一种微生物发酵转化生产甘草次酸的方法.pdf

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1、10申请公布号CN102363796A43申请公布日20120229CN102363796ACN102363796A21申请号201110355872622申请日20111110CGMCCNO514420110816C12P7/42200601C12R1/6720060171申请人中科医药行业生产力促进中心有限公司地址100038北京市海淀区羊坊店路18号海天大厦二期N座（北段）9层90372发明人王福清徐莉张桐74专利代理机构北京远大卓悦知识产权代理事务所普通合伙11369代理人史霞54发明名称一种微生物发酵转化生产甘草次酸的方法57摘要本发明提供了一种微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中。

2、，包括以下步骤将黄曲霉ASPERGILLUSFLAVUS，CGMCCNO5144接入固体PDA斜面培养基中培养，然后从斜面上按1的接种量接种至含新鲜种子培养基中进行培养；将种子培养基所得菌株按照30的接种量接种至含新鲜发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，得到含甘草次酸的发酵液；采用膜分离联用工艺从发酵液中分离出甘草次酸粗品，再通过纯化工艺得到高纯甘草次酸。通过本发明最后获得甘草次酸的发酵量达到438G/L，产品纯度98、转化率90，达到了工艺规模化水平。83生物保藏信息51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图1页CN102363814A1/1页2。

3、1一种微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其特征是，所述的微生物为黄曲霉ASPERGILLUSFLAVUS，CGMCCNO5144。2如权利要求1所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其特征是，包括以下步骤步骤一、将黄曲霉ASPERGILLUSFLAVUS，CGMCCNO5144接入固体PDA斜面培养基中培养，然后从斜面上按1的接种量接种至新鲜种子培养基中进行培养；步骤二、将处于生长期中的经种子培养基培养的菌种按照30的接种量接种至含新鲜发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵产生含甘草次酸的发酵液。3如权利要求1所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其特征是，在步骤二之后还包括步骤三然后从发。

4、酵液中分离出甘草次酸粗品，并进行纯化。4如权利要求2所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，步骤一中种子培养基的质量百分组成为玉米糖化液0515，麸皮汁4555，酵母膏0507，硫酸铵005015，硫酸镁004006，磷酸二氢钾009011，甘草酸粗品009011，其余为水。5如权利要求4所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，步骤一中种子培养基培养条件为菌株放置到锥形瓶中于转速200RPM的摇床上振摇培养，通气量02M3/H，培养时间24小时。6如权利要求2所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，步骤二中发酵培养基的质量百分组成为甘草酸0812，硫酸铵0810，硫酸镁003。

5、005，磷酸氢二钾0608，磷酸二氢钾0709，其余为水，初始PH45。7如权利要求6所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，步骤二中发酵罐中发酵培养条件为发酵培养基5070L，发酵温度2040，通气量0305M3/H，搅拌速度为130170RMP，发酵24D。8如权利要求3所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，甘草次酸的分离包含以下步骤通过滤布过滤，收集滤液1，然后将所得滤液1通过超滤膜PES20，截流粒径在10NM以上，分子量在500500000范围内的物质，收集滤液2；采用纳滤膜NF270过滤上步骤所得滤液2，截流分子量在2001000左右的低分子物质，收集滤液3。9如权利。

6、要求3所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，甘草次酸的纯化包含以下步骤先通过大孔吸附树脂H103对所述滤液3进行分离纯化，得到甘草次酸粗品；然后将所得甘草次酸的粗品制成样品胶后水平安置于硅胶柱表面，先用纯石油醚通柱，再用石油醚乙酸乙酯21体积比的流动相每次20目洗脱甘草次酸，收集滤液并进行喷雾干燥、分步收集，最后得到甘草次酸纯品。10如权利要求1所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，黄曲霉ASPERGILLUSFLAVUS，CGMCCNO5144为通过紫外线和LICL复合诱变处理葡萄糖醛酸的曲霉属黄曲霉获得。权利要求书CN102363796ACN102363814A1/6页3一。

7、种微生物发酵转化生产甘草次酸的方法技术领域0001本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种用微生物转化生产甘草次酸的技术。背景技术0002甘草为我国传统中药材，素有“国老”之称，味甘、性平。归心、肺、脾、胃。补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药。用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒。可缓解药物毒性、烈性。甘草广泛应用于医药、烟草、食品等领域。甘草酸和甘草次酸是甘草的主要有效成分，甘草酸经胃酸水解或经肝中葡萄糖醛酸酶分解形成甘草次酸，甘草酸的药理作用实质上是甘草次酸的效用。0003甘草次酸GLYCYRRHETINICACID的分子式为C30H46O。

8、4，分子量47064KD，为白色结晶性粉末，熔点为288297，结构式如图1。本品在吡啶中易溶，在乙醇或氯仿中溶解，在汽油或乙醚中微溶，在水中不溶。0004近年随着现代中药的发展，各国学者在中医理论的基础上，对甘草有效成分甘草次酸的药理作用进行了深入研究，以寻找高效低毒的新有效成分应用于临床。研究发现甘草次酸不仅具有抗炎、抗溃疡、抗病毒、降血脂、镇咳、平喘及祛痰等作用，还可用于防治病毒性肝炎、高血脂症和癌症等疾病，是有效的干扰素诱生剂及细胞免疫调节剂。将甘草酸类药物与生物碱、抗生素、氨基酸等复配或制成其金属化合物，还可增加药物的稳定性，提高生物利用度，降低毒副作用。伴随甘草次酸临床应用价值的深。

9、入研究，甘草次酸的开发利用也越来越受到国内外医药界的关注。0005甘草次酸的制备未见化学合成法。目前多以天然豆科植物甘草经加工提取来生产，即植物提取法。植物提取法以甘草为原料提取甘草酸，再通过酸水解法水解甘草酸制取甘草次酸。00060007甘草为药用植物，主要分布于北纬3055度之间的干旱和半干旱地区，近年由于生态环境的恶化，甘草资源日趋匮乏。另外，以甘草为原料制取甘草次酸，工艺繁琐、产品收率低、成本较高，严重制约了甘草次酸的产量。微生物发酵法是利用微生物大规模发酵所产生的葡萄糖醛酸酶，体外转化甘草中的甘草酸生成甘草次酸的方法。微生物发酵生产不受资源制约，具有反应条件温和、产品专一性好、工艺简。

10、单、成本低、不造成环境污染和后处理说明书CN102363796ACN102363814A2/6页4简单等优点，成为近年该领域研究开发的热点，也是解决当前甘草资源短缺问题的最佳方法。0008目前，国外有关甘草次酸微生物转化的研究报道不多，国内主要有四川大学、北京中医药大学、湖北工业大学等科研机构进行相关研究，但均还处于实验研究阶段，尚未形成规模化水平。0009本发明通过紫外线和LICL复合诱变处理获得高产葡萄糖醛酸酶的微生物菌种，选择甘草煮提液为培养基带渣发酵，采用超滤与纳滤膜联合分离技术，对不同分子量片段的杂质分级去除，大大提高了产品转化率、收率和纯度，达到了工业规模化水平。发明内容0010本。

11、发明提供了一种微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其特征是，所述的微生物为黄曲霉ASPERGILLUSFLAVUS，CGMCCNO5144。0011优选的是，所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法中，包括以下步骤0012步骤一、将黄曲霉ASPERGILLUSFLAVUSCGMCCNO5144接入固体PDA斜面培养基中培养，然后从斜面上按1的接种量接种至新鲜种子培养基中进行培养；0013步骤二、将处于生长期中的经种子培养基培养的菌种按照30的接种量接种至含新鲜发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵产生含甘草次酸的发酵液；0014优选的是，所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法中，在步骤二之后还包括。

12、步骤三然后从发酵液中分离出甘草次酸粗品，并进行纯化。0015优选的是，所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法中，步骤一中种子培养基的质量百分组成为玉米糖化液0515，麸皮汁4555，酵母膏0507，硫酸铵005015，硫酸镁004006，磷酸二氢钾009011，甘草酸粗品009011，其余为水。0016优选的是，所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法中，步骤一中种子培养基培养条件为菌株置于锥形瓶中于转速200RPM的摇床中振摇培养，通气量02M3/H，培养时间24小时。0017优选的是，所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法中，步骤二中发酵培养基的质量百分组成为甘草酸0812，硫酸铵0810，。

13、硫酸镁003005，磷酸氢二钾0608，磷酸二氢钾0709，其余为水，初始PH45。0018优选的是，所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法中，步骤二中发酵罐中发酵培养条件为发酵培养基5070L，发酵温度2040，通气量0305M3/H，搅拌速度为130170RMP，发酵24D。0019优选的是，所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法中，甘草次酸的分离包含以下步骤0020通过滤布过滤，收集滤液1，然后将所得滤液1通过超滤膜PES20，截流粒径在10NM以上，分子量在500500000范围内的物质，收集滤液2；0021采用纳滤膜NF270过滤上步骤所得滤液2，截流分子量在2001000左右的低分。

14、子物质，收集滤液3。0022优选的是，所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法中，甘草次酸的纯化包含说明书CN102363796ACN102363814A3/6页5以下步骤0023先通过大孔吸附树脂H103对所述滤液3进行分离纯化，得到甘草次酸粗品；0024然后将所得甘草次酸的粗品制成样品胶后水平安置于硅胶柱表面，先用纯石油醚通柱，再用石油醚乙酸乙酯21体积比的流动相每次20目洗脱甘草次酸，收集滤液并进行喷雾干燥、分步收集，最后得到甘草次酸纯品。0025优选的是，所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法中，黄曲霉ASPERGILLUSFLAVUS，CGMCCNO5144为通过紫外线和LICL复合诱。

15、变处理葡萄糖醛酸的曲霉属黄曲霉获得。0026本发明提供了一种微生物转化生产甘草次酸的方法，包括以下步骤00271先在固体PDA斜面培养基中对黄曲霉ASPERGILLUSFLAVUSCGMCCNO5144进行培养，然后用接种铲从斜面上取一环接种至含种子培养基的锥形瓶中，接种量为1，培养条件为PH自然，转速200RPM的摇床中振摇培养，通气量02M3/H，培养时间24小时。00282将种子瓶中培养好的菌株按照30的接种量转接入100L的发酵罐中，发酵罐内装60L经灭菌的发酵培养基，调整发酵温度为30，通气量04M3/H，搅拌速度为150RMP，发酵3D，得到含甘草次酸的发酵液。00293将上述所得。

16、含甘草次酸的发酵液先通过滤布除去大分子物质，收集滤液1，然后将发酵液1通过超滤膜PES20，截流粒径在10NM以上，分子量在500500000范围内的物质，收集滤液2，再采用纳滤NF270对滤液2进行浓缩过滤，截流分子量在2001000左右的低分子物质，收集滤液3。00304将滤液3通过大孔吸附树脂H103进行分离和纯化得到粗提物，量取粗提物200ML浓缩到一定体积放入瓷碗中，加入80100目的硅胶5G，快速搅拌均匀，置60水浴锅上加热并不停搅拌，待溶剂挥发净尽后即制得样品胶，在硅胶柱中加入300400目的硅胶100G分离胶，保持上表面水平，再装入干燥好的样品胶，然后先用纯石油醚通柱，再用石油。

17、醚乙酸乙酯21体积比的流动相每次20目洗脱甘草次酸，收集滤液并进行喷雾干燥、分步收集，最后得到甘草次酸纯品。0031本发明提供的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法具有以下突出特点00321采用紫外线和LICL复合诱变处理筛选高产菌株。所得菌株遗传性能稳定，所分泌的葡萄糖醛酸酶能定向高效地酶解甘草酸的葡萄糖糖苷键，大大提高了甘草酸的转化率；00332选择甘草煮提液为培养基，不仅为菌种生长提供了丰富的碳源、氮源，而且解决了化学酸解法中原料甘草酸必须经过复杂的精制工艺问题，提高了原料利用率，减少了废液排放和环境污染；00343采用超滤与纳滤膜联合分离技术，对不同分子量片段的杂质分级去除，提高了产品收率。

18、和纯度，降低了成本。0035本发明通过优化发酵培养和目标产品的分离纯化工艺，使得甘草次酸的发酵量达到438G/L，产品转化率90，大大降低了甘草次酸的工业生产成本。附图说明0036图1本发明提供的微生物转化生产甘草次酸的工艺流程图。说明书CN102363796ACN102363814A4/6页6具体实施方式0037下面通过实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。0038黄曲霉ASPERGILLUSFLAVUS，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101。

19、，保藏号CGMCCNO5144，保藏日期2011年08月16日。0039实施例10040将黄曲霉ASPERGILLUSFLAVUSCGMCCNO5144接种至含种子培养基的锥形瓶中，PH自然，接种量为1，转速为200RPM，通气量为02M3/H，培养时间为24小时。0041将以上培养菌株按照30的接种量转接入100L的发酵罐内内装60L经灭菌的发酵培养基，调整发酵温度为10，通气量04M3/H，搅拌速度150RMP，发酵3D。0042考察甘草次酸的产量。用硫酸香草醛法检测甘草次酸00431对照品溶液配制0044精密称取100干燥至恒重的甘草次酸标准品20MG，置20ML量瓶中，加无水乙醇至刻度。

20、，得到甘草次酸标准液含量为1MG/ML。00452标准曲线的制备0046精密量取对标准溶液1MG/ML01，15，25，45ML挥干分别加05ML乙酸乙酯于试管中，再依次加入95乙醇3ML，1香草醛水溶液02ML，放在冰水中，加入80硫酸2ML将试管塞紧，混合均匀，立即置于50水浴上保温10MIN，再放至室温，稀释到刻度20ML。取5ML于紫外分光光度计上在500600NM波段扫描吸收光谱，以00MG/ML浓度作空白参比。甘草次酸反应液最大吸收峰作为样品测定吸收峰，测OD值，其结果为绘制标准曲线。00473样品准备0048甘草液体发酵产物25ML，依次加入5ML乙酸乙酯萃取。吸取乙酸乙酯上清液。

21、1ML，3ML乙醇溶液，02ML1香草醛及2ML80硫酸溶液于50显色10MIN，稀释到刻度20ML，测定OD。0049实施例20050将黄曲霉ASPERGILLUSFLAVUSCGMCCNO5144接种至含种子培养基的锥形瓶中，PH自然，接种量为1，转速为200RPM，通气量为02M3/H，培养时间为24小时。0051将以上培养菌株按照30的接种量转接入100L的发酵罐内内装60L经灭菌的发酵培养基，调整发酵温度为20，通气量04M3/H，搅拌速度150RMP，发酵3D，菌株发酵浓度达31G/L。0052甘草次酸检测方法同上。0053实施例30054将黄曲霉ASPERGILLUSFLAVUS。

22、CGMCCNO5144接种至含种子培养基的锥形瓶中，PH自然，接种量为1，转速为200RPM，通气量为02M3/H，培养时间为24小时。0055将以上培养菌株按照30的接种量转接入100L的发酵罐内内装60L经灭菌的发酵培养基，调整发酵温度为30，通气量04M3/H，搅拌速度150RMP，发酵3D，菌株发酵浓度达42G/L。0056甘草次酸检测方法同上。说明书CN102363796ACN102363814A5/6页70057实施例40058将黄曲霉ASPERGILLUSFLAVUSCGMCCNO5144接种至含种子培养基的锥形瓶中，PH自然，接种量为1，转速为200RPM，通气量为02M3/H。

23、，培养时间为24小时。0059将以上培养菌株按照30的接种量转接入100L的发酵罐内内装60L经灭菌的发酵培养基，调整发酵温度为40，通气量04M3/H，搅拌速度150RMP，发酵3D，菌株发酵浓度达33G/L。0060甘草次酸检测方法同上。0061实施例50062将黄曲霉ASPERGILLUSFLAVUSCGMCCNO5144接种至含种子培养基的锥形瓶中，种子培养基质量百分组成为玉米糖化液05，麸皮汁45，酵母膏05，硫酸铵005，硫酸镁004，磷酸二氢钾009，甘草酸粗品009，其余为水PH自然，接种量为1，转速为180RPM，通气量为015M3/H，培养时间为20小时。0063将以上培养。

24、菌株按照30的接种量转接入100L的发酵罐内，内含50L发酵培养基，发酵培养基的质量百分组成为甘草酸08，硫酸铵08，硫酸镁003，磷酸氢二钾06，磷酸二氢钾07，其余为水，初始PH4，调整发酵温度为30，通气量03M3/H，搅拌速度130RMP，发酵2D，得到含甘草次酸的发酵液。0064将上述所得含甘草次酸的发酵液先通过滤布除去大分子物质，收集滤液1，然后将发酵液1通过超滤膜PES20，截流粒径在10NM以上，分子量在500500000范围内的物质，收集滤液2，再采用纳滤NF270对滤液2进行浓缩过滤，截流分子量在2001000左右的低分子物质，收集滤液3。0065将滤液3通过大孔吸附树脂H。

25、103进行分离和纯化得到粗提物，量取粗提物200ML浓缩到一定体积放入瓷碗中，加入80100目的硅胶5G，快速搅拌均匀，置60水浴锅上加热并不停搅拌，待溶剂挥发净尽后即制得样品胶，在硅胶柱中加入300400目的硅胶100G分离胶，保持上表面水平，再装入干燥好的样品胶，然后先用纯石油醚通柱，再用石油醚乙酸乙酯21体积比的流动相每次20目洗脱甘草次酸，收集滤液并进行喷雾干燥、分步收集，最后得到甘草次酸纯品。0066最后获得甘草次酸产品纯度98，转化率90。0067实施例60068将黄曲霉ASPERGILLUSFLAVUSCGMCCNO5144接种至含种子培养基的锥形瓶中，种子培养基质量百分组成为玉。

26、米糖化液10，麸皮汁50，酵母膏06，硫酸铵01，硫酸镁005，磷酸二氢钾01，甘草酸粗品01，其余为水PH自然，接种量为1，转速为180RPM，通气量为015M3/H，培养时间为20小时。0069将以上培养菌株按照30的接种量转接入100L的发酵罐内，内含60L发酵培养基，发酵培养基的质量百分组成为甘草酸10，硫酸铵09，硫酸镁004，磷酸氢二钾07，磷酸二氢钾08，其余为水，初始PH45，调整发酵温度为32，通气量04M3/H，搅拌速度150RMP，发酵3D，得到含甘草次酸的发酵液。0070甘草次酸的分离和提纯步骤同实施例5，最后获得甘草次酸产品纯度98，转化率90。0071实施例7说明书。

27、CN102363796ACN102363814A6/6页80072将黄曲霉ASPERGILLUSFLAVUSCGMCCNO5144接种至含种子培养基的锥形瓶中，种子培养基质量百分组成为玉米糖化液15，麸皮汁55，酵母膏07，硫酸铵015，硫酸镁006，磷酸二氢钾011，甘草酸粗品011，其余为水PH自然，接种量为1，转速为180RPM，通气量为015M3/H，培养时间为20小时。0073将以上培养菌株按照30的接种量转接入100L的发酵罐内，内含70L发酵培养基，发酵培养基的质量百分组成为甘草酸12，硫酸铵10，硫酸镁005，磷酸氢二钾08，磷酸二氢钾09，其余为水，初始PH5，调整发酵温度为。

28、30，通气量05M3/H，搅拌速度170RMP，发酵4D，得到含甘草次酸的发酵液。0074甘草次酸的分离和提纯步骤同实施例5，最后获得甘草次酸产品纯度98，转化率90。0075实施例80076将从甘草种植地的土壤中采集目标样本经过初筛、紫外诱变和LICL复合多重诱变得到高产葡萄糖醛酸的曲霉属黄曲霉ASPERGILLUSFLAVUS，CGMCCNO5144。0077初筛为取甘草地土样加入无菌蒸馏水，摇匀、静置后，取上清液1ML梯度稀释，然后各吸取01ML于在初筛培养基上按常规涂布方法30培养3D，初筛平板的质量百分组成90甘草酸粗品10G，硫酸镁005G，硝酸钠05G，硫酸亚铁0001G，磷酸二。

29、氢钾01G，琼脂18G，其余为水，PH5，挑选出长势良好的单菌落，保藏为初筛菌种待用。将初筛菌种接入复筛培养基中，复筛培养基的质量百分组成10甘草煮提液W/V，PH自然，30，150RPM的摇床中发酵培养3D。发酵液作产物TLC检测，在薄层层析板上有甘草次酸斑点出现的菌株即为目标菌株。取目标菌株的菌落于试管斜面培养基上进行培养，培养12D即可获得斜面菌种。0078紫外诱变是将斜面菌种用接种环轻轻刮孢子于50ML的无菌水三角瓶中，用力摇动5MIN均匀分散，取5ML置于10CM的平皿中，30W紫外灯，距离30CM，照射20S。0079LICL诱变是将经紫外诱变的菌液稀释涂布诱变培养基平板，避光25培养57D，诱变培养基葡萄糖4，硫酸铵04，磷酸二氢钾015，硫酸镁005，酵母膏001，醋酸钠02，醋酸锌6G/ML，硫酸铜05G/ML，氯化锂05，琼脂20。0080最后需要强调的是以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。说明书CN102363796ACN102363814A1/1页9图1说明书附图CN102363796A。