含有北玄参提取物的皮肤外用组合物以及该组合物用作皮肤保湿化妆品的应用 【技术领域】
本发明涉及用于缓解皮肤干燥症状的皮肤外用组合物，以及该外用组合物用作皮肤保湿化妆品的应用，所述外用组合物含有北玄参提取物(Scrophularia buergeriana Miq)作为主要成分并且还含有茯苓提取物(Poriacocos Wolf)。更确切地说，本发明涉及一种含有北玄参提取物和茯苓提取物作为有效成分的皮肤外用组合物，以及该外用组合物用作皮肤保湿化妆品的应用，当在皮肤上使用所述外用组合物时，该外用组合物能够正常地恢复和维持皮肤角质化细胞的分化，因此能够预防或缓解由不完全的表皮分化所导致的皮肤干燥症状、过敏症状以及接触性皮炎。
背景技术
皮肤最外层的表皮最重要的功能是保护机体免受各种外部刺激(物理和化学刺激，包括化学物质、污染物、干燥的环境和紫外线)的功能以及防止机体内的水份通过皮肤过度蒸发的功能。只有在正常形成由角质化细胞组成的角质层(角质化层)时，才能够维持这样的保护性功能。作为表皮最外层的角质层是由角质化细胞形成的并由分化的角质化细胞和环绕在角质化细胞周围的脂质所组成(J.Invest.Dermato1.1983；80：44-49)。角质化细胞是通过以下过程形成的特定细胞：在表皮的最底层连续增殖的基底层细胞经历逐步的形状及功能的改变，并升至皮肤的表层。在给定时间的传代之后，死亡的角质化细胞从皮肤上去除掉并由新生的角质化细胞代替，这个重复的过程称作“表皮细胞的分化或角质化”。在角质化过程中，在形成角质层的过程中角质化细胞产生具有天然保湿因子(NMF)的细胞内脂质(神经酰胺、胆固醇和脂肪酸)，从而使角质层具有作为皮肤屏障的硬度和弹性。
然而，由于生活习惯的原因(例如，过度的洗涤或沐浴)、环境因素(例如，干燥的环境或污染物)以及内在疾病(过敏性皮肤或老化皮肤)，角质层易于丧失其自身的功能。事实上，患有由多种因素引发的干燥皮肤综合症和由干燥皮肤综合症引发的多种紊乱的患者近年来逐渐地增多。因此，为了将皮肤的水含量维持在合适的水平，进行了很多的研究，这些研究的焦点都在于提供外源水源或者防止机体内水份的流失，实际上，已经开发出了多种具有持水能力的保湿剂并主要在化妆品领域内进行了应用。
然而，由于对人体有害的环境因素的不断增加以及老龄化人口的迅速增长，出现以下皮肤状况的人数逐渐地增多：角质层周转率降低，角质化细胞合成脂质的能力下降，或者表皮中的细胞的正常分裂、生长和分化不稳定，从而导致角质层中保湿因子和脂质的量减少，因此，无法维持角质层的正常功能，即，皮肤屏障功能受到损害。
表皮细胞的这种不正常的分裂和分化能够导致多种皮肤疾病，包括干燥皮肤(干燥症)、过敏症以及牛皮癣。当在皮肤上使用具有持水功能的保湿剂时，可以显著地减少这些皮肤疾病，但很难对这些皮肤疾病进行彻底地治疗。
【发明内容】
因此，本发明人开发了调控表皮细胞分化的物质并尝试着在皮肤上使用开发的物质，以诱导角质层的正常生成的去除并增强天然保湿因子在角质层中的生成和维持，从而彻底地预防或治疗干燥皮肤疾病，包括干燥皮肤(干燥症)及由此引发的过敏症。
本发明进行了与表皮细胞分化有关的研究，结果发现北玄参(Scrophularia buergeriana Miq)提取物和茯苓(Poria cocos Wolf)提取物具有促进角质化细胞分化的功能；另外，还具有能够促进细胞内脂质神经酰胺合成的功能；以及激活由过氧化物酶增殖子激活的受体-α(PPAR-α)(一种核激素受体)的功能，该受体-α能够促进角质化细胞的分化和抑制角质化细胞的增殖，并且所述受体-α能够增加细胞内脂质的合成，通过这些发现，本发明的发明人更加确认了北玄参(Scrophularia buergeriana Miq)提取物和茯苓(Poria cocos Wolf)提取物的作用。另外，本发明的发明人还发现，当将这些提取物以皮肤外用制剂的形式施用于动物皮肤上时，它们增强了皮肤的屏障功能，从而完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是促进角质化细胞在表皮内的正常分化以诱导以下作用：(1)正常诱导作为形成角质层和皮肤屏障的主要骨架成分的角质化细胞的作用，从而使皮肤免受外部的物理刺激；(2)促进环绕着角质化细胞以形成皮肤屏障的脂质的生物合成的作用，从而加强了皮肤屏障。本发明的另一个目的在于提供一种用于皮肤保湿的外用组合物，该组合物通过提取物的作用增强了皮肤的弹性和硬度从而能够提高皮肤的持水能力，因此，使皮肤能够顺畅地行使其原始的保护功能，此外，该组合物还能够减少由皮肤干燥引起的细微皱纹的形成，从而预防和治疗了皮肤干燥疾病，例如，干燥皮肤或过敏症。
为了实现上述目的，本发明提供了一种皮肤保湿外用组合物，其中，该外用组合物含有北玄参提取物作为活性成分。
除了含有北玄参提取物以外，根据本发明的组合物还可以含有茯苓提取物。
所述皮肤保湿外用组合物优选含有0.0001-30重量％的北玄参提取物。
同样，所述皮肤保湿外用组合物优选用于增强皮肤的屏障功能、促进角质化细胞的分化、促进神经酰胺的产生或激活PPAR-α。
此外，本发明还提供了含有北玄参提取物作为活性成分的外用组合物用作皮肤保湿化妆品的应用。
下文中，将对本发明进行详细的描述。
本发明中所用的北玄参(Scrophularia buergeriana Miq)是一种属于玄参科的多年生植物，分布在韩国、中国、日本等国家，其根部在中医中被用作药材。北玄参含有作为主要成分的玄参素(Scrophularine)、植物甾醇(phytosterol)、植物固醇(Phytosterine)，此外，北玄参还含有糖类、精油(essential oils)、脂肪酸等。北玄参具有退烧和改善心肌功能的作用，因此，被用于治疗咽喉痛、扁桃体炎、结膜炎、淋巴腺炎等，并且能够有效地抵抗具有发热症状的各种疾病。
本发明中所用的茯苓(Poria cocos Wolf)是多孔菌科(Polyporaceae)家族中的一员，生活在松树的根部。茯苓是直径为约30-50cm的菌块，其外部与松树皮一样粗糙，其内部的颜色为白色或粉红色。生活在松树的根部的茯苓的内部为白色，生活在日本松树的根部的茯苓的内部为粉红色。茯苓的三萜烯组分被报道具有抗呕吐和抗炎症等的作用，茯苓的菌核含有相当于茯苓干重的93％的β-茯苓聚糖。茯苓还含有三萜系化合物、茯苓酸(pachymicacid)、块苓酸(tumulosic acid)、松苓新酸(3β-羟基羊毛甾-7，9，24-三烯-2-酸，3β-hydroxylanosta-7，9 and 24-triene-2-acid)，此外，还含有角素、固醇、卵磷脂、腺嘌呤、组氨酸、胆碱、脂肪酶、蛋白酶等。此外，茯苓还长期地被用作补药。药理学结果揭示了茯苓具有利尿作用、降血糖作用以及镇静作用，并且还具有免疫激活作用。此外，对妇科疾病也具有效果。
在本发明的皮肤保湿外用组合物中，以所述组合物的总重量为基准，所述北玄参提取物的量或所述北玄参提取物与茯苓提取物的组合的量为0.0001-30重量％。如果所述提取物的含量小于0.0001重量％，则所述提取物不能够提供皮肤保湿的作用、增强皮肤的屏障功能的作用、以及诱导皮肤角质化细胞分化的作用；如果所述提取物的含量大于30重量％，则含量的增加并不能够显著地增强所述提取物的作用。
根据本发明的皮肤保湿外用组合物可以作为化妆品组合物或药物组合物，本发明组合物的组成将在下文中进行更加详细的描述。
除了上文中描述的北玄参提取物和茯苓提取物以外，根据本发明的化妆品组合物可以含有其它组分，这些其它组分能够增强本发明组合物的主要作用，只要不对本发明组合物的主要作用产生不利影响即可。
虽然，上文描述的本发明北玄参提取物和茯苓提取物优选被制成化妆品产品并被施用在皮肤上，但它们也可以被制成常规的外用制剂形式。
包括含有上述北玄参提取物和茯苓提取物的本发明组合物的化妆品组合物可以为溶液、乳剂或粘性混合物的形式。
为了提供使皮肤保湿的作用、增强皮肤的屏障功能的作用、或诱导皮肤角质化细胞分化的作用，本发明的化妆品组合物可以在多种化妆品中使用。本发明的组合物的产品的例子包括：化妆品，例如，乳剂(creams)、洗剂和皮肤洗剂(lotions and skin lotions)、清洁泡沫(cleansing foams)、洗面奶(face cleansers)、香皂(soaps)、美容液(beauty solutions)等等。
特别地，对本发明的化妆品组合物的剂型没有特别的限制，所述化妆品组合物的剂型的例子可以包括：皮肤洗液(skin lotion)、收敛洗液(astringentlotion)、乳液(milk lotion)、营养霜(nourishing cream)、按摩霜(massagecream)、香精(essence)、眼霜(eye cream)、眼部香精(eye essence)、填充剂(pack)、凝胶(gel)、粉剂(powder)、粉底(makeup base)、打底剂(foundation)、软膏(ointment)、贴剂(patch)、美容液(beauty solution)、清洁泡沫(cleansing foam)、清洁霜(cleansing cream)、清洁水(cleansingwater)、身体洗液(body lotion)、身体用霜剂(body cream)、身体用油(body oil)、身体用香精(body essence)、洗发剂(shampoo)、清洗剂(rinse)、身体清洁剂(body cleanser)、香皂(soap)、染发剂(hair dye)、以及喷雾剂(spray)等等。
在各种剂型的化妆品组合物中，除了上述北玄参提取物和茯苓提取物以外，本领域技术人员根据所述化妆品组合物的剂型或使用目的还可以容易地选择其它适合的组分。
本发明的药物组合物还可以含有在药物组合物的制备中常用的合适的载体、赋形剂或稀释剂。
根据常规的方法，含有上述北玄参提取物和茯苓提取物的本发明药物组合物可以被制成各种适于药物应用的制剂，包括外用制剂，例如，软膏(ointments)、凝胶(gels)、霜剂(creams)、贴剂(patches)或喷雾剂(sprays)。每种制剂均可以含有对于该种制剂需要的且合适的各种基底材料和添加剂，本领域的技术人员可以容易地对这些组分的种类和用量进行选择。
根据患者的年龄、性别、体重和疾病状况以及给药方式，可以对所述制剂的剂量进行调整，但优选情况下，每种所述制剂的给药量为1.0-3.0毫升/天，每天1-5次，持续至少一个月。
同时，本发明的北玄参提取物和茯苓提取物具有很小或根本不具有毒副作用，因此，可以安全地用于长期的保护目的。
本发明的皮肤保湿外用组合物的特征在于，除了含有北玄参提取物以外，它还含有茯苓提取物。本发明的皮肤外用组合物可以常规地诱导作为形成角质层和皮肤屏障的骨架组分的角质化细胞，从而使皮肤能够免受外部的物理刺激。此外，本发明的外用组合物能够促进环绕于角质化细胞来形成皮肤屏障的脂质的生物合成，从而增强皮肤的屏障作用。由于这些作用的优点，含有所述北玄参提取物和茯苓提取物的本发明皮肤外用组合物能够有益地用作皮肤保湿的化妆品或药物组合物，以防止或缓解由表皮的不完全分化导致的干燥皮肤、过敏性皮炎、接触性皮炎或牛皮癣，并增强皮肤的屏障功能以及诱导皮肤角质化细胞的分化。
【具体实施方式】
下面，参考实施例和测试实施例对本发明进行更加详细的描述，但本发明的范围并不限制于这些实施例。
如本发明参考实施例1-6中所描述的，通过使用提取溶剂分别从冷冻干燥的北玄参和茯苓中提取有效成分并对提取物进行浓缩和干燥，制备得到北玄参提取物和茯苓提取物。
在北玄参中加入北玄参重量的1-15倍的水、低碳醇(如甲醇或乙醇)、乙酸乙酯或正己烷。然后，将北玄参于50-100℃加热3-24小时或于所述溶剂中在4-25℃浸渍3-4天，来提取北玄参的有效成分。此外，将无水的或含水的甲醇和乙醇提取物溶解于合适量的水与乙酸乙酯、丁醇或己烷的混合溶剂中并放置以使其分层，然后分离出上层。使用真空蒸发器对由此得到的提取物进行浓缩并进行干燥，并将干燥的提取物溶解在溶剂(例如，水、乙醇或1，3-丁二醇)中。
通过与上述描述的提取北玄参的方法相同的方法对干燥粉末状的茯苓进行提取。特别地，在干燥粉末状的茯苓中加入茯苓重量的1-15倍的水、低碳醇(例如甲醇或乙醇)、乙酸乙酯或正己烷，然后将加入后的茯苓在50-100℃下加热提取3-24小时或者浸渍在所述溶剂中于4-25℃下提取3-4天，以提取出茯苓的有效成分。此外，将无水的或含水的甲醇和乙醇提取物溶解于合适量的水与乙酸乙酯、丁醇或己烷的混合溶剂中并放置以使其分层，然后分离出上层。使用真空蒸发器对由此得到的提取物进行浓缩并进行干燥，并将干燥的提取物溶解在溶剂(例如，水、乙醇或1，3-丁二醇)中。
因为在以下参考实施例中通过参考实施例1的提取方法得到的提取物具有最高的效力，所以在以下测试实施例中仅对参考实施例1的提取物进行论述，以证明本发明的北玄参提取物和茯苓提取物的作用。此外，参考实施例2-6中提取物的效力通常比参考实施例1中提取物的效力低约10-50％，本发明的范围包括所有的参考实施例1-6中的提取物。
参考实施例1：草药药材水提取物的制备
分别将200g的冷冻干燥的北玄参和茯苓(购自Kunwha制药有限公司，韩国)碾碎，并在其中加入10倍重量的水。然后，在充分振荡的条件下于80℃对所述草药药材提取18小时。将提取物冷却至室温并用滤纸过滤，分别在各滤液中加入4kg的乙醇并放置48小时。然后，过滤该溶液，并分别将形成的各沉淀物溶解在2kg的蒸馏水中并再次进行过滤。在真空蒸发器中对最终的滤液进行浓缩，由此获得北玄参和茯苓的水提取物。
参考实施例2：草药药材乙醇提取物的制备
分别将200g的冷冻干燥的北玄参和茯苓加入到10倍重量的70％的乙醇中并在80℃加热2小时以提取其有效成分。将提取物在室温下放置2天以沉淀杂质，然后将提取物用滤纸过滤两次。在真空蒸发器中对滤液进行浓缩，由此获得北玄参和茯苓的乙醇提取物。
参考实施例3：草药药材甲醇提取物的制备
分别将200g的冷冻干燥的北玄参和茯苓加入到10倍重量的甲醇中并在70℃加热2小时以提取其有效成分。将提取物在室温下放置2天以沉淀杂质，然后将提取物用滤纸过滤两次。在真空蒸发器中对滤液进行浓缩，由此获得北玄参和茯苓的甲醇提取物。
参考实施例4：草药药材的己烷和乙酸乙酯提取物部分(fraction)
分别将在参考实施例3中制备的北玄参提取物和茯苓提取物加入并完全悬浮在20倍重量的水和己烷(1∶1)的混合溶剂中。然后，分别将各悬浮液在室温下放置1天以使其分层。仅分离出上部的己烷层并在真空蒸发器内进行浓缩，由此分别获得北玄参和茯苓的己烷提取物部分。
将下部的水层加入到2倍重量的乙酸乙酯溶剂中并进行振荡，然后在室温下放置1天以使其分层。将上部的乙酸乙酯层分离出并在真空蒸发器中浓缩，由此分别获得北玄参和茯苓的乙酸乙酯提取物部分。
参考实施例5：草药药材的丁醇提取物部分
将在参考实施例4中获得乙酸乙酯提取物部分的过程中得到的下部水层加入至2倍重量的丁醇中，并用与参考实施例4中的方法相同的方法进行处理，由此分别获得北玄参和茯苓的丁醇提取物部分。
参考实施例6：草药药材的水提取物部分
将在参考实施例5中得到的各水层在真空蒸发器中进行浓缩，由此分别获得北玄参和茯苓的水提取物部分。
分别将北玄参提取物和茯苓提取物或者浓缩的北玄参提取物和茯苓提取物以30％(重量/重量)的浓度溶解于水中、以5％(重量/重量)的浓度溶解于1，3-丁二醇中、或者以10％(重量/重量)的浓度溶解于乙醇中。将各溶液加入到化妆品制剂中，例如皮肤洗液、牛奶状洗液、香精或填充剂中。
为了证明本法发明参考实施例1中得到的北玄参提取物和茯苓提取物的效力，进行以下试验。在下述实施例3中，将北玄参提取物和茯苓提取物彼此以1∶1的比例混合。
表1
测试实施例1：对人角质化细胞分化的诱导
为了检测北玄参提取物和茯苓提取物促进细胞分化的效力，通过以下方法进行测试：(1)通过吸光度来检测在角质化细胞分化过程中形成的角质化外膜(comified envelops，CE)的量的方法；(2)使用同位素来检测在角质化细胞分化过程中形成的角质化外膜(comified envelops，CE)的量的方法。
在第一种检测吸光度的测试中，将原代培养的人角质化细胞放置在培养瓶中，并允许附着在培养瓶的底部。然后将如下表2所示的试验材料以表2所示的浓度加入到培养基中，并培养细胞5天直至细胞的汇合度(confluence)达到70-80％。收集细胞并使用磷酸盐缓冲液(PBS)进行清洗。然后，将含有2％的十二烷基磺酸钠(SDS)的1mM Tris-HCl(pH 7.4)和20mM的二硫苏糖醇(DTT)加入到细胞中，然后对细胞进行超声处理、煮沸处理和离心处理。将离心的沉淀物再次悬浮在1ml的PBS中并检测340nm处的吸光度。同时，取超声处理后的溶液部分，检测其中的蛋白质含量并将取样的样品作为评价细胞分化的参照。分别使用低钙处理的组(0.03mM)和高钙处理的组(1.2mM)作为阴性对照组和阳性对照组，向低浓度钙中添加试验材料而进行的测试结果如表2和图1所示。
在第二种使用同位素来检测角质化外膜的量的测试中，将原代培养的人皮肤细胞系放置在24孔培养盒中，并允许附着在培养盒的底部。然后将1uCi/ml的[35S]-甲硫氨酸与如下表2所示的试验材料以表2所示的浓度加入到培养基中，并培养细胞2天直至细胞的汇合度(confluence)达到70-80％。收集细胞并使用磷酸盐缓冲液(PBS)进行清洗。然后，将含有2％的十二烷基磺酸钠(SDS)的500μl的PBS和20mM的二硫苏糖醇(DTT)加入到细胞中，吸取细胞溶液。然后，将100μl的细胞溶液分装在各个闪烁管(scintillation vial)中，并在管中加入2.5ml的鸡尾酒溶液(cocktail solution)，通过液体闪烁计数法(LSC)来检测细胞溶液的放射性，以确定总蛋白量。根据确定的总蛋白量，将相应量的各试验材料用25-mm的过滤器过滤。只将残留在过滤器上的不溶性蛋白质取下，过滤器本体置于闪烁管上。在管中加入2.5ml的鸡尾酒溶液，对过滤器进行完全的溶解，使用液体闪烁计数法来检测溶液的放射性。检测到的值除以上述制备的总的蛋白量，得到在分化过程中形成的CE的量。检测结果如表2和图2所示。
表2
如上表2所示，本发明的北玄参提取物和茯苓提取物促进了角质化细胞和人皮肤细胞系的分化。此外，还可以看出，使用北玄参提取物和茯苓提取物的混合物比单独使用北玄参提取物更加有效。
测试实施例2：人皮肤细胞系中转谷氨酰胺酶的表达
将人皮肤细胞系以5×104个细胞/孔的浓度置于96孔细胞培养板的各个孔中，并允许附着在底部24小时。使用试验材料的乙酰胆碱(Ach)对附着的细胞系进行处理，两天后移出培养基，将细胞于-20℃下保存。通过重复的冻融两次使细胞破裂，然后使用丙酮∶乙醇的混合物(1∶1，v/v)进行处理，在4℃下放置30分钟固定细胞。放置细胞以蒸发有机溶剂并使用1％的胎牛白蛋白进行阻断，加入转谷氨酰胺酶(第一抗体)和HRP(辣根过氧化物酶)抗鼠第二抗体和邻苯二胺(OPD)以使细胞显色。通过检测490nm处的吸光度来确定细胞中转谷氨酰胺酶的表达，通过检测630nm处的背景对检测进行校正。分别使用低钙处理的组(0.03mM)和高钙处理的组(1.2mM)作为阴性对照组和阳性对照组，向低浓度钙中添加试验材料而进行的测试结果如表3和图3所示。
表3
从上表3和图3可以看出，本发明的北玄参提取物和茯苓提取物使转谷氨酰胺酶的表达水平比阴性对照组高两倍以上，与阴性对照相比显示出对转谷氨酰胺酶的表达水平具有显著的提高，因此，可以看出，本发明的北玄参提取物和茯苓提取物能够提高转谷氨酰胺酶的表达。此外还可以看出，使用北玄参提取物和茯苓提取物的混合物比单独使用北玄参提取物更加有效。
测试实施例3：皮肤屏障恢复以及裸鼠皮肤保湿能力的测试
为了评价北玄参提取物和茯苓提取物在由于长期皮肤损伤引起的皮肤屏障功能受损的恢复中的效力，进行以下试验。使用丙酮在8-10周鼠龄的裸鼠的背部上进行涂抹，每天两次共5天，以破坏皮肤的屏障功能。然后，使用蒸发计检测小鼠皮肤的经表皮水损失(TEWL)，当在给定的时间间隔内检测鼠皮肤的经表皮水损失(TEWL)时，分别使用赋形剂(丙二醇∶乙醇＝7∶3)和含有5重量％的北玄参提取物/茯苓提取物的混合物的试验材料仅在具有经表皮水损失高于40g/m2/hr的皮肤的试验动物上施用，施用剂量为每5平方厘米皮肤200μl，每天两次共3天。在给定的时间间隔测量小鼠皮肤的TEWL。检测结果如图4所示。
如图4所示，在使用北玄参提取物/茯苓提取物的混合物处理的组中，受损的皮肤屏障功能恢复的比赋形剂组更快。此外，在检测经表皮水损失(TEWL)的过程中，使用水份测试仪Corneometer(Courage Khazaka公司，德国)检测皮肤的含水量，结果显示，使用北玄参提取物/茯苓提取物处理的组中的皮肤含水量高于用赋形剂处理的组中的皮肤含水量。因此可以看出，在使用北玄参提取物/茯苓提取物的混合物处理的组的情况下，皮肤含水量增加并恢复了受损的皮肤屏障功能。检测结果如图5所示。
测试实施例4：发明的提取物在增加人类皮肤的表皮脂质(总神经酰胺)的生成中的效力的试验
为了评价北玄参提取物和茯苓提取物在增加人类皮肤的脂质的合成中的效力，进行以下试验。试验材料的组合物含有0.5％的聚羧乙烯ETD2020、0.45％的TEA 0.45％、5％的试验材料以及余量的去离子水。在12个成年男性和女性的手臂上，标记具有与50ml的聚丙烯锥管的大小相适应的大小的区域，然后向受试者施用20μl的各对照组、北玄参提取物、以及北玄参提取物/茯苓提取物的混合物。此处，将受试者分为两组，通过以下方式在施用的第3天和第11天从受试者体内提取脂质，并对提取的脂质进行分析。特别地，使用供应的水清洗手臂，然后使用810魔术胶带剥离一次。然后，使用作为容器的50ml的经剪切的聚丙烯锥管将1ml的环己烷/乙醇(4∶1)的混合物加入到手臂上，振荡约1分钟，然后移至新的管中。然后，将1ml的环己烷/乙醇(1∶1)的混合物加入到管中并振荡约1分钟，然后再转移至新管中。在50℃下使用氮气将管中的内含物干燥，溶解并保存在500μl的氯仿∶甲醇(2∶1)中。使用自动薄层层析加样器-4(CAMAG)将每个样品加样至硅胶薄层层析(薄层层析，TLC)板上，然后使用AMD(自动多重展开仪)在具有如下表4所示的组合物比例的展开溶剂中展开。
表4
氯仿 甲醇 水 乙酸 己烷 二乙醚 石油醚 溶剂迁移距离(cm) 第一 40 10 1 3.0 第二 190 9 1 6.5 第三 2 12 3 7.5 第四 100 顶端
在TLC板展开后，使用TLC扫描仪-II光密度计(CAMAG)在570nm波长处检测各条带的大小。相对于未处理组的神经酰胺的产量(表示为100％)的各处理组中的神经酰胺的产量如表5和图6所示。
表5
如表5和图6所示，在处理后的3天和11天，分别用北玄参提取物、茯苓提取物、以及北玄参提取物/茯苓提取物的混合物处理的组中神经酰胺的产生比使用阴性对照(未处理组/赋形剂)处理的组中以及阳性对照(丙三醇)处理的组中的神经酰胺的产生有显著的增加。这表明北玄参提取物和茯苓提取物能够使神经酰胺的产生增加。此外还可以看出，使用北玄参提取物和茯苓提取物的混合物比单独使用北玄参提取物更加有效。
测试实施例5：关于PPAR-α(过氧化物酶增殖子激活的受体-α)在促进皮肤细胞分化、抑制皮肤细胞增殖、促进脂质的生物合成、以及抗炎症中起到的激活作用的测试
在含有碳/葡聚糖处理的10％的胎牛血清的DMEM(达尔伯克氏改良的伊格尔氏培养基)中次代培养猴肾上皮细胞系CV-1(ATCC CCL 70)。使用不含酚红的培养基以避免酚红的雌激素作用。使用的质粒为以PPRE(PPARs响应元件)作为启动子的质粒，且以萤火虫荧光素酶基因作为报告基因，被PPAR(含有PPAR-以及配体结合的PPAR-的基因)激活的PPRE与在普通培养条件下表达的通用启动子相连；以及使用连接了花虫荧光素酶基因的参比质粒。
以每孔5×104个细胞的浓度，将CV-I细胞置于24孔的微量滴定板上培养24小时。然后，将上述三种质粒基因进行瞬时转染。培养24小时后，使用1倍的PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤培养板并用多种浓度的候选配体进行处理。再次培养24小时后，使用1倍的PBS洗涤培养板并用1倍的PLB(惰性裂解缓冲液)裂解细胞，并使用Dual-LuciferaseR报告分析系统试剂盒检测荧光素酶的活性。
在这个实验中，阳性对照为已知为最有效PPAR-α配体的Wy-14,643，阴性对照为用于溶解样品的乙醇和未处理组。结果如图7所示。如图7所示，使用北玄参提取物和茯苓提取物的混合物比单独使用北玄参提取物对于激活PPAR-α更加有效。
从上述结果中可以看出，北玄参提取物和茯苓提取物在促进皮肤细胞分化、抑制皮肤细胞的增殖、角质化细胞的增殖、受损的皮肤屏障功能的恢复、以及提高皮肤的保湿能力中显示出了显著效力。
下面，将对本发明组合物的制剂实施例进行描述，但这些制剂实施例仅是说明的目的，并不限制本发明的范围。
制剂实施例中的草药提取物为实施例1-3中的任意一种提取物。
制剂实施例 1：肥皂制剂
草药提取物：1.00(％)
油和脂肪：适量
氢氧化钠：适量
氯化钠：适量
香料：少量
使用纯化水制成总量为100％。根据上述的组合比例制备肥皂。
制剂实施例2：洗液制剂
草药提取物：3.00(％)
L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁：1.00
水溶性胶原(1％的水溶液)：1.00
柠檬酸钠：0.10
柠檬酸：0.05
甘草根提取物：0.20
1，3-丁二醇：3.00
使用纯化水制成总量为100％。根据上述的组合比例制备洗液。
制剂实施例3：霜剂制剂
草药提取物：1.00(％)
单硬脂酸聚乙二醇酯：2.00
自乳化的单硬脂酸甘油酯：5.00
十六醇：4.00
角鲨烯：6.00
三-2-甘油基己酸乙酯：6.00
鞘糖脂：1.00
1，3-丁二醇：7.00
使用纯化水制成总量为100％。根据上述的组合比例(％)制备霜剂。
制剂实施例4：填充剂制剂
草药提取物：5.00(％)
聚乙烯醇：13.00
L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁：1.00
月桂酰羟脯氨酸：1.00
水溶性胶原质(1％的水溶液)：2.00
1，3-丁二醇：3.00
乙醇：5.00
使用纯化水制成总量为100％。根据上述的组合比例(％)制备填充剂。
制剂实施例5：美容液制剂
草药提取物：2.00(％)
羟乙基纤维素(2％的水溶液)：12.00
黄原胶(2％的水溶液)：2.00
1，3-丁二醇：6.00
浓缩甘油：4.00
透明质酸钠(1％的水溶液)：5.00
使用纯化水制成总量为100％。根据上述的组合比例(％)制备美容液。
工业实用性
如上所述，本发明的组合物能够正常地修复及维持皮肤角质化细胞的分化，因此，能够预防或缓解由不完全的表皮分化所导致的干燥皮肤症状、过敏症状以及接触性皮炎。