因此本发明采用 12% 或 14% 的聚丙烯酰胺凝胶 电泳来分离六种基因型。按照以下步骤 ： 从绵羊血液中提取基因组 DNA， 应用 KF1 和 KR1 引物进行 PCR 扩增， 使用聚丙烯酰胺凝 胶对 PCR 产物进行电泳分离， 根据条带进行基因型判定， 并根据基因型， 与绵羊毛纤维直径 进行关联分析的应用。
与现有技术相比， 本发明的优点 ： 本发明操作简单、 费用低、 精确度高， 可进行自动 化检测。使用本发明的标记基因型对绵羊的毛纤维直径进行选择时， 将使绵羊毛纤维直径 取得很大的遗传进展。利用本发明的分子标记方法对毛纤维直径进行选择， 不仅为绵羊育 种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、 简便易行的分子标记方法， 同时为绵羊的细 度性状改良提供了一种有效的分子标记育种手段， 可以加速优质细毛羊的育种进程。
附图说明 图1： 是本发明的技术流程图。
图2： 绵羊 KAP1.1 基因 PCR 产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图中 ： 聚丙烯酰胺凝胶浓度为 14%。M 泳道 ： pUC 19DNA/Msp（HapII） Marker ； 泳道 1： CC 基因型个体 ； 泳道 2、 3： AB 基因型个体 ； 泳道 4、 5、 12、 13 ： BC 基因型个体 ； 泳道 6、 7、 8、 9、 10 ： BB 基因型个体 ； 泳道 11、 14 ： AC 基因型个体 ； 泳道 15、 16 ： AA 基因型个体。箭头所指 为 331bp 的条带。
图3： 为 3 个分子标记在群体中不同基因型展示图。其中， A 为 AA 基因型位点， B 为 BB 基因型位点， C 为 CC 基因型位点。具体实施方式
实施例 1 ： 下面举例对本发明做更详细地描述 ： 一、实验材料 1、 样品采集和性状测定 采用一次性注射器从绵羊颈静脉抽取约 1ml 的血液， 注入经高压灭菌并装有约 200µl 2% 无菌 EDTA（Ethylene diamine tetraacetic acid， EDTA） 抗凝剂的 1.5ml 离心管中， 轻 轻摇匀， 记录羊号， -20℃保存备用。
采集绵羊体侧部皮肤毛样， 根据国家纤维检验标准并参考国际羊毛组织 （IWTO） 纤 维检测标准， 对绵羊体侧部毛样进行细度、 卷曲度、 细度离散、 自然长度、 污毛量、 密度、 净毛 率的测定。
2、 药品和酶 三羟甲基氨基甲烷 （Tris） ， Sigma Chemicals Co ； Tris 饱和酚， 北京鼎国生物技术发展 中心 ； 蛋白酶 K （Proteinase K） ， MERCK Co ； dNTP （dATP; dTTP; dCTP; dGTP） 、 Taq 酶 （配套 2+ 10×Taq buffer， 25 mmol ／ L Mg ） ， 大连宝生物公司 ； 琼脂糖 （Agarose H） 、 pUC19DNA ／ Msp（Hap Ⅱ）Marker、 丙烯酰胺、 甲叉双丙烯酰胺， 生工生物 （上海） 有限公司。
3、 主要仪器 Icycler PCR 仪 （Bio-Rad 公司） 、 梯度 PCR 仪 （Eppendorf 公司） 、 Gel2000 凝胶成像系 统、 Ultrospec 1000 紫外分光光度计、 Sigma 3K30 高速冷冻离心机、 Milli-Q 超纯水仪、 Bio-Rad 稳压电泳仪及配套电泳槽。
二、 实验方法 1、 缓冲液与常用试剂的配制 TE 缓冲液 ： 10mM Tris·Cl， 1mM EDTA， pH8.0， 高压灭菌。
20×SET 缓冲液 ： 3M NaCl， 1M Tris· Cl（pH 8.0） ，20mM EDTA（pH 8.0） ， 高压灭 菌。
5×TBE 缓冲液 ： 54g Tris 碱， 27.5g 硼酸， 20ml 0.5M EDTA（pH8.0） ， 加水至 1L。
50×TAE 缓冲液 ： 242g Tris 碱， 57.1ml 冰乙酸， 100ml 0.5M EDTA（pH8.0） ， 加水 至 1L。
1M Tris·Cl ： 121.14g Tris 碱溶于 800ml 双蒸水中， 用盐酸调 pH 值至 8.0， 定容 至 1000ml， 高压灭菌。
0.5M EDTA ： 186.1g EDTA 溶于 800ml 双蒸水中， 用 NaOH 调 pH 值至 8.0， 定容至 1000ml， 高压灭菌。
3M NaAc（pH5.2） ： 408.1g NaAc·3H2O 溶于 800ml 双蒸水中， 用冰乙酸调 pH 至 7.0， 定容至 1000ml。
200ml 银染液 ： NH3·H2O 2ml; 3.6% NaOH 4.2ml ； 20% AgNO3 3.6ml， 加去离子水至 200ml。
200ml 显色液 ： 1% 柠檬酸钠 1ml ； 甲醛 100ul ； 加去离子水至 200ml。血细胞裂解液 ： 10mM Tris·Cl（pH8.0） ， 0.1M EDTA（pH8.0） ， 0.5% SDS。
2、 引物的设计与合成 根据 KAP1.1 基因序列 （GenBank 登录号 ： AY835603） 设计上游引物 KF1 和下游引物 KR1， 引物由生工生物 （上海） 有限公司合成 ： KF1: <210>1 ； KR1: <210>2。
3、 绵羊基因组 DNA 的小量提取 （1） 取 20μl 抗凝血液， 加入 500μl 血细胞裂解液， 加入蛋白酶 K 至终浓度为 100-200 μg/ml， 混匀 55℃消化 12hr， 直至溶液中不再有粘稠的团块。
（2） 将溶液冷却至室温， 加入 5M NaCl 至终浓度 1.5 M， 混匀 10min。加入等体积 酚 / 氯仿， 反复颠倒离心管混匀 10min。 （3） 12， 000 rpm， 室温离心 10min。取上清， 加等体积氯仿混匀 10min。
（4） 12， 000 rpm， 室温离心 10min。取上清 2 倍体积无水乙醇沉淀 DNA。
（5） 将 DNA 挑出放到 1.5ml 离心管中， 用 70% 乙醇洗 1 次。 （6） 7,500 rpm， 室温离心 5min， 弃上清。 （7） 将 DNA 干燥后 （注意不能太干） 溶于 200μl TE 中。
4、 PCR 反应 （1） 以绵羊基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增， 25μl 反应体系中包含以下溶液或试剂 ： 10×PCR reaction buffer 2.5μl dNTP Mixture（各 2.5mM） 2.0μl 引物 1（10μM） 0.5μl 引物 2（10μM） 0.5μl EX-Taq（5U/μl） 0.25μl 去离子水 18.25μl 基因组 DNA（50ng/μl） 1.0μl （2） 将上述溶液混合并按以下条件进行 PCR 反应。
94℃变性 5 min ； 94℃ 30 sec， 65℃ 30 sec， 72℃ 30 sec， 33 个循环 ； 72℃延伸 5 min。
（3） 反应结束后， 取 PCR 反应液 （5~10μl） 进行琼脂糖凝胶电泳， 检测 PCR 产物。
5、 非变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳 以浓度为 14%、 体积为 25ml， 厚度为 0.1cm 的胶为例。
（1） 清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净， 烘干后， 用 0.8% 琼脂糖封闭玻璃 板和胶条间的缝隙。
（2） 在 100ml 烧杯内加入 30% 丙烯酰胺 11.7ml， 50% 甘油 2.5ml， 5×TBE 5ml， 10% 过硫酸铵 0.175ml， TEMED 8μl， 去离子水 5.617ml， 混匀后迅速灌胶。
（3） 当浇灌至离玻璃板上沿 0.1cm 时停止灌胶， 插入梳子， 室温聚和半小时， 多余 的丙烯酰胺 4℃保存。随时观察凝胶聚合情况， 并补加丙烯酰胺。
（4） 凝胶聚合好后， 向电泳槽加入 1×TBE， 用注射器冲洗加样孔。
（5） 预电泳 10min， 同时准备点样。
（6） 取 2μl PCR 产物置于 PCR 管中， 加 2μl 上样 Buffer 混匀， 用微量注射器点样。
（7） 120V， 电泳 8~10h。
6、 硝酸银染色方法 （1） 电泳结束后关上电泳仪， 放出电泳液， 小心取下凝胶， 置于 70% 乙醇中， 水浴震荡器 缓慢摇匀固定 10~15min。
（2） 双蒸水洗胶 2 遍， 每次 2min， 去除残留乙醇。
（3） 用 200ml 染色液染色 30min。
（4） 双蒸水洗胶 3 遍， 每次 2min。
（5） 用 200ml 显色液显色， 约 10~30min， 当 DNA 带的强度合适时， 倒掉显色液。
（6） 去离子水洗掉多余的显色液， 保鲜膜封好， 扫描照相或保存。
7、 基因型判定 经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测， KAP1.1 基因在绵羊群体存在六种基因型， 对于 PCR 扩增片段长度为 281bp， 将其命名为 CC 基因型 ； 对于 PCR 扩增片段长度为 311bp， 将其命 名为 BB 基因型 ； 对于 PCR 扩增片段长度为 341bp， 将其命名为 AA 基因型 ； 该位点杂合的个 体 PCR 扩增产物为两条带， 分别为 341bp 和 311bp， 将其命名为 AB 基因型 ； 341bp 和 281bp， 将其命名为 AC 基因型 ； 311bp 和 281bp， 将其命名为 BC 基因型。 （附图） 。
8、 统计模型建立 根据中国美利奴羊品系选育的特点， 构建线性统计模型如下 ： Yijkm= μ+ G i+ L j+ Am+Gi×Lj+ Gi×Am + Lj×Am + e 其中 ： Yijkm 为性状观察值， μ 为群体性状均值， G i 为基因型固定效应， L j 为品系固定 效应， Am 为年龄效应。Gi×Lj 为基因型和品系互作效应， Gi×Am 为基因型和年龄互作效应， Lj×Am 为品系和年龄互作效应， e 为随机误差。使用统计软件 JMP 4.0（SAS Institute Inc.， Cary， NC， 2000） 检验基因型与性状间的相关程度， 并估计性状的最小二乘均值。
本实施例是运用本发明的分子标记选择方法在中国美利奴 （新疆军垦型） 5 个品系 群体羊毛细度性状的选择应用。
具体为 ： 选用中国美利奴羊 （新疆军垦型） 5 个品系， 共计 768 只， 其中超细型品系 158 只， 毛用多胎型品系 138 只， 军垦 A 型品系 167 只， 军垦 B 型品系 163 只， 肉用多胎型品 系 142 只。采集绵羊颈静脉血液样本， -20℃保存备用。
同时采集绵羊体侧部皮肤毛样， 根据国家纤维检验标准并参考国际羊毛组织 （IWTO） 纤维检测标准， 对绵羊体侧部毛样进行自然长度、 细度、 细度离散、 卷曲度、 污毛量、 净毛率、 密度的测定， 按照细毛羊鉴定标准测定生产性能。其中， 羊毛的细度和卷曲度在农 业部种羊及羊毛羊绒质量监督检验测试中心 （乌鲁木齐） 检测。
利用本发明的引物 （KF1 和 KR1） 对中国美利奴 （新疆军垦型） 群体 768 个个体的基 因组 DNA 进行 PCR 扩增， 然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
KAP1.1 基因的 PCR 产物经电泳分离得到 6 种基因型， 分别为 AA 基因型、 AB 基因 型、 AC 基因型、 BB 基因型、 BC 基因型、 CC 基因型。对 KAP1.1 基因 60bp 和 30bp 插入 / 缺 失的变异位点的 6 种基因型在中国美利奴 （新疆军垦型） 5 个品系群体中的分布进行分析， 结果表明 BB 基因型个体最多， 基因型频率为 0.548。 （表 1） 表 1 KAP1.1 基因插入 / 缺失位点不同基因型在绵羊群体中的分布 单位 ： 只9102363813 A CN 102363831 品系 超细型品系 毛用多胎型品系 A 型品系 B 型品系 肉用多胎型品系 总计 基因型频率 AA 3 10 1 3 3 20 0.026说明书BB 110 20 111 84 96 421 0.548 BC 32 38 20 48 11 149 0.194 CC 1 6 3 4 6 20 0.026 总计 158 138 167 163 142 7687/9 页AB 11 44 27 17 24 123 0.160AC 1 20 5 7 2 35 0.046对 KAP1.1 基因 60bp 和 30bp 插入 / 缺失的变异位点的 6 种基因型与中国美利奴 （新 疆军垦型） 群体 768 个个体的羊毛纤维直径等 7 个性状进行最小二乘分析， 结果表明不同基 因型间的中国美利奴 （新疆军垦型） 群体的平均羊毛纤维直径存在显著差异 （P<0.05） （表 2） 。均值比较时同一行无相同字母者差异显著（a-b p<0.05） 。
表 2 KAP1.1 基因位点不同基因型绵羊毛性状的比较 （最小二乘均值）对 6 种基因型间中国美利奴 （新疆军垦型） 群体毛品质的最小二乘均值进行多重比较， AA、 BB、 BC、 AC、 AB 和 CC 基因型间的毛卷曲度、 细度离散、 自然长度、 污毛重、 净毛率和密度差 异不显著 （P>0.05） ， 而 BB 基因型羊只的平均纤维直径显著小于 AA、 BC、 AC、 AB 和 CC 基因型 羊只的平均纤维直径 （P<0.05） 。
以上结果表明， KAP1.1 基因可作为绵羊毛纤维直径的主要候选基因之一， BB 基因 型可作为分子标记用于预测绵羊毛纤维直径， 可以组建以 BB 基因型个体为主的毛细度较细的群体。
实施例 2 ： 参照图 1—图 3 ： 与实施例 1 相比， 本实施例不同地方在于绵羊基因组 DNA 的小量提取 ： （1） 将 20μl 全血加入装有 700μl 1×SET 的 1.5ml 离心管中， 轻轻混匀。
（2） 加入蛋白酶 K（10mg/ml） 至终浓度 100-200 μg/μl 和 10% 的 SDS 至终浓度 0.5%， 55℃消化 12h。
（3） 待消化完全后， 加入等体积的 Tris 饱和酚， 来回颠倒， 使其混匀。
（4） 12,000 rpm 离心 10min， 用剪去尖端的吸头将上层水相小心移入另一个离心管 中， 弃去有机相。重复第三和第四步骤一次。
（5）向水相中加入等体积的酚、 氯仿、 异戊醇混合液 （体积比为 24 ： 23 ： 1） ， 混合 10min。12,000 rpm， 离心 10min， 移出水相到另一个离心管。
（6）向水相中加入等体积的氯仿、 异戊醇混合液 （23 ： 1） ， 来回颠倒混合 10min， 12,000 rpm， 离心 10min， 移出水相到另一个离心管。
（7） 向水相中加入 1/10 体积 NaAc（3 M， pH5.2） 和 2 倍体积的无水乙醇， 来回颠 倒， 沉淀 DNA。 （8） 将 DNA 挑出放到 1.5ml 离心管中， 用 70% 乙醇洗 1 次。
（9） 7,500 rpm 离心 5min。小心倒掉管中乙醇， 将倒置在滤纸上， 让乙醇流尽， 置于 空气中干燥。
（10） 加入 200 μl 的 TE， 置 50℃水浴中过夜溶解 DNA。溶解后贮存于 -20℃备用。
另一个不同地方在于用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的丙烯酰胺凝胶浓度为 12%。
本实施例是运用本发明的分子标记选择方法在中国美利奴 （新疆军垦型） 6 个品系 群体羊毛细度性状的选择应用。
选用中国美利奴羊 （新疆军垦型） 6 个品系， 共计 765 只， 其中超细型品系 189 只， 毛用多胎型品系 147 只， 军垦 A 型品系 160 只， 军垦 B 型品系 103 只， 肉用多胎型品系 131 只， U 品系 35 只。采集绵羊颈静脉血液样本， -20℃保存备用。
采集绵羊体侧部皮肤毛样， 根据国家纤维检验标准并参考国际羊毛组织 （IWTO） 纤 维检测标准， 对绵羊体侧部毛样进行自然长度、 细度、 细度离散、 卷曲度、 污毛量、 净毛率、 密 度的测定， 按照细毛羊鉴定标准测定生产性能。 其中， 羊毛的细度和卷曲度在农业部种羊及 羊毛羊绒质量监督检验测试中心 （乌鲁木齐） 检测。
利用本发明的引物 （KF1 和 KR1） 对中国美利奴 （新疆军垦型） 群体 6 个品系 765 个 个体的基因组 DNA 进行 PCR 扩增， 然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
KAP1.1 基因的 PCR 产物经电泳分离得到 6 种基因型， 分别为 AA 基因型、 AB 基因 型、 AC 基因型、 BB 基因型、 BC 基因型、 CC 基因型。对 KAP1.1 基因 60bp 和 30bp 插入 / 缺 失的变异位点的 6 种基因型在中国美利奴 （新疆军垦型） 6 个品系群体中的分布进行分析， 结果表明 BB 基因型个体最多， 基因型频率为 0.55。 （表 3） 表 3 KAP1.1 基因插入 / 缺失位点不同基因型在绵羊群体中的分布 单位 ： 只
品系 超细型品系 毛用多胎型品系 AA 4 10 AB 17 46 AC 2 18 11 BB 128 30 BC 37 39 CC 1 4 总计 189 147102363813 A CN 102363831 A 型品系 B 型品系 肉用多胎型品系 U 品系 总计 基因型频率 1 1 2 18 0.024说明书107 47 88 21 421 0.550 20 34 10 9 149 0.195 3 3 7 1 19 0.025 160 103 131 35 7659/9 页22 14 21 3 123 0.1617 4 3 1 35 0.045对 KAP1.1 基因 60bp 和 30bp 插入 / 缺失的变异位点的 6 种基因型与中国美利奴 （新 疆军垦型） 群体 765 个个体的羊毛纤维直径等 7 个性状进行最小二乘分析， 结果表明不同 基因型间的中国美利奴 （新疆军垦型） 群体的羊毛纤维直径存在显著差异 （P=0.01） （表 4） 。 表中所示， 均值比较时同一行无相同字母者差异显著（a-b p<0.05） 。
表 4 KAP1.1 基因位点不同基因型绵羊毛性状的比较 （最小二乘均值）对 6 种基因型间中国美利奴 （新疆军垦型） 群体毛品质的最小二乘均值进行多重比较， AA、 BB、 BC、 AC、 AB 和 CC 基因型间的毛卷曲度、 细度离散、 自然长度、 污毛重、 净毛率和密度差 异不显著 （P>0.05） ， 而 BB 基因型羊只的平均纤维直径显著小于 AA、 BC、 AC、 AB 和 CC 基因型 羊只的平均纤维直径 （P<0.05） 。
以上结果表明， KAP1.1 基因可作为绵羊毛纤维直径的主要候选基因之一， BB 基因 型可作为分子标记用于预测绵羊毛纤维直径。可以组建以 BB 基因型个体为主的毛细度较 细的群体。12102363813 A CN 102363831序列表1/2 页<110> <120> <130> <141> <160>新疆农垦科学院 一种预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法 2011-10-23 3<210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> 绵羊 （Ovis aries） <220> <221> misc_feature <223> 引物 <400> 1 caaccctcct ctcaacccaa ctcc 24 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> 绵羊 （Ovis aries） <220> <221> misc_feature <223> 引物 <400> 2 cgctgctacc cacctggcca ta 22 <210> 3 <211> 341 <212> DNA <213> 绵羊 （Ovis aries） <220> <221> gene <222> (1)..(341) <223> <400> 3 caaccctcct ctcaacccaa ctcctgacac catggcctgc tgttccacca gcttctgtgg 60 atttcccatc tgttccactg gtgggacctg tggctccagt ccctgccagc agacctgctg 120 ccagaccagc tgctgccagc caacctccat ccagaccagc tgctgccagc caacttccat 18013102363813 A CN 102363831序列表2/2 页ccagaccagc tgctgccaac cgatctccat ccagaccagc tgctgccagc caacctccat 240 ccagaccagc tgctgccagc caacctgcct ccagaccagt ggctgtgaga cgggctgtgg 300 cattggtggc agcattggct atggccaggt gggtagcagc g 341