检测神经胰蛋白酶体内活性的方法、该方法的使用和集聚蛋白C末端的22KDA片段作为诊断和检测神经胰蛋白酶相关失调的生物标志物的用途.pdf

检测神经胰蛋白酶体内活性的方法，其中样品中集聚蛋白22kDa片段所测得的含量用于计算神经胰蛋白酶的活性；该方法在诊断和监测神经胰蛋白酶相关失调的用途和集聚蛋白22kDa片段作为神经胰蛋白酶相关失调的生物标志物的用途。

1.  检测神经胰蛋白酶体内活性的方法，其中在取自患者的样品中测量集聚蛋白的22kDa片段的量，并且将所测得的集聚蛋白的22kDa片段在样品中的量用于计算神经胰蛋白酶的活性。

2.  根据权利要求1的方法，其中在其内测量22kDa片段的样品为血液、脑脊液(CSF)、尿液或淋巴液。

3.  根据权利要求1或2的方法用于诊断和监测神经胰蛋白酶相关失调的用途。

4.  根据权利要求3的用途，其用于诊断和监测由神经胰蛋白酶失调所致疾病。

5.  根据权利要求3或4对诊断和监测神经胰蛋白酶相关疾病和神经及神经肌肉系统失调的用途。

6.  根据权利要求3或4对诊断和监测神经胰蛋白酶相关疾病和非神经系统、特别是肾脏和肺的失调的用途。

7.  根据权利要求1或2的方法在用于确定物质对神经胰蛋白酶活性的影响的临床或临床前研究中的用途。

8.  集聚蛋白的22kDa片段作为关于神经胰蛋白酶相关失调的生物标志物的用途。

9.  根据权利要求8对诊断和监测由神经胰蛋白酶失调所致疾病的用途。

10.  根据权利要求8或9对诊断和监测神经胰蛋白酶相关疾病和神经元及神经肌肉系统失调的用途。

11.  根据权利要求8或9对诊断和监测神经胰蛋白酶相关疾病和非神经系统失调的用途。

12.  集聚蛋白的22kDa片段在用于确定物质对神经胰蛋白酶活性的影响的临床或临床前研究中作为生物标志物的用途。

13.  由重组技术制备的集聚蛋白的22kDa片段在根据权利要求1的方法中作为参照的用途。

14.  由重组技术或化学合成制备的集聚蛋白的22kDa片段或其部分作为用于生成天然或重组抗体或其他特异结合蛋白的靶标的用途。

检测神经胰蛋白酶体内活性的方法、该方法的使用和集聚蛋白C末端的22kDa片段作为诊断和检测神经胰蛋白酶相关失调的生物标志物的用途
发明领域
本发明涉及一种用于检测神经胰蛋白酶(neurotrypsin)体内活性的方法、该方法的用途和集聚蛋白(agrin)C末端22kDa片段作为生物标志物在所有与神经胰蛋白酶活性直接或间接相关的不同诊断或临床应用中的使用。
生物标志物可报告在疾病或治疗中正在进行的生物学现象。生物标志物定义为任何作为正常的或病理生物学过程、或对治疗干预的药理学反应的指标，可以客观测量和评估的特征。不同类型的生物标志物可报告分子特征、生理参数(例如血压、心率)，或提供影像信息。重要的是，它们提供关于“结果”的信息：例如关于分子、细胞或生理学机制的结果，关于治疗的益处或关于治疗干预的风险。有用的生物标志物应满足两个标准，它们必须与疾病或治疗中进行中的生物学机制相关，并且它们必须与临床结果在统计学上相关。
神经胰蛋白酶是一个类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶。它表现出独特的结构域组成(Proba等，1998)。它由富脯氨酸的碱性片段、一个Kringle结构、四个富半胱氨酸的清除受体结构域(SRCR)和一个蛋白酶结构域组成。
神经胰蛋白酶主要在大脑皮层的神经元、海马和扁桃体中表达(Gschwend等，1997)。通过免疫组化，神经胰蛋白酶定位于突触前膜、不对称(兴奋性)和对称(抑制性)突触的突触前活性区(Molinari等，2002)。
神经胰蛋白酶在神经精神失调以及神经系统外的失调中起重要作用。
最近，神经胰蛋白酶被确定为一种严重常染色体隐性形式的智力迟钝的原因(Molinari等，2002)。遭受依赖于神经胰蛋白酶的智力迟钝的个体表现出神经胰蛋白酶基因第7个外显子中4个碱基对缺失，其所导致的缺少催化结构域的缩短蛋白。受影响个体中病理生理学表型和发生疾病的年龄将神经胰蛋白酶特征化为适应性突触功能(比如晚期神经发育中的突触重组和成人突触可塑性)的调节因子。在最初18个月的正常精神运动发育中，受影响的个体在大约两岁时表现出智力迟钝的初步迹象。这表明神经胰蛋白酶功能作为例如建立和/或维持高级认知功能必需的适应性突触功能在大脑发育的晚期中至关重要。
WO2006/103261中表明在转基因小鼠运动神经元中神经胰蛋白酶过表达导致神经肌肉接头的退化，从而反过来导致去神经支配的肌肉纤维的死亡。肌肉纤维的丧失是老年人中发现的肌肉萎缩类型的特征，命名为肌肉减少症。因此已经假定对神经胰蛋白酶的抑制可以对依赖于年龄的肌肉纤维退化、肌肉纤维丧失和骨骼肌萎缩具有有益的作用。
进一步的数据(Aimes等，2005)表明类似神经胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶在血管功能和血管发生中具有潜在影响。
鉴于神经胰蛋白酶在新陈代谢中的中心作用，确定和监测患者中神经胰蛋白酶相关的失调，或评估药物对体内神经胰蛋白酶状态的影响各自都令人期待。
发明概述
发明人已发现本发明的目标可以通过根据权利要求1的方法实现，其中在脑脊液(CSF)、或血液或尿液中检测集聚蛋白22kDa片段以确定神经胰蛋白酶的体内活性，并且通过根据权利要求3的方法的使用以诊断和监测神经胰蛋白酶相关失调。本发明进一步包括根据权利要求8将集聚蛋白22kDa片段作为特异性生物标志物的用途。
进一步独立的权利要求针对于集聚蛋白22kDa片段在确定物质对神经胰蛋白酶活性影响的临床或临床前研究中作为生物标志物的使用，由重组技术(参照根据权利要求1的方法)制备的集聚蛋白22kDa片段的用途，以及由重组技术或化学合成制备集聚蛋白22kDa片段或部分，其作为生成天然或重组抗体或其它特异性结合蛋白的靶标的用途
本发明的优选实施方案在子权利要求中讨论。

附图简述
图1显示人集聚蛋白的蛋白质序列(SEQ ID NO：1)。未加工的前体全长为2045个氨基酸。在所示的序列部分标记了α-和β-切割位点的位置。此外标记了在实施例中涉及的一些亚序列。集聚蛋白22kDa片段的序列由粗体显示。
图2A为集聚蛋白结构域组织的示意图和其依赖于神经胰蛋白酶的切割位点的位置。集聚蛋白具有的核心蛋白质量为约220kDa。它是一个多结构域蛋白，由9个FS(类卵泡抑素)结构域、2个LE(类层粘连蛋白-表皮生长因子)结构域、1个SEA(精子蛋白肠激酶和集聚蛋白)结构域、4个EG(类表皮生长因子)结构域和3个LG(球形层粘连蛋白，laminin glebular)结构域组成。在SEA结构域的两边都发现有一个S/T(富丝氨酸/苏氨酸)区域。
集聚蛋白存在有几种同工型，例如，一个有N末端集聚蛋白(NtA)结构域的分泌同工型和一个有N末端跨膜(TM)片段以保证其定位于细胞膜的II型跨膜同工型。C末端部分(moiety)的剪切变异体：在A/y位点4个氨基酸长度的插入，和三个包含8、11或19(8+11)个氨基酸在B/z位点的不同插入。神经胰蛋白酶在两个位点剪切集聚蛋白。一个位点(命名为α位点)位于1102位的精氨酸(R1102)和1103位的丙氨酸(A1103)之间。另一个位点(命名为β位点)位于1859位的赖氨酸(K1859)和丝氨酸1860(S1860)之间。氨基酸编号依照人直系同源(UniProtKB/Swiss-Prot O00468)的分泌集聚蛋白(剪切变异体A0B0)。神经胰蛋白酶对集聚蛋白的剪切产生一个110-400kDa范围的N末端片段(由于不同的碳水化合物水平)、一个约90kDa的中间片段和一个22kDa的C末端片段。
图2B显示神经胰蛋白酶如何在体外剪切集聚蛋白。膜结合集聚蛋白(+)、野生型神经胰蛋白酶(wt)、失活神经胰蛋白酶(S/A)和空pcDNA 3.1(-)组合共转染Hela细胞的Western印迹分析。用直接针对集聚蛋白的C末端的抗集聚蛋白抗体分析上清(S)和细胞裂解物(CL)。上图板：单独转染集聚蛋白导致细胞裂解物中超过250kDa的信号。与野生型神经胰蛋白酶共转染时，全长集聚蛋白被剪切导致上清中的片段跑在22、90和110kDa。在与失活神经胰蛋白酶共转染后发现没有剪切。下图板：用针对神经胰蛋白酶的抗体的神经胰蛋白酶表达的对照。
图3显示跨膜集聚蛋白的结构域结构。已指示由神经胰蛋白酶剪切所致的α-和β-切割位点和C-末端片段的序列。TM，跨膜片段；FS，类似于卵泡抑素的富半胱氨酸重复；LE，类层粘连蛋白-表皮生长因子结构域；S/T，富丝氨酸/苏氨酸区域；SEA，精子蛋白、肠激酶和集聚蛋白结构域；；EG，类表皮生长因子结构域；LG，球形层粘连蛋白结构域；单环，N连接的糖基化的位点；多环，聚糖连接的位点。
图4显示神经胰蛋白酶在体内剪切集聚蛋白。来源于野生型(wt)和神经胰蛋白酶缺陷型(KO)小鼠组织的Western印迹分析。在野生型小鼠的大脑、肾脏和肺中检测到集聚蛋白的90kDa剪切产物，但是在神经胰蛋白酶缺陷型中不存在。对集聚蛋白的22kDa片段除了肺以外获得了类似的结果。β-肌动蛋白用作上样对照。
图5A，B显示长时强化的化学刺激诱导了神经胰蛋白酶蛋白酶活性的增加。
图5A为在无刺激(No Stim)和由木防己苦毒素、福斯高林、咯利普兰组合(PFR)刺激的海马切片中集聚蛋白(上图板)和β-肌动蛋白(下图板)的Western印迹。在PFR刺激的海马中神经胰蛋白酶剪切的集聚蛋白90kDa片段的信号强度比在非刺激对照中的更强。
图5B显示通过β-肌动蛋白信号强度标准化后集聚蛋白90kDa片段信号强度的比率。非刺激对照中的信号强度的平均值设为1。三个独立实验显示通过PFR刺激和非刺激对照相比集聚蛋白的片段有30％显著的增加(通过Student t检验，p＜0.05)
图6证明长时强化的化学刺激如何以依赖于神经胰蛋白酶的方式增加丝状伪足的数目。
直方图显示在四种不同条件下海马CA1锥体神经元次级顶端树突(Dend)每1微米的丝状伪足(Fil)的数目。在野生型小鼠(w.t.)中，和非刺激对照相比，木防己苦毒素、福斯高林、咯利普兰组合的刺激诱导了丝状伪足数量的显著增加(No Stim；通过Student t检验，p＜0.01)。与此相反，神经胰蛋白酶缺陷型小鼠(ntd)受PFR刺激时显示没有丝状伪足数目的显著改变。
图7为显示在神经胰蛋白酶缺陷型小鼠中海马CA1锥体神经元次级顶端树突(Dend)每1微米的丝状伪足(Fil)的数目。和非刺激对照相比，PFR单独刺激没有诱导丝状伪足数目的显著增加。共同施加木防己苦毒素、福斯高林和咯利普兰(PFR)和22-kDa片段(PFR+22-kDa)补救了化学刺激诱导的丝状伪足数目的增加(通过Student t检验和No Stim和PFR对比，p＜0.001)。另外，无PFR刺激的22-kDa(22-kD frag)片段也诱导了丝状伪足数目的显著增加(通过Student t检验和No Stim对比，p＜0.001)
因此集聚蛋白22kDa片段在神经胰蛋白酶缺陷型小鼠中诱导丝状伪足数目的增加。
图8A为野生型(+/+)和神经胰蛋白酶缺陷型(-/-)小鼠脑匀浆的Western印迹分析。注意仅在野生型中可以检测到集聚蛋白22kDa片段。这表明22kDa片段确实是依赖于神经胰蛋白酶对集聚蛋白的剪切的结果。
图8B为野生型(+/+)、纯合神经胰蛋白酶缺陷型(-/-)和杂合神经胰蛋白酶缺陷型(+/-)小鼠血浆的Western印迹分析。显示集聚蛋白22kDa片段仅在表达有功能的神经胰蛋白酶(+/+和+/-)中存在。
另外从图8A和B中证明集聚蛋白22kDa片段在小鼠的脑匀浆和血液中存在。
图9A为年龄范围在1个月和86岁之间人脑脊液(CSF)样品的Western印迹。每道分析10微升人脑脊液。使用市售梯度SDS-PAGE凝胶(NuPAGE，4-12％)。用针对集聚蛋白22kDa片段的抗体R139进行免疫检测。和神经胰蛋白酶在神经发育中升高的表达水平一致，依赖于神经胰蛋白酶的集聚蛋白22kDa片段在2和9个月龄时最多。
图9B为在人脑脊液中发现的22kDa片段的液相色谱/质谱联用分析。所示序列包含22kDa片段和5个在β切割位点之前的氨基酸(SEQID NO：2)。合并数个个体的脑脊液样品并层析分离其蛋白以富集由Western印迹确定的22kDa片段。富集了22kDa片段的组分从SDS-PAGE凝胶上切出并用于液相色谱/电喷雾/质谱联用分析。鉴定出了两条肽：肽#1(SEQ ID NO：3)和#2(SEQ ID NO：4)。二者都位于集聚蛋白22kDa片段。
图9A和B都显示可以在人脑脊液中检测到集聚蛋白22kDa片段。
图10为层析处理的人血清的Western印迹，显示有一条具有集聚蛋白22kDa片段的免疫反应性的强带。其鉴定的最终确认需要质谱分析，然而，本结果为集聚蛋白22kDa片段可在人血清中发现的一条有力的证明。
发明内容
在本发明的方法中用作生物标志物的蛋白聚糖集聚蛋白C末端22kDa片段是一个由集聚蛋白特有的加工酶神经胰蛋白酶对其蛋白水解剪切的天然生成产物。
集聚蛋白是一个特征明确的分子(Bezakova等，2003；Sanes和Lichtman，2001)。它具有约220kDa的核心蛋白质量。集聚蛋白存在有几种同工型和剪切变异体。
如图2A所示，集聚蛋白由丝氨酸蛋白酶神经胰蛋白酶在两个同源位点(命名为α-和β-切割位点)剪切。神经胰蛋白酶对集聚蛋白的剪切由Hela细胞中两个蛋白的共表达所致，释放出集聚蛋白的三个片段到培养上清中(实施例1和图1B)。22kDa片段范围从β-切割位点到集聚蛋白的C末端。90kDa片段范围从α-到β-切割位点，而110kDa片段范围从α-切割位点到C末端，因此为β-切割位点不完全剪切的结果。N末端片段和细胞一起保留，并且极有可能通过内吞迅速被降解。
两个切割位点都明确得到鉴定，并且发现为同源并且在进化中保守(实施例2)。
如果在本申请中使用，术语“集聚蛋白22kDa片段”范围从β-切割位点到集聚蛋白的C末端，并且应当包括体内产生的片段的所有不同同工型和剪切变异体。一些出版物中，集聚蛋白C末端层粘连蛋白G结构域(LG3)指20kDa片段。这个定义所指蛋白质在结构上和根据本发明所使用的片段等同，但是它作为重组蛋白质由人工生成，与集聚蛋白C末端LG结构域一致，用于检测其功能的目的。相比之下，本发明在此的重要之处为集聚蛋白C末端LG结构域为通过依赖于神经胰蛋白酶的蛋白水解剪切天然地从集聚蛋白分子其余部分分离。只有在所谓的β-切割位点蛋白水解剪切后，集聚蛋白22kDa片段成为可活动片段并从其生成位置易位至脑脊液或血液中，在此处根据既有检测方法可以对其进行检测并且因此作为生物标志物使用。
从上面引用的WO 2006/103261中已知一种确定抑制物质对神经胰蛋白酶活性影响的检测方法。该所知方法的典型方案提出将抑制物质与神经胰蛋白酶和集聚蛋白共同孵育，并且根据对神经胰蛋白酶蛋白水解活性生成的片段的测量来确定对集聚蛋白剪切的量。
该已知方法涉及一种具有有限数量的反应伙伴的体外酶分析。由于体内情况远过于复杂，不能期望能在脑脊液或血液中发现集聚蛋白的特异性片段，并用其作为体内生物标志物以用于报告神经胰蛋白酶分别在脑中和在神经外组织中的体内活性。首先，从对一个蛋白质或多肽的体外剪切中，不能得出该剪切也在体内发生的结论。体外剪切是人工的实验反应。它通过在试管中将蛋白水解酶和蛋白质放在一起并且一起孵育以使剪切反应得以发生。相反地，一个蛋白质或肽的体内剪切需要它与指定蛋白水解酶在空间和时间上的共定位以使得反应发生。例如，可以证明集聚蛋白可在体外被胰脏丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶剪切。但是胰蛋白酶不能体内剪切集聚蛋白，因为集聚蛋白在体内不与胰蛋白酶共定位。发明者发现通过基因靶向选择性的神经胰蛋白酶失活使集聚蛋白剪切完全丧失(实施例3)。这表明只有神经胰蛋白酶能在体内剪切集聚蛋白，而其他类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶，例如能在体外剪切集聚蛋白的胰蛋白酶，不在体内剪切集聚蛋白。其次，即使根据在匀浆组织中发现通过神经胰蛋白酶对集聚蛋白的体内剪切的事实，也不能预测依赖于神经胰蛋白酶的集聚蛋白的片段是否能在脑脊液或血液中发现。在脑脊液和血液中，仅发现可忽略不计的全长的集聚蛋白和90kDa片段的量。神经胰蛋白酶在脑脊液和血液中不能检测到。因此，通过神经胰蛋白酶对集聚蛋白的剪切既不发生在脑脊液中也不在血液中，但是在内部的神经和非神经组织中，在此处集聚蛋白和神经胰蛋白酶在细胞表面或细胞外基质中相遇。因此，脑脊液和血液中22kDa片段的发现绝对是空前的而非毫不重要的发现。为支持这个结论，可以注意到在通过神经胰蛋白酶生成后既没有集聚蛋白的N末端片段也无中间90kDa片段在CSF或血液中出现。因此，由神经胰蛋白酶蛋白水解活性生成的三个集聚蛋白的片段中，只有22kDa片段有效地转移到脑脊液和血液中，而其余两个片段没有。
集聚蛋白22kDa片段在脑脊液和血液中的发现分别反映了在脑和在非神经组织中神经胰蛋白酶活性的水平。
关于神经胰蛋白酶在脑中的活性，发明者首次显示野生型小鼠脑匀浆中含有集聚蛋白22kDa片段，其相比之下未在神经胰蛋白酶缺陷型小鼠脑匀浆中发现(实施例3)。此外，发明者能够证明集聚蛋白22kDa片段在分离的突触制备物(称为突触小体)中存在。该发现表明来自于脑的集聚蛋白22kDa片段来源于突触，在此处分泌神经胰蛋白酶并且与集聚蛋白在细胞外空间相遇。在突触或在突触附近集聚蛋白的原位剪切后，22kDa片段选择性地易位至脑脊液。因此，脑脊液中22kDa片段的水平报告了在中枢神经系统突触处的神经胰蛋白酶活性。
关于神经胰蛋白酶在非神经组织中的活性，发明者显示神经胰蛋白酶在肾脏和肺中表达，并且在肾脏和肺中依赖于神经胰蛋白酶的对集聚蛋白的剪切生成了90kDa和22kDa的集聚蛋白片段。由于肾脏和肺均为高度血管化的组织，极可能至少部分在血液中发现的集聚蛋白22kDa片段来源于肾脏和/或肺。因此在血液中发现的22kDa片段的水平报告了在肾脏和/或肺中的神经胰蛋白酶活性。
在血液中发现的一部分集聚蛋白22kDa片段极可能来源于神经肌肉接头。发明者发现来自于运动神经元沿运动神经转运至骨骼肌的神经胰蛋白酶，在神经肌肉接头(NMJ)处剪切集聚蛋白。在神经肌肉接头处释放的集聚蛋白22kDa片段最可能转移到血液中。因此，在血液中发现的集聚蛋白22kDa片段的水平也报告了在神经肌肉接头的神经胰蛋白酶活性。
通过测量集聚蛋白22kDa片段在脑脊液和血液中水平分别对在脑或神经外组织中神经胰蛋白酶活性的评估，使得可以对于依赖于神经胰蛋白酶的生理或病理状态得出结论。
发明者认识到神经胰蛋白酶在中枢神经系统中作用为突触可塑性的促进剂。他们证明神经胰蛋白酶对突触可塑性的促进依赖于对集聚蛋白的剪切，导致生成并释放C末端22kDa片段(实施例4)。22kDa片段反过来具有突触刺激以及因此具有可塑性促进活性。使用基于海马组织切片的实验模型系统，发明者发现在神经胰蛋白酶缺陷型小鼠中对长时强化的诱导丧失了丝状伪足的增加(实施例5)。他们还发现由神经胰蛋白酶剪切集聚蛋白生成的22kDa片段通过增加树突丝状伪足可作为在对突触可塑性依赖于神经胰蛋白酶的促进中的工具(实施例6)。树突丝状伪足是突触的前体。增加树突丝状伪足促进在中枢神经系统中突触线路的重组。用神经胰蛋白酶缺陷型小鼠海马的实验显示没有依赖于神经胰蛋白酶生成的集聚蛋白22kDa片段时，对树突丝状伪足依赖于活性的促进没有功能。因此在动物模型中可以建立在病理性依赖于神经胰蛋白酶的状态和集聚蛋白22kDa片段之间的直接联系。在小鼠中的该发现和在人的神经胰蛋白酶缺陷个体中的发现良好地吻合，表明没有神经胰蛋白酶时适应性突触可塑性没有功能，并且产生在高级(认知)脑功能中的严重缺陷，也被称为智力迟钝(Molinari等，2002)。因此，通过测量脑脊液中集聚蛋白22kDa片段检测神经胰蛋白酶在突触的活性使依赖于神经胰蛋白酶突触功能的失调(例如依赖于神经胰蛋白酶的突触可塑性)的诊断成为可能。
进一步的实验中显示可以在小鼠以及患者中血液或脑脊液检测集聚蛋白22kDa片段。用于检测集聚蛋白22kDa片段的抗体通过首先生产重组集聚蛋白22kDa片段，然后将其用于生产抗体的任何常用方法而生成(实施例8)。
使用针对集聚蛋白22kDa片段的抗体，已经证明其在小鼠脑匀浆和血液(实施例9)以及在人脑脊液(实施例10)和血液(实施例11)中的存在。这标明该片段为用于常规应用的合适的生物标志物。
因此本发明包括了通过测量患者样品中集聚蛋白22kDa片段的量用于确定神经胰蛋白酶体内活性的方法。通过使用该方法可以诊断和检测神经胰蛋白酶相关失调，并且通常可将该片段作为生物标志物用于所有神经胰蛋白酶相关失调。
该类失调可特别的为由神经胰蛋白酶失调所致的疾病，其中术语“失调”不仅仅包括基因水平上的调节过程，还可以反映影响神经胰蛋白酶活性的新陈代谢过程。
本发明的优选实施方案中将集聚蛋白片段用作神经胰蛋白酶相关的神经或神经肌肉系统疾病或失调(例如分别为依赖于神经胰蛋白酶的智力迟钝和肌肉减少症——老年人的骨骼肌萎缩)的生物标志物。
集聚蛋白22kDa片段可用于所提及失调或疾病的诊断。除了诊断还可能将该生物标志物针对监测与神经胰蛋白酶相关的疾病的趋势或过程来使用。
如上所述，有广泛不同的疾病或失调似乎可以与该神经胰蛋白酶或其活性相关。因而一个重要的治疗途径为寻找在体内影响、特别地抑制神经胰蛋白酶活性的物质。也是在本文中，即在进行确定例如神经胰蛋白酶抑制剂的物质可能用途的临床或临床前研究中，集聚蛋白22kDa片段可用作生物标志物。该类研究的设计对本领域技术人员而言没有任何问题。在因不同物质对神经胰蛋白酶的可能作用而选用其治疗的患者中，任何使用集聚蛋白22kDa片段体内测量的设计都合适。
使用集聚蛋白22kDa片段作为生物标志物的主要优势是该片段可以在同为体液的能在常规应用中进行分析的血液或脑脊液中检测。可以通过本领域常见方法检测该片段，如酶联免疫吸附、免疫印迹(Western印迹)技术、放射免疫、流式细胞仪、荧光偏振、乳胶凝集、侧流分析、免疫层析分析、免疫芯片、dip stick免疫检测、或与任何其他方法组合的基于微珠的技术(例如化学发光、Luminex)，这仅引用一些例子。
用血液或脑脊液工作的主要优势是在所提及组织中在由神经胰蛋白酶蛋白水解剪切后只释放出集聚蛋白22kDa片段。集聚蛋白全长分子不存在或可忽略不计地存在于血液或脑脊液中，因此血液中该片段的检测可以用不需要区分全长集聚蛋白和其22kDa片段的抗体。
抗体或其他类与集聚蛋白22kDa片段选择性结合的特异性结合蛋白可以由任何本领域已知技术生成(Roque等，2004；Gill和Damle，2006)。优选通过使用集聚蛋白22kDa片段或由重组技术或化学合成制备的其中部分作为靶标生成的天然或重组抗体或其他特异性结合蛋白。
本发明所定义的集聚蛋白22kDa片段为SEQ ID NO：12中的人集聚蛋白的22kDa片段，可进一步包括在B/z位点集聚蛋白同工型的8、11或19(8+11)个氨基酸插入。人集聚蛋白中B/z位点位于LG3结构域中氨基酸丝氨酸1884和谷氨酸1885之间(图1和UniProtKB/Swiss-Prot O00468)。插入序列可为ELANEIPV(B/z 8；SEQ ID NO：13)、PETLDSGALHS(B/z 11；SEQ ID NO：14)或ELANEIPVPETLDSGALHS(B/z 19；SEQ ID NO：15)。本发明中术语集聚蛋白22kDa片段还包括由SEQ ID NO：12定义的蛋白质的变异体或相应的有8、11或19个额外氨基酸的同工型，其中一个或多个，特别地一个、两个、三个或四个氨基酸由其他氨基酸替代，和/或其中在C末端或N末端任一端的上至12个氨基酸被删除，或其中上至30个氨基酸加在N末端。这些额外在N端的氨基酸是例如由于通过在合适细胞中重组合成和表达制备所出现。列入集聚蛋白22kDa片段定义的蛋白质的一个例子为根据实施例7制备的SEQ ID NO：12的蛋白质，其还含有一个以简化纯化的8个组氨酸标签和甘氨酸-丝氨酸(GS)接头和四个额外在N末端的氨基酸。在真核细胞或其他的表达中糖基化或其他修饰的蛋白质也包括在本集聚蛋白22kDa片段的定义中。
抗体或其他直接针对集聚蛋白22kDa片段的结合蛋白可以也通过用仅集聚蛋白22kDa片段的一部分而产生，例如取自集聚蛋白22kDa片段序列的18个氨基酸的肽。
另外，本发明包括由重组技术制备的集聚蛋白22kDa片段在根据权利要求1的方法中为校准目的用作参照。
实施例：
实施例1：在真核细胞中共转染集聚蛋白和神经胰蛋白酶导致在两个位点的集聚蛋白的剪切。
为检测作为神经胰蛋白酶底物的集聚蛋白，用大鼠集聚蛋白的跨膜同工型(x4y8)单独或与野生型神经胰蛋白酶(wt)或失活型神经胰蛋白酶(S/A)(其中活性位点丝氨酸突变为丙氨酸)一起转染Hela细胞。
为表达神经胰蛋白酶，将人全长神经胰蛋白酶(CAA04816)的编码区插入到载体pcDNA3.1(Invitrogen)中。通过重叠延伸PCR方法将丝氨酸825突变为丙氨酸生成催化失活的神经胰蛋白酶(S/A)。为表达膜结合的全长集聚蛋白，将大鼠集聚蛋白(P25304，同工型4，剪切变异体y4z8)范围从甲硫氨酸1至脯氨酸1948的编码序列插入到pcDNA3.1中。用加有10％胎牛血清(Biochrom)的DMEM培养基以60-80％克隆率在12孔培养板(Corning)上培养Hela细胞。如Baldi等(2005)所述使用聚乙醇胺(PEI)作为转染试剂。转染后4-6小时用磷酸缓冲液洗一次除去转染混合物。在无胎牛血清的DMEM培养基中48小时以后，收集培养基并用在20mM的Tris-HCl(pH值7.4)中的150mM氯化钠、0.5mM的EDTA、10％的甘油、1％的Triton-X-100裂解细胞。为分析剪切产物，上清和细胞裂解物在4-12％的NuPAGE凝胶(Invitrogen)上进行分离并由免疫检测进行分析。
在单独转染集聚蛋白的细胞裂解物中，在Western印迹中用直接针对其C末端组分的抗体检测到一条为全长集聚蛋白特征的约250kDa的拖尾带(图2A)。在与失活神经胰蛋白酶共转染的细胞裂解物中也发现相同的信号。当野生型神经胰蛋白酶和集聚蛋白共转染时，细胞裂解物中没有发现集聚蛋白的信号。然而，在培养上清中发现新的110、90和22kDa的条带。在与失活型神经胰蛋白酶共转染的上清中没有发现任何一个集聚蛋白的片段。总之，这些结果证明催化活性的神经胰蛋白酶剪切集聚蛋白，导致三个C末端片段释放到培养上清中。
实施例2：依赖于神经胰蛋白酶的两个集聚蛋白的切割位点同源并且进化上保守。
为确定依赖于神经胰蛋白酶的集聚蛋白的切割位点，使用聚乙醇胺转染(Baldi等，2005)将神经胰蛋白酶在HEK293T细胞中与大鼠集聚蛋白(剪切变异体y4z8)的跨膜全长型或含有LG2、EG4和LG3结构域的集聚蛋白的C末端片段共表达。3天后收集上清。为纯化90kDa片段，11份转染有全长集聚蛋白的细胞上清上样至用在20mM的Tris-HCl(pH值7.5)中150mM至1M的氯化钠平衡的肝素琼脂糖CL-6B柱(GE Healthcare)。根据商家推荐用StrepTactin柱(IBA)通过其C末端的Strep标签从24毫升转染有集聚蛋白C末端片段的细胞的培养基中纯化22kDa片段。为了通过Edman降解法进行N端测序，肽样品在4-12％的NuPAGE凝胶上进行分离、电转移至PVDF膜上并在苏黎世功能基因组中心的Procise 492 cLC测序仪(AppliedBiosystems)上分析。
由此，发现90kDa片段的N端序列为ASCYN sPLGCCSDGK(SEQ IDNO：5)和22kDa片段的为SVGDLETLAF(SEQ ID NO：6)。因此，一个切割位点位于第一个S/T片段和SEA结构域之间，C末端的精氨酸995在序列PIER-ASCY中(SEQ ID NO：7，图3)。第二个切割位点位于第四个类EGF和LG3结构域之间，C末端的赖氨酸1754在序列LVEK-SVGD(SEQ ID NO：8，图3)中。氨基酸数目参照膜定位的大鼠集聚蛋白(P25304；剪切变异体x4y0)。我们定义在精氨酸995和丙氨酸996之间易断裂的键为α-切割位点，而且在赖氨酸1754和丝氨酸1755之间易断裂的键为β-切割位点。
大鼠集聚蛋白两个剪切序列和不同脊椎动物种类相应片段的比对(表1)，显示切割位点两侧氨基酸的严格保守。

表1
不同物种集聚蛋白序列的比对。为比较α-和β-切割位点的易断裂键周围的氨基酸残基，我们使用了Schechter和Berger的术语。P1指示N末端而P1’为连在易断裂键的C末端残基。两侧残基在N末端方向一侧残基指示为P2、P3......Pn，在C末端方向一侧残基指示为P2’、P 3’......Pn’。
表1中显而易见，α-位点有严格保守的P1精氨酸和P2谷氨酸。β-位点有严格保守的P1赖氨酸和P2谷氨酸。P3位的残基更为多变，而在两个位点的P4位主要发现为非极性残基。在易断裂键的C末端一侧，P1’和P2’残基在各自位点都很保守，在α-位点主要为丙氨酸-丝氨酸序列而且在β-位点为丝氨酸-丙氨酸序列。在P3’和P4’两个位点发现为很保守但不同的残基。
总之，α和β-位点的共有序列表现为相同的属性，具有严格保守的P1和P2残基、可变的P3位的占用，和在P4、P1’、P2’和P3’的高度保守。当组合的两个切割位点的共有序列产生时，单个α和β-位点共有序列的总体属性得以保留，保证了在α和β-位点单个剪切序列的同源性。

表2结合α-和β-切割位点的共有序列。
实施例3：依赖于神经胰蛋白酶的集聚蛋白的剪切在体内发生，并且不发生在神经胰蛋白酶缺陷型小鼠中。
我们研究了集聚蛋白片段在来自于野生型和神经胰蛋白酶缺陷型小鼠不同组织中的存在。从10天大的野生型和N缺陷型小鼠中分离出脑、肺和肾脏。将每个组织各约1克用Potter匀浆器在1毫升含蛋白酶抑制剂鸡尾酒配方(Sigma)的裂解液(320mM蔗糖，5mM HEPES，pH值7.4)中匀浆。使用免疫印迹分析细胞裂解物(40微克肾脏，80微克脑/肺)神经胰蛋白酶的表达和集聚蛋白的剪切。在集聚蛋白免疫标记的裁切膜上标记β-肌动蛋白。如图4所示，在野生型小鼠的脑、肾脏和肺中观察到对全长集聚蛋白的强免疫反应性。在这些组织中还发现集聚蛋白的90kDa剪切产物。22kDa剪切产物在脑和肾脏中容易检测到，但在肺中缺失。在神经胰蛋白酶缺陷型小鼠中在22kDa或90kDa不能检测到集聚蛋白的免疫反应性。该结果证明由神经胰蛋白酶对集聚蛋白的剪切发生于体内，并且神经胰蛋白酶缺陷型小鼠中剪切产物的缺失表明集聚蛋白的剪切严格的依赖于神经胰蛋白酶。
实施例4：诱导长时强化(LTP)导致神经胰蛋白酶在脑脊液组织中蛋白水解活性增加，致使包括22kDa片段在内的集聚蛋白片段的生成。
类似学习的神经活性对神经胰蛋白酶蛋白水解活性的影响通过海马CA1区域组织切片中的长时强化得以证明。目前，LTP是最广泛接受的学习和记忆在细胞、分子和电生理学层面的关连(Martin等，2000)。为将参与LTP的突触数目最大化，对LTP的诱导使用木防己苦毒素(50μM)、福斯高林(50μM)、咯利普兰(0.1μM)组合的化学方案(Otmakhov等，2004)。这些化合物的组合无需任何电刺激时诱导了持续数小时的强LTP。
为制备海马切片，海马和相邻的大脑皮层从4至5周大的C57BL/6小鼠中迅速切出，然后使用McIlwain机械组织切片机(MickleLaboratory Engineering Co.Ltd.)沿长轴垂直地将海马切为400微米厚度的切片。切片转移至供有95％氧气/5％二氧化碳不含钙的人工脑脊液(ACSF)中(120mM氯化钠，3mM氯化钾，1.2mM磷酸二氢钠，23mM碳酸氢钠，11mM葡萄糖，2.4mM氯化镁)，并在室温下孵育1小时以提供充足的时间使脑组织从切片损伤中恢复。在预先孵育后，切片在含有钙的人工脑脊液(120mM氯化钠，3mM氯化钾，1.2mM磷酸二氢钠，23mM碳酸氢钠，11mM葡萄糖，4mM氯化钙)中孵育20分钟。然后在切片中通过与50μM木防己苦毒素、50μM福斯高林和0.1μM咯利普兰的组合(PFR刺激)孵育16分钟诱导化学长时强化。
为检测切片中的神经胰蛋白酶蛋白水解活性，蛋白水解过程的底物——集聚蛋白通过Western印迹进行评估。在PFR刺激后，切片立刻在1％的Triton-X-100、0.32M的蔗糖、0.5mM的EDTA、5mM的HEPES、pH值7.4中匀浆。碎片通过离心除去(在4℃16,000g离心30分钟)。上清的蛋白质(75微克蛋白质)在10％SDS聚酰胺凝胶中电泳分离，然后电转移至PVDF膜。随后，将膜浸入甲醇10秒并晾干用于封闭。封闭后，将膜与亲和纯化的溶于Tris缓冲液(TBS：0.15M的氯化钠，10mM Tris-HCl，pH值8.0；含有0.1％的Tween-20(TTBS))的兔抗集聚蛋白多抗(R132；1μg/ml)孵育。R132识别由神经胰蛋白酶在α和β位点对集聚蛋白的剪切产生的集聚蛋白的中间90kDa片段。在TTBS清洗3次达10分钟后，膜与含有偶联过氧化物酶的抗兔IgG抗体(Sigma；稀释度1∶10,000)在4℃孵育过夜，然后在TTBS洗3次并在TBS中洗1次。然后将膜浸入化学发光底物(CHEMIGLOW；AlphaInnotech Corporation)5分钟使集聚蛋白的片段显现。化学发光信号由ChemiImager检测(Alpha Biotech)。
如图5A所示，在PFR刺激下(PFR)和非刺激对照(No Stim)相比依赖于神经胰蛋白酶的90kDa集聚蛋白片段的量增加。该增加通过Student’s t检验确定为统计学显著(使用不同样品的3个独立印迹实验；p＜0.05；图5B)。该结果表明PFR刺激诱导了依赖于神经胰蛋白酶的蛋白水解活性的增加。90kDa集聚蛋白片段量的增加也表明22kDa片段(集聚蛋白C末端片段)的增加，因为90kDa集聚蛋白片段的产生不能没有22kDa片段的产生。
实施例5：活性诱导的神经胰蛋白酶蛋白水解活性的增加，和由此在中枢神经系统组织中集聚蛋白22kDa片段的生成导致树突丝状伪足数目的增加
为能研究树突丝状伪足，在Thy-1启动子调控下在单个神经元中表达绿色荧光蛋白(GFP)或膜定位绿色荧光蛋白(mGFP)的转基因小鼠系与神经胰蛋白酶缺陷型小鼠系杂交。表达GFP或mGFP的转基因小鼠由之前所述产生(Feng等，2000；De Paola等，2003)。表达GFP或mGFP的神经胰蛋白酶缺陷型小鼠由将神经胰蛋白酶缺陷型小鼠与在单个神经元中表达GFP或mGFP的转基因小鼠杂交产生。纯合的过表达mGFP的神经胰蛋白酶缺陷型小鼠和相应的mGFP过表达野生型小鼠在5-6周大时用于以下分析。
按实施例4中所述制备急性(Acute)海马切片并用PFR刺激。在刺激时段后，立刻将切片用4％的多聚甲醛、4％的蔗糖、0.1M的磷酸缓冲液(PBS，pH值7.4)在4℃固定过夜。在PBS中清洗后，将切片置于载玻片上并用Vectashield封固剂(Vector Laboratory Inc.)盖片。表达mGFP的海马CA1锥体神经元次级顶端树突的荧光信号用激光共聚焦显微镜(Leica)观察，并采集间隔为0.1221微米的连续图像。由此使用Imaris图像软件(Bitplane AG)的Surpass Volume模式重建三维图像。沿12-20个独立树突在30-40微米的长度上通过各个角度检查三维图像将典型丝状伪足的数目进行手工计数。根据以下形态学标准确定树突丝状伪足：1)如果一个树枝状膜突起长度至少为同一树突上尖突平均长度的两倍则被归类为丝状伪足；2)头部直径对颈部直径的比例小于1.2∶1；以及3)丝状伪足的长度对颈部直径的比例大于3∶1(Grutzendler等，2002)。
该结果表明，在PFR刺激下，野生型(WT)小鼠海马中树突丝状伪足的数目和非刺激对照相比有增加。使用来自12-20独立树突的数据进行统计分析表明受PFR刺激的丝状伪足数量上有显著增加(通过Student’s t检验，p＜0.01；图6)。相反地，通过PFR的化学刺激没有改变神经胰蛋白酶缺陷型小鼠中丝状伪足的数目(图6)。这表明活性促进的丝状伪足数目的增加需要神经胰蛋白酶。总而言之，这些结果表明在中枢神经系统神经元神经胰蛋白酶蛋白水解活性的增加导致树突丝状伪足数目增加。
实施例6：对中枢神经系统神经元使用集聚蛋白22kDa片段导致树突丝状伪足数目增加。
22kDa片段(集聚蛋白C末端片段)天然地通过神经胰蛋白酶在集聚蛋白β-切割位点的蛋白水解活性生成。集聚蛋白的重组22kDa片段按实施例7中所述生产。为研究由神经胰蛋白酶生成的22kDa片段是否参与活性促进的丝状伪足数目的增加，对来自于在单个神经元中表达GFP或mGFP纯合神经胰蛋白酶缺陷型小鼠的急性(快速)切片，经22kDa片段处理后对沿海马CA1神经元树突的丝状伪足计数。神经胰蛋白酶缺陷型小鼠按实施例9中所述生成。表达GFP或mGFP的转基因小鼠按之前所述生成(Feng等，2000；De Paola等，2003)。表达GFP或mGFP的神经胰蛋白酶缺陷型小鼠通过将神经胰蛋白酶缺陷型小鼠与在单个神经元中表达GFP或mGFP的转基因小鼠杂交产生。急性海马切片从如实施例4中所述的神经胰蛋白酶缺陷型、mGFP过表达型小鼠中制备。这些切片分为4组以用于4中不同刺激条件：无刺激(NoStim)、与PFR孵育(PFR)、与22kDa片段和PFR共同孵育(22kDafrag+PFR)和与22kDa片段孵育(22-kDa frag)。实验条件制定22-kDafrag和22kDa frag+PFR包含在氧化人工脑脊液中浓度为22nM的人、大鼠或小鼠22-kDa片段(按实施例7中所述制备)在刺激时段后(16分钟)，立刻将切片固定、置于载玻片上，并按实施例5中所述用激光共聚焦显微镜从表达GFP的神经元的次级顶端树突获取在0.1221微米的连续图像。用Imaris图像软件重建三维图像后在CA1锥体神经元14-20个次级顶端树突(每个30-40微米长)中对丝状伪足计数。
如图7所示，在PFR刺激下树突丝状伪足增加的数目在神经胰蛋白酶缺陷型小鼠中丢失(该影响也在实施例5和图6中显示)。然而，对PFR加入22kDa片段恢复了来自神经胰蛋白酶缺陷型小鼠海马切片中丝状伪足数目的增加，达到与在野生型小鼠PFR组中发现的相同水平(通过Student’s t检验，p＜0.001)。这证明活性促进的丝状伪足的增加依赖于由源于集聚蛋白依赖于神经胰蛋白酶蛋白水解剪切的22kDa片段的生成(其不在神经胰蛋白酶缺陷型小鼠中发生)。另外，单独使用22nM纯化的重组人22kDa片段(无PFR)在无由PFR的化学LTP诱导时引起了丝状伪足的显著增加。22kDa片段的丝状伪足诱导效果还在无LTP诱导的刺激中发现，表明22kDa片段为LTP的丝状伪足诱导效果的下游介质。简而言之，这些结果表明22kDa片段作用为丝状伪足诱导剂。
实施例7：克隆、表达和纯化人集聚蛋白22kDa的C末端片段。
登记号BC007649的BAC DNA具有人集聚蛋白cDNA的3’区域作为插入片段，用于通过PCR扩增产生编码集聚蛋白最后的LG结构域的DNA片段。所用PCR引物为：
(SEQ ID NO：9)5’-GCG CGACAC CAT CAC CAT CAC CATCAC CAT TCA GCG GGG GAC GTG GAT ACC TTG GC-3’，引入一个HpaI位点(5’human C)，和
(SEQ ID NO：10)5’-TTA CCTCAT GGG GTG GGG CAGGGC CGC AGC TC-3’，引入一个NotI位点(3’human C)。
使用该方案，将编码N末端8个His标签的DNA序列插入。由此所得的PCR产物用限制性内切酶NotI和HpaI(引物序列中的黑体)进行剪切，并克隆到含有人calsyntenin-1信号序列的编码序列、用相同限制性内切酶酶切的pEAK8载体中。由此的构建物pEAK8-22-kDa片段包含人calsyntenin-1信号序列的编码区，作为22kDa片段的分泌信号。在E.coli中克隆以及扩增质粒。对于真核蛋白质合成，使用磷酸钙法转染HEK293T细胞。在HEK 293T细胞中的翻译中信号肽被切去。所得的分泌的蛋白质具有的序列其中引导序列ARVNHHHHHHHH(SEQ ID NO：11)与依赖于神经胰蛋白酶在β位点集聚蛋白的剪切所得序列(包含LG3结构域和SEQ ID NO：12的集聚蛋白的C末端)的N末端相连。
SAGDVDTLAFD    GRTFVEYLNA    VTESEKALQS     NHFELSLRTE
ATQGLVLWSG KATERADYVA LAIVDGHLQL SYNLGSQPVV LRSTVPVNTN
RWLRVVAHRE QREGSLQVGN EAPVTGSSPL GATQLDTDGA LWLGGLPELP
VGPALPKAYG TGFVGCLRDV VVGRHPLHLL EDAVTKPELR PCPTP
该多肽具有约20kDa的分子质量，无N-末端ARVN-8xHis标签。包括标签在内的总质量为约21.5kDa。
为生成蛋白质，将HEK 293T细胞以80％的转接率在7个500平方厘米的培养平板(Corning)中各用100毫升加有10％胎牛血清的DMEM培养基(GIBCO)培养。将35毫升500mM的氯化钙和35毫升HBS缓冲液(50mM的HEPES，140mM的氯化钠，1.5mM的磷酸氢二钠，pH值7.1)平衡至室温用于转染。在氯化钙溶液中加入2毫克pEAK8-22-kDa片段表达构建物的DNA并与HBS缓冲液混合。转染混合物在室温孵育30分钟。对于500平方厘米平板的HEK细胞的转染，逐滴地向培养物加入10毫升转染混合物并在37℃孵育4小时。通过用PBS洗一次并且加入无胎牛血清的DMEM培养基去掉转染混合物。60小时后将处理后的培养基收集并用Steritop 0.22微米滤器(Millipore)过滤。上清用20mM的Tris-HCl、400mM的氯化钠、pH值为8.5透析，并使用Ni-NTA柱在BioLogic液相色谱系统(Biorad)上(10毫升HisSelect，Sigma-Aldrich)用于IMAC(固化金属离子亲和层析)纯化。处理后和透析后的培养基以5ml/min的流速上样。该柱用20CV的20mMTris-HCl、400mM的氯化钠、pH值8.5清洗。将10倍柱体积的在清洗缓冲液中线性梯度从0至250mM的咪唑用于洗脱。将含有纯重组22-kDa片段的组分合并，用15毫升离心浓缩器(Millipore)浓缩，并将缓冲液用NAP 25柱换为10mM的MOPS、100mM的氯化钠、pH值7.5。将纯化的蛋白在液氮中冷冻并保存于-80℃。该方法生成的22-kDa片段包含一个N末端8个His标签，其后为β切割位点的P’残基和天然的集聚蛋白的C末端。
类似地，克隆、表达和纯化包含同样结构域结构的大鼠或小鼠集聚蛋白的重组22kDa片段。
还可能用标准克隆技术构建带其他标签的22kDa片段或无标签的22kDa片段变异体。表达在标准真核或原核细胞系统中完成，并且通过标准液相色谱或通过从包含体的重折叠完成期望蛋白的纯化。
为了生成与体内发现的形式相同的22kDa片段，将N末端His标签省去并且从任何编码集聚蛋白C末端片段(包含LG3结构域和由神经胰蛋白酶体外消化的集聚蛋白(例如全长集聚蛋白或44kDa的C末端片段)的β切割位点)的cDNA生成22kDa片段。按上所述纯化22kDa片段。
实施例8：生成针对集聚蛋白22-kDa片段的多抗。
针对LG 3结构域的集聚蛋白的多克隆抗体通过用50微克大鼠集聚蛋白的LG3结构域免疫兔子而产生。由此产生的抗体对于人类、小鼠或大鼠全长集聚蛋白，以及对含有集聚蛋白LG3结构域的集聚蛋白片段的检测。
实施例9：集聚蛋白的22kDa片段可在小鼠脑匀浆和血液中发现。
我们研究了集聚蛋白片段在小鼠脑匀浆可溶成分和血浆中的存在。对于检测我们使用本实验室生成的对90kDa和22kDa片段的特异性、亲和纯化的抗体。可以容易地在脑匀浆和血浆的Western印迹中地检测到22kDa片段(图8)。包含的纯合神经胰蛋白酶缺陷型小鼠(图8A和B中-/-)脑匀浆不含22kDa片段，而杂合型神经胰蛋白酶缺陷型小鼠(图8A和B中+/-)以减少的水平显示了22kDa片段。总之，这些结果表明通过Western印迹检测到的22kDa片段归因为神经胰蛋白酶的活性，并且其可以在脑匀浆可溶性组分以及血浆中检测到。
实施例10：在人脑脊液中发现集聚蛋白22kDa片段。
对于依赖于神经胰蛋白酶的集聚蛋白片段的存在，我们还检测了人的样品，即尿液、血液和脑脊液。目前为止，我们没有发现任何110kDa或90kDa片段在任何体液中存在的证据。然而，我们发现22kDa片段在脑脊液和血浆中都存在。
如图9A所示，在所有检测的年龄(范围从1个月大起，贯穿后期发育阶段和成人，至一位86岁女性的脑脊液)中发现了集聚蛋白22kDa片段的免疫反应性信号。根据神经胰蛋白酶的时间表达模式预期在产后早期发育中有表达高峰，我们发现在2和9月大孩子的脑脊液中集聚蛋白22kDa片段的量最高。有趣的是，在86岁女性中发现22kDa片段的水平明确上升。然而，绝对需要检测更多的样品以得出该现象的生物学或病理生理学相关性的结论。
为核实对22kDa免疫反应性条带的鉴定，我们从脑脊液中分离了基本的蛋白质并将其用于LC/ESI/MS/MS分析。由于鉴定该蛋白的目标明确地基于其部分的肽序列，将其用胰蛋白酶消化进行片段化。由此的片段由液相色谱分离并用于MS/MS分析(质谱分析)。如图9B中所示，两个肽与开头27个氨基酸(包含13个氨基酸的肽#1(SEQ ID NO：3))的氨基酸序列准确吻合；检测到包含人集聚蛋白22kDa片段14个氨基酸的肽#2(SEQ ID NO：4)。两个肽都以碱性氨基酸结尾，确定其胰蛋白酶水解的本质。肽#1始于依赖于神经胰蛋白酶的集聚蛋白的β切割位点。没有发现位于集聚蛋白22kDa片段边缘之外的肽。总之，这些结果确证Western印迹中发现的免疫反应性22kDa条带为依赖于神经胰蛋白酶的集聚蛋白22kDa片段的鉴定。这些结果表明脑脊液作为报告部分用于检测神经胰蛋白酶在脑中的活性。
实施例11：可在人血液中检测集聚蛋白22kDa片段
对依赖于神经胰蛋白酶的集聚蛋白的片段的搜寻还可以延伸到神经外样品。如图10中所示，人血清的Western印迹显示出一条清晰的免疫反应性条带。然而，血浆中检测到的信号不如在脑脊液中的强。对于明确的检测，需要血浆蛋白的色谱分离和各种富集以显示信号(图10中箭头)。目前正在进行的工作目标为对免疫反应性22kDa条带作为集聚蛋白衍生物鉴定的结构确认。只要提供成功的确认，血浆也可以用作检测体内神经胰蛋白酶的报告部分。血浆中对22kDa片段的定量数据可以对在神经肌肉接头处和神经外组织(例如肾脏和肺)中神经胰蛋白酶的活性做出结论。
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Met Ala Gly Arg Ser His Pro Gly Pro Leu Arg Pro Leu Leu Pro Leu
1               5                   10                  15
Leu Val Val Ala Ala Cys Val Leu Pro Gly Ala Gly Gly Thr Cys Pro
            20                  25                  30
Glu Arg Ala Leu Glu Arg Arg Glu Glu Glu Ala Asn Val Val Leu Thr
        35                  40                  45
Gly Thr Val Glu Glu Ile Leu Asn Val Asp Pro Val Gln His Thr Tyr
    50                  55                  60
Ser Cys Lys Val Arg Val Trp Arg Tyr Leu Lys Gly Lys Asp Leu Val
65                  70                  75                  80
Ala Arg Glu Ser Leu Leu Asp Gly Gly Asn Lys Val Val Ile Ser Gly
                85                  90                  95
Phe Gly Asp Pro Leu Ile Cys Asp Asn Gln Val Ser Thr Gly Asp Thr
            100                 105                 110
Arg Ile Phe Phe Val Asn Pro Ala Pro Pro Tyr Leu Trp Pro Ala His
        115                 120                 125
Lys Asn Glu Leu Met Leu Asn Ser Ser Leu Met Arg Ile Thr Leu Arg
    130                 135                 140
Asn Leu Glu Glu Val Glu Phe Cys Val Glu Asp Lys Pro Gly Thr His
145                 150                 155                 160
Phe Thr Pro Val Pro Pro Thr Pro Pro Asp Ala Cys Arg Gly Met Leu
                165                 170                 175
Cys Gly Phe Gly Ala Val Cys Glu Pro Asn Ala Glu Gly Pro Gly Arg
            180                 185                 190
Ala Ser Cys Val Cys Lys Lys Ser Pro Cys Pro Ser Val Val Ala Pro
        195                 200                 205
Val Cys Gly Ser Asp Ala Ser Thr Tyr Ser Asn Glu Cys Glu Leu Gln
    210                 215                 220
Arg Ala Gln Cys Ser Gln Gln Arg Arg Ile Arg Leu Leu Ser Arg Gly
225                 230                 235                 240
Pro Cys Gly Ser Arg Asp Pro Cys Ser Asn Val Thr Cys Ser Phe Gly
                245                 250                 255
Ser Thr Cys Ala Arg Ser Ala Asp Gly Leu Thr Ala Ser Cys Leu Cys
            260                 265                 270
Pro Ala Thr Cys Arg Gly Ala Pro Glu Gly Thr Val Cys Gly Ser Asp
        275                 280                 285
Gly Ala Asp Tyr Pro Gly Glu Cys Gln Leu Leu Arg Arg Ala Cys Ala
    290                 295                 300
Arg Gln Glu Asn Val Phe Lys Lys Phe Asp Gly Pro Cys Asp Pro Cys
305                 310                 315                 320
Gln Gly Ala Leu Pro Asp Pro Ser Arg Ser Cys Arg Val Asn Pro Arg
                325                 330                 335
Thr Arg Arg Pro Glu Met Leu Leu Arg Pro Glu Ser Cys Pro Ala Arg
            340                 345                 350
Gln Ala Pro Val Cys Gly Asp Asp Gly Val Thr Tyr Glu Asn Asp Cys
        355                 360                 365
Val Met Gly Arg Ser Gly Ala Ala Arg Gly Leu Leu Leu Gln Lys Val
    370                 375                 380
Arg Ser Gly Gln Cys Gln Gly Arg Asp Gln Cys Pro Glu Pro Cys Arg
385                 390                 395                 400
Phe Asn Ala Val Cys Leu Ser Arg Arg Gly Arg Pro Arg Cys Ser Cys
                405                 410                 415
Asp Arg Val Thr Cys Asp Gly Ala Tyr Arg Pro Val Cys Ala Gln Asp
            420                 425                 430
Gly Arg Thr Tyr Asp Ser Asp Cys Trp Arg Gln Gln Ala Glu Cys Arg
        435                 440                 445
Gln Gln Arg Ala Ile Pro Ser Lys His Gln Gly Pro Cys Asp Gln Ala
    450                 455                 460
Pro Ser Pro Cys Leu Gly Val Gln Cys Ala Phe Gly Ala Thr Cys Ala
465                 470                 475                 480
Val Lys Asn Gly Gln Ala Ala Cys Glu Cys Leu Gln Ala Cys Ser Ser
                485                 490                 495
Leu Tyr Asp Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly Val Thr Tyr Gly Ser Ala
            500                 505                 510
Cys Glu Leu Glu Ala Thr Ala Cys Thr Leu Gly Arg Glu Ile Gln Val
        515                 520                 525
Ala Arg Lys Gly Pro Cys Asp Arg Cys Gly Gln Cys Arg Phe Gly Ala
    530                 535                 540
Leu Cys Glu Ala Glu Thr Gly Arg Cys Val Cys Pro Ser Glu Cys Val
545                 550                 555                 560
Ala Leu Ala Gln Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly His Thr Tyr Pro Ser
                565                 570                 575
Glu Cys Met Leu His Val His Ala Cys Thr His Gln Ile Ser Leu His
            580                 585                 590
Val Ala Ser Ala Gly Pro Cys Glu Thr Cys Gly Asp Ala Val Cys Ala
        595                 600                 605
Phe Gly Ala Val Cys Ser Ala Gly Gln Cys Val Cys Pro Arg Cys Glu
    610                 615                 620
His Pro Pro Pro Gly Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly Val Thr Tyr Gly
625                 630                 635                 640
Ser Ala Cys Glu Leu Arg Glu Ala Ala Cys Leu Gln Gln Thr Gln Ile
                645                 650                 655
Glu Glu Ala Arg Ala Gly Pro Cys Glu Gln Ala Glu Cys Gly Ser Gly
            660                 665                 670
Gly Ser Gly Ser Gly Glu Asp Gly Asp Cys Glu Gln Glu Leu Cys Arg
        675                 680                 685
Gln Arg Gly Gly Ile Trp Asp Glu Asp Ser Glu Asp Gly Pro Cys Val
    690                 695                 700
Cys Asp Phe Ser Cys Gln Ser Val Pro Gly Ser Pro Val Cys Gly Ser
705                 710                 715                 720
Asp Gly Val Thr Tyr Ser Thr Glu Cys Glu Leu Lys Lys Ala Arg Cys
                725                 730                 735
Glu Ser Gln Arg Gly Leu Tyr Val Ala Ala Gln Gly Ala Cys Arg Gly
            740                 745                 750
Pro Thr Phe Ala Pro Leu Pro Pro Val Ala Pro Leu His Cys Ala Gln
        755                 760                 765
Thr Pro Tyr Gly Cys Cys Gln Asp Asn Ile Thr Ala Ala Arg Gly Val
    770                 775                 780
Gly Leu Ala Gly Cys Pro Ser Ala Cys Gln Cys Asn Pro His Gly Ser
785                 790                 795                 800
Tyr Gly Gly Thr Cys Asp Pro Ala Thr Gly Gln Cys Ser Cys Arg Pro
                805                 810                 815
Gly Val Gly Gly Leu Arg Cys Asp Arg Cys Glu Pro Gly Phe Trp Asn
            820                 825                 830
Phe Arg Gly Ile Val Thr Asp Gly Arg Ser Gly Cys Thr Pro Cys Ser
        835                 840                 845
Cys Asp Pro Gln Gly Ala Val Arg Asp Asp Cys Glu Gln Met Thr Gly
    850                 855                 860
Leu Cys Ser Cys Lys Pro Gly Val Ala Gly Pro Lys Cys Gly Gln Cys
865                 870                 875                 880
Pro Asp Gly Arg Ala Leu Gly Pro Ala Gly Cys Glu Ala Asp Ala Ser
                885                 890                 895
Ala Pro Ala Thr Cys Ala Glu Met Arg Cys Glu Phe Gly Ala Arg Cys
            900                 905                 910
Val Glu Glu Ser Gly Ser Ala His Cys Val Cys Pro Met Leu Thr Cys
        915                 920                 925
Pro Glu Ala Asn Ala Thr Lys Val Cys Gly Ser Asp Gly Val Thr Tyr
    930                 935                 940
Gly Asn Glu Cys Gln Leu Lys Thr Ile Ala Cys Arg Gln Gly Leu Gln
945                 950                 955                 960
Ile Ser Ile Gln Ser Leu Gly Pro Cys Gln Glu Ala Val Ala Pro Ser
                965                 970                 975
Thr His Pro Thr Ser Ala Ser Val Thr Val Thr Thr Pro Gly Leu Leu
            980                 985                 990
Leu Ser Gln Ala Leu Pro Ala Pro Pro Gly Ala Leu Pro Leu Ala Pro
        995                 1000                1005
Ser Ser Thr Ala His Ser Gln Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Arg
    1010                1015                1020
Pro Arg Thr Thr Ala Ser Val Pro Arg Thr Thr Val Trp Pro Val
    1025                1030                1035
Leu Thr Val Pro Pro Thr Ala Pro Ser Pro Ala Pro Ser Leu Val
    1040                1045                1050
Ala Ser Ala Phe Gly Glu Ser Gly Ser Thr Asp Gly Ser Ser Asp
    1055                1060                1065
Glu Glu Leu Ser Gly Asp Gln Glu Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly
    1070                1075                1080
Gly Leu Glu Pro Leu Glu Gly Ser Ser Val Ala Thr Pro Gly Pro
    1085                1090                1095
Pro Val Glu Arg Ala Ser Cys Tyr Asn Ser Ala Leu Gly Cys Cys
    1100                1105                1110
Ser Asp Gly Lys Thr Pro Ser Leu Asp Ala Glu Gly Ser Asn Cys
    1115                1120                1125
Pro Ala Thr Lys Val Phe Gln Gly Val Leu Glu Leu Glu Gly Val
    1130                1135                1140
Glu Gly Gln Glu Leu Phe Tyr Thr Pro Glu Met Ala Asp Pro Lys
    1145                1150                1155
Ser Glu Leu Phe Gly Glu Thr Ala Arg Ser Ile Glu Ser Thr Leu
    1160                1165                1170
Asp Asp Leu Phe Arg Asn Ser Asp Val Lys Lys Asp Phe Arg Ser
    1175                1180                1185
Val Arg Leu Arg Asp Leu Gly Pro Gly Lys Ser Val Arg Ala Ile
    1190                1195                1200
Val Asp Val His Phe Asp Pro Thr Thr Ala Phe Arg Ala Pro Asp
    1205                1210                1215
Val Ala Arg Ala Leu Leu Arg Gln Ile Gln Val Ser Arg Arg Arg
    1220                1225                1230
Ser Leu Gly Val Arg Arg Pro Leu Gln Glu His Val Arg Phe Met
    1235                1240                1245
Asp Phe Asp Trp Phe Pro Ala Phe Ile Thr Gly Ala Thr Ser Gly
    1250                1255                1260
Ala Ile Ala Ala Gly Ala Thr Ala Arg Ala Thr Thr Ala Ser Arg
    1265                1270                1275
Leu Pro Ser Ser Ala Val Thr Pro Arg Ala Pro His Pro Ser His
    1280                1285                1290
Thr Ser Gln Pro Val Ala Lys Thr Thr Ala Ala Pro Thr Thr Arg
    1295                1300                1305
Arg Pro Pro Thr Thr Ala Pro Ser Arg Val Pro Gly Arg Arg Pro
    1310                1315                1320
Pro Ala Pro Gln Gln Pro Pro Lys Pro Cys Asp Ser Gln Pro Cys
    1325                1330                1335
Phe His Gly Gly Thr Cys Gln Asp Trp Ala Leu Gly Gly Gly Phe
    1340                1345                1350
Thr Cys Ser Cys Pro Ala Gly Arg Gly Gly Ala Val Cys Glu Lys
    1355                1360                1365
Val Leu Gly Ala Pro Val Pro Ala Phe Glu Gly Arg Ser Phe Leu
    1370                1375                1380
Ala Phe Pro Thr Leu Arg Ala Tyr His Thr Leu Arg Leu Ala Leu
    1385                1390                1395
Glu Phe Arg Ala Leu Glu Pro Gln Gly Leu Leu Leu Tyr Asn Gly
    1400                1405                1410
Asn Ala Arg Gly Lys Asp Phe Leu Ala Leu Ala Leu Leu Asp Gly
    1415                1420                1425
Arg Val Gln Leu Arg Phe Asp Thr Gly Ser Gly Pro Ala Val Leu
    1430                1435                1440
Thr Ser Ala Val Pro Val Glu Pro Gly Gln Trp His Arg Leu Glu
    1445                1450                1455
Leu Ser Arg His Trp Arg Arg Gly Thr Leu Ser Val Asp Gly Glu
    1460                1465                1470
Thr Pro Val Leu Gly Glu Ser Pro Ser Gly Thr Asp Gly Leu Asn
    1475                1480                1485
Leu Asp Thr Asp Leu Phe Val Gly Gly Val Pro Glu Asp Gln Ala
    1490                1495                1500
Ala Val Ala Leu Glu Arg Thr Phe Val Gly Ala Gly Leu Arg Gly
    1505                1510                1515
Cys Ile Arg Leu Leu Asp Val Asn Asn Gln Arg Leu Glu Leu Gly
    1520                1525                1530
Ile Gly Pro Gly Ala Ala Thr Arg Gly Ser Gly Val Gly Glu Cys
    1535                1540                1545
Gly Asp His Pro Cys Leu Pro Asn Pro Cys His Gly Gly Ala Pro
    1550                1555                1560
Cys Gln Asn Leu Glu Ala Gly Arg Phe His Cys Gln Cys Pro Pro
    1565                1570                1575
Gly Arg Val Gly Pro Thr Cys Ala Asp Glu Lys Ser Pro Cys Gln
    1580                1585                1590
Pro Asn Pro Cys His Gly Ala Ala Pro Cys Arg Val Leu Pro Glu
    1595                1600                1605
Gly Gly Ala Gln Cys Glu Cys Pro Leu Gly Arg Glu Gly Thr Phe
    1610                1615                1620
Cys Gln Thr Ala Ser Gly Gln Asp Gly Ser Gly Pro Phe Leu Ala
    1625                1630                1635
Asp Phe Asn Gly Phe Ser His Leu Glu Leu Arg Gly Leu His Thr
    1640                1645                1650
Phe Ala Arg Asp Leu Gly Glu Lys Met Ala Leu Glu Val Val Phe
    1655                1660                1665
Leu Ala Arg Gly Pro Ser Gly Leu Leu Leu Tyr Asn Gly Gln Lys
    1670                1675                1680
Thr Asp Gly Lys Gly Asp Phe Val Ser Leu Ala Leu Arg Asp Arg
    1685                1690                1695
Arg Leu Glu Phe Arg Tyr Asp Leu Gly Lys Gly Ala Ala Val Ile
    1700                1705                1710
Arg Ser Arg Glu Pro Val Thr Leu Gly Ala Trp Thr Arg Val Ser
    1715                1720                1725
Leu Glu Arg Asn Gly Arg Lys Gly Ala Leu Arg Val Gly Asp Gly
    1730                1735                1740
Pro Arg Val Leu Gly Glu Ser Pro Val Pro His Thr Val Leu Asn
    1745                1750                1755
Leu Lys Glu Pro Leu Tyr Val Gly Gly Ala Pro Asp Phe Ser Lys
    1760                1765                1770
Leu Ala Arg Ala Ala Ala Val Ser Ser Gly Phe Asp Gly Ala Ile
    1775                1780                1785
Gln Leu Val Ser Leu Gly Gly Arg Gln Leu Leu Thr Pro Glu His
    1790                1795                1800
Val Leu Arg Gln Val Asp Val Thr Ser Phe Ala Gly His Pro Cys
    1805                1810                1815
Thr Arg Ala Ser Gly His Pro Cys Leu Asn Gly Ala Ser Cys Val
    1820                1825                1830
Pro Arg Glu Ala Ala Tyr Val Cys Leu Cys Pro Gly Gly Phe Ser
    1835                1840                1845
Gly Pro His Cys Glu Lys Gly Leu Val Glu Lys Ser Ala Gly Asp
    1850                1855                1860
Val Asp Thr Leu Ala Phe Asp Gly Arg Thr Phe Val Glu Tyr Leu
    1865                1870                1875
Asn Ala Val Thr Glu Ser Glu Lys Ala Leu Gln Ser Asn His Phe
    1880                1885                1890
Glu Leu Ser Leu Arg Thr Glu Ala Thr Gln Gly Leu Val Leu Trp
    1895                1900                1905
Ser Gly Lys Ala Thr Glu Arg Ala Asp Tyr Val Ala Leu Ala Ile
    1910                1915                1920
Val Asp Gly His Leu Gln Leu Ser Tyr Asn Leu Gly Ser Gln Pro
    1925                1930                1935
Val Val Leu Arg Ser Thr Val Pro Val Asn Thr Asn Arg Trp Leu
    1940                1945                1950
Arg Val Val Ala His Arg Glu Gln Arg Glu Gly Ser Leu Gln Val
    1955                1960                1965
Gly Asn Glu Ala Pro Val Thr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Ala Thr
    1970                1975                1980
Gln Leu Asp Thr Asp Gly Ala Leu Trp Leu Gly Gly Leu Pro Glu
    1985                1990                1995
Leu Pro Val Gly Pro Ala Leu Pro Lys Ala Tyr Gly Thr Gly Phe
    2000                2005                2010
Val Gly Cys Leu Arg Asp Val Val Val Gly Arg His Pro Leu His
    2015                2020                2025
Leu Leu Glu Asp Ala Val Thr Lys Pro Glu Leu Arg Pro Cys Pro
    2030                2035                2040
Thr Pro
    2045
<210>2
<211>191
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Gly Leu Val Glu Lys Ser Ala Gly Asp Val Asp Thr Leu Ala Phe Asp
1               5                   10                  15
Gly Arg Thr Phe Val Glu Tyr Leu Asn Ala Val Thr Glu Ser Glu Lys
            20                  25                  30
Ala Leu Gln Ser Asn His Phe Glu Leu Ser Leu Arg Thr Glu Ala Thr
        35                  40                  45
Gln Gly Leu Val Leu Trp Ser Gly Lys Ala Thr Glu Arg Ala Asp Tyr
    50                  55                  60
Val Ala Leu Ala Ile Val Asp Gly His Leu Gln Leu Ser Tyr Asn Leu
65                  70                  75                  80
Gly Ser Gln Pro Val Val Leu Arg Ser Thr Val Pro Val Asn Thr Asn
                85                  90                  95
Arg Trp Leu Arg Val Val Ala His Arg Glu Gln Arg Glu Gly Ser Leu
            100                 105                 110
Gln Val Gly Asn Glu Ala Pro Val Thr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Ala
        115                 120                 125
Thr Gln Leu Asp Thr Asp Gly Ala Leu Trp Leu Gly Gly Leu Pro Glu
    130                 135                 140
Leu Pro Val Gly Pro Ala Leu Pro Lys Ala Tyr Gly Thr Gly Phe Val
145                 150                 155                 160
Gly Cys Leu Arg Asp Val Val Val Gly Arg His Pro Leu His Leu Leu
                165                 170                 175
Glu Asp Ala Val Thr Lys Pro Glu Leu Arg Pro Cys Pro Thr Pro
            180                 185                 190
<210>3
<211>13
<212>PRT
<213>智人
<400>3
Ser Ala Gly Asp Val Asp Thr Leu Ala Phe Asp Gly Arg
1               5                   10
<210>4
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>4
Thr Phe Val Glu Tyr Leu Asn Ala Val Thr Glu Ser Glu Lys
1               5                   10
<210>5
<211>15
<212>PRT
<213>兔(Rattus rattus)
<400>5
Ala Ser Cys Tyr Asn Ser Pro Leu Gly Cys Cys Ser Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
<210>6
<211>10
<212>PRT
<213>兔
<400>6
Ser Val Gly Asp Leu Glu Thr Leu Ala Phe
1               5                   10
<210>7
<211>8
<212>PRT
<213>兔
<400>7
Pro Ile Glu Arg Ala Ser Cys Tyr
1               5
<210>8
<211>8
<212>PRT
<213>兔
<400>8
Leu Val Glu Lys Ser Val Gly Asp
1               5
<210>9
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>9
gcgcgagtta accaccatca ccatcaccat caccattcag cgggggacgt ggataccttg    60
gc                                                                   62
<210>10
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>10
ttacctgcgg ccgctcatgg ggtggggcag ggccgcagct c                        41
<210>11
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>His-Tag
<400>11
Ala Arg Val Asn His His His His His His His His
1               5                   10
<210>12
<211>186
<212>PRT
<213>智人
<400>12
Ser Ala Gly Asp Val Asp Thr Leu Ala Phe Asp Gly Arg Thr Phe Val
1               5                   10                  15
Glu Tyr Leu Asn Ala Val Thr Glu Ser Glu Lys Ala Leu Gln Ser Asn
            20                  25                  30
His Phe Glu Leu Ser Leu Arg Thr Glu Ala Thr Gln Gly Leu Val Leu
        35                  40                  45
Trp Ser Gly Lys Ala Thr Glu Arg Ala Asp Tyr Val Ala Leu Ala Ile
    50                  55                  60
Val Asp Gly His Leu Gln Leu Ser Tyr Asn Leu Gly Ser Gln Pro Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Arg Ser Thr Val Pro Val Asn Thr Asn Arg Trp Leu Arg Val
                85                  90                  95
Val Ala His Arg Glu Gln Arg Glu Gly Ser Leu Gln Val Gly Asn Glu
            100                 105                 110
Ala Pro Val Thr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Ala Thr Gln Leu Asp Thr
        115                 120                 125
Asp Gly Ala Leu Trp Leu Gly Gly Leu Pro Glu Leu Pro Val Gly Pro
    130                 135                 140
Ala Leu Pro Lys Ala Tyr Gly Thr Gly Phe Val Gly Cys Leu Arg Asp
145                 150                 155                 160
Val Val Val Gly Arg His Pro Leu His Leu Leu Glu Asp Ala Val Thr
                165                 170                 175
Lys Pro Glu Leu Arg Pro Cys Pro Thr Pro
            180                 185
<210>13
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>氨基酸插入
<400>13
Glu Leu Ala Asn Glu Ile Pro Val
1               5
<210>14
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>氨基酸插入
<400>14
Pro Glu Thr Leu Asp Ser Gly Ala Leu His Ser
1               5                   10
<210>15
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>氨基酸插入
<400>15
Glu Leu Ala Asn Glu Ile Pro Val Pro Glu Thr Leu Asp Ser Gly Ala
1               5                   10                  15
Leu His Ser