一种鸡隐性白羽基因的分子鉴定方法 【技术领域】
本发明涉及动物遗传育种领域，具体涉及一种鸡隐性白羽基因的分子鉴定方法。
背景技术
随着生活水平的提高，人们消费观念从过去的数量型转变为质量型。白羽鸡是国外引进的肉鸡及部分蛋鸡(如白壳蛋鸡)的重要象征之一，国外引进的肉鸡生长快、饲料效率高，但肉质较中国本地鸡品种差，近年来通过利用引进国外的鸡种改良中国本地鸡产生的优质鸡(包括肉鸡、蛋鸡)越来越受到消费者的青睐。市场需求推动了优质鸡育种的发展，一个好的育种素材对育种来说至关重要，由国外引进的鸡种多为显性白羽型，与中国地方土鸡杂交后代多为白羽型，中国消费者不喜欢白羽鸡。有关鸡羽色遗传相对复杂，进行羽色纯化需要一个较长的过程，显性白羽作为育种素材对于中国地方优质土鸡种的育种显然不利。隐性白羽相对于中国地方鸡种的有色羽为隐性，同中国地方鸡杂交后代羽色与中国地方鸡羽色一样。因此隐性白羽鸡种质资源是利用地方鸡中国进行优质鸡育种的稀缺育种素材资源。而传统的育种方法是根据杂交后代鸡的表型性状留种，进行测交检测，繁殖扩群等步骤，需要一个较长的过程，为了适应市场的快速变化，缩短育种时间有重要意义，本发明建立的方法可以快速的鉴定隐性白羽基因，扩大携带隐性白羽基因的繁殖群体，缩短育种时间。
鸡的白羽分为显性白羽和隐性白羽，而其中隐性白羽又有多种，TYR(酪氨酸酶)基因控制的隐性白羽是其中重要的一种。TYR基因位于常染色体上，正常的TYR基因控制的性状是有色羽，当TYR两等位基因中插入了一个逆转录病毒可导致出现隐性白羽。因此当等位基因含有正常TYR基因时多数是有色羽(携带有显性白羽的鸡种如白来航除外)，若等位基因均为逆转录病毒插入的TYR基因时则为隐性白羽。
【发明内容】
本发明的目的在于克服传统育种方法时间长的缺陷，寻找一种快速、可靠的用于鸡隐性白羽基因鉴定的分子生物学方法。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种鸡隐性白羽基因的分子鉴定方法，利用鸡隐性白羽控制基因(插入了逆转录病毒的TYR基因)和有色羽控制基因(TYR基因)的核苷酸序列分别设计引物对1和引物对2；其中：引物对1用于检测鸡隐性白羽等位基因，引物对2用于检测鸡有色羽等位基因；提取待鉴定鸡的基因组DNA，用引物对1和引物对2做PCR扩增；电泳检测扩增产物；根据电泳结果判断鸡的羽色基因型：若只有引物对1扩增出产物，则为隐性白羽纯合子(表型为白羽)；若只有引物对2扩增出产物，则是非隐性白羽纯合子(表型可能为有色或白羽)；若两对引物均能扩增出产物，则是隐性白羽杂合子(表型可能为有色或白羽)。
所述引物对1的正向引物根据插入鸡TYR基因的逆转录病毒核苷酸序列设计，反向引物根据鸡TYR基因的外显子5核苷酸序列设计；引物2的正向引物根据TYR基因内含子4的核苷酸序列设计，反向引物根据TYR基因的外显子5的核苷酸序列设计。
所述引物对1的正向引物为5’GTTGCCTCTGGCTCTATT 3’，反向引物为5’TTTCTGTGAGTAAGGGTTG 3’；所述引物对2的正向引物为5’TTGTTGGAGGCTGGGTAT 3’，反向引物为5’ATGGGCTTGCTTGAGGTA 3’。
本发明可用琼脂糖凝胶电泳检测方法检测扩增结果。也可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法(李宏业等，1999，改良聚丙烯酰胺凝胶电泳检测DNA，细胞生物学杂志，1999，21(4)：201-202)。
本发明可用苯酚-氯仿粗提法提取待鉴定鸡的基因组DNA。也可采用CTAB法提取方法(逢洪波等，从动物血液中提取基因组DNA方法的比较研究，辽宁师范大学学报(自然科学版)，2005，28(4)：457-460)。
与传统的育种方法相比，本发明建立的分子生物学方法能有效地缩短育种时间和扩大群体规模。
【附图说明】
序列表SEQ ID NO 1是引物对1扩增的鸡TYR基因基因片段；
序列表SEQ ID NO 2是引物对2扩增的鸡TYR基因基因片段；
图1：是本发明的技术流程图。
图2：是郧阳县白羽乌骨鸡DNA的PCR扩增结果电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1-15均只有隐性白羽等位基因，检出292bp大小的条带。M为2000plus的DNAmarker。
图3：是白来航鸡DNA的PCR扩增结果电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1-14均只有有色羽等位基因，检出764bp大小地条带。M为2000plus的DNAmarker。
图4：是欣华鸡DNA的PCR扩增结果电泳图谱。编号说明如下：泳道1-7、9、10有有色羽等位基因，检出764bp大小的条带。3-5、8-11有隐性白羽等位基因，检出292bp大小的条带。
M为2000plus的DNAmarker。
【具体实施方式】
实施例1.
1.试样的制备与保存
取100ul含抗凝剂的中国湖北省郧阳县的白羽乌骨鸡的血液，用常用的苯酚-氯仿粗提法(萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].第2版.金冬雁，黎孟枫.北京：科学出版社，1999.465-467)提取白羽乌骨鸡血液DNA，将DNA样品存于4℃冰箱中备用。
2.引物设计
本实施例的引物设计如表1所示。
表1本发明设计的PCR扩增引物
引物 作用 正向引物 反向引物 大小 引物对1 检测是否逆转录病 毒插入 5’GTTGCCTCT GGCTCTATT 3’ 5’TTTCTGTGAGT AAGGGTTG 3’ 292bp 引物对2 检测是否由TYR基 因控制 5’TTGTTGGAG GCTGGGTAT 3’ 5’ATGGGCTTGCT TGAGGTA 3’ 764bp
3.PCR扩增
(1)检测是否有逆转录病毒插入：以引物对1为扩增引物，建立20ul体系：10×PCR缓冲液，10mM/L的dNTP，25mM/L的MgCl2，2.5U的Tag聚合酶，10umol/L的模板(郧阳白羽乌鸡DNA)，加适量双蒸水至20ul；反应程序为94℃预变性5min，94℃变性40s，53.3℃退火40s，72℃延伸15s，30个循环，72℃再延伸5min。4℃下保存备用。
(2)检测是否是由TYR基因控制的有色羽：以引物对2为扩增引物，建立的20ul体系：10×PCR缓冲液，10mM/L的dNTP，25mM/L的MgCl2，2.5U的Tag聚合酶，10umol/L的模板(郧阳白羽乌骨鸡DNA)，加适量双蒸水至20ul；反应程序为94℃预变性5min，94℃变性40s，53℃退火40s，72℃延伸35s，30个循环，72℃再延伸5min。4℃下保存备用。
4.PCR扩增产物的检测及结果判定
取5ul PCR扩增产物，1.0％～1.5的琼脂糖凝胶电泳(3V/cm～5V/cm，电泳20min～30min)，溴化乙淀染色，用上述两个扩增产物混合点样，凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图2。
根据电泳图谱中出现条带数及大小判定结果：若只有引物对1扩增出产物，则为隐性白羽纯合子(表型为白羽)；若只有引物对2扩增出产物，则是非隐性白羽纯合子(表型可能为有色或白羽)；若两对引物均能扩增出产物，则是隐性白羽杂合子(表型可能为有色或白羽)。
结果所检测的57只郧阳白羽乌鸡全部是隐性白羽基因纯合子。
实施例2
1.试样的制备与保存
取100ul含抗凝剂的白来航鸡的血液，用常用的苯酚-氯仿粗提法(萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].第2版.金冬雁，黎孟枫.北京：科学出版社，1999.465-467)提取血液DNA，将DNA样品存于4℃冰箱中备用。
2.引物设计
本实施例的引物设计如表2所示。
表2本发明设计的PCR扩增引物
引物 作用 正向 反向 大小 引物对1 检测是否逆转录病 毒插入 5’GTTGCCTCT GGCTCTATT 3’ 5’TTTCTGTGAGT AAGGGTTG 3’ 292bp
引物 作用 正向 反向 大小 引物对2 检测是否由TYR基 因控制 5’TTGTTGGAG GCTGGGTAT 3’ 5’ATGGGCTTGCT TGAGGTA 3’ 764bp
3.PCR扩增
(1)检测是否逆转录病毒插入：以引物对1为扩增引物，20ul体系：10×PCR缓冲液，10mM/L的dNTP，25mM/L的MgCl2，2.5U的Tag聚合酶，10umol/L的模板(白来航鸡DNA)，适量双蒸水至20ul；反应程序为94℃预变性5min，94℃变性40s，53.3℃退火40s，72℃延伸15s，30个循环，72℃再延伸5min。4℃保存。
(2)检测是否是由TYR控制的白羽羽型：以引物对2为扩增引物，20ul体系：10×PCR缓冲液，10mM/L的dNTP，25mM/L的MgCl2，2.5U的Tag聚合酶，10umol/L的模板(白来航鸡DNA)，加适量双蒸水至20ul；反应程序为94℃预变性5min，94℃变性40s，53℃退火40s，72℃延伸35s，30个循环，72℃再延伸5min。4℃保存。
4.PCR扩增产物的检测及结果判定
取5ulPCR扩增产物，1.0％～1.5的琼脂糖凝胶电泳(3V/cm～5V/cm，电泳20min～30min)，溴化乙淀染色，两个产物混合点样，凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图3。
根据电泳图谱中出现条带数及大小判定结果：若只有引物对1扩增出产物，则为隐性白羽纯合子(表型为白羽)；若只有引物对2扩增出产物，则是非隐性白羽纯合子(表型可能为有色或白羽)；若两对引物均能扩增出产物，则是隐性白羽杂合子(表型可能为有色或白羽)。
结果所检测的22只白来航鸡全部是非隐性白羽纯合子。
实施例3
1.试样的制备与保存
血液采自湖北欣华生态畜禽开发有限公司的欣华鸡，取100ul含抗凝剂的血液，用常用的苯酚-氯仿粗提法(萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].第2版.金冬雁，黎孟枫.北京：科学出版社，1999.465-467)提取血液DNA，将DNA样品存于4℃冰箱中备用。
2.引物设计
本实施例所用的引物见表3。
表3本发明设计的PCR扩增引物
引物 作用 正向引物 反向引物 大小 引物对1 检测是否逆转录病 毒插入 5’GTTGCCTCT GGCTCTATT 3’ 5’TTTCTGTGAGT AAGGGTTG 3’ 292bp
引物 作用 正向引物 反向引物 大小 引物对2 检测是否由TYR基 因控制 5’TTGTTGGAG GCTGGGTAT 3’ 5’ATGGGCTTGCT TGAGGTA 3’ 764bp
3.PCR扩增
(1)检测是否有逆转录病毒插入：以报道的引物对1基因为扩增引物，建立10ul体系：20×PCR缓冲液，10mM/L的dNTP，25mM/L的MgCl2，2.5U的Tag聚合酶，10umol/L的模板(湖北欣华公司的鸡的DNA)，适量双蒸水至20ul；反应程序为94℃预变性5min，94℃变性40s，53.3℃退火40s，72℃延伸15s，30个循环，72℃再延伸5min。4℃下保存备用。
(2)检测是否是由TYR基因控制的白羽羽型：以引物对2为扩增引物，20ul体系：10×PCR缓冲液，10mM/L的dNTP，25mM/L的MgCl2，2.5U的Tag聚合酶，10umol/L的模板(湖北欣华公司的鸡的DNA)，加适量双蒸水至20ul；反应程序为94℃预变性5min，94℃变性40s，53℃退火40s，72℃延伸35s，30个循环，72℃再延伸5min。4℃下保存备用。
4.PCR扩增产物的检测及结果判定
取5ulPCR扩增产物，1.0％～1.5％的琼脂糖凝胶电泳(3V/cm～5V/cm，电泳20min～30min)，溴化乙淀染色，两个产物混合点样，凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图4。
根据电泳图谱中出现条带数及大小判定结果：若只有引物对1扩增出产物，则为隐性白羽纯合子(表型为白羽)；若只有引物对2扩增出产物，则是非隐性白羽纯合子(表型可能为有色或白羽)；若两对引物均能扩增出产物，则是隐性白羽杂合子(表型可能为有色或白羽)。
结果在检测的108个体中，隐性白羽纯合子11个，非隐性白羽纯合子65个，隐性白羽杂合子32个。
【序列表】
<110>华中农业大学
<120>一种鸡隐性白羽基因的分子鉴定方法
<130>
<141>2009-09-25
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>292
<212>DNA
<213>鸡(Gallus gallus)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(292)
<223>
<400>1
gctctatttg actacacagt actacacagt gttatctgtt acacaatctg tatacactgg 60
tactgcattg catcatgtaa aaggacctct gtttttctcc tttctagagc acttggttct 120
ttccaggact ttttaatccc ctacctcaag caagcccatc agatctggcc ctggctggtt 180
ggcgcagctg tgatcggagg cataattact gctgtgctct ctgggctcat cctggcctgc 240
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<210>2
<211>764
<212>DNA
<213>鸡(Gallus gallus)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(764)
<223>
<400>2
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agacactcaa gattaggctg gattgagctc tgagcacttg atggagctgt agatgtccct 360
tttcatagca ggggagctgg gctagatggc cttcaagagc atctttcagc tcaaacgatt 420
cagcgattca atgattctat gatcattctt gctttctatt cttacagctt tcacaaaacc 480
ataaatagca ctggaaatag taaacccagt tcccttcaat ttcaacacaa aaattgggaa 540
actttaagga ctggtggaat ttgcttagaa ttatttgtaa ccttcagaca attttcttca 600
cttcaataat catttttcac tctgagcctt ccagtgttat ctgttacaca atctgtatac 660
actggtactg cattgcatca tgtaaaagga cctctgtttt tctcctttct agagcacttg 720
gttctttcca ggacttttta atcccctacc tcaagcaagc ccat 764