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抗CD20治疗组合物和方法
发明领域
本发明提供了使用CD20特异性结合分子用于治疗涉及异常B细胞活性的疾病的材料和方法。本文公开的组合物用于治疗和诊断B细胞病症，例如B细胞恶性肿瘤和自身免疫疾病。
发明背景
以其通常作用，人免疫系统保护机体不受外源物质和病原体的损害。免疫系统保护机体的一种方法是通过产生称为B淋巴细胞或B细胞的专门细胞。B细胞产生与外源物质或病原体结合并且在某些情况下介导外源物质或病原体的破坏的抗体。
然而，在某些情况下，人免疫系统和特别地人免疫系统的B淋巴细胞出错并且导致疾病。存在涉及B细胞不受控制的增殖的众多癌症。还存在涉及B细胞抗体产生的众多自身免疫疾病，所述抗体不是与外源物质和病原体结合而是与机体的部分结合。此外，存在众多自身免疫疾病和炎性疾病，在其病理学中涉及B细胞，例如通过不适当的B细胞抗原呈递给T细胞或通过涉及B细胞的其他途径。例如，在B细胞方面有缺陷的自身免疫倾向小鼠不发展自身免疫肾疾病、脉管炎或自身抗体。(Shlomchik等人，J Exp.Med.1994，180：1295-306)。有趣的是，当实验诱导时，具有B细胞但在免疫球蛋白产生方面有缺陷的这些自身免疫倾向小鼠的确发展自身免疫疾病(Chan等人，J Exp.Med.1999，189：1639-48)，指出B细胞在自身免疫疾病发展中起整体所需的作用。
可以通过在其细胞表面上的分子鉴定B细胞。CD20是通过单克隆抗体鉴定的第一种人B细胞谱系特异性表面分子。它是非糖基化的、疏水性35kDa B细胞跨膜磷蛋白，其氨基和羧基末端位于细胞内。Einfeld等人，EMBO J.1988，7：711-17。CD20由所有正常成熟的B细胞表达，但不由前体B细胞或浆细胞表达。CD20的天然配体仍未鉴定，并且仍未完全了解CD20在B细胞生物学中的作用。
特定抗CD20单克隆抗体可以影响B细胞的活力和生长。(Clark等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1986，83：4494-98)。CD20的广泛交联可以在B淋巴瘤细胞系中诱导凋亡(Shan等人，Blood 1998，91：1644-52)，并且已报告CD20在细胞表面上的交联增加信号转导的量级并且增强信号转导的动力学，例如，如通过测量细胞基质的酪氨酸磷酸化所检测出的。(Deans等人，J.Immunol.1993，146：846-53)。因此，除通过补体和ADCC机制的细胞耗尽外，在体内通过特定CD20单克隆抗体的Fc受体结合可以通过CD20交联促进恶性B细胞的凋亡，与SCID小鼠模型中人淋巴瘤的CD20治疗的有效性可能依赖于通过CD20单克隆抗体的Fc受体结合的理论一致(Funakoshi等人，J.Immunotherapy 1996，19：93-101)。在CD20多肽中的多个跨膜结构域的存在(Einfeld等人，EMBO J.1988，7：711-17；Stamenkovic等人，J.Exp.Med.1988，167：1975-80；Tedder等人，J.Immunol.1988，141：4388-4394)阻止抗体结合后的CD20内在化，并且这被认为是关于B细胞恶性肿瘤治疗的重要特征，当将鼠类CD20单克隆抗体1F5注入具有B细胞淋巴瘤的患者内时，导致恶性细胞的显著耗尽和部分临床应答(Press等人，Blood 1987，69：584-91)。
因为正常成熟B细胞也表达CD20，所以抗CD20抗体疗法耗尽正常B细胞(Reff等人，Blood 1994，83：435-445)。然而，治疗完成后，正常B细胞可以通过CD20阴性B细胞前体得到再生；因此，用抗CD20疗法疗法的患者不经历显著的免疫抑制。
CD20由B细胞起源的恶性细胞表达，包括B细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。CD20不由前B细胞的恶性肿瘤表达，例如急性成淋巴细胞性白血病。CD20因此是用于治疗B细胞淋巴瘤、CLL和其中B细胞涉及疾病病因学的其他疾病的良好靶。其他B细胞病症包括其中自身抗体在B细胞分化成浆细胞的过程中产生的自身免疫疾病。
靶向优先在肿瘤细胞表面上表达的分子的单克隆抗体(mAb)的使用目前是良好确定的治疗策略，其中至少7种不同的mAb治疗得到批准并且目前用于癌症疗法中：(RITUXAN)、曲妥珠单抗、阿仑珠单抗、西妥昔单抗、帕木单抗、贝伐珠单抗和吉妥珠单抗奥佐米星。此种mAb治疗经由2种不同机制介导其抗肿瘤活性。第一种机制涉及mAb介导的关键受体-配体/反受体(counter-receptor)相互作用的抑制，所述相互作用促成肿瘤生长，并且第二种机制依赖于宿主的免疫系统的效应子组分(例如能够介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的FcR⁺效应子细胞)和人因子(例如能够介导补体依赖性细胞毒性(CDC)的补体)的参与。在后面一种情况下，mAb治疗必须具有与效应子细胞和补体上的FcγRs相互作用的能力。除EGFR靶向的帕木单抗外，目前在癌症疗法中使用的5种免疫治疗mAb各自具有衔接免疫系统的效应子组分的能力。
RITUXAN是批准在癌症中临床使用的第一种mAb。RITUXAN是重组小鼠人IgG1嵌合mAb，其中鼠类抗CD20mAb的重链和轻链的可变结构域与人IgG1的恒定区融合。
此外，CD20也已被放射免疫治疗试剂靶向以治疗B细胞相关疾病。一种治疗由以用于治疗B细胞淋巴瘤的放射性核素形式(例如，¹³¹I标记的抗CD20抗体)以及用于减轻由前列腺和乳腺癌转移引起的骨痛的⁸⁹Sr标记形式制备的抗CD20抗体组成(Endo，Gan To Kagaku Ryoho1999，26：744-748)。
在一项研究中，RITUXAN就用于治疗具有系统性红斑狼疮(SLE)的18个患者(其为非免疫抑制患者)的安全性、耐受性和初步临床功效进行测试。在治疗的18个患者中，6个患者接受100mg/m²的RITUXAN的1次输注(低剂量)，6个患者接受375mg/m²的RITUXAN的1次输注(中等剂量)，并且6个患者接受375mg/m²的RITUXAN的每周4次输注(高剂量)。即使在低或中等剂量下，12个患者中的3个(25％)在2个月时发展升高水平的人抗嵌合抗体(HACA)。
因此，需要发展用于治疗的新型CD20特异性结合分子，优选地，当施用于并非免疫抑制的患者时，不引起HACA反应或引起HACA反应的潜力减少的新型CD20特异性结合分子。此外，尽管已存在对基于抗体的疗法进行的广泛研究，但本领域仍需要治疗与异常B细胞活性相关的疾病的组合物和方法。
发明概述
本发明涉及在有此需要的受试者中诊断和治疗B细胞介导疾病和病状中有用的新型CD20结合分子，所述疾病和病状包括但不限于B细胞癌症、类风湿性关节炎和红斑狼疮。在各种实施方案中，本发明提供了新型重链CDR序列，轻链CDR序列，包含CDR序列的新型可变结构域序列和包含新型CDR或可变结构域序列的CD20结合分子，包含CDR、含其的结合结构域或分子的核酸、载体、宿主细胞、组合物和试剂盒。在某些实施方案中，包含新型CDR序列或可变结构域的CD20结合分子是抗体或其抗原结合片段。在其他实施方案中，CD20结合分子是小分子免疫药物SMIP。在某些实施方案中，抗体或SMIP是人源化的，并且包含人序列构架和恒定区序列。本发明的CD20结合分子结合在细胞上的CD20，显示CDC和ADCC活性，耗尽血液、骨髓和淋巴结中的CD19+B细胞，减少B细胞淋巴瘤肿瘤生长，和/或减少播散性淋巴瘤的进展和作用。本发明的CD20结合分子还用于例如在来自受试者的生物样品中检测和定量CD20或表达其的细胞的存在。

附图简述
图1。抗CD20SMIP与原代B细胞的结合。如说明的，将从血沉棕黄层(buffy coat)中分离的原代B细胞与指示浓度的各种抗CD20SMIP一起温育。通过流式细胞术(MFI)使用标记的抗人IgG-PE抗体(Fc特异性的)分析SMIP的结合。相应地，计算每种SMIP的Ec50。
图2。针对人B细胞淋巴瘤的018011(也称为18011或011，这是相同分子)的体外生长抑制作用。
图3A-3B。抗CD20SMIP的补体依赖性细胞毒性测定法。A：将RamosB细胞与抗CD20SMIP在10％人血清(Quidel)的存在下一起于37℃温育3.5小时。通过由细胞释放的LDH(Promega试剂盒)测量细胞死亡。B：将从血沉棕黄层中分离的原代人B细胞(5X10⁵)与抗人CD55抗体(2μg/ml)一起于37℃温育10分钟。随后添加指示浓度的抗CD20SMIP和血清(10％)。温育3.5小时后，通过7-AAD染色和流式细胞术分析评估细胞死亡。
图4A-4B。这些体外研究证实018011以剂量依赖性方式与CD20+B细胞淋巴瘤细胞结合，并且能够造成针对CD20+B细胞淋巴瘤靶细胞的Fc介导的细胞毒性以及补体依赖性细胞毒性。效应子功能性能力的这种证实对于018011抑制人B细胞淋巴瘤生长的能力是重要的。A.018011针对SU-DHL4B细胞淋巴瘤细胞的补体依赖性细胞毒性。B.018011针对BJAB B细胞淋巴瘤细胞的补体依赖性细胞毒性。
图5。抗CD20SMIP的抗体依赖性细胞毒性测定法。BJAB淋巴瘤细胞用CFSE进行标记，随后与SMIP和活化的人PBMC一起温育。细胞用PI进行染色并且通过流式细胞术进行分析。仅CFSE⁺细胞就细胞死亡进行评估。
图6A-6B。A.018011针对SU-DHL4B细胞淋巴瘤的Fc介导的细胞的细胞毒性。B.018011针对Ramos B细胞淋巴瘤的Fc介导的细胞的细胞毒性。
图7。CD20-SMIP针对Ramos B细胞的ADCC。
图8。在非人灵长类动物中外周CD19+B细胞的耗尽。2LM 20-4和2LM 20-4mut Fc都证实在非人灵长类动物中至少与Rituxan相当的外周CD19+B细胞的有效耗尽。
图9。在非人灵长类动物中骨髓CD19+B细胞的耗尽。2LM 20-4和2LM 20-4mut Fc都证实在非人灵长类动物中至少与Rituxan相当的骨髓CD19+B细胞的有效耗尽。
图10。在非人灵长类动物中淋巴结CD19+B细胞的耗尽。2LM 20-4和2LM 20-4mut Fc都证实在非人灵长类动物中至少与Rituxan相当的淋巴结CD19+B细胞的有效耗尽。
图11。IV施用后，在食蟹猴中2LM 20-4和2LM 20-4mut Fc的药代动力学(PK)分析。2LM 20-4和2LM 20-4mut Fc的PK曲线都与Rituxan的PK曲线相当。
图12。018011和利妥昔单抗对Balb/c裸鼠中建立的Ramos皮下异种移植物的作用。
图13。018011和利妥昔单抗对Balb/c裸鼠中建立的Ramos皮下异种移植物的存活分析。
图14。018011、TRU-015和利妥昔单抗对nu/nu裸鼠中建立的Ramos皮下异种移植物的作用。
图15。018011、TRU-015和利妥昔单抗对nu/nu裸鼠中建立的Ramos皮下异种移植物的存活分析。
图16。018011、TRU-015和利妥昔单抗治疗的具有播散性Ramos B细胞淋巴瘤的Scid小鼠的存活分析。
图17。在具有播散性疾病的Scid小鼠的骨髓中对人B淋巴瘤细胞的检测。
图18。018011、TRU-015和利妥昔单抗治疗的具有播散性WSU-DLCL2弥漫性大细胞淋巴瘤的Scid小鼠的存活分析。
图19。静脉内或腹膜内施用018011对Ramos皮下异种移植物生长的作用。
图20。018011和利妥昔单抗对未照射和照射的Ramos皮下异种移植物的作用。
图21A-21C。随着时间的平均肿瘤体积。在研究第0天时，将具有可触知Ramos肿瘤的裸鼠分成处理组(n＝8只/组)，从而使得每个组的平均肿瘤体积是相当的。在第0、2、4、6和8天时用100μg人IgG、TRU-015、018008(也称为18008或008，这是相同分子)、018011或2Lm20-4来I V处理小鼠。在指示天数时用测径器测量肿瘤，并且使用下式计算肿瘤体积：V＝1/2[长度x(宽度)²]。一旦动物由于肿瘤体积超过指定限制而从研究中取出，就推进关于最后一次肿瘤体积的值。结果仅显示到最后一只对照小鼠处死时的第10天。
图22A-22C。在早期时间点时个别小鼠的肿瘤体积。对小鼠进行处理且监控，并且如关于图21中的图例所述测定肿瘤体积。就在第8天(其中所有小鼠都活着的最后时间点)时个别小鼠的肿瘤体积(i)或相对于第0天在第8天时个别小鼠的相对肿瘤体积(ii)而言显示结果。使用单向ANOVA用Dunnett’s多重比较事后检验(用于与huIgG处理的对照的比较)和Tukey’s多重比较事后检验(用于所有其他配对比较)测定组间的显著性差异；指出了关于所有配对比较的p值。
图23A-23C。用TRU-015或HuCD20SMIP处理的小鼠的存活百分比。小鼠进行处理且监控，并且如关于图21中的图例所述测定肿瘤体积。每周至少3次测定肿瘤体积(MWF)，除当研究中剩余的所有小鼠都不具有可触知肿瘤时的时间段期间监控转变成每周一次外。当肿瘤体积达到超过1500mm³(或在星期五时1200mm³)时，处死小鼠。未发现小鼠由于其他原因而死亡或处死。
图24A-24C。随着时间的无肿瘤小鼠百分比。小鼠进行处理且监控，并且如关于图21中的图例所述测定肿瘤体积。如果小鼠不具有可触知肿瘤，那么它视为“无肿瘤的”。每周至少3次测定肿瘤体积(MWF)，除当研究中剩余的所有小鼠都不具有可触知肿瘤时的时间段期间监控转变成每周一次外。
图25A-25C。随着时间的小鼠平均体重。如关于图21中的图例所述处理且监控小鼠。在研究的指示天数时测定体重。
图26。与从Ramos B细胞淋巴瘤异种移植物中分离的细胞结合的018011或利妥昔单抗的流式细胞术评估。
图27。018011针对人B细胞淋巴瘤的体外生长抑制作用。
图28。018011的交联对Ramos B细胞淋巴瘤细胞的活化诱导死亡的作用。
图29是概括示例性人源化SMIP的几个关键位置处的氨基酸残基的表。在“铰链”列下列出的残基描述了关于SEQ ID NO：60的位置220、226、229和230的残基。在“IgG1Fc”列中的残基331指在SEQID NO：61中的残基331。
发明详述
I.定义
为了本发明可以更容易理解，首先定义了特定术语。其他定义在详述的说明书中阐述。
根据本发明的各种实施方案的“CD20结合分子”是包含本文特别例示的人源化CD20结合分子的CD20结合部分的分子。本发明所包括的CD20结合分子类型是抗体或其CD20结合片段。结合分子可以根据本领域的标准方法进行修饰，例如以改善其结合亲和力、改善其特异性、减少其免疫原性、改变其效应子功能和/或改善其在个体体内的可用性。此种修饰可以包括例如氨基酸序列修饰或作为融合蛋白表达。此种融合蛋白也是根据本发明的结合分子。本发明的示例性结合分子是小分子免疫药物(SMIP)。
术语“抗体”指免疫球蛋白或其片段，并且包括包含抗体的抗原结合片段的任何此种多肽。该术语包括但不限于多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、人源化、人、单链、嵌合、合成、重组、杂交、突变、移植和体外产生的抗体。
术语“抗体”还包括抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的例子包括但不限于Fab片段(由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成)；Fd片段(由V_H和C_H1结构域组成)；Fv片段(指以紧密、非共价结合的1个重链可变结构域和1个轻链可变结构域的二聚体)；dAb片段(由V_H结构域组成)；分离的CDR区；(Fab′)₂片段、二价片段(包含通过在铰链区处的二硫桥连接的2个Fab片段)、scFv(指用短接头连接在一起的V_L和V_H结构域的融合物)和保留抗原结合功能的其他抗体片段。由抗体特异性识别并结合的抗原部分称为“表位”。
本发明的抗CD20抗体的抗原结合片段通过常规生物化学技术产生，例如酶切割、或本领域已知的重组DNA技术。这些片段可以如下产生：通过本领域众所周知的方法蛋白酶解切割完整抗体，或通过使用定点诱变在载体中的所需位置处插入终止密码子，例如在C_H1后以产生Fab片段，或在铰链区后以产生(Fab′)₂片段。例如，抗体的木瓜蛋白酶消化产生2个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有单个抗原结合位点，和残留的“Fc”片段。抗体的胃蛋白酶处理产生F(ab’)₂片段，其具有2个抗原结合位点并且仍能够交联抗原。单链抗体可以通过用DNA使V_L和V_H编码区连接而产生，所述DNA编码使V_L和V_H蛋白质片段连接的肽接头。
“体外产生的抗体”指其中所有或部分可变区(例如，至少一个CDR)在非免疫细胞选择中(例如，体外噬菌体展示、蛋白质芯片或其中候选序列可以就其与抗原结合的能力进行测试的任何其他方法)产生的抗体。这个术语排除了在免疫细胞中通过基因组重排产生的序列。
抗原结合片段/结构域可以包含抗体轻链可变区(V_L)和抗体重链可变区(V_H)；然而，它不必包含两者。例如，Fd片段具有2个V_H区，并且通常保留完整抗原结合结构域的某些抗原结合功能。抗体的抗原结合片段的例子包括(1)Fab片段，具有V_L、V_H、C_L和C_H1结构域的单价片段；(2)(Fab′)₂片段，具有通过在铰链区处的二硫桥连接的2个Fab片段的二价片段；(3)具有2个V_H和C_H1结构域的Fd片段；(4)具有抗体单臂的V_L和V_H结构域的Fv片段，(5)具有V_H结构域的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)；(6)分离的互补决定区(CDR)，和(7)单链Fv(scFv)。尽管Fv片段的2个结构域V_L和V_H由分离基因编码，但它们可以使用重组DNA方法通过合成接头进行连接，所述合成接头使得它们能够制备为其中V_L和V_H区配对以形成单价分子的单条蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science 242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且片段以与完整抗体相同的方式就功能进行评估。
术语“人抗体”包括具有与本领域已知的人种系免疫球蛋白序列基本上相对应的可变和恒定区的抗体，包括例如，由Kabat等人描述的那些(参见Kabat，等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，U.S.Department of Health andHuman Services，NIH Publication No.91-3242)。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过随机或体外的位点特异性诱变或通过体内的体细胞突变引入的突变)。人抗体可以具有至少1、2、3、4、5或更多个位置的氨基酸残基被不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基替换。CDR如由Kabat或在Chothia C，Lesk AM，Canonical structures for thehypervariable regions of immunoglobulins，J Mol Biol.1987Aug20；196(4)：901-17中定义。CDR一般指在序列中高变和/或形成结构上限定的环的区域，例如Kabat CDR基于序列变异性，如在Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Departmentof Health and Human Services(1991)，编辑.Kabat等人中描述的，或备选地，指如由Chothia描述的高变结构环的位置。参见例如，Chothia，D.等人(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；和Tomlinson等人(1995)EMBO J.14：4628-4638。另外一个标准是由OxfordMolecular′s AbM抗体模拟软件使用的AbM定义，这基于晶体结构限定了完整高变区。一般参见例如，Protein Sequence and StructureAnalysis of Antibody Variable Domains.In：Antibody EngineeringLab Manual(Ed.：Duebel，S.和Kontermann，R.，Springer-Verlag，Heidelberg)。就Kabat CDR而言描述的实施方案可以备选地使用就Chothia高变环或AbM限定的环而言相似描述的关系来实现。
术语“有效量”指经过治疗过程足以减少任何CD20活性、改善一种或多种临床症状或达到所需生物后果的剂量或量。
短语“抑制”或“对抗”CD20活性及其同源物指由于结合CD20特异性结合分子而减少、抑制或以其他方式降低CD20的至少一种活性，其中减少是相对于在不存在相同分子的情况下的CD20活性。抑制或对抗不一定指示CD20生物活性的总体消除。活性中的减少可以是至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
术语“分离的”指基本上不独立于其天然环境的分子。例如，分离的蛋白质基本上不含来自衍生其的细胞或组织来源的细胞材料或其他蛋白质。该术语还指其中分离的蛋白质对于药物组合物足够纯的制剂；或至少70％(w/w)纯；或至少80％(w/w)纯；或至少90％纯；或至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(w/w)纯。
术语“治疗剂”是治疗或帮助治疗医学病症的物质。治疗剂可以包括但不限于抗增殖试剂、抗癌剂包括化学治疗剂、抗病毒剂、抗感染药、免疫调节剂等，其以补充通过本发明的CD20特异性结合分子减少CD20活性的方式调节免疫细胞或免疫应答。治疗剂的非限制性例子和用途在本文中描述。
如本文所使用的，“治疗有效量”的CD20特异性结合分子指一定量的CD20特异性结合分子，其在单次或多次剂量施用于受试者(例如，人患者)后，有效治疗、阻止、治愈、延迟、减少病症或复发病症的严重性，和/或改善病症或复发病症的至少一种症状，或延长受试者的存活超过在没有治疗情况下的预期。当应用于单独施用的个别活性成分时，治疗有效量指单独的那种成分。当应用于组合时，治疗有效量指无论以组合、顺次还是同时施用，导致疗效的活性成分的组合量。本发明特别包括一种或多种CD20特异性结合分子可以各自以有效剂量根据本发明的方法施用。
术语“治疗”或“处理”指治疗、预防或防病措施。治疗处理可以改善接受治疗的个体中的至少一种疾病症状，或可以延迟个体中的进行性疾病的恶化，或阻止其他相关疾病的发作。治疗可以施用于具有医学病症或最终可能获得病症的受试者，以阻止、治愈、延迟、减少病症或复发病症的严重性，和/或改善病症或复发病症的至少一种症状，或以便延长受试者的存活超过在没有治疗情况下的预期。
术语“人CD20”意指人B淋巴细胞限制的分化抗原(也称为Bp35)。CD20在早期前B细胞发育过程中表达，并且保留直至浆细胞分化。CD20分子可以调节活化过程中的步骤，这是细胞周期起始和分化所需的，并且通常以极高水平在肿瘤B细胞上表达。CD20存在于“正常”B细胞以及“恶性”B细胞(即，不衰退增殖的那些B细胞可以导致B细胞淋巴瘤)。
II.CD20特异性结合分子
根据本发明，CD20结合分子结合在原代B细胞和B细胞淋巴瘤细胞系上的CD20，所述细胞系包括NU-DHLl、Ramos、SU-DHL4、SU-DHL5和WSU-DLCL2。在各种实施方案中，CD20结合分子以与图1中所示的EC50相当的EC50结合CD20表达细胞和/或以剂量依赖性方式结合。在各种实施方案中，CD20结合分子具有选自下述的一种或多种性质：在原代B细胞以及至少Ramos、SU-DHL4和BJAB细胞中的补体介导的细胞毒性(CDC)，在某些情况下具有至少40％的细胞毒性；在至少Ramos、BJAB和SU-DHL4细胞中的抗体依赖性(或Fc依赖性细胞毒性(ADCC或FcCC)，其为剂量依赖性的，并且在某些情况下具有至少40％的细胞毒性；在骨髓和淋巴结中维持CD19+B细胞耗尽比更长的持续时间，或超过8天并且至少10、12、14、16、18、20或21天；如实施例中所述在小鼠模型中减少生长建立的异种移植物肿瘤，并且当在各种小鼠模型中在播散性淋巴瘤的早期中施用时是保护性的，如实施例中所述。
在某些实施方案中，α-CD20结合分子是小分子免疫药物(SmallModular-ImmunoPharmaceutical，SMIP)。在一个方面，本发明提供了人源化CD20特异性结合分子。申请人已提供了57种新型CD20特异性结合分子，其对于治疗哺乳动物受试者包括人和驯养动物有用。本发明还提供了编码CD20特异性结合分子的核酸序列。
在特定实施方案中，本发明的CD20特异性结合分子具有高结合亲和力、低离解速率且与人CD20特异性结合。
在特定实施方案中，本发明的人源化CD20特异性结合分子是抗体，特别是抗CD20单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段。
嵌合抗体是具有衍生自不同抗体的部分的抗体。例如，嵌合抗体可以具有衍生自2种不同抗体的可变区和恒定区。供体抗体可以来自相同或不同物种。在特定实施方案中，本发明的嵌合抗CD20抗体的可变区是非人的，例如鼠类的，(或非人和人的组合)，并且恒定区是人的。
本发明的人源化CD20结合分子还包括CDR移植的人源化抗CD20抗体。在一个实施方案中，人源化抗体包含本发明的人源化抗CD20SMIP的重链CDR和/或轻链CDR(SEQ ID NO：1-59)，以及人受体免疫球蛋白的重链和轻链构架和恒定区。制备人源化抗体的方法公开于美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；和6,180,370中，所述专利各自通过引用整体合并入本文。
保留完整抗体的结合特异性的本发明抗体的抗原结合片段也包括在本发明中。抗原结合片段包括本文描述的任何CD20特异性抗体的部分或全部重链或轻链、可变区或CDR区。
在某些实施方案中，本发明的人源化CD20特异性抗体包含本申请的序列表中例示的任何结合分子的重链CDR3、轻链CDR3或两者。在包含HCDR3和LCDR3的实施方案中，它们可以来自本申请的序列表中的相同分子或不同分子。在某些实施方案中，本发明的人源化CD20特异性抗体包含本申请的序列表中例示的结合分子的重链CDR1、CDR2和CDR3，轻链CDR1、CDR2和CDR3，或所有6个CDR，或者HCDR1-3和LCDR1-3可以来自本申请的序列表中的不同结合分子。在某些实施方案中，本发明的人源化CD20特异性抗体是包含本申请的序列表中例示的结合分子的重链可变结构域、轻链可变结构域或两者的抗体。本发明还包括的是包含本申请的序列表中显示的任何V_H、本申请的序列表中显示的任何V_L、本申请的序列表中显示的此种V_H和V_L的任何组合或任何V_H/V_L对的人源化抗CD20抗体，或此种抗体的抗原结合部分。
在特定实施方案中，本发明的CD20特异性结合分子是CD20特异性的、小分子免疫药物(SMIP)。
本发明的人源化抗CD20SMIP包含3个模块结构域：结合结构域、铰链结构域和效应子结构域。在某些实施方案中，本发明的抗CD20SMIP的结合结构域包含V_H结构域和V_L结构域。本发明的抗CD20SMIP的铰链结构域通过提供在结合结构域和效应子结构域之间的弹性连接形成2种互补功能，同时还控制SMIP的结合或多聚化。本发明的人源化抗CD20SMIP的效应子结构域可以包含例如人抗体Fc结构域、或具有效应子功能的非抗体蛋白质。效应子结构域决定活化何种类型的免疫细胞，并且调节所采用的效应子功能的平衡，包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的相对活性。效应子结构域还可以进行改造，以调节SMIP药物多聚化。
本发明的SMIP的结合结构域可以具有一个或多个结合区，例如衍生自一种或多种免疫球蛋白的可变轻链和可变重链结合区。这些区域一般通过接头肽分开，所述接头肽可以是与结构域相容的本领域已知的任何接头肽或区域连接者。示例性接头是基于Gly₄Ser接头基序的接头，例如(Gly₄Ser)n，其中n＝1-5，或本申请的序列表中显示的任何接头。任何合适的接头可以在本发明的上下文中使用，它的例子描述在WO 2007/146968中。
在某些实施方案中，结合结构域包含人源化单链免疫球蛋白衍生的Fv产物，其可以包括通过接头连接的，至少一个免疫球蛋白轻链可变区的全部或部分以及至少一个免疫球蛋白重链可变区的全部或部分。
本发明的人源化抗CD20SMIP的铰链结构域可以是天然存在的肽、突变或遗传改造的肽、或人工肽。例如，铰链区可以衍生自免疫球蛋白铰链区(例如，负责形成C_H1和C_H2区中的链内免疫球蛋白结构域二硫键的免疫球蛋白重链序列的部分)。铰链区还可以是在分类上视为具有铰链功能的免疫球蛋白多肽链区域的片段(例如，5-65个氨基酸，10-50个氨基酸，15-35个氨基酸，18-32个氨基酸，20-30个氨基酸，21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸)。铰链结构域还可以包括位于相邻的免疫球蛋白结构域，例如C_H1结构域、C_H2结构域或可变结构域中的氨基酸(根据用于对特定残基指定特定结构域的结构标准，如本领域已知的，所述标准可以改变)。
本发明的人源化抗CD20SMIP的铰链结构域可以是人铰链区，即人抗体的重链的铰链区。在包含人铰链区的实施方案中，铰链区可以来自任何人免疫球蛋白同种型，例如人IgG免疫球蛋白(即，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在特定实施方案中，铰链结构域包含零或1个半胱氨酸残基。在某些实施方案中，本发明的人源化抗CD20SMIP包含SEQ IDS 60或63至66中的任何一个中所示的铰链。
本发明的人源化抗CD20SMIP包含免疫球蛋白的恒定区的足够氨基酸序列，以提供效应子功能，优选ADCC和/或CDC。例如，效应子结构域可以包含人免疫球蛋白C_H2结构域的序列，或可以包含人免疫球蛋白C_H2和C_H3结构域。在包含C_H2和C_H3结构域的实施方案中，结构域可以来自相同或不同人免疫球蛋白。在其他实施方案中，效应子结构域可以包含人免疫球蛋白IgE C_H3和C_H4区的序列。
在特定实施方案中，本发明的SMIP的CD20结合结构域包含SEQ IDNO：1-59中所示的V_H氨基酸序列、V_L氨基酸序列、V_H和V_L氨基酸序列中的任何或V_H/V_L对。在特定实施方案中，本发明的SMIP的铰链结构域包含如SEQ ID NO：60中所示的氨基酸序列。在特定实施方案中，本发明的SMIP的效应子结构域包含如SEQ ID NO：60或61中所示的氨基酸序列。
在特定实施方案中，本发明的SMIP的CD20结合结构域包含具有人免疫球蛋白构架序列的V_H区，以及选自SEQ ID NO：1-59的SMIP的CD20结合结构域的重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列或两者。在特定实施方案中，SMIP铰链结构域进一步包含SEQ ID NO：60，并且效应子结构域包含SEQ ID NO：61。
本发明提供了用于产生CD20特异性结合分子的众多重链V_H、轻链V_L、和CDR序列。例如，本申请的序列表中显示的一个或多个CDR可以与人构架亚区(例如，全人FR1、FR2、FR3或FR4)组合，以产生CD20特异性结合分子。在特定实施方案中，本发明的CD20特异性结合分子包含来自轻链可变区的3个CDR和来自重链可变区的3个CDR，其中重链CDR和轻链CDR来自相同参考序列。本发明的CDR可以移植至任何类型的免疫球蛋白构架。
本发明还提供了包含如下氨基酸序列的人源化CD20特异性结合分子，所述氨基酸序列与本申请的序列表中显示的序列基本上相同或基本上同源，和包含如下CDR的人源化CD20特异性结合分子，所述CDR与本申请的序列表中显示的CDR序列(有下划线的)基本上相同或基本上同源。例如，许多氨基酸或核苷酸碱基可以在本申请的序列表中显示的序列中加以改变，特别是在一个或多个CDR、构架区或两者中。因此，在某些实施方案中，本发明的CD20特异性结合分子具有如下氨基酸序列，其与SEQ ID NO 1-59中所示的序列至少80％相同。在其他实施方案中，氨基酸序列与如SEQ ID NO 1-59中所示的序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。任何合适的接头可以在本发明的上下文中使用，所述接头的例子在WO 2007/146968中描述。
与本文公开的序列基本上相同或同源(例如，至少约85％序列同一性)的序列也是本申请的部分。在某些实施方案中，序列同一性可以是约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。备选地，与核酸相关，当核酸区段在选择性杂交条件(例如，高严格杂交条件)下与链的互补体杂交时，存在基本同一性或同源性。核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中、或以部分纯化或基本上纯的形式存在。
通过改变编码氨基酸序列的核酸序列可以产生对氨基酸序列的改变。可以通过本领域已知的方法，使用本说明书关于特定序列的指导制备编码给定CDR的变体的核酸序列。这些方法包括但不限于，通过较早制备的编码CDR的核酸的定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变和盒式诱变制备，所有这些都是本领域众所周知的技术。例如，定点诱变可以用于制备置换变体(参见例如，Carter等人，(1985)Nucleic Acids Res.13：4431-4443和Kunkel等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492，所述2个参考文献都通过引用在此合并)。
在另一个方面，本发明提供了编码本发明的抗CD20结合分子的核酸。在某些实施方案中，核酸编码包含SEQ ID NO：1-59中的任何一个中所示的V_H或V_L氨基酸序列的多肽，或编码包含SEQ ID NO：1-59中的任何一个的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，核酸是SEQ IDNO：67-126中的任何一个或者编码V_H区或V_L区的那些序列之一的片段。
III.产生CD20结合分子
本发明的人源化CD20特异性结合分子可以例如通过重组DNA技术进行制备。例如，在本发明的抗体或其抗原结合片段的情况下，可以用一种或多种重组表达载体转染宿主细胞，所述重组表达载体携带编码抗体的免疫球蛋白轻链和重链，或抗体的抗原结合片段的DNA片段，从而使得轻链和重链在宿主细胞中表达，并且优选地分泌到培养宿主细胞的培养基内，可以从所述培养基中回收抗体。在SMIP的情况下，将编码SMIP的核酸引入宿主细胞内并且在宿主细胞中表达。
标准重组DNA技术可以用于获得抗体重链和轻链基因或编码SMIP的核酸，将这些基因掺入重组表达载体内，并且将载体引入宿主细胞内，例如Sambrook，Fritsch和Maniatis(编辑)，MolecularCloning；A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，Ausubel，F.M.等人(编辑)Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates，(1989)和Boss等人的美国专利号4,816,397中所述的那些，所述所有参考文献通过引用合并入本文。
例如，为了表达本发明的抗体或其抗原结合片段，可以首先获得编码轻链和重链可变区的核酸。这些核酸可以通过使用聚合酶链式反应(PCR)获得和修饰人种系轻链和重链可变区基因来获得。关于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列是本领域已知的。一旦获得V_H和V_L片段，这些序列就可以进行遗传改造，以编码例如一个或多个SMIP序列、SMIP序列的V_H和V_L片段、或本文公开的SMIP序列的CDR(参见例如，本申请的序列表)。
为了表达本发明的抗体或其抗原结合片段，编码部分或全长轻链和重链的一种或多种核酸或在SMIP的情况下，可以将编码SMIP的核酸插入一种或多种表达载体内，从而使得核酸与转录和翻译控制序列可操作地连接。一般选择与所使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。
除抗体重链和/或轻链基因外，本发明的重组表达载体可以另外携带调节序列，所述调节序列控制一条或多条抗体链(或片段)或SMIP在宿主细胞中的表达，例如启动子、增强子或其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)，其控制编码本发明的结合分子的一种或多种核酸的转录或翻译。此种调节序列是本领域已知的(参见例如，通过引用合并入本文的Goeddel，Gene Expression Technology：Methodsin Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990))。本领域技术人员应当理解表达载体的设计，包括调节序列的选择可以依赖于如下因素，如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的示例性调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白质表达的病毒元件，例如衍生自巨细胞病毒(CMV)(例如，CMV启动子/增强子)、猴病毒40(SV40)(例如，SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。关于病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见例如Stinski的美国专利号5,168,062、Bell等人的美国专利号4,510,245和Schaffner等人的美国专利号4,968,615，所述所有专利通过引用合并入本文。
除编码本发明的抗体重链和/或轻链或SMIP的序列和调节序列外，本发明的重组表达载体可以携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如，复制起点)和可选标记基因。可选标记基因促进对载体已引入其内的宿主细胞的选择(参见例如，Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634.665和5,179,017)。例如，一般地可选标记基因对已将载体引入其内的宿主细胞赋予针对药物的抗性，所述药物例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤。其他合适的可选标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在用氨甲蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞中使用)和新霉素基因(用于G418选择)。
为了表达，编码抗体重链和轻链或SMIP的一种或多种表达载体可以通过标准技术转染到宿主细胞内，所述标准技术例如电穿孔、磷酸钙沉淀、或DEAE-葡聚糖转染。在特定实施方案中，用于表达本发明的CD20特异性结合分子的表达载体是病毒载体，例如逆转录病毒载体。此种病毒载体还可以用于产生稳定的细胞系(作为CD20特异性结合分子的连续供应的来源)。
用于表达本发明的重组人源化抗CD20结合分子的合适哺乳动物宿主细胞包括PER.C6细胞(Crucell，The Netherlands)、中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞，与DHFR可选标记一起使用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中描述的)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。此外，还可以使用表达GnTin的宿主细胞(W09954342和美国专利公开20030003097中描述的，所述2个专利通过引用合并入本文)，从而使得表达的CD20特异性结合分子具有增加的ADCC活性。
当将编码抗体或SMIP的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时，一般如下产生抗体和SMIP：通过培养宿主细胞足够的时间段以允许蛋白质在宿主细胞中表达，更优选地，抗体或抗原结合片段或SMIP分泌到宿主细胞在其中生长的培养基内。抗CD20结合分子可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收。
应当理解关于上述操作的变化在本发明的范围内。例如，重组DNA技术可以用于去除对于与CD20结合不需要的编码轻链和重链中的任一或两者的某些或全部DNA。此外，可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体，并且另一条重链和轻链对于除CD20外的抗原特异(例如，通过经由标准化学交联方法使本发明的抗体与第二种抗体交联)。
用于制备SMIP的方法已在美国专利公开2003/0133939、2003/0118592和2005/0136049号中得到描述，所述专利通过引用整体合并入本文。在特定实施方案中，本发明的SMIP是结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白，其特征在于(1)关于同源结构(例如，抗原、反受体等)的结合结构域，(2)具有零、1或2个半胱氨酸残基的IgG1、IgA或IgE铰链区或突变的IgG1铰链区，和(3)免疫球蛋白C_H2和C_H3结构域。在特定实施方案中，结合结构域包含在铰链区中的1或2个半胱氨酸(Cys)残基。在特定实施方案中，当结合结构域包含2个Cys残基时，涉及重链和轻链之间的结合的第一个Cys不缺失或不被另一个氨基酸置换。
本发明的人源化抗CD20SMIP与嵌合抗CD20SMIP，TRU-015相关，所述TRU-015是与CD20抗原结合的重组(鼠类/人)单链蛋白质，如US 2007/0213293中所述。TRU-015的结合结构域基于可公开获得的2H7结合结构域。结合结构域通过经修饰的CSS铰链区与效应子结构域，人IgG1的C_H2和C_H3结构域连接。
IV.治疗用途
在另一个方面，本发明提供了治疗具有或怀疑具有与异常B细胞活性相关的疾病的受试者的方法，其包括给患者施用治疗有效量的本发明的人源化CD20特异性结合分子。在一个实施方案中，CD20特异性结合分子是CD20特异性小分子免疫药物(SMIP)。
“异常B细胞活性”指偏离正常、合适或预期过程的细胞活性。例如，异常细胞活性可以包括不适当的细胞增殖，所述细胞的DNA或其他细胞组分已变得损害或有缺陷。异常B细胞活性可以包括其特征与如下疾病相关的细胞增殖，所述疾病由不适当高水平的细胞分裂、不适当低水平的凋亡或两者引起，由不适当高水平的细胞分裂、不适当低水平的凋亡或两者介导，或导致不适当高水平的细胞分裂、不适当低水平的凋亡或两者。此种疾病的特征在于例如下文更全面地描述的，细胞、细胞群体或组织的单次或多次局部异常增殖，无论是癌性还是非癌性的、良性还是恶性的。异常B细胞活性还可以包括异常抗体生产，例如自身抗体产生，或一般希望在正常水平下的抗体的过量生产。包括异常B细胞活性可以在B细胞的特定亚群中并且不在其他亚群中发生。异常B细胞活性还可以包括T细胞的不适当刺激，例如通过不适当的B细胞抗原呈递给T细胞或通过涉及B细胞的其他途径。
“具有或怀疑具有与异常B细胞活性相关的疾病的受试者”是如下受试者，其中疾病或疾病的症状可以由异常B细胞活性引起，可以通过异常B细胞活性恶化，或可以通过调节B细胞活性得到缓解。此种疾病的例子是B细胞癌症(例如，B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、B细胞骨髓瘤)，特征在于自身抗体产生的疾病或特征在于不适当的T细胞刺激的疾病，例如通过不适当的B细胞抗原呈递给T细胞或通过涉及B细胞的其他途径。
在一个方面，通过本发明的方法治疗的个体证实对用本文描述的CD20特异性结合分子的治疗的改善应答，这改善超过对其他治疗的应答，例如，用于治疗RA的(Amgen/Wyeth)、(Abbott)、(Johnson&Johnson/Schering-Plough)、(Genentech/Roche)、ocrelizumab(Genentech/Roche)、(BMS)、(Roche/Chugai)、(UCB Pharma)，以及用于治疗狼疮(SLE)的(Genentech/Roche)、ocrelizumab(Genentech/Roche)、贝利木单抗(HGS)、依帕珠单抗(Immunomedics/UCB)、Humax(Genmab/GSK)、atacicept(Zymogenetics)、(BMS)和(Roche/Chugai)。经改善超过其他治疗的应答指如下临床应答，其中通过本发明的方法的治疗导致患者中优于单独或与其他试剂组合的其他治疗的临床应答。改善的应答通过本领域众所周知和本文描述的临床标准的比较进行评估。示例性标准包括但不限于，B细胞耗尽的持续时间、B细胞数目总体中的减少、生物样品中B细胞数目中的减少、肿瘤大小中的减少、在治疗后存在和/或出现的肿瘤数目中的减少，以及如通过患者其自身和医生评估的改善的总体应答，例如，使用国际预后指数(International Prognostic Index)。改善可以以一个或超过一个临床标准。用本发明的方法改善的应答可以是由于对先前或目前治疗不足够的应答，例如因为其他治疗的毒性(例如，输注相关不利事件)和/或不足够的功效。此外，可以存在改善的本发明的结合分子的给药方案或时间表(例如，皮下施用)。
例如，与比较，在用人源化CD20SMIP治疗21天后，用人源化的CD20SMIP的治疗产生骨髓和淋巴结中的CD19+B细胞中的显著减少。参见图9和10以及实施例4。
在类风湿性关节炎中，负责关节中的慢性炎症以及后续软骨破坏和骨质侵蚀的主要细胞类型是巨噬细胞、滑液成纤维细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞(Marrack等人，Nat Med.2001；7：899-905)。已证实浸润发炎滑液组织的T和B淋巴细胞通常被组织成类似淋巴样滤泡的结构(Berek和Kim，Semin Immunol.1997；9：261-268；Berek&，Schroder，Ann N Y Acad Sci.1997；815：211-217；Kim和Berek，Arthritis Res.2000；2：126-131)。在类风湿性关节炎过程中从滑液滤泡结构中分离的B细胞的分子分析证实B细胞在局部抗原驱动的特异性免疫应答和类风湿因子(RF)--具有自身反应性的高亲和力抗体的增加产生中的重要性(Weyand和Goronzy，Ann N Y Acad Sci.2003；987：140-149；Gause等人，BioDrugs.2001；15：73-79)。关于RF的阳性与更具侵袭性的关节疾病和更高频率的关节外表现相关(van Zeben等人，Ann Rheum Dis.1992；51：1029-1035)。
关于B细胞在RA中的致病性的证据近期已从在具有难治疾病的患者中的临床试验获得，通过使用由利妥昔单抗()--人嵌合抗CD20单克隆抗体的B细胞消融(Leandro等人，Ann Rheum Dis.2002；61：883-888；Edwards等人，N Engl J Med.2004；350：2572-2581)。在用利妥昔单抗治疗的所有组中，显著更高比例的患者具有根据ACR标准的疾病症状中的20％改善。所有ACR应答在利妥昔单抗-氨甲蝶呤组中在48周时维持。在涉及具有活性RA的161个患者中的这个研究中，在对照组中的1个患者(2.5％)中以及在利妥昔单抗组中的4个患者(3.3％)中发生严重感染，指出B细胞耗尽在RA中是相对安全的疗法。
CD20是35KD非糖基化四次跨细胞膜嵌入磷蛋白，限制于B细胞谱系中，并且在前B细胞、未成熟B细胞、成熟的天然和记忆B细胞上表达，但在早期前B细胞和浆细胞上不表达。目前，去除致病B细胞及其前体而不是抗体分泌浆细胞导致临床改善的机制仍是令人困惑的(Cragg等人，Therapy.Curr Dir Autoimmun 2005；8：140-17410)。包括到B细胞作为淋巴样聚集物在RA患者的滑液内存在，除抗体产生外的B细胞功能(例如，细胞因子产生、抗原呈递、给T细胞提供共刺激信号)也可能在疾病发病机理中起重要作用(Martin和Chan，Immunity.2004；20：517-527)。
体外研究暗示利妥昔单抗通过3种可能机制诱导CD20阳性淋巴瘤细胞的裂解：ADCC、CDC和导致凋亡的直接信号传导(Clark和Ledbetter，Ann Rheum Dis 2005；64：77-8012)。在人中的证据暗示在SLE中的B细胞裂解可能通过在天然杀伤细胞和巨噬细胞上的FcγRIIIa(CD16)衔接经由ADCC和凋亡而发生，因为在SLE中的B细胞耗尽程度以及淋巴瘤的临床应答依赖于FcγRIIIa多态性(Anolik等人，Arthritis Rheum 2003；48：455-459)。
抗CD20疗法也已在几种其他自身免疫病症包括系统性红斑狼疮(SLE)中进行测试，提供B细胞在自身免疫中的作用的新了解(Eisenberg R.，Arthritis Res Ther.2003；5：157-159)。接受利妥昔单抗的大多数SLE患者证实完全B细胞耗尽和临床改善(Anolik等人，Curr Rheumatol Rep.2003；5：350-356)。相比之下，不含B细胞耗尽的那些对治疗不应答。B细胞数目通常在初始给药后1-3个月最低，并且这种耗尽持续3-12个月。
患者可能在治疗后发展人抗嵌合抗体(HACA)，因为利妥昔单抗是嵌合抗体。在一个研究中，用利妥昔单抗治疗的患者中33％具有高HACA滴度(Looney等人，Curr Opin Rheumatol.2004；16：180-185)。有趣的是，这些包括仅接受单次剂量的利妥昔单抗的患者。发现HACA与较不有效的B细胞耗尽以及在初次输注后2个月时较低的利妥昔单抗血清水平相关。
利妥昔单抗治疗诱导具有RA的患者中所有外周血B细胞群体的几乎完全耗尽(Leandro等人，Arthritis Rheum 2006；54：613-620)。在1个患者中至少3个月无法达到循环B细胞的97％耗尽与缺乏对治疗的应答相关。外周血的B细胞再增殖依赖于原初B细胞的形成而不是记忆B细胞的扩增。与其复发较后发生的患者相比较，在B细胞恢复时经历较早疾病复发的患者趋于在再增殖时显示更高数目的循环记忆B细胞。实体组织中较少的广泛B细胞耗尽因此可能与RA的较早复发相关。
利妥昔单抗在自身免疫中的近期临床成功指出需要开发备选B细胞靶向治疗，所述治疗将是更少免疫原性的，并且可能潜在耗尽希望重建免疫耐受的病理性自体反应B细胞的所有克隆残留部分。
尽管在用现有CD20靶向疗法治疗的患者中可见显著的临床应答，但这些试剂的疗效并不持久，并且特别是在淋巴瘤患者中的疾病复发频率保持很高。CD20靶向治疗在耗尽来自循环的正常和转化的B细胞方面高度有效。然而，它们消除组织或淋巴管中包埋的B细胞的能力更有限，可能是由于大生物分子接近这些部位的能力减少或通过组织微环境提供的靶细胞抗性增加。无论是什么原因，这些环境可以提供关于存活B细胞或淋巴瘤细胞的保护储库，所述存活B细胞或淋巴瘤细胞可以在表面上成功的治疗方案后再度出现并且引起疾病复发。
与对照治疗比较，用人源化SMIP治疗非人灵长类动物随后为切除术和组织分析已证实CD20SMIP消除组织包埋的B细胞的极佳能力。这与消除来自循环的B细胞的明确能力组合指出用这种试剂治疗的患者在短期将有利地响应有效的B细胞消除，但此外，与目前的CD20靶向治疗比较，治疗后的功效将具有显著更大的持续时间。对于这些试剂，看起来在骨髓和淋巴结组织中的深度耗尽是显著的，指出这些分子可能能够有效耗尽在免疫活性的相关区域中的B细胞。因此，这些分子可能提供治疗更广泛的患者组，包括其中需要增强此种功效的那些的优选疗法。
在相关方面，对通过本发明的方法治疗的个体还施用RITUXAN。在一个实施方案中，RITUXAN可以已作为第一线治疗进行施用，并且当用本发明的方法的治疗已开始时继续。在另一个实施方案中，RITUXAN治疗在用本发明的方法的治疗已开始后中断。
“具有或怀疑具有风湿性疾病的受试者”是受关节起源或肌肉骨骼系统的疾病或病症侵袭的受试者或个体，所述疾病或病症影响此种区域如关节、软骨、肌肉、神经和腱。进一步包括具有或怀疑具有风湿性疾病的受试者可能先前已接受治疗风湿性疾病的疗法。在一个实施方案中，风湿性疾病包括但不限于，类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、皮肌炎、亨-许二氏(Henoch Schonlein)紫癜、幼年型类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、雷诺氏(Raynaud’s)综合征、莱特氏(Reiter’s)综合征、肉瘤样病、脊椎关节病变、进行性系统性硬化症和肌炎。
“具有或怀疑具有中枢神经系统自身免疫疾病的受试者”或“中枢神经系统病症”是受影响中枢神经系统的疾病或病症侵袭的受试者或个体，所述中枢神经系统包括脑和脊髓，或此种区域如视神经。进一步包括具有或怀疑具有中枢神经系统病症的受试者可能先前已接受治疗中枢神经系统病症的疗法。在一个实施方案中，中枢神经系统自身免疫疾病包括但不限于，多发性硬化症、变应性脑脊髓炎、视神经脊髓炎、狼疮脊髓炎和狼疮大脑炎。
“脉管炎”指与血管中的炎症相关的疾病或病症。示例性脉管炎病症包括但不限于，贝切特氏(Behcet’s)病、中枢神经系统脉管炎、丘-斯二氏(Churg-Strauss)综合征、冷球蛋白血症、巨细胞动脉炎、亨-许二氏紫癜、超敏性脉管炎/血管炎、川崎病、白细胞破坏性脉管炎、多血管炎、结节性多发性动脉炎、多肌痛、多软骨炎、类风湿性脉管炎、高安氏(Takayasu’s)关节炎、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener’s granulamatosis)、由于肝炎的脉管炎、家族性地中海热、显微镜下多血管炎、科甘(Cogan′s)综合征、韦-奥二氏(Whiskott-Aldrich)综合征和血栓闭塞性血管炎。
本发明包括的方法对于治疗疾病有用，例如B细胞癌症(例如，B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、B细胞淋巴瘤)，特征在于自身抗体产生的疾病或特征在于不适当的T细胞刺激的疾病，例如通过不适当的B细胞抗原呈递给T细胞或通过涉及B细胞的其他途径。
B细胞癌症包括B细胞淋巴瘤(例如各种形式的霍奇金氏(Hodgkin′s)病、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或中枢神经系统淋巴瘤)、白血病(例如急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病和慢性成肌细胞性白血病)和骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)。另外的B细胞癌症包括小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞早幼淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、骨的孤立性浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、粘膜相关淋巴样组织结节外边缘区B细胞淋巴瘤(MALT)、结节边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/白血病、原因不明的恶性潜在的B细胞增殖、淋巴瘤样肉芽肿病、和移植后淋巴增生性病症。
特征在于自身抗体产生的病症通常视为自身免疫疾病。自身免疫疾病包括但不限于：关节炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、多软骨炎、牛皮癣关节炎、牛皮癣、皮炎、多肌炎/皮肌炎、包涵体肌炎、炎性肌炎、中毒性表皮坏死松懈症、系统性硬皮病和硬化症、CREST综合征、与炎性肠病相关的应答、克罗恩氏(Crohn′s)病、溃疡性结肠炎、呼吸窘迫综合征、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、结肠炎、肾小球肾炎、变应性病状、湿疹、哮喘、涉及T细胞浸润和慢性炎症应答的病状、动脉粥样硬化、自身免疫性心肌炎、白细胞粘附缺陷、系统性红斑狼疮(SLE)、亚急性皮肤红斑狼疮、盘状狼疮、狼疮脊髓炎、狼疮大脑炎、幼年型糖尿病、多发性硬化症、变应性脑脊髓炎、视神经脊髓炎、风湿热、西德纳姆氏(Sydenham’s)舞蹈病、与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫应答、肺结核、结节病、肉芽肿病包括韦格纳氏肉芽肿病和许-斯二氏病、粒细胞缺乏症、脉管炎(包括超敏性脉管炎/血管炎、ANCA和类风湿性脉管炎)、再生障碍性贫血、戴-布二氏(Diamond Blackfan)贫血、免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血、单纯红细胞再生障碍(PRCA)、因子VIII缺陷、血友病A、自身免疫性嗜中性白血球减少症、全血细胞减少症、白血球减少症、涉及白细胞渗出的疾病、中枢神经系统(CNS)炎性病症、多器官损伤综合征、重症肌无力(mysathenia gravis)、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基膜疾病、抗磷脂抗体综合征、变应性神经炎、贝切特氏病、卡斯尔曼氏(Castleman′s)综合征、古德帕斯彻氏(Goodpasture′s)综合征、朗-伊二氏(Lambert-Eaton)肌无力综合征、雷诺氏(Reynaud’s)综合征、Sjogren′s综合征、斯-约二氏(Stevens-Johnson)综合征、实体器官移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、类天疱疮、天疱疮、自身免疫性多内分泌腺疾病、血清阴性脊柱关节病、莱特氏(Reiter’s)病、僵人综合征、巨细胞动脉炎、免疫复合物肾炎、IgA肾病、IgM多发性神经病或IgM介导的神经病、特应性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓血小板减少性(throbocytopenic)紫癜(TTP)、亨-许二氏紫癜、自身免疫性血小板减少症、睾丸和卵巢的自身免疫疾病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎、原发性甲状腺机能减退；自身免疫性内分泌疾病包括自身免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎(桥本氏(Hashimoto′s)甲状腺炎)、亚急性甲状腺炎、特发性甲状腺机能减退、阿狄森氏(Addison′s)病、格雷夫斯氏(Grave′s)病、自身免疫性多内分泌腺综合征(或多腺内分泌病综合征)、I型糖尿病也称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和席汉氏(Sheehan′s)综合征；自身免疫性肝炎、淋巴样间质性肺炎(HIV)、闭塞性细支气管炎(非移植)对NSIP、格-巴二氏(Guillain-Barre′)综合征、大血管脉管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏)动脉炎)、中等血管脉管炎(包括川崎氏病和结节性多发性动脉炎)、结节性多发性动脉炎(PAN)强直性脊柱炎、Berger′s病(IgA肾病)、急进性肾小球肾炎、原发性胆汁性肝硬变、口炎性腹泻(麸质肠病)、冷球蛋白血症、与肝炎相关的冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化(ALS)、冠状动脉病、家族性地中海热、显微镜下多血管炎、科甘氏综合征、韦-奥二氏综合征和血栓闭塞性血管炎。
类风湿性关节炎(RA)是特征在于关节炎症的慢性疾病，导致肿胀、疼痛和功能缺失。具有延长时期的RA的患者通常显示进行性关节破坏、变形、残疾且甚至早产儿死亡。
系统性红斑狼疮(SLE)是通过对多器官中的血管的复发损伤引起的自身免疫疾病，所述多器官包括肾、皮肤和关节。在具有SLE的患者中，T细胞和B细胞之间的错误相互作用导致攻击细胞核的自身抗体的产生。一般同意自身抗体负责SLE的至少某些方面。包括耗尽B细胞谱系允许免疫系统重新设定为新B细胞由前体产生的新疗法，将提供SLE患者中的长期利益的希望。
克罗恩氏病和相关疾病溃疡性结肠炎是属于称为炎性肠病(IBD)的一组疾病的2个主要疾病类别。克罗恩氏病是引起消化或胃肠(GI)道的炎症的慢性病症。尽管它可以涉及从口腔到肛门的GI道的任何区域，但它最通常影响小肠和/或结肠。在溃疡性结肠炎中，GI牵涉局限于结肠。多发性硬化症(MS)也是自身免疫疾病。它的特征在于中枢神经系统的炎症和髓磷脂的破坏，所述髓磷脂使脑、脊髓和体内的神经细胞纤维绝缘。尽管MS的原因不明，但广泛相信自身免疫T细胞是该疾病的发病机理的主要贡献者。然而，高水平的抗体存在于具有MS的患者的脑脊髓液中，并且某些理论预测导致抗体产生的B细胞应答对于介导该疾病是重要的。MS的原因难以预测，并且该疾病可能有时静止休眠或稳定进展。几个亚型或进展模式已得到描述，这不仅与预后相关还与治疗决定相关。复发-缓解型描述了85％-90％具有MS的个体的初始过程。这个亚型的特征在于不可预测的发作(复发)随后为数月至数年的相对平静(缓解)时期，无疾病活性的新征兆。在发作过程中遭受的缺陷可能消退或可能是持久的。当缺陷总是在发作之间消退时，这称为“良性”MS。继发进展型描述了具有初始复发-缓解型MS的约80％，其随后开始具有在其急性发作之间的神经病学减退，无任何确定的缓解期。这种减退可能包括新神经病学症状、恶化认知功能、或其他缺陷。继发进展型是最常见类型的MS，并且引起最大量的残废。原发进展型描述了在其初始MS症状后从未缓解的个体的约10％。减退持续发生，无明确发作。原发进展亚型趋于影响在疾病发作时年龄较大的人。进展复发型描述了从其MS发作开始具有稳定的神经病学减退但也遭受重叠发作的那些个体；并且是所有亚型中最不常见的。
克罗恩氏病的特征可能在于针对嗜中性粒细胞抗原(即“核周抗嗜中性粒细胞抗体”(pANCA))，和酿酒酵母(Saccharomycescervisiae)(即“抗酿酒酵母抗体”(ASCA))的抗体。具有溃疡性结肠炎的许多患者在其血液中具有pANCA抗体而不是ASCA抗体，而许多克罗恩氏病患者显示ASCA抗体而不是pANCA抗体。评估克罗恩氏病的一种方法是使用克罗恩氏病活性指数(Crohn’s disease ActivityIndex)(CDAI)，基于由医生收集的18个预测变量得分。150和更低的CDAI值与休眠性疾病相关；高于其的值指示活动性疾病，并且超过450的值可见极其严重的疾病(Best，等人，″Development of aCrohn′s disease activity index.″Gastroenterology 70：439-444，1976。然而，自最初研究以来，某些研究者使用200-250的‘主观值’作为健康得分。
自身免疫性甲状腺病起因于如下自身抗体的产生，所述自身抗体刺激甲状腺以引起甲状腺功能亢进(格雷夫斯氏病)，或破坏甲状腺以引起甲状腺机能减退(桥本氏甲状腺炎)。甲状腺的刺激由结合且激活促甲状腺激素(TSH)受体的自身抗体引起。甲状腺的破坏通过与其他甲状腺抗原反应的自身抗体引起。
Sjogren’s综合征是特征在于破坏机体的湿气产生腺体的自身免疫疾病。
免疫性血小板减少性紫癜(ITP)通过与血液血小板结合且引起其破坏的自身抗体引起。
重症肌无力(MG)是特征在于如下自身抗体的慢性自身免疫性神经肌肉障碍，所述自身抗体与在神经肌肉连接处表达的乙酰胆碱受体结合，导致随意肌群的虚弱。
牛皮癣特征在于皮肤中的自身免疫炎症，并且在30％的病例中也与关节炎相关。
还包括特发性炎症性肌病(IIM)，包括皮肌炎(DM)和多肌炎(PM)的治疗。炎症性肌病已使用许多分类方案进行分类。Miller’s的分类方案(Miller，Rheum Dis Clin North Am.1994，20：811-826)鉴定了2种特发性炎症性肌病(IIM)--多肌炎(PM)和皮肌炎(DM)。
多肌炎和皮肌炎是慢性、虚弱炎性疾病，其涉及肌肉并且在DM的情况下涉及皮肤。这些病症是罕见的，具有在美国报告的每年发生率是每年约5-10个病例/百万成人和0.6-3.2个病例/百万儿童(Targoff，Curr Probl Dermatol.1991，3：131-180)。特发性炎症性肌病与显著的发病率和死亡率相关，其中高达一半的受累成人已遭受显著损害(Gottdiener等人，Am J Cardiol.1978，41：1141-49)。Miller(Rheum Dis Clin North Am.1994，20：811-826和Arthritisand Allied Conditions，第75章，编辑Koopman和Moreland，Lippincott Williams and Wilkins，2005)阐述了用于诊断IIM的5组标准，即特发性炎症性肌病标准(IIMC)评估，包括肌无力、退化的肌肉活组织检查证据、肌肉相关酶的血清水平升高、肌病的电磁三联、在皮肌炎中的皮疹证据，并且还包括自身抗体的证据作为次级标准。
IIM相关因子，包括肌肉相关酶类和自身抗体包括但不限于，肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶、醛缩酶、C反应蛋白、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、以及抗核自身抗体(ANA)、肌炎特异性抗体(MSA)和针对可提取核抗原的抗体。
V.药物组合物和施用方法
在本发明的另一个方面，本发明的CD20特异性结合分子作为药物组合物施用。为了给人或测试动物施用CD20特异性结合分子，优选在包含一种或多种药学上可接受的载体的组合物中配制结合分子。短语“药学或药理学上可接受的”指这样的分子实体和组合物，其当使用本领域众所周知的途径施用时，不产生过敏或其他不良反应，如下所述。“药学上可接受的载体”包括任何和所有临床上有用的溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。
此外，化合物可能与水或常见有机溶剂形成溶剂化物。还包括此种溶剂化物。
CD20特异性结合分子组合物可以经口、局部、经皮、肠胃外、通过吸入喷雾、经阴道、经直肠或通过颅内注射进行施用。如本文所使用的，术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌内、脑池内注射或输注技术。还包括通过静脉内、真皮内、肌内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内注射的施用和或在特定部位处的手术植入。一般地，组合物基本上不含热原，以及可能对接受者有害的其他杂质。在特定实施方案中，注射特别是静脉内的是优选的。
包含在本发明方法中使用的CD20特异性结合分子的本发明药物组合物可以取决于施用途径包含药学上可接受的载体或添加剂。此种载体或添加剂的例子包括水、药学上可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性右旋糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯树胶、酪蛋白、明胶、琼脂、双甘油、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HAS)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、药学上可接受的表面活性剂等。适当地取决于本发明的剂型，所使用的添加剂选自但不限于：上述或其组合。
药物组合物的配制将根据所选择的施用途径而改变(例如，溶液、乳状液)。例如，待施用的包含抗CD20抗体(或其CD20结合片段，例如SMIP)的合适组合物可以在生理学上可接受的媒介物或载体中进行制备。对于溶液或乳状液，合适的载体包括例如水溶液或醇/水溶液、乳状液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物可以包括氯化钠溶液、林格氏(Ringer′s)右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发性油。静脉内媒介物可以包括各种添加剂、防腐剂、或液体、营养或电解质补充剂。
各种水载体例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸，或水悬浮液，可以包含与适合于制造水悬浮液的赋形剂混合的活性化合物。此种赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散或湿润剂可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或烯基氧化物与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七氧乙烯鲸蜡醇(heptadecaethyl-eneoxycetanol)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。水悬浮液还可以包含一种或多种防腐剂，例如乙基或正丙基、对羟基苯甲酸酯。
CD20特异性结合分子组合物可以冻干用于贮藏并且在使用前在合适载体中进行重构。已显示这种技术对于常规免疫球蛋白有效。可以采用任何合适的冻干和重构技术。本领域技术人员应当理解冻干和重构可以导致各种程度的抗体活性丧失，并且使用水平可能必须进行调整以补偿。
适合于通过添加水制备水悬浮液的可分散粉剂和粒剂提供与分散或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性化合物。合适的分散或湿润剂和悬浮剂通过上文已提及的那些例示。
CD20特异性结合分子在这些制剂中的浓度可以广泛变化，例如从小于约0.5重量％通常为或至少约1重量％到多达15或20重量％，并且将主要基于流体体积、粘度等进行选择，依照所选择的具体施用方式。因此，用于肠胃外注射的一般药物组合物可以构建为包含1ml无菌缓冲水和50mg抗体。用于静脉内输注的一般组合物可以构建为包含250ml无菌林格氏溶液和150mg抗体。用于制备可肠胃外施用的组合物的实际方法将是本领域技术人员已知的或显而易见的，并且在例如Remington′s Pharmaceutical Science，第15版，MackPublishing Company，Easton，Pa.(1980)中更详细地描述。抗体的有效剂量为0.01mg-1000mg/kg体重/施用。
药物组合物可以为无菌可注射水悬浮液、油悬浮液、分散系或无菌粉末的形式，用于临时制备无菌可注射溶液或分散系。悬浮液可以根据已知技术，使用上文已提及的那些合适的分散或湿润剂和悬浮剂进行制备。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为在1，3-丁二醇中的溶液。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、蔬菜油、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液的溶剂或分散介质。此外，无菌、不挥发性油照常规用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成甘油单或二酯。此外，脂肪酸例如油酸在注射剂的制备中有用。
在所有情况下，形式必须是无菌的并且必须是流动的至具有容易注射性(syringability)的程度。合适的流动性可以如下得到维持，例如通过使用包衣例如卵磷脂、在分散系的情况下通过维持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂。其在制造和贮藏条件下必须是稳定的，并且必须针对微生物例如细菌和真菌的污染作用进行保存。对微生物作用的预防可以通过各种抗菌和抗真菌剂来达到，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，将希望包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂来达到，所述试剂例如单硬脂酸铝和明胶。
对于施用有用的组合物可以用摄取或吸收促进剂进行配制，以增加其功效。此种促进剂包括例如水杨酸盐、甘胆酸盐/亚油酸盐、glycholate、抑肽酶、杆菌肽、SDS、癸酸盐等。参见例如，Fix(J.Pharm.Sci.，85：1282-1285，1996)以及Oliyai和Stella(Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，32：521-544，1993)。
此外，包括在本发明中使用的组合物的亲水性和疏水性性质是良好平衡的，由此增强其用于在体外且特别是体内使用的效用，而缺乏此种平衡的其他组合物具有基本上更少的效用。特别地，包括在本发明中使用的组合物在水介质中具有合适程度的溶解性，这允许在体内的吸收和生物利用度，同时还具有在液体中的一定溶解性程度以允许化合物穿过细胞膜至假定作用部位。因此，当包括的抗体组合物可以递送至靶抗原活性部位时，它们是最大限度有效的。
在一个方面，本发明的方法包括施用包含本发明的CD20特异性结合分子的药物组合物的步骤。
本发明的方法使用用于将治疗剂直接或间接引入哺乳动物受试者内的任何医学上可接受的方法来执行，包括但不限于注射、口服摄入、鼻内、局部、经皮、肠胃外、吸入喷雾、阴道或直肠施用。如本文所使用的，术语肠胃外包括皮下、静脉内、肌内和脑池内注射，以及导管和输注技术。还包括通过真皮内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内注射、硬膜外施用和或在特定部位处的手术植入。用于口部或经粘膜施用的药物组合物可以为液体或固体组合物形式。
在特定实施方案中，药物组合物经配制与其预期施用途径相容。用于肠胃外、真皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包含下述组分：无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调整张力的试剂例如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠进行调整。肠胃外制剂可以封入由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
用于皮下应用的溶液或悬浮液一般包含一种或多种下述组分：无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调整张力的试剂例如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠进行调整。此种制剂可以封入由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。在某些实施方案中，CD20结合分子为冻干剂型，并且可以进一步包含一种或多种下述赋形剂：L-组氨酸、L-甲硫氨酸、蔗糖和聚山梨醇酯80。
还包括的是使用本发明的药物组合物的皮下疗法。这些疗法可以每天、每周、或更优选地每2周或每月施用。最终主治医生将决定使用本发明的药物组合物的静脉内或皮下疗法的合适持续时间，或用小分子的疗法、和疗法的施用时间测定。
在一个示例性实施方案中，为了皮下提供高剂量，其中体积限制很小(例如，约1-1.2ml/注射)，CD20结合分子的浓度一般为100mg/ml或更大。
在其他实施方案中，施用在需要治疗的癌症或受累组织部位处进行，通过直接注射到部位内或经由持续递送或持续释放机制，这可以内部递送制剂。例如，能够持续递送组合物(例如，可溶性多肽、抗体或小分子)的生物可降解的微球体或胶囊或其他生物可降解聚合物构型可以包括在癌症附近植入的本发明的制剂中。
治疗组合物还可以在多个部位处递送给患者。多次施用可以同时给予或可以经过连续时间段施用。
在本发明中还包括与第二种试剂结合的CD20特异性结合分子组合物的施用。本发明包括的第二种试剂在下文段落中列出。
第二种试剂可以是B细胞关联分子。本发明包括的其他B细胞关联分子包括与并非CD20的B细胞表面分子结合的结合分子。B细胞关联分子包括但不限于CD19(B淋巴细胞抗原CD19，也称为B淋巴细胞表面抗原B4或Leu-12)、CD21、CD22(B细胞受体CD22，也称为Leu-14、B淋巴细胞细胞粘附分子或BL-CAM)、CD23、CD 37、CD40(B细胞表面抗原CD40，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员5、CD40L受体或Bp50)、CD80(T淋巴细胞活化抗原CD80，也称为活化B7-1抗原、B7、B7-1或BB1)、CD86(T淋巴细胞活化抗原CD86，也称为活化B7-2抗原、B70、FUN-1或BU63)、CD137(也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员9)、CD152(也称为细胞毒性T淋巴细胞蛋白质4或CTLA-4)、L6(肿瘤相关抗原L6，也称为跨膜4超家族成员1，膜组分表面标记1或M3S1)、CD30(淋巴细胞活化抗原CD30，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员8、CD30L受体或Ki-1)、CD50(也称为细胞间粘附分子-3(ICAM3)或ICAM-R)、CD54(也称为细胞间粘附分子-1(ICAM1)或主要组鼻病毒受体)、B7-H1(由活化的T细胞、B细胞和骨髓样细胞表达的免疫抑制受体的配体，也称为PD-L1；参见Dong，等人，″B7-H1，a third member of the B7 family，co-stimulates T-cellproliferation and interleukin-10secretion，″Nat.Med.1999，5：1365-1369)、CD134(也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员4、OX40、OX40L受体、ACT35抗原或TAX转录活化的糖蛋白1受体)、41BB(4-1BB配体受体、T细胞抗原4-1BB或T细胞抗原ILA)、CD153(也称为肿瘤坏死因子配体超家族成员8、CD30配体或CD30-L)、CD154(也称为肿瘤坏死因子配体超家族成员5、TNF相关的活化蛋白质、TRAP或T细胞抗原Gp39)和Toll受体。构建体靶和/或靶抗原的上述列表仅是示例性的并且不是完全的。
作为第二种试剂而包括的化学治疗剂的例子包括但不限于烷化剂，例如氮芥(例如，二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥)；亚硝基脲(例如，卡莫司汀(BCNU)、罗莫司汀(CCNU)和司莫司汀(甲基-CCNU))；乙烯亚胺和甲基-蜜胺(例如，三乙撑蜜胺)(TEM)、三乙撑硫代磷酰胺(噻替派)和六甲基蜜胺(HMM，六甲蜜胺))；烷基磺酸盐(例如，白消安(buslfan，))；和三嗪(例如，达卡巴嗪(dacabazine)(DTIC))；抗代谢药例如叶酸类似物(例如，氨甲蝶呤、三甲曲沙和培美曲塞(多靶向抗叶酸剂))；嘧啶类似物(例如，5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟脱氧尿苷、吉西他滨、胞嘧啶阿拉伯糖苷(AraC，阿糖胞苷)、5-氮胞苷和2，2’-二氟脱氧胞苷)；和嘌呤类似物(例如，6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、2’-脱氧肋间型霉素(喷司他丁)、红羟基壬基腺嘌呤(EHNA)、磷酸氟达拉滨、2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨，2-CdA)；I型拓扑异构酶抑制剂例如喜树碱(CPT)、托泊替康和伊立替康；特定天然产物例如表鬼臼毒素(epipodophylotoxins)(例如，依托泊苷和替尼泊苷)；和长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱和长春瑞滨)；抗肿瘤抗生素例如放线菌素D、多柔比星和博来霉素；特定放射致敏剂例如5-溴脱氧尿苷(5-bromodeozyuridine)、5-碘脱氧尿苷和溴脱氧胞苷；铂配位络合物例如顺铂、卡铂和奥沙利铂；取代的尿素例如羟基脲；和甲基肼衍生物例如N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼。
化学治疗剂、放射治疗剂以及其他活性和辅助试剂的非限制性例子也在表1中显示。
                    表1
烷化剂               天然产物
氮芥                 抗有丝分裂药
二氯甲基二乙胺
环磷酰胺
异环磷酰胺           紫杉烷
美法仑               紫杉醇
苯丁酸氮芥           长春花生物碱
                     长春碱(VLB)
亚硝基脲             长春新碱
卡莫司汀(BCNU)       长春瑞滨
罗莫司汀(CCNU)       (多西他赛)
司莫司汀(甲基-CCNU)  雌氮芥
                     磷酸雌莫司汀
乙烯亚胺/甲基-蜜胺
三乙撑蜜胺(TEM)      表鬼臼毒素
三乙撑硫代磷酰胺(噻替派)依托泊苷
六甲基蜜胺           替尼泊苷
(HMM，六甲蜜胺)
                     抗生素
烷基磺酸盐           放线菌素D
白消安               道诺霉素(柔红霉素)
                     多柔比星(阿霉素)
三嗪                 mitoxantroneidarubicin
达卡巴嗪(DTIC)       博来霉素
                     splicamycin(光神霉素)
抗代谢药             丝裂霉素C
叶酸类似物           更生霉素
氨甲蝶呤                    阿非科林
三甲曲沙
培美曲塞                    酶
(多靶向抗叶酸剂)            L-天冬酰胺酶
                            L-精氨酸酶
嘧啶类似物
5-氟尿嘧啶                  放射致敏剂
氟脱氧尿苷                  甲硝唑
吉西他滨                    米索硝唑
胞嘧啶阿拉伯糖苷            去甲基醚醇硝唑
(AraC，阿糖胞苷)            哌莫硝唑
5-氮胞苷                    依他硝唑
2，2’-二氟脱氧胞苷         尼莫唑
                            RSU 1069
嘌呤类似物                  EO9
6-巯嘌呤                    RB 6145
6-硫鸟嘌呤                  SR4233
硫唑嘌呤                    烟酰胺
2′-脱氧肋间型霉素          5-溴脱氧尿苷
(喷司他丁)                  5-碘脱氧尿苷
红羟基壬基腺嘌呤(EHNA)      溴脱氧胞苷
磷酸氟达拉滨
2-氯脱氧腺苷
(克拉屈滨，2-CdA)           混杂试剂
                            铂配位络合物
                            顺铂
I型拓扑异构酶抑制剂         卡铂
喜树碱                      奥沙利铂
托泊替康                    蒽二酮
伊立替康                米托蒽醌
生物应答调节剂          取代尿素
G-CSF                   羟基脲
GM-CSF
                        甲基肼衍生物
分化试剂                N-甲基肼(MIH)
视黄酸衍生物            丙卡巴肼
激素和拮抗剂            肾上腺皮质抑制剂
肾上腺皮质类固醇/拮抗剂 米托坦(o，p’-DDD)
泼尼松和等价物          ainoglutethimide
地塞米松
ainoglutethimide        细胞因子
                        干扰素(α，β，γ)
孕激素                  白介素-2
己酸羟孕酮
乙酸甲羟孕酮            光敏剂
乙酸甲地孕酮            血卟啉衍生物
                        
雌激素                  苯卟啉衍生物
己烯雌酚                Npe6
乙炔雌二醇/等价物       初卟啉锡(SnET2)
                        pheoboride-a
抗雌激素药              细菌叶绿素-a
他莫西芬                萘酞菁
                        酞菁
雄激素                  酞菁锌
丙酸睾酮
氟甲睾酮/等价物        放射
                       X射线
抗雄激素药             紫外线
氟他胺                 γ射线
促性腺激素             可见光
激素类似物             红外线辐射
亮丙瑞林               微波辐射
非类固醇类抗雄激素药
氟他胺
本发明包括的用于治疗自身免疫疾病的第二种试剂还可以包括免疫抑制剂，其作用于抑制或掩蔽待治疗个体的免疫系统。免疫抑制剂包括例如非类固醇抗炎药(NSAID)、镇痛药(analgesiscs)、糖皮质激素、用于治疗关节炎的疾病缓解抗风湿性药物(DMARD)、或生物应答调节剂。DMARD描述中的组合物也在治疗除RA外的许多其他自身免疫疾病中有用。
示例性NSAID选自布洛芬、萘普生、萘普生钠、Cox-2抑制剂例如和以及唾液酸盐。示例性镇痛药选自对乙酰氨基酚、羟可酮、盐酸丙氧芬(proporxyphene hygrochloride)的曲马多。示例性糖皮质激素选自可的松、地塞米松(dexamethosone)、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙或泼尼松。示例性生物应答调节剂包括但不限于，针对细胞表面标记的分子(例如，CD4、CD5、CTLA4等)、阿巴西普、细胞因子抑制剂例如TNF拮抗剂(例如依那西普()、阿达木单抗()和英夫利昔单抗())、趋化因子抑制剂和粘附分子抑制剂。生物应答调节剂包括单克隆抗体以及重组形式的分子。示例性DMARD包括但不限于硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素、氨甲蝶呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺胺吡啶、羟氯喹、金[口服(金诺芬)和肌内]和米诺环素。因此，例如，本发明的结合蛋白质可以与DMARD组合用于治疗RA，所述DMARD例如氨甲蝶呤(MTX)、柳氮磺胺吡啶(SSZ)或来氟米特(LEF)；与DMARD、类固醇、环磷酰胺或组合用于治疗狼疮(SLE)；以及与各种疾病缓解试剂组合用于治疗MS，所述疾病缓解试剂例如干扰素(干扰素β-1a(和)或干扰素β-1b(或))、乙酸格拉替雷(glatiramer acetate)()、米托蒽醌或那他珠单抗()。
包括CD20特异性结合分子组合物和第二种试剂可以同时在相同制剂中给予。备选地，试剂在分开制剂中施用，并且同时施用，其中同时指试剂在彼此30分钟内给予。
在另一个方面，在CD20特异性结合分子组合物施用前施用第二种试剂。在施用前指第二种试剂的施用在用抗体治疗前一周直到抗体施用前30分钟的范围内。进一步包括第二种试剂在CD20特异性结合分子组合物施用后施用。在施用后意欲描述从抗体治疗后30分钟直到抗体施用后1周的施用。
进一步包括当CD20特异性结合分子与第二种试剂组合施用时，其中第二种试剂是细胞因子或生长因子、或化学治疗剂，施用还包括使用放射治疗剂或放射疗法。对与CD20特异性结合分子组合物和第二种试剂施用组合的放射疗法的需要可以由治疗医生决定。
CD20特异性结合分子组合物在给定剂量中的量将根据治疗所施用的个体的大小以及待治疗病症的特征而变。在示例性治疗中，可能必须施用约1mg/天、约5mg/天、约10mg/天、约20mg/天、约50mg/天、约75mg/天、约100mg/天、约150mg/天、约200mg/天、约250mg/天、约400mg/天、约500mg/天、约800mg/天、约1000mg/天、约1600mg/天或约2000mg/天。剂量还可以基于患者的体重以0.01-50mg/kg的剂量施用。在一个相关实施方案中，CD20特异性结合分子可以以0.015-30mg/kg的剂量范围施用。在一个另外实施方案中，CD20特异性结合分子以约0.015、约0.05、约0.15、约0.5、约1.5、约5、约15或约30mg/kg的剂量施用。
首先在动物模型中随后在临床测试中的标准剂量应答研究可以揭示关于特定疾病和患者群体的最佳剂量。
在特定实施方案中，CD20特异性结合分子组合物的施用使B细胞群体在治疗后降低或减少至少约20％。在一个实施方案中，B细胞群体降低或减少至少约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90或约100％。B细胞耗尽定义为绝对B细胞计数的减少低于正常范围下限。B细胞回收定义为绝对B细胞计数恢复至下述任一：1)70％的受试者基线值；或2)正常范围。
在特定实施方案中，CD20特异性结合分子组合物的施用还导致特定B细胞子集中凋亡的增强。凋亡指细胞的程序性细胞死亡的诱导，通过DNA断裂、细胞收缩、细胞碎裂、膜囊泡形成或如通过膜联蛋白V染色评估的膜脂质组成的改变显示且评估的。
在特定实施方案中，CD20特异性结合分子组合物的施用导致待治疗的疾病或病症中的所需临床效应。例如，在受类风湿性关节炎侵袭的患者中，本发明的CD20分子的施用使患者的病状改善了临床显著的量[例如，达到美国风湿病学会的改善初步检测(American College ofRheumatology Preliminary Detection of Improvement)(ACR20)]，和/或触痛和肿胀关节中20％的改善以及3/5其余ACR测量中20％的改善(Felson等人，Arthritis Rheum.1995，38：727-35)。关于CD20特异性结合分子施用后RA患者中的改善的生物测量包括经由蛋白质或RNA水平测量的细胞因子水平中的改变的测量。目的细胞因子包括但不限于，TNF-α、IL-1、干扰素、Blys和APRIL。细胞因子改变可以是由于减少的B细胞数目或减少的活化T细胞。在RA患者中，在CD20特异性结合分子施用前和后测量与骨更新(骨质吸收或侵蚀)相关的标记。相关标记包括但不限于，碱性磷酸酶、骨钙素、胶原断裂片段、羟脯氨酸、抗酒石酸盐酸性磷酸酶和RANK配体(RANKL)。与RA改善相关的其他读数包括C反应蛋白(CRP)水平、红细胞沉降率(ESR)、类风湿性因子、CCP(瓜氨酸环肽)抗体的测量以及经由流式细胞术的全身性B细胞水平和淋巴细胞计数的评估。特异性因子还可以根据RA患者的滑膜进行测量，包括在来自滑膜活组织检查的滑膜中B细胞水平的评估，RANKL和其他骨因子以及上文所述的细胞因子的水平。关于RA的另外生物标记包括CRP和SAA。
在一个相关方面，CD20特异性结合分子治疗对其他疾病的作用根据本领域已知的标准进行测量。例如，包括接受用CD20特异性结合分子的治疗的克罗恩氏病患者达到克罗恩氏病活性指数(Crohn’sDisease Activity Index，CDAI)中约50至约70单位的改善，其中缓解为150单位(Simonis等人，Scand.J Gastroent.1998，33：283-8)。150或200的得分视为正常的，而450的得分视为严重疾病得分。进一步希望CD20特异性结合分子的施用导致受炎性肠病侵袭的个体中核周抗嗜中性粒细胞抗体(pANCA)和抗酿酒酵母抗体(ASCA)中的减少。
进一步包括接受用本发明CD20特异性结合分子的治疗的成人和青少年肌炎患者达到核心评估组中的改善，例如测量的6个核心组中的3个改善约20％，其中不超过2个核心测量恶化约25％(参见Rider等人，Arthritis Rheum.2004，50：2281-90)。
进一步包括接受用本发明CD20特异性结合分子的治疗的SLE患者达到系统性红斑狼疮活性测量(Systemic Lupus Activity Measure)(SLAM)或SLE疾病活性指数(SLE Disease Activity Index)(SLEDAI)得分中至少1点的改善(Gladman等人，J Rheumatol 1994，21：1468-71)(Tan等人，Arthritis Rheum.1982，25：1271-7)。＞5的SLAM得分或＞2的SLEDAI得分视为临床上活性疾病。对治疗的应答可以定义为在2种疾病活性测量(SLE疾病活性指数[SLEDAI]和系统性红斑狼疮活性测量)和2种生活质量测量(患者的整体评价和Krupp疲劳严重度量表(Fatigue Severity Scale))中的改善或稳定(Petri等人，Arthritis Rheum.2004，50：2858-68.)。进一步希望CD20特异性结合分子对SLE患者的施用导致抗双链DNA抗体中的减少。备选地，改善可以使用大不列颠群岛狼疮评估组标准(British IslesLupus Assessment Group Criteria)(BILAG)进行测量。关于SLE的其他生物标记包括B细胞子集(新生、记忆、过渡)；CD40L；补体、抗ds-DNA、C1Q；尿生物标记(TWEAK、MIF)。此外，就分化标记而言，FcγRIII状态(高或低亲和力)可以用于使B细胞耗尽和功效关联。减少的补体激活还可以赋予安全优点(基于C3a、C4a、Bb结合)。
进一步包括接受用本发明CD20特异性结合分子的治疗的多发性硬化症患者在Kurtzke扩展残废状态量表(EDSS)(Kurtzke，F.，Neurology 1983，33：1444-52)上达到临床得分中至少0.5的改善，或在Kurtzke量表上临床疾病恶化中至少1.0的延迟(Rudick等人，Neurology 1997，49：358-63)。
进一步包括接受用本发明CD20特异性结合分子的治疗的患有IIM的患者达到特发性炎症性肌病标准(Idiopathic InflammatoryMyopathy Criteria)(IIMC)评估中所述的5个标准中至少一个减少(Miller，F.，同上)。进一步包括给IIM患者施用本发明的CD20特异性结合分子导致选自下述的IIM相关因子的减少：肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶、醛缩酶、C反应蛋白、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、以及抗核自身抗体(ANA)、肌炎特异性抗体(MSA)和针对可提取核抗原的抗体。备选地，符合Rider等人，Arthritis Rheum.2004，50：2281-90中所述的6个标准中的3个的患者可以是根据本发明的治疗的受试者，伴随在不超过2个标准中的恶化。
在一个再进一步的实施方案中，患有B细胞癌症的患者接受用本发明的CD20特异性结合分子的治疗，并且证实对CD20特异性结合分子的总体有利应答，基于本领域众所周知且通常使用的临床标准，并且如下所述，例如肿瘤大小中的减少、肿瘤数目中的减少和/或疾病症状中的改善。
例如，美国国家癌症研究所(U.S.National Cancer Institute)(NCI)已将某些类别的癌症分成“惰性”和“侵袭性”淋巴瘤的临床种类。惰性淋巴瘤包括分成细胞学“级别”的滤泡细胞淋巴瘤、弥散性小淋巴细胞性淋巴瘤/慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、淋巴浆细胞样淋巴瘤/沃尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom′sMacroglobulinemia)、边缘区淋巴瘤和毛细胞白血病。侵袭性淋巴瘤包括弥散性混合和大细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/弥散性小无裂细胞淋巴瘤、成淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和AIDS相关淋巴瘤。在某些情况下，国际预后指数(IPI)在侵袭性和滤泡型淋巴瘤的情况下使用。在IPI中考虑的因素包括年龄(年龄＜60岁对年龄＞60岁)、血清乳酸脱氢酶(正常水平对升高水平)、体力状态(0或1对2-4)(参见下文定义)、疾病分期(I或II对III或IV)、和结节外部位牵涉(0或1对2-4)。具有2种或更多危险因素的患者具有小于50％的无复发机率和5年的总体存活。
侵袭性IPI中的体力状态如下定义：级别描述：0完全能动，能够从事所有疾病前行为而无限制；1在身体上的重体力作业方面有限制，但能走动并且能够从事轻或静坐状态的工作，例如轻室内工作、办公室工作；2能走动并且能够全部自我护理，但不能从事任何工作作业高达且约超过50％的清醒时间；3仅能够有限的自我护理，卧床不起或不能站立超过50％的清醒时间；4完全残废，无法从事任何自我护理，完全卧床不起或不能站立；和5，死亡。(参见，TheInternational Non-Hodgkin’s Lymphoma Prognostic FactorsProject.A predictive model for aggressive non-Hodgkin’slymphoma.N Engl J Med.329：987-94，1993)
一般地，淋巴瘤的级别使用低度淋巴瘤通常呈现为结节疾病并且通常无痛或缓慢生长的标准进行临床评估。中度和高度疾病通常呈现为侵袭性大得多的疾病，伴随大结节外庞大肿瘤。
Ann Arbor分类系统也用于测量肿瘤特别是非霍奇金氏淋巴瘤的进展。在这个系统中，成人NHL的I、II、III和IV期可以分成A和B类，这取决于患者具有(B)且不具有(A)定义明确的泛发症状。B名称给予具有下述症状的患者：在诊断前6个月内无法解释的超过10％体重减轻，体温超过38℃的无法解释的发烧，和湿透性盗汗。分期的定义如下：I期-单个淋巴结区域的牵涉或单个淋巴外器官或部位的局限性牵涉。II期-在横膈膜同一侧上的2个或更多淋巴结区域的牵涉，或单个关联淋巴外器官或部位及其区域淋巴结伴随或不伴随在横膈膜同一侧上的其他淋巴结区域的局限性牵涉。III期-在横膈膜两侧上的淋巴结区域的牵涉，可能伴随淋巴外器官或部位的局限性牵涉，脾脏的牵涉，或两者。IV期-一个或多个淋巴外部位的播散性(多病灶)牵涉伴随或不伴随关联淋巴结的牵涉，或分离的淋巴外器官牵涉伴随遥远的(非区域)结节牵涉。关于进一步的细节，参见TheInternational Non-Hodgkin′s Lymphoma Prognostic FactorsProject：A predictive model for aggressive non-Hodgkin′slymphoma，New England J.Med.(1993)329：987-994。
在一个方面，CD20特异性结合分子的疗效通过应答水平进行测定，例如部分应答定义为肿瘤减少至小于其原始大小的一半。完全应答定义为通过临床或放射学评估证实的疾病的完全消除。在一个实施方案中，接受用本发明CD20特异性结合分子的治疗的个体证实对治疗的至少部分应答。
根据与美国国家癌症研究所合作开发的用于评估NHL的Cheson标准(Cheson等人，J Clin Oncol.1999，17：1244；Grillo-Lopez等人，Ann Oncol.2000，11：399-408)，当存在疾病和疾病相关症状的所有可检测的临床和X线照片证据的完全消失，所有淋巴结回复正常大小，脾的大小已回归，并且骨髓没有淋巴瘤时，获得完全应答。
当患者显示疾病的完全消失并且脾的大小回归，但淋巴结已回归超过75％并且骨髓不确定时，获得未经证实的完全应答。未经证实的完全应答符合且超过关于部分应答的标准。总体应答定义为总体肿瘤负荷中至少50％的减少。
已开发相似标准用于各种其他形式的癌症或过度增生性疾病，并且对于本领域技术人员容易获得。参见例如，Cheson等人，Clin AdvHematol Oncol.2006，4：4-5，其描述了用于评估CLL的标准；Cheson等人，J Clin Oncol.2003，21：4642-9，其描述了用于AML的标准；Cheson等人，Blood 2000，96：3671-4，其描述了用于骨髓增生异常综合征的标准。
在另一个方面，在具有B细胞癌症的患者中对CD20结合分子的治疗性应答表现为与未接受治疗的患者想比较疾病进展缓慢。对缓慢的疾病进展或任何上述因素的测量可以使用本领域众所周知的技术进行，包括骨扫描、CT扫描、镓扫描、淋巴管造影照片、MRI、PET扫描、超声等。
在一个相关方面，为了测定CD20结合分子治疗的功效，测量个体的生物样品中的B细胞数目。在一个实施方案中，生物样品选自血液、肿瘤活组织检查、淋巴结、扁桃体、骨髓、胸腺和其他富含淋巴细胞的组织。富含淋巴细胞的组织是特别富含淋巴细胞的组织，包括但不限于，淋巴结和相关器官(脾、骨髓、扁桃体、胸腺、粘膜淋巴组织)、肿瘤和炎症区域。
还显而易见的是，如果将常规治疗与本发明的治疗组合施用时，可以修改剂量。
进一步包括待通过本发明的方法治疗的个体可以是进行再治疗，例如如果疾病的症状再现或治疗的药代动力学和/或药效学(pharmodynamics)使得此种再治疗可行。在一个实施方案中，对用本发明的CD20结合分子治疗的个体施用另一种CD20特异性结合分子。基于本领域的普通技术，临床医生将能够确定何时指定再治疗，基于例如疾病症状的再现或个体的B细胞恢复至需要再治疗的水平。临床标准和后果的其他测量或标记的例子在本文中进一步描述。可以将通过本发明的方法治疗的个体置于维持治疗时间表上，其中个体用CD20特异性结合分子进行再治疗，这基于CD20特异性结合分子的药代动力学/药效学性质。此种维持治疗一般从初次治疗后约3个月到约2年的任何地方施用。示例性药效学数据包括但不限于，如本文所述的关于疾病改善的生物学测量，例如在血清中的CD20特异性结合分子水平，疾病评估中的改善(例如，通过ACR、SLAM或IPI)，细胞因子或表面标记表达中的改变、自身抗体水平、和肿瘤大小的改变。本领域进一步理解对通过本发明的方法治疗的个体应答中的差异可以使得用CD20特异性结合分子的再治疗的时间选择中的差异成为必需。
作为一个另外的方面，本发明包括试剂盒，所述试剂盒包含以促进其用于实施本发明的方法的方式包装的一种或多种化合物或组合物。在一个实施方案中，此种试剂盒包括本文描述的CD20特异性结合分子化合物或组合物(例如，包含单独或与第二种试剂组合的CD20特异性结合分子的组合物)，包装在容器例如密封瓶或小瓶中，具有描述化合物或组合物在实施该方法中的用途的、附着于容器或包括在包装中的标签。优选地，化合物或组合物以单位剂型包装。试剂盒可以进一步包括适合于根据特定施用途径施用组合物或用于实施筛选测定法的装置。优选地，试剂盒包含描述抗体组合物的用途的标签。
本发明还包含了制造物品。此种物品包含至少一种CD20特异性结合分子，任选连同药物载体或稀释剂，和描述根据本发明的CD20特异性结合分子的使用方法的至少一个标签。此种制造物品还可以任选包含用于与CD20特异性结合分子结合施用的至少一种第二种试剂。
实施例
实施例1：抗CD20SMIP与原代B细胞的结合
原代人B细胞
为了测定抗CD20SMIP与原代B细胞的结合，我们使用阴性选择B细胞分离试剂盒(StemCell Technologies)从血沉棕黄层中分离原代B细胞。使收获的细胞与多种浓度的抗CD20SMIP一起在冰上温育30分钟。随后在0.5％BSA/PBS中洗涤细胞，并且用抗人IgG-PE染色30分钟，并且通过流式细胞术(MFI)在FacsCalibur上进行分析。
如图1中证实的，在这个实施例中分析的所有抗CD20SMIP(TRU-015、018008csc、018008sccp、2LM19-3csc、2LM19-3sccp、2LM20-4csc、2LM16csc、2LM16scc、2LM16sccp、2LM20-4sccp、009csc、009scc、009sccp、018011csc、018011scc、018011sccp)对于在人B细胞上的CD20具有相当的结合亲和力。
表2-在原代B细胞上与P/S突变SMIP的结合


恶性B淋巴样细胞
使用5种人B淋巴瘤细胞系(BCL)的实验对象组检查抗CD20018011、TRU-015和的结合：NU-DHL1、Ramos、SU-DHL4、SU-DHL5和WSU-DLCL2。这些细胞系各自来自不同的非霍奇金氏B细胞淋巴瘤患者。简言之，使浓度渐增的CD20结合剂与100,000BCL一起于4℃温育30分钟。细胞随后用包含1％BSA的PBS洗涤2次，以去除未结合的抗体，并且随后在4℃下加入FITC标记的山羊抗人(H+L)次级抗体(100倍稀释)30分钟。细胞再次洗涤2次，以去除未结合的次级抗体，并且随后重悬浮于具有1％BSA的1％甲醛(在PBS中)中。使用Becton Dickinson FACSORT流式细胞仪测量每种样品的荧光强度。结果表示为荧光强度的几何平均值(GeoMean)。
图2显示了在5种细胞系中的结果。018011证实与这些细胞系中每个的剂量依赖性结合。018008和2Lm20-4也与5种细胞系结合(数据未显示)。018011与Ramos和SWU-DLCL2细胞的结合根据实施例5中的方案通过免疫荧光法(IFA)加以证实
实施例2：抗CD20SMIP的补体依赖性细胞毒性测定法
Ramos细胞
为了测定人抗CD20SMIP的补体依赖性细胞毒性(CDC)水平，使Ramos细胞与抗CD20SMIP在10％人血清(Quidel)的存在下一起于37℃温育3.5小时。通过测量从细胞的LDH释放评估细胞死亡(Promega试剂盒)。
如图3A中所示，TRU-015、2LM 20-4、018008和018011具有针对人Ramos B细胞的相当的CDC活性。
表3-对具有P/S突变SMIP的Ramos细胞的CDC


原代B细胞
同样使用阴性选择B细胞分离试剂盒(StemCell Technologies)从血沉棕黄层中分离原代B细胞。使5x10⁵个B细胞与抗hCD55抗体(2ug/ml)一起于37℃预温育10分钟。随后加入抗CD20SMIP和血清(10％：Quidel)。温育3.5小时后，通过7-AAD染色和FACs分析评估细胞死亡。
如图3B中所示，TRU-015、和2LM 20-4具有针对原代B细胞的相当的CDC活性。当加入IgG对照时，未检测出针对原代B细胞的CDC活性。
SU-DHL4B细胞和BJAB细胞
还研究了人源化抗CD20SMIP介导针对SU-DHL4B细胞淋巴瘤细胞的CDC的能力，其中使用新鲜的人血清作为补体来源。收集人全血并且允许在室温下凝固60分钟，这之后离心试管以收集血清用于CDC分析。在这个研究中，CD20特异性TRU-015和用作阳性对照，并且HER2特异性曲妥珠单抗用作同种型匹配的非结合对照。
SU-DHL4B细胞在96孔平板中与多种量的CD20结合剂一起铺平板。向每个孔中加入由健康志愿者的血液制备的稀释人补体(1∶100)。测试以100μl/孔的最终体积一式三份地进行，其中单独的培养基、单独的细胞、单独的CD20结合剂和单独的补体全都用作对照。于37℃温育4小时后，从培养箱中取出平板并且平衡至22℃(约20-30分钟)。
LDH释放测定法
CYTOTOX-ONE^TM荧光测定法估计在细胞毒性测定法中的非存活细胞数目。它允许快速荧光测量从具有损害细胞膜的细胞中释放的乳酸脱氢酶(LDH)。释放到培养基内的LDH用10分钟偶联酶促测定法进行测量，所述测定法导致刃天青转换成试卤灵。荧光试卤灵产物的产生与LDH的量成比例。
简言之，将等体积的CYTOTOX-ONE^TM加入每个孔中，轻轻振荡30秒，并且进一步于22℃温育10分钟。作为阳性对照，加入2μl裂解缓冲液/孔(一式三份地)，以产生来自细胞的最大LDH释放。温育10分钟后，通过添加50μl停止液来停止酶促反应，并且使平板轻轻振荡10秒。用荧光计在560nm的激发波长和590nm的发射波长处测量荧光。
通过下式计算细胞毒性百分比：

如图4中所示，018011能够与来自2个分开供体的人补体和SU-DHL4B细胞一起介导CDC。这个CDC效应与018011、TRU-015和的浓度成比例。来自2个供体之一的补体较不支持018011的CDC活性，这看起来低于的情况。对于018011这个观察的意义不明。
在使用BJAB细胞作为靶细胞群体的相似研究中，018011和TRU-015都产生针对BJAB细胞的、等价的浓度依赖性补体介导的细胞毒性(图4)。
实施例3：抗CD20SMIP的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定法
使用许多不同的靶细胞测定抗CD20SMIP的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(也称为FcCC)的水平。
BJAB淋巴瘤细胞
在一个实验中，用0.5uM CFSE标记BJAB淋巴瘤细胞。随后使标记细胞与抗CD20结合剂一起温育15分钟，随后添加活化的PBMC(其先前用IL-2和IL-12刺激过夜)。温育6小时后，用PI染色CFSE靶细胞(CFSE⁺)，并且使用流式细胞术评估细胞死亡。
如图5中证实的，TRU-015和2LM20-4介导相当的ADCC活性。使用⁵¹Cr标记的BJAB细胞的其他实验证实018008和018011的ADCC活性(数据未显示)。
Ramos B细胞和SU-DHL4
效应子细胞的制备
通过密度梯度离心使用(Lymphoprep^TM Axis-Shield PoC AS，Norway)分离PBMNC。将全血收集在包含抗凝剂(肝素)的试管中。通过添加等体积的0.9％NaCl稀释血液，并且随后将6ml稀释血液铺层在15ml圆锥管中的3ml Lymphoprep溶液上，并且以800xg在室温下离心20分钟。从界面处回收的单核细胞进行洗涤，并且在ADCC和FcCC测定法中使用。
ADCC方案
效应子和靶细胞以50∶1的比在96孔平板中铺平板，其中将多种浓度的CD20结合剂加入合适孔中。以100μl/孔的最终体积一式三份地进行测试，其中单独的培养基、单独的效应子细胞、单独的靶细胞和单独的CD20结合剂作为对照。如上文在CDC测定法中所述测量荧光信号。
结果
将018011促进Fc介导的细胞毒性(FcCC)的能力针对CD20+SU-DHL4和Ramos BCL进行评估。此外，在这个评估中使用TRU-015、和抗HER2曲妥珠单抗(用作同种型匹配的非结合对照Fc)。来自正常健康供体的新鲜分离的PBMNC在这个评估中用作效应子细胞的来源。PBMNC包括能够介导FcCC的FcγR3/CD16+NK细胞。除NK细胞外，在PBMNC中的单核细胞也表达FcγR，并且具有造成FcCC的能力。图6呈现来自使用CD20+SU-DHL4和Ramos B淋巴瘤细胞的实验的结果。CD20结合试剂各自能够使用人效应子细胞以剂量依赖性方式介导FcCC。
使用其他人源化CD20结合分子的相似实验显示对Ramos B细胞的ADCC活性[图11]。
表4人源化抗CD20SMIP的排序

实施例4抗CD20SMIP的药代动力学和药效学研究。
为了研究抗CD20SMIP的药代动力学和药效学，在食蟹猴中进行26周IV推注药代动力学研究。根据下述处理成年雌性食蟹猴：
表5

从动物组中获得血液样品、淋巴结活组织检查和骨髓抽吸物，以研究测试物品药代动力学。对全血和血清样品实施血液学、流式细胞术和PK分析；对淋巴结活组织检查实施流式细胞术和免疫组织化学分析；通过流式细胞术分析骨髓抽吸物。
动物的临床观察是正常的，测试物品无一与不利征候相关。此外，注意到血红素水平以及血小板、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞计数不受测试物品影响。
外周血的流式细胞术分析显示用10mg/kg 2LM 20-4(野生型)或2LM 20-4mut Fc处理的那些组显示CD19⁺B细胞的强和长效消除(图8)。用2LM 20-4、2LM 20-4mut Fc和Rituxan处理的组显示外周CD19⁺B细胞的相当的耗尽。
骨髓的流式细胞术分析揭示用2LM 20-4、2LM 20-4mut Fc和Rituxan处理的组证实在第8天时骨髓CD19+B细胞的相当的耗尽(图9)。然而，在第22天时，与用2LM 20-4和2LM 20-4mut Fc处理的组比较，Rituxan处理的组具有显著更高数目的CD19+B细胞(图9)。
淋巴结的流式细胞术分析揭示在第8天和第22天时，与2LM 20-4mut Fc比较，2LM 20-4证实更佳的功效(图10)。2LM 20-4显著减少淋巴结CD19⁺B细胞的相对百分比。
在IV施用后在食蟹猴中还获得2LM 20-4和2LM 20-4mut Fc的药代动力学(PK)数据。当以10mg/kg施用时，2LM 20-4和2LM 20-4都显示缓慢的消除速率，伴随对于2LM 20-4的7.2±0.6天半衰期，和对于2LM 20-4mut Fc的5.5±2.4天半衰期(图11)。分配的体积很小，约40-70ml/kg。存在关于1-20mg/kg剂量范围的非线性PK的某些证据。2LM 20-4和2LM 20-4mut Fc的PK谱与Rituxan和TRU-015的PK谱相当。
总之，我们证实人源化抗CD20SMIP，特别是2LM 20-4，显示如果不比Rituxan更佳，也与Rituxan相当的B细胞耗尽功效。
实施例5.体外研究
A.CD20特异性018011针对皮下或系统性播散性人B细胞淋巴瘤异种移植物的体外评估
检查018011针对在裸鼠中生长的人B细胞淋巴瘤异种移植物的临床前抗瘤功效。018011抑制建立的皮下B淋巴瘤异种移植物的生长，并且引起在小鼠中建立的B细胞淋巴瘤异种移植物的退行。在018011的抗瘤活性中不存在明确的剂量应答关系。在播散性B细胞淋巴瘤的小鼠模型中，当在疾病过程的早期施用时，018011保护具有系统性播散性B细胞淋巴瘤的scid小鼠不受后肢麻痹和死亡。
测试和对照分子
CD-20结合分子
使018011(溶解于20mM磷酸钠、240mM蔗糖，pH 6.0中的3.1mg/ml或溶解于10mM组氨酸、5％蔗糖，pH 6.0中的4.09mg/ml)和TRU-015贮藏于-80℃。利妥昔单抗()得自MedWorldPharmacy(Chestnut Ridge，NY)。在使用前使药物在磷酸盐缓冲盐水中稀释。
细胞系
B细胞淋巴瘤(BCL)系Ramos(CRL-1596)得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。弥散性大B细胞淋巴瘤系WSU-DLCL2(ACC-575)得自Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ Braunschweig，Germany)。通过DNA荧光染料染色测定法(Bionique Testing Laboratories，Saranac Lake，NY)测定细胞不含支原体。使细胞维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、10mM HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸)、1mM丙酮酸钠、0.2％葡萄糖、青霉素G钠(100U/ml)、硫酸链霉素(100μg/m)和L-谷氨酰胺(2mM)的RPMI 1640培养基中。在使用前，使用Lymphoprep(Axis Shield PoC AS，Oslo，Norway)密度梯度通过离心(在1000xg下30分钟)分离活细胞。
动物
雌性、BALB/c和nu/nu(裸)鼠(18-23g)和CB17scid雄性小鼠(18-23g)得自Charles River Laboratories，Wilmington，MA。所有小鼠饲养在微型隔离单元中，并且在研究自始至终无限制地提供无菌食物和水。
皮下BCL异种移植物
对雌性、无胸腺(裸)鼠植入Ramos或WSU-DLCL2皮下异种移植物。在Ramos BCL的肿瘤植入前，使另外一组小鼠暴露于全身照射(400rads)，以进一步抑制其残留免疫系统。在背侧、右胁腹中给小鼠注射悬浮在Matrigel(Collaborative Biomedical Products，Belford，MA，在RPMI 1640培养基中1∶1稀释)中的1x10⁷个Ramos细胞或5x10⁶个WSU-DLCL2细胞。当肿瘤达到合适的质量(通常＞100mg)时，在施用治疗前，给它们分期以使肿瘤质量的一致性达到最大(n＝8-10只小鼠/处理组)。化合物在无菌盐水(0.2ml/小鼠)中iv或ip施用。为了考虑018011和之间在分子量上的差异，调整给小鼠施用的每种药物的剂量，以使得每种蛋白质的摩尔等价。因此，施用的量是施用的018011量的约137％。每周至少一次测量肿瘤的长度和宽度(以cm表示)，并且通过下述计算肿瘤质量：肿瘤质量(g)＝[0.5x(肿瘤宽度²)(肿瘤长度)]。计算关于每个处理组的平均(±sem)肿瘤质量，并且使用ANOVA就统计显著性与媒介物处理组比较和通过单尾t检验与媒介物处理组的后续配对比较，其中关于t检验的误差项基于跨越所有处理组的合并方差。记录关于每个处理组的肿瘤质量值直至处理开始后100天或直至肿瘤生长至体重的15％，在这时根据机构规程对这些小鼠实施安乐死。记录在每个研究结束时无肿瘤小鼠的数目。描绘小鼠的存活，并且通过肿瘤质量进行测定；对于存活曲线的计算，具有肿瘤质量≥1.5g的任何小鼠视为死亡，即使小鼠直到肿瘤质量达到小鼠体重的15％才根据机构指导方针被杀死。
针对播散性BCL的抗瘤功效的评估
用3x10⁶个Ramos细胞或5x10⁶个WSU-DLCL2细胞以0.2ml的体积在尾静脉中对雄性scid小鼠进行静脉内注射。在药物疗法开始前，允许细胞的散布和生长的发生经过3天(命名为发展模型)、6天(命名为中间模型)或9天(命名为建立模型)的时间段。在指定天数时给具有播散性疾病的小鼠(9-13只小鼠/处理组)iv施用媒介物(PBS)、018011、TRU-015或每天就后肢麻痹或死亡的出现监控具有播散性疾病的小鼠直至100天。根据机构规程，对显示后肢麻痹的小鼠通过CO₂窒息实施安乐死。
对于每个组计算平均存活时间(天数±SD)。通过使用非参数法测定在组间在存活分布中的差异，比较患病小鼠的存活分布。使用级转化操作(rank transformation procedure)执行多重比较。级转化操作由用其级替换存活时间并对级应用通常的参数F检验组成。使用Tukey’s方法对级执行多重比较。Tukey’s方法指示小鼠中在存活时间中的差异，其中报告的显著性在0.05水平。使用Kaplan-Meier方法(J Am Stat Assoc 1958；53：457-81)构建存活曲线。
从具有播散性Ramos BCL的某些scid小鼠中收集来自股骨的骨髓细胞，并且就人CD19或鼠类CD45抗原的表达进行评估，这是通过与对照FITC标记的大鼠IgG2A、FITC标记的小鼠IgG1、FITC标记的大鼠抗小鼠CD45或FITC标记的小鼠抗人CD19(所有FITC标记的试剂都来自BD Pharmingen，San Diego，CA)一起温育。使细胞形成团块，用PBS-1％BSA洗涤，并且随后用1％甲醛固定。在FACSort流式细胞仪上就人CD19表达细胞的存在或不存在分析样品。人CD19+细胞的数目显示为基于通过表达CD45常见白细胞抗原而鉴定的淋巴样细胞的正面和侧面光散射性质特征门控的细胞群体总数目百分比。
在这个研究中使用的动物在表5中列出。
表6：所使用的小鼠的说明

结果
018011对Ramos皮下异种移植物的作用
媒介物、018011(4mg/kg iv)或(5.5mg/kg iv)以摩尔等价剂量施用于具有建立的Ramos异种移植物的Balb/c小鼠。随着时间的个别小鼠的肿瘤质量显示于图12中(描绘的结果合并自2个分开研究)和存活(基于肿瘤质量＜1.5g)显示于图13中。在使用nu/nu裸鼠进行的另一个研究中，媒介物、018011(8mg/kg ip)、TRU-015(8mg/kg ip)或(11mg/kg ip)以摩尔等价剂量施用于具有建立的Ramos异种移植物的nu/nu小鼠。
在Balb/c小鼠中建立的Ramos异种移植物模型中检查018011和的剂量应答活性，并且在nu/nu小鼠中建立的WSU-DLCL2异种移植物模型中检查018011、和TRU-015的剂量应答活性(表7)。在2个研究中，所有化合物以每隔一日5个剂量(周末除外)通过药物施用的ip途径进行施用。记录无肿瘤小鼠的数目(对于Ramos研究第50天，并且对于WSU-DLCL2研究第100天)。
表7018011、TRU-015和利妥昔单抗对Ramos和WSU-DLCL2异种移植物的作用

018011、TRU-015和利妥昔单抗对Scid小鼠中的播散性淋巴瘤的作用
评估了018011、TRU-015和延长具有系统性播散性B淋巴瘤的CB17scid小鼠的存活的能力。在这个模型中，CD19+CD20+Ramos B淋巴瘤细胞的静脉内注射允许它们快速播散到各个器官包括中枢神经系统内，最终引起后肢麻痹和死亡(Clin Can Res 2004；10：8620-9)。在发展(早)期过程中(治疗在Ramos细胞播散后3天开始)、在疾病的中间期(治疗在肿瘤细胞播散后6天开始)或播散疾病的建立(晚)期(治疗在播散后10天开始)过程中，在具有播散性Ramos B淋巴瘤的scid小鼠中iv施用化合物。如图16中所示，在播散性疾病的发展期(第3天开始)过程中，等摩尔剂量的018011、TRU-015或(分别为2mg/kg、2mg/kg和2.8mg/kg)的施用导致针对发展的播散性疾病的显著保护。018011、TRU-015或的施用延迟至播散后10天导致每种蛋白质的保护活性的显著丧失。在疾病的建立时期过程中，每种化合物给予5个剂量(与发展期中的3个剂量和中间期的4个剂量形成对比)，并且4倍于发展期中施用的剂量(对于018011、TRU-015和分别为8mg/kg、8mg/kg和11.2mg/kg)。即使在这些更高和更延长的给药下，每种化合物在建立的疾病中的活性显著小于在播散模型的发展期过程中的活性。这些结果说明018011、TRU-015和在Ramos播散性疾病模型中，针对发展疾病比建立疾病更有效。
从具有Ramos播散性疾病的小鼠中收集的骨髓就播散性人CD19+Ramos细胞的存在进行检查。来自具有播散性疾病的、媒介物处理的小鼠的大多数骨髓衍生的淋巴样细胞表达CD19抗原，指示在骨髓中存在人淋巴样细胞。在播散性疾病过程的早期中(BCL播散后3天开始)，用018011、TRU-015或处理使骨髓中的人CD19+细胞百分比减少至＜10％(图17)。在早期处理组中的这些小鼠无一呈现后肢麻痹。从疾病过程的建立期(BCL播散后10天开始)中处理的小鼠骨髓中分离的淋巴样细胞接近30％表达人CD19抗原。在这个晚期处理组中的小鼠经历后肢麻痹。人B淋巴瘤细胞在骨髓中的扩展可能指示这些患病小鼠中的疾病进展程度。
在WSU-DLCL2弥散性大B细胞淋巴瘤播散性疾病模型中研究018011、和TRU-015的作用。对于发展模型在肿瘤细胞注射后第3天时开始iv施用治疗性蛋白质，总共3个剂量，而对于建立模型在第10天开始iv施用治疗性蛋白质，总共5个剂量。蛋白质以等价摩尔剂量进行施用。当在疾病过程中早期(发展期)施用时，018011显著(p＜0.05对媒介物处理的小鼠)保护小鼠不受肿瘤细胞诱导的后肢麻痹(图18)，而TRU-015的作用接近统计显著性(p＝0.073对媒介物处理的小鼠)。的作用在发展期中不显著，当在疾病的建立期施用时，3种蛋白质中任何一种的作用都不显著。这些结果类似于当化合物在疾病的建立期过程中施用时在Ramos播散性模型中观察到的那些。
静脉内和腹膜内施用的018011对Ramos皮下异种移植物的作用
在iv和ip药物施用后比较018011(8mg/kg)的抗瘤活性。在肿瘤分期(Balb/c小鼠)后每隔一日5次给予018011，并且监控它的抗瘤活性。2种药物施用途径都显著(p＜0.05)抑制肿瘤生长(图19)。将ip施用的018011的抗瘤活性维持比iv施用的018011的抗瘤活性更长的时间。这个研究证实ip或iv施用的018011在抑制人B细胞淋巴瘤异种移植物的生长方面有效。
018011和利妥昔单抗对照射和未照射的裸鼠中的皮下异种移植物的作用
γ照射可以抑制先天免疫系统，促进肿瘤异种移植物在免疫缺乏的裸鼠中的建立。根据照射还可以影响能够介导治疗性抗体的抗瘤活性的效应子细胞的可能性，在照射(4Gy等价于400rads)或未照射的Balb/c裸鼠中评估018011和针对Ramos B淋巴瘤异种移植物的抗瘤活性。在照射和未照射的小鼠中都建立Ramos异种移植物。在照射和未照射的小鼠中，018011(8mg/kg ip)和(11.2mg/kg ip)各自能够显著(p＜0.05对媒介物处理的小鼠)抑制Ramos B淋巴瘤异种移植物的生长(图20)。与在未照射的小鼠中观察到的比较，在照射小鼠中肿瘤更快速地生长并且每种化合物的抑制作用不够强。这些结果暗示宿主的照射可能负面影响免疫治疗剂例如018011或的治疗活性，所述免疫治疗剂依赖于免疫系统的效应子细胞的功能完整性。照射影响018011的治疗活性的机制仍未研究。
结论
018011在临床前模型中作为抗肿瘤剂起作用。它抑制建立的皮下B淋巴瘤异种移植物的生长，并且当在疾病过程中较早而不是较晚施用时，保护具有播散性B细胞淋巴瘤的小鼠。
B.HuCD20SMIP在裸鼠中建立的Ramos肿瘤异种移植物模型中的功效
下述实验测试了人源化CD20特异性SMIPS(HuCD20SMIPS)在裸鼠中建立的Ramos肿瘤异种移植物模型中的功效。实验一式三份地进行(在此称为(A)、(B)和(C))。使用7.5-8周大的Athymic Nude-Foxnlnu小鼠(Harlan Livermore，CA)。
Ramos肿瘤异种移植物的建立且分选成处理组
Ramos细胞是衍生自伯基特淋巴瘤的CD20⁺人B类成淋巴细胞细胞系。将五百万Ramos细胞皮下注入雌性无胸腺nu/nu小鼠的胁腹内。在肿瘤接种后第6天时，在大多数小鼠中出现可触知肿瘤。将荷瘤小鼠分选成具有等价平均肿瘤体积的组(n＝8/组；对于每个组2个笼，每笼4只小鼠)。分选当天定义为研究的第0天。用测径器测量肿瘤，并且使用下式计算肿瘤体积：V＝1/2[长度x(宽度)²]。关于这个实验的基线平均肿瘤体积是228mm³(A)和(B)或227mm³(C)；中值基线肿瘤大小是228mm³(A)、233(B)或225mm3(C)；并且范围是180-281mm3(A)、168-300mm3(B)或157-300mm3(C)。
用于体内使用的试剂。


不知情方案(blinding protocol)
以相似体积制备PBS和蛋白质(药物)溶液，并且在可去除标记上注明试管的内容物。未处理或评估小鼠的研究者在每个试管上放置颜色编码，并且在实验室笔记中注明试管内容物的编码和身份。用这种设计减少但并未消除研究者偏见的可能性，因为执行研究的研究者仅是部分“不知情的”，因为他们不了解特定小鼠组接受何种处理，但的确了解在一组2个笼内的所有小鼠都属于相同组。在研究结束时揭开编码；然而，知道编码的研究者能够在中间基础上监控研究结果。
体内处理
在第0、2、4、6和8天，用在0.2mL体积中的100μg人IgG、TRU-015、018008、018011或2Lm20-4静脉内(IV)注射小鼠。PBS和药物溶液如上所述进行颜色编码。
监控和终末点
通过目视检查每天监控小鼠。测定重量，并且通过对处理组不知情的观察者(参见上文)用一对测径器每周至少3次测量肿瘤(M、W、F)。如上所述计算肿瘤体积。在所有组中的所有小鼠都活着的最后一天时的肿瘤体积也就相对于第0天的肿瘤体积而言进行表示，使用下式：

在研究中的其余小鼠不具有可触知肿瘤时，重量和肿瘤监控天数变成每周一次。如果肿瘤达到超过1500mm³，那么处死小鼠。应注意死亡不是肿瘤方案中的终末点，并且除非另有说明，小鼠的“存活”由其处死的时间决定。
研究在第90天时结束。
统计分析
所有统计分析使用GraphPad Prism软件来进行。使用单向ANOVA用Dunnett’s多重比较事后检验(用于与huIgG对照的比较)和Tukey’s多重比较事后检验(用于所有其他配对比较)测定在第8天时的平均肿瘤体积或平均相对肿瘤体积中的显著性差异。使用Kaplan-Meier存活分析、用于比较存活曲线的时序检验测定随着时间的小鼠存活中的显著性差异。使用Fisher’s精确检验测定在观察期结束时的无肿瘤小鼠发生率中的显著性差异。p值＜0.05视为显著的。
结果
用TRU-015或用3种HuCD20SMIPS(018008、018011和2Lm20-4)中的任何一种处理小鼠导致相对于对照的肿瘤生长减慢和/或相对于基线测量的肿瘤体积减少(图21-23)。在第8天时huIgG处理组的平均肿瘤体积和平均相对肿瘤体积显著不同于TRU-015、018008和2Lm20-4(仅(C))处理组，这是所有小鼠都活着的最后一天(图22A-22B)。huIgG处理组和任何其他HuCD20SMIP处理组之间或在任何2个HuCD20SMIP处理组之间在平均肿瘤体积或相对肿瘤体积中不存在显著性差异。在第8天时开始处死小鼠；因此在稍后时间点时未进行肿瘤体积的比较。
当肿瘤体积达到上文提及的限制时，处死小鼠。未发现小鼠死亡并且没有一只由于极端重量减轻、肿瘤溃疡形成或活动性受损而处死，因此“存活”时间是肿瘤生长速率的另一个量度。如图23中显示和表8中概括的，huIgG对照组中的中值存活时间为10天。相反，相对于对照组，在各其他小鼠组中的中值存活时间显著增加。在TRU-015、018008、018011和2Lm20-4处理组中小鼠的中值存活时间分别为24.0、88.5、20.5和20.5天(A)，22.0、50.0、11.5和13.5天(B)，或40.5、52、16和83天(C)。这些组的任何2个之间在中值存活时间中不存在显著性差异(表8)。
8只huIgG处理的小鼠在90天观察期结束时无一活着，并且因此在第90天时这个组的无肿瘤发生率是0/8(图24和表8)。在观察期结束时的无肿瘤小鼠发生率在TRU-015处理组中是2/8(25％)(A)或1/8(12.5％)(B)和(C)；在018008处理组中是4/8(50％)(A)、3/8(37.5％)(B)和(C)；在018011处理组中是1/8(12.5％)(A)和(B)或2/8(25％)(C)，并且在2Lm20-4处理组中是1/8(12.5％)(A)和(B)或4/8(50％)(C)。huIgG对照组和任何处理组之间或任何2个其他小鼠组之间在无肿瘤小鼠发生率中不存在显著性差异(表8和9)。
在任何处理组中未观察到明显的毒性症状或重量减轻(图25)。
表8在观察期结束时的中值存活时间和无肿瘤小鼠发生率

  处理组  中值存活时  间(天数)^a  来自时序检  验的p值^b  在第90天时的无  肿瘤小鼠^c  来自Fisher’s  精确检验的p值^b  HuIgG  (200μg)  10  ---  0/8(0％)  ---  TRU-015  (200μg)  24(A)  22(B)^d  40.5(C)  0.0023(A)  0.0001(B)  0.0006(C)  2/8(25％)(A)  1/8(12.5％)(B)  1/8(12.5％)(C)  0.4667(A)  1.0000(B，C)  018008  (200μg)  88.5(A)  50(B)  52(C)  0.0007(A)  0.0079(B)  0.0090(C)  4/8(50％)(A)  3/8(37.5％)(B，C)  0.0769(A)  0.2000(B，C)  018011  (200μg)  20.5(A)  11.5(B)  16(C)  0.0470(A)  0.0198(B)  0.0006(C)  1/8(12.5％)(A，B)  2/8(25％)(C)  1.0000(A，B)  0.4667(C)  2Lm20-4  (200μg)  20.5(A)  13.5(B)  83(C)  0.0061A)  0.0198(B)  0.0001(C)  1/8(12.5％)(A，B)  4/8(50％)(C)  1.0000(A，B)  0.0769(C)
^a通过根据肿瘤生长的其处死时间测定小鼠的“存活”。未发现小鼠由于其他原因死亡或处死。研究在第90天时结束。
^b每个组与HuIgG处理组进行比较。关于其他比较，参见下表9。
^c“无肿瘤”小鼠不具有可触知肿瘤。肿瘤细胞的不存在未通过组织学加以证实。
^d粗体字的值显著不同于HuIgG处理组的那些。
表9关于在TRU-015和HuCD20SMIP处理组之间的存活曲线和无肿瘤发生率比较的p值

^a关于组的信息参见表8的图例
在研究第0天时，将具有可触知Ramos肿瘤的裸鼠分选成处理组(n＝8/组)，从而使得关于每个组的平均肿瘤体积是等价的。在第0、2、4、6和8天时用100μg人IgG、TRU-015、018008、018011或2Lm20-4来IV处理小鼠。在指示天数时用测径器测量肿瘤，并且使用下式计算肿瘤体积：V＝1/2[长度x(宽度)²]。一旦动物由于肿瘤体积超过指定限制而从研究中取出，就推进关于最后一次肿瘤体积的值。结果仅显示到最后一只对照小鼠处死时的第10天。
就第8天(其中所有小鼠都活着的最后时间点)时个别小鼠的肿瘤体积(A)或相对于第0天在第8天时个别小鼠的相对肿瘤体积(B)而言显示结果。使用单向ANOVA用Dunnett’s多重比较事后检验(用于与huIgG处理的对照的比较)和Tukey’s多重比较事后检验(用于所有其他配对比较)测定组间的显著性差异；指出了关于所有配对比较的p值。
处理且监控小鼠，并且如图21的图例中所述测定肿瘤体积。每周至少3次测定肿瘤体积(MWF)，除在研究中的其余所有小鼠都不具有可触知肿瘤的时间段期间监控转变成每周一次。当肿瘤体积达到超过1500mm³(或在星期三时1200mm³)时，处死小鼠。未发现小鼠由于其他原因死亡或处死。
C.人源化CD20结合分子的瘤内累积
通过直接免疫荧光分析(IFA)和流式细胞术评估018011在裸鼠中建立的皮下人B细胞淋巴瘤异种移植物中的瘤内累积，并且与--基准CD20特异性抗体治疗的情况进行比较。2种试剂都以单次静脉内剂量进行施用。如通过流式细胞术评估的，与Ramos或WSDLCL2细胞在体外更大程度结合。这种差异通过IFA分析不明显。WSU-DLCL2皮下异种移植物的IFA分析(试剂iv施用0.5mg)证实关于018011的染色趋于在肿瘤中更分散，而染色看起来更加强，并且不象018011那样一样分散。当试剂以1mg/小鼠的剂量施用并且在施用后24小时或96小时分析时，在Ramos异种移植物中观察到相似结果。从异种移植物中分离的淋巴瘤细胞的流式细胞术分析证实了这个观察。
测试和对照物品
CD-20结合分子
使018011(溶解于20mM磷酸钠、240mM蔗糖，pH 6.0中的3.1mg/ml或L37852-001溶解于10mM组氨酸、5％蔗糖，pH 6.0中的4.09mg/ml)贮藏于-80℃。利妥昔单抗()、曲妥珠单抗()和西妥昔单抗()得自MedWorld Pharmacy(Chestnut Ridge，NY)。在使用前将药物在磷酸盐缓冲盐水中稀释。
细胞系
B细胞淋巴瘤系Ramos(CRL-1596)得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。弥散性大B细胞淋巴瘤系WSU-DLCL2(ACC-575)得自Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ Braunschweig，Germany)。通过DNA荧光染料染色测定法(Bionique Testing Laboratories，Saranac Lake，NY)测定所有细胞系不含支原体。将每种细胞系维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、10mM HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸)、1mM丙酮酸钠、0.2％葡萄糖、青霉素G钠(100U/ml)、硫酸链霉素(100μg/m)和L-谷氨酰胺(2mM)的RPMI 1640培养基中。在使用前，使用Lymphoprep(Axis Shield PoCAS，Oslo，Norway)密度梯度通过离心(在1000x g下30分钟)分离活细胞。
动物
雌性、BALB/c、nu/nu(裸)鼠(18-23g)得自Charles RiverLaboratories，Wilmington，MA。所有小鼠饲养在微型隔离单元中，并且在研究自始至终无限制地提供无菌食物和水。
在这个研究中使用的动物在表10中列出。
表10：使用的小鼠的说明

免疫荧光(IFA)
将Ramos或WSU-DLCL2细胞以500,000个细胞/孔在聚-D-赖氨酸8孔培养载玻片(BD BioCoat目录#354632)上进行铺平板，并且培养过夜。第二天，在5％CO₂的存在下使细胞与100nM曲妥珠单抗或018011一起于37℃温育30分钟。细胞随后用在PBS中的3.75％甲醛和0.2M蔗糖进行固定。通过用PBS洗涤(3x5分钟)以及随后在溶于PBS的0.1M甘氨酸中温育10分钟使细胞再水合。细胞用3％BSA/PBS封闭1小时。所有后续步骤在黑暗中进行。使用在1％BSA/PBS中稀释度为1∶100的Fcγ片段特异的荧光素(FITC)山羊抗人IgG于37℃30分钟来分析特异性结合(Jackson ImmunoResearch Labs目录#109-095-008)。某些载玻片也用R-PE抗小鼠CD31(CaltagLaboratories)进行染色。为了分离小室和载玻片，将小室浸泡在70％MEOH中2分钟，小心不使细胞暴露。向具有盖玻片的每个室中加入1滴具有DAPI复染剂(ProLong anti-fade reagent with DAPI，Invitrogen目录#P36931)的封固剂(mounting media)。使用荧光显微镜(Nikon Eclipse E400)评估免疫荧光。为了允许直接比较，使用相同参数(亮度、对比度、40x放大倍数等)获得所有图像。用Spot RT Slider(Diagnostics Instruments，Sterling heights，MI)数码相机获取图像，并且使用Spot Advanced(版本4.0.9)数字软件进行加工。
瘤内累积到皮下异种移植物内
在背侧、右胁腹中给雌性、无胸腺(裸)鼠注射在Matrigel(Collaborative Biomedical Products，Belford，MA，在RPMI 1640培养基中1∶1稀释)中悬浮的1x10⁷个Ramos细胞。当肿瘤达到合适大小时，将媒介物(PBS)、018011、曲妥珠单抗(用作同种型匹配的、非结合对照)或西妥昔单抗(用作同种型匹配的、非结合对照)iv施用(0.2ml/小鼠)到小鼠的尾静脉内。在24或96小时后摘除肿瘤用于分析。在尸检时对肿瘤称重。摘除的肿瘤在包埋剂(O.T.C.化合物，Tissue-Tek目录#4583，Sakura Fintec Torrance，CA)中进行速冻，并且贮藏于-80℃。用切片机(Tissue-Tek Cryo 2000)切割4微米冷冻切片。使切片风干30分钟并且贮藏于-80℃。切片随后如根据IFA方案(3.1)所述的进行固定和加工。
肿瘤组织消化和流式细胞术
摘除肿瘤并并将其切碎成1-2mm小片。通过于37℃将2ml的2mg/ml母液加入肿瘤小片中30分钟，用4型胶原酶处理(Worthington，Lakewood，NJ)消化肿瘤小片。滴定(titerate)细胞，旋转以收集细胞，并且随后将其重悬浮于新鲜培养基中。随后如实施例1中所述，通过流式细胞术评估经由018011、或曲妥珠单抗与分散的肿瘤细胞的结合。
结果
瘤内累积到皮下异种移植物内
给具有WSU-DLCL2皮下异种移植物(肿瘤质量130mg-270mg)的小鼠施用018011、或曲妥珠单抗(0.5mg/小鼠iv)，并且24小时后摘除肿瘤用于IFA。关于018011的染色趋于比的情况更分散。染色看起来更加强和浓厚，并且不象018011的情况一样分散。切片还就血管进行染色(CD31)。无一试剂看起来在脉管周围累积，两者都能够深度分散到肿瘤内。还用0.2mg/小鼠剂量的018011和处理小鼠。取自0.2mg处理组的肿瘤的IFA证实18011和两者的染色(数据未呈现)，尽管无一试剂在其染色中与在0.5mg处理组中观察到的一样浓厚或分散。
具有Ramos皮下肿瘤(肿瘤质量100mg-400mg)的小鼠用018011、或曲妥珠单抗(所有人IgG1)以1mg/小鼠iv进行处理，并且在注射试剂后24和96小时摘除肿瘤。在24或96小时后，018011染色强度和染色强度看起来一样。类似于使用WSU-DLCL2异种移植物得到的观察，018011染色看起来比的情况更分散，所述的染色更加强和浓厚。曲妥珠单抗产生非常小的本底染色。用于IFA的每个异种移植物组织的部分在摘除时进行消化，并且随后通过流式细胞术分析与异种移植物衍生细胞结合的018011、或曲妥珠单抗的存在(图26)。流式细胞术谱暗示检测出在异种移植物衍生细胞的细胞表面上结合的018011和018011和的结合在量上相似。来自iv注射018011和后96小时分离的异种移植物的细胞具有比在相同处理后24小时分离的那些更高水平的CD20结合剂。不存在与iv注射任一试剂后2小时分离的异种移植物衍生细胞结合的可检测018011和(数据未呈现)。当每种试剂的剂量减至0.5mg/小鼠iv时，看起来相对于018011的染色强度在2个分开研究中略微增强(在给药后24小时评估)，尽管这在研究条件下无法定量。肿瘤质量对于用于产生结果的小鼠为290mg-420mg，并且对于用于产生结果的小鼠为820mg-3000mg。因此，看起来肿瘤大小不显著影响任一试剂的肿瘤累积，因为观察到的结果是相当的，而肿瘤质量在第二个研究中明显更大。当小鼠用更低剂量的任一CD20靶向试剂(0.05、0.1或0.2mg/小鼠iv)进行处理时，018011是检测不到的，而在0.1和0.2mg剂量组观察到最低限度的染色(数据未呈现)。
实施例6.生长抑制
生长抑制测定法
使用MTS--活体染料(Promega，Madison，WI)评估BCL的体外生长。这个测试依赖于MTS通过来自活细胞的完整线粒体转变成有色产物，并且是培养中的活细胞的可靠指示剂。对于6种BCL中的每一种，建立校正曲线(细胞数目对在与MTS约2小时的温育时间后衍生的有色产物的光密度)，以估计合适的起始接种密度。细胞随后以10,000-50,000个细胞/孔的密度接种在96多孔皿中，这取决于细胞系。接种后，使细胞暴露于多种浓度的018011、TRU-015或并且在96小时温育期后，测定在每种培养物中的活细胞数目。
使用通过流式细胞术测量的碘化丙啶(PI)排除来评估018011或与抗人IgG Fc抗体交联的作用。损害细胞的细胞膜允许PI进入细胞并且染色核DNA，而活细胞的细胞膜对于PI是不通透的并且因此PI不能对其核DNA染色。为此，将三万BCL与增加浓度的018011或一起在96孔微孔板中铺平板，随后添加1或10μg/ml的山羊抗人IgG Fc抗体(Jackson Immunoresearch)并且于37℃温育24小时。温育后，通过PI排除以流式细胞术测量细胞存活。使用CellQuest程序(Becton-Dickinson)进行数据分析。
018011针对人B淋巴瘤细胞的生长抑制作用
在体外评估018011抑制各种B淋巴瘤细胞系生长的能力，并且与和TRU-015的情况进行比较。将6种人CD20+B细胞系与增加浓度的个别CD20结合剂一起培养96小时，这之后计数每种培养物中的活细胞数目。如图27中所示，018011、TRU-015、在所研究的6种B淋巴瘤细胞系的5种中都不直接引起生物学意义的生长抑制。例外是SU-DHL4B细胞系，其生长以剂量依赖性方式被TRU-015和抑制，但不被018011显著抑制。因此，CD20的表达是必需的但不足以确保BCL被任何CD20结合剂的直接抑制。除CD20的表面表达程度以外的因素控制B淋巴瘤细胞对这些抗CD20结合剂的敏感性。Ramos细胞表面上的018011或与抗人IgGFc的交联增强2种试剂的细胞毒性活性(图28)。
所有出版物、专利和专利申请通过引用整体合并入本文，其程度与每种个别出版物、专利或专利申请特别且个别指出通过引用整体合并入本文一样。
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                      GAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV
2Lm10  2Hm            RQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGR
                      VTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCA
                      RSVYYSN.YWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：25)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMI
                      WYQQKPGQAPRLLIYAISNLASGIPARFSGSG
                      SGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWISNPITFG
                      QGTKVEIKQVQLVQS
                      GAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV
2Lm11    2Hm          RQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGR
                      VTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      SVYYSN.YWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：26)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMH
                      WYQQKPGQAPRLLIYATSNLASGIPARFSGSG
                      SGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFG
                      QGTKVEIKQVQLVQS
                      GAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV
2Lm12    2Hm          RQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGR
                      VTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      SVYYSN.YWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：27)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMH
                      WYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGS
                      GTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWISNPPTFGQG
                      TKVEIKQVQLVQSGAE
                      VKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAP
2Lm13    2Hm          GQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTR
                      DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      SVYYSN.YWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：28)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMH
                      WYQQKPGQAPRLLIYATSNLASGIPARFSGSGS
                      GTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWISNPPTFGQ
                      GTKVEIKQVQLVQSGA
                      EVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQA
2Lm14    2Hm          PGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMT
                      RDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      SVYYSN.YWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：29)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYIHW
                      YQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSG
                      TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWISNPPTFGQG
2Lm15   2Hm
                      TKVEIKQVQLVQSGA
                      EVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQ
                      APGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVT
                      MTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      SVYYSN.YWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：30)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMH
                      WYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSG
                      SGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFG
                      QGTKVEIKQVQLVQS
                      GAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV
2Lm16   2Hm3          RQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGR
                      VTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：31)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYLS
                      WYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSG
                      SGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFG
                      QGTKVEIKQVQLVQS
                      GAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV
2Lm17-3 2Hm3          RQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGR
                      VTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCA
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：32)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYLT
                      WYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSG
                      SGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFG
                      QGTKVEIKQVQLVQS
                      GAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV
2Lm17-4  2Hm3         RQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGR
                      VTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：33)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYLY
                      WYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGS
                      GTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQ
                      GTKVEIKQVQLVQSGA
                      EVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQA
2Lm17-6  2Hm3         PGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMT
                      RDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：34)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYLH
                      WYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSG
                      SGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFG
                      QGTKVEIKQVQLVQS
                      GAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV
2Lm17-8   2Hm3        RQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGR
                      VTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：35)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYLN
                      WYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSG
                      SGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTF
                      GQGTKVEIKQVQLV
                      QSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMH
2Lm17-
          2Hm3        WVRQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFK
12
                      GRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCA
                      RS.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：36)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYLA
                      WYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSG
                      SGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFG
                      QGTKVEIKQVQLVQS
                      GAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVR
2Lm17-
        2Hm3          QAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVT
14
                      MTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：37)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYLA
                      WYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSG
                      SGTDFTLTIS SLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFG
                      QGTKVEIKQVQLVQS
                      GAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV
2Lm18-2 2Hm3          RQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGR
                      VTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：38)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYLN
                      WYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGS
                      GSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPT
2Lm18-3  2Hm3
                      FGQGTKVEIKQVQLV
                      QSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMH
                      WVRQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKG
                      RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
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                      (SEQ ID NO：39)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYLD
                      WYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSG
                      SGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFG
                      QGTKVEIKQVQLVQS
                      GAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV
2Lm18-4   2Hm3        RQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGR
                      VTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：40)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYLSW
                      YQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSG
                      TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQG
                      TKVEIKQVQLVQSGAE
                      VKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAP
2Lm18-5   2Hm3        GQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTR
                      DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：41)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYLHW
                      YQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGT
                      DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQGTK
                      VEIKQVQLVQSGAEVKK
                      PGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQGL
2Lm18-
          2Hm3        EWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTST
14
                      VYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：42)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYIDW
                      YQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGT
                      DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQGTK
                      VEIKQVQLVQSGAEVK
                      KPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQG
2Lm19-1   2Hm3        LEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTST
                      STVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：43)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYISW
                      YQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSG
                      TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQG
                      TKVEIKQVQLVQSGAE
                      VKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAP
2Lm19-2   2Hm3        GQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTR
                      DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：44)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYIVW
                      YQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGT
                      DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQGT
                      KVEIKQVQLVQSGAEV
                      KKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPG
2Lm19-3  2Hm3         QGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRD
                      TSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：45)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYIAW
                      YQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSG
                      TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQG
                      TKVEIKQVQLVQSGAE
                      VKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAP
2Lm19-4  2Hm3         GQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTR
                      DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：46)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYITW
                      YQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSG
                      TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQG
                      TKVEIKQVQLVQSGAE
                      VKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAP
2Lm19-7  2Hm3         GQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTR
                      DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：47)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYIIW
                      YQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSG
                      TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQG
2Lm19-9  2Hm3
                      TKVEIKQVQLVQSGAE
                      VKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAP
                      GQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTR
                      DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                     (SEQ ID NO：48)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYIPW
                      YQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSG
                      TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQG
                      TKVEIKQVQLVQSGAE
                      VKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAP
2Lm19-
        2Hm3          GQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTR
12
                      DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：49)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYINW
                      YQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSG
                      TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQG
                      TKVEIKQVQLVQSGAE
                      VKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAP
2Lm19-
       2Hm3           GQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTR
14
                      DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：50)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYISW
                      YQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSG
                      TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQG
                      TKVEIKQVQLVQSGAE
                      VKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAP
2Lm20-1  2Hm3         GQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTR
                      DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：51)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYIAW
                      YQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSG
                      TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQG
                      TKVEIKQVQLVQSGAE
                      VKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAP
2Lm20-2  2Hm3         GQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTR
                      DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                     (SEQ ID NO：52)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYIVW
                      YQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSG
                      TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQG
                      TKVEIKQVQLVQSGAE
                      VKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAP
2Lm20-4  2Hm3         GQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTR
                      DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：53)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVNYIYW
                      YQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSG
                      TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQG
                      TKVEIKQVQLVQSGAE
                      VKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAP
2Lm20-8  2Hm3         GQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTR
                      DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：54)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYIDW
                      YQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSG
                      TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQG
                      TKVEIKQVQLVQSGAE
                      VKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAP
2Lm20-
         2Hm3         GQGLEWMGAIYPGNGDTSYNOKFKGRVTMTR
11
                      DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：55)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYHW
                      YQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSG
                      TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQG
                      TKVEIKQVQLVQSGAE
                      VKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAP
2Lm20-
        2Hm3          GQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTR
12
                      DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：56)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYIYW
                      YQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSG
2Lm20-
                      TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQG
       2Hm3
13
                      TKVEIKQVQLVQSGAE
                      VKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAP
                      GQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTR
                      DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
                      S.YYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：57)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMH
                      WYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGS
                      GSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPT
                      FGQGTKVEIKDGGGSGGGGSGGGGTGEVQLV
2Lm5
                      QSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYNMHW   (18009)   2H5m3
                      VRQMPGKGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKG
                      QVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCA
                      RVVYYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：58)
                      EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMH
                      WYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGS
                      GTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFG
                      QGTKVEIKDGGGSGGGGSGGGGTGEVQLLES
2Lm5
                      GGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYNMHWVR   (2Lm5       2H3m3
2H3m3)
                      QAPGKGLEWVSAIYPGNGDTSYNQKFKGRFT
                      ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
                      KSYYSNSYWYFDLWGRGTLVTVSS
                      (SEQ ID NO：59)
                      DQEPKSCDKTHTSPPSS
        铰链
IgG1
        CSSS         (SEQ ID NO：60)
                     APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF
                     N
                     WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKE
        CH2CH        YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQV
IgG1    3            SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS
        WT           KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
                     (SEQ ID NO：61)
                     APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF
                     N
                     WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE
       CH2CH         YKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQV
IgG1   3             SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS
       P331S         KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
                     (SEQ ID NO：62)
                     DQEPKSCDKTHTCPPCP
       铰链
IgG1
       WT            (SEQ ID NO：63)
                     DQEPKSCDKTHTSPPCS
      铰链
IgG1
      CSCS           (SEQ ID NO：64)
                     DQEPKSSDKTHTCPPCS
      铰链
IgG1
      SCCS          (SEQ ID NO：65)
                    DQEPKSSDKTHTCPPCP
      铰链
IgG1
      SCCP          (SEQ ID NO：66)
核苷酸序列
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              ct
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              c
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               c
2Lm19-9
               actctcaccatcagcagtctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtggagtttaacc
               ctcccacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
               (SEQ ID NO：105)
               gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggtgaaagagccaccctctcctgca
               gggccagtcagagtgttagctacattccctggtaccaacagaaacctggccaggcacctaggctcctc
               at
               ctatgccccatccaacctggcttctggaattccagccaggttcagtggcagtggatccgggacagactt
                                                                                                                                                                                             
2Lm19-12       c
               actctcaccatcagcagtctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtggagttttaacc
               ctcccacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
               (SEQ ID NO：106)
               gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggtgaaagagccaccctctcctgca
               gggccagtcagagtgttagctacattaactggtaccaacagaaacctggccaggcacctaggctcctc
               at
               ctatgccccatccaacctggcttctggaattccagccaggttcagtggcagtggatccgggacagactt
               c
2Lm19-14      actctcaccatcagcagtctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtggagttttaacc
              ctcccacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
               (SEQ ID NO：107)
               gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggtgaaagagccaccctctcctgca
               gggccagttccagtgttagctacatttcttggtaccaacagaaacctggccaggcacctaggctcctcat
               ctatgccccatccaacctggcttctggaattccagccaggttcagtggcagtggatccgggacagactt
               c
2Lm20-1        actctcaccatcagcagtctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtggagttttaacc
               ctcccacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
               (SEQ ID NO：108)
               gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggtgaaagagccaccctctcctgca
               gggccagttccagtgttagctacattgcctggtaccaacagaaacctggccaggcacctaggctcctca
               t
               ctatgccccatccaacctggcttctggaattccagccaggttcagtggcagtggatccgggacagactt
               c                                            
2Lm20-2        actctcaccatcagcagtctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtggagttttaacc
               ctcccacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
              (SEQ ID NO：109)
              gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggtgaaagagccaccctctcctgca
              gggccagttccagtgttagctacattgtttggtaccaacagaaacctggccaggcacctaggctcctcat
              ctatgccccatccaacctggcttctggaattccagccaggttcagtggcagtggatccgggacagactt
2Lm20-4       cactctcaccatcagcagtctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtggagttttaaccc
              tcccacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
              (SEQ ID NO：110)
              gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggtgaaagagccaccctctcctgca
              gggccagttccagtgttaactacatttattggtaccaacagaaacctggccaggcacctaggctcctcat
              ctatgccccatccaacctggcttctggaattccagccaggttcagtggcagtggatccgggacagactt
              c
2Lm20-8       actctcaccatcagcagtctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtggagttttaacc
              ctcccacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
              (SEQ ID NO：111)
              gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggtgaaagagccaccctctcctgca
              gggccagttccagtgttagctacattgattggtaccaacagaaacctggccaggcacctaggctcctca
              t
              ctatgccccatccaacctggcttctggaattccagccaggttcagtggcagtggatccgggacagactt
              c
2Lm20-11      actctcaccatcagcagtctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtggagttttaacc
              ctcccacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
               (SEQ ID NO：112)
                 gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggtgaaagagccaccctctcctgca
                 gggccagttccagtgttagctccattatctggtaccaacagaaacctggccaggcacctaggctcctcat
                 ctatgccccatccaacctggcttctggaattccagccaggttcagtggcagtggatccgggacagactt
                 c
2Lm20-12         actctcaccatcagcagtctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtggagttttaacc
                 ctcccacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
                 (SEQ ID NO：113)
                 gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggtgaaagagccaccctctcctgca
                 gggccagttccagtgttagctacatttattggtaccaacagaaacctggccaggcacctaggctcctcat
                 ctatgccccatccaacctggcttctggaattccagccaggttcagtggcagtggatccgggacagactt
                 c
2Lm20-13         actctcaccatcagcagtctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtggagttttaacc
                 ctcccacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
                (SEQ ID NO：114)
                gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgca
                gggccagtcagagtgttagctacatgatctggtaccaacagaaacctggccaggctcctaggctcctca
                t
                ctatgccatatccaacctggcttctggaattccagccaggttcagtggcagtggatccgggacagacttc
2Lm             actctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtggatttctaacc
                ctcccacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
                (SEQ ID NO：115)
                gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggtgaaagagccaccctctcctgca
                gggccagtcagagtgttagcagctacatgcactggtaccaacagaaacctggccaggcacctaggct
                cctcatctatgccccatccaacctggcttctggaattccagccaggttcagtggcagtggatccgggac
2L              agacttcactctcaccatcagcagtctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtggagtttt
                aaccctcccacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
                (SEQ ID NO：116)
                caggcttatctacagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaa
                gg
                cttctggctacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatg
                gattggagctatttatccaggaaatggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactg
                actgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctgacatctgaagactctgcggtc
2H7_mVK         t
                atttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcacagggaccac
                ggtcaccgtctct
                (SEQ ID NO：117)
                     gaggtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagcccggagagtctctgaagatttcctgtaa
                     gg
                     gatccggatacagctttaccagctacaacatgcactgggtgcgccagatgcccgggaaaggcctcga
                     gtg
                     gatgggggctatctatcctggaaatggtgatacatcctacaatcagaagttcaagggccaggtcactatc
2H5m3                tcggccgacaagtccatcagcaccgcctacctgcaatggagcagcctgaaggcctcggacaccgcc
                     atgtattactgtgcacgcagcgtgtactatagtaactactggtacttcgatctctggggccgcggcaccct
                     ggt
                     cactgtctcctct
                     (SEQ ID NO：118)
                     gaggtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagcccggagagtctctgaagatttcctgtaa
                     gg
                     gatccggatacagctttaccagctacaacatgcactgggtgcgccagatgcccgggaaaggcctcga
                     gtg
                     gatgggggctatctatcctggaaatggtgatacatcctacaatcagaagttcaagggccaggtcactatc
2H5                  tcggccgacaagtccatcagcaccgcctacctgcaatggagcagcctgaaggcctcggacaccgcc
                     atgtattactgtgcacgcgtcgtgtactatagtaactcttactggtacttcgatctctggggccgcggcacc
                     ct
                     ggtcactgtctcctct
                     (SEQ ID NO：119)
                     gaggtgcagctgttggagtctggtggaggcttggtacagcctggcggatccctgagactctcct
                     gtgcagcctctggattcacctttagcagctataacatgcactgggtccgccaggctccagggaaggga
                     ct
2H3m3                ggagtgggtctcagctatctatcctggaaatggtgatacatcctacaatcagaagttcaagggccggttc
(huVH3-47构架中      accatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacac
                     gg
的突变CDR3和        ccgtatattactgtgcgaaaagctactatagtaactcctactggtacttcgatctctggggccgcggcac
JH2)
                     cctggtcactgtctcctca
                     (SEQ ID NO：120)
                     caggtgcagctggtgcagtctggtgctgagagcaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaa
                     gg
                     ctagcggatacaccttcaccagctacaatatgcactgggtgcgacaggcgcctggacaagggctcga
                     gtg
2Hm                  gatgggagctatctatcctggaaatggtgatacatcctacaatcagaagttcaagggcagggtcaccat
                     g
(huVH1构架中的       accagagacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggcc
CDR3突变和JH2)       gtgtattactgtgcccgaagcgtgtactatagtaactactggtacttcgatctctggggccgcggcaccct
                     ggt
                    cactgtctcctct
                    (SEQ ID NO：121)
                     caggtgcagctggtgcagtctggtgctgagagcaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcct
                     gcaaggctagcggatacaccttcaccagctacaatatgcactgggtgcgacaggcgcctggacaagg
                     gctcgagtggatgggagctatctatcctggaaatggtgatacatcctacaatcagaagttcaagggcag
2H                   ggtc
                     accatgaccagagacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggaca
(huVH1构架中的       cggccgtgtatttctgtgcccgagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatctctggggccgcg
WT 2H7 CDR和         g
JH2)                 caccctggtcactgtctcctct
                     (SEQ ID NO：122)
                     caggtgcagctggtgcagtctggtgctgagagcaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaa
                     gg
                     ctagcggatacaccttcaccagctacaatatgcactgggtgcgacaggcgcctggacaagggctcga
                     gtg
2Hm3                 gatgggagctatctatcctggaaatggtgatacatcctacaatcagaagttcaagggcagggtcaccat
                     g
(CDR3突变)           accagagacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggcc
                     gtgtattactgtgcccgaagctactatagtaactcttactggtacttcgatctctggggccgcggcaccct
                     ggtcactgtctcctct
                     (SEQ ID NO：123)
                     caggtgcagctggtgcagtctggtgctgagagcaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaa
                     gg
                     ctagcggatacaccttcaccagctacaatatgcactgggtgcgacaggcgcctggacaagggctcga
                     gtg
                     gatgggagctatctatcctggaaatggtgatacatcctacaatcagaagttcaagggcagggtcaccat
2Hm4                 g
                     accagagacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggcc
(CDR3突变)           gtgtattactgtgcccgagtgtactatagtaactcttactggtacttcgatctctggggccgcggcaccct
                     ggt
                     cactgtctcctct
                     (SEQ ID NO：124)
                     caggtgcagctggtgcagtctggtgctgagagcaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaa
                     gg
                     ctagcggatacaccttcaccagctacaatatgcactgggtgcgacaggcgcctggacaagggctcga
2Hm5                 gtg
                     gatgggagctatctatcctggaaatggtgatacatcctacaatcagaagttcaagggcagggtcaccat
(huVH1构架中的       g
                     accagagacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggcc
CDR3突变和JH2)       gtgtattactgtgcccgaagcgtgtactataactcttactggtacttcgatctctggggccgcggcaccct
                     ggtcactgtctcctct
                     (SEQ ID NO：125)
                     gaggtgcagctgttggagtctggtggaggcttggtacagcctggcggatccctgagactctcct
2H3                  gtacagcctctggattcacctttagcagctataacatgcactgggtccgccaggctccagggaaggga
                     ct
(huVH3-47构架中      ggagtgggtctcagctatctatcctggaaatggtgatacatcctacaatcagaagttcaagggccggttc
的WT 2H7 CDR和       accatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacac
                     gg
JH2)                 ccgtatattactgtgcgaaagtcgtgtactatagtaactcctactggtacttcgatctctggggccgcgg
                     caccctggtcactgtctcctct
                     (SEQ ID NO：126)
                     caggcttatctacagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaa
                     gg
                     cttctggctacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctagacagggcctggaatg
                     gattggagctatttatccaggaaatggtgatacttcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactg
2H7mVH               actgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctgacatctgaagactctgcggtc
                     t
                     atttctgtgcaagagtggtgtactatagtaactcttactggtacttcgatgtctggggcacagggaccac
                     ggtcaccgtctct
                     (SEQ ID NO：127)
                     EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT
                     CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY
                     RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
IgG1                 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
铰链和CH2CH3         WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
                     NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
                     (SEQ ID NO：128)
                     MTTPRNSVNGTFPAEPMKGPIAMQSGPKPLFRRMSSLVGPTQSFF
                     MRESKTLGAVQIMNGLFHIALGGLLMIPAGIYAPICVTVWYPLW
                     GGIMYIISGSLLAATEKNSRKCLVKGKMIMNSLSLFAAISGMILSI
                     MDILNIKISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPST
Human CD20           QYCYSIQSLFLGILSVMLIFAFFQELVIAGIVENEWKRTCSRPKSNI
(下划线的是胞外      VLLSAEEKKEQTIEIKEEVVGLTETSSQPKNEEDIEIIPIQEEEEEET
结构域)              ETNFPEPPQDQESSPIENDSSP
                     (SEQ ID NO：129)