由Nakamura等人(2000)描述并由Morse等人(2001)克隆的H4受体是与Gi/o异二聚体偶联的具有390个氨基酸的跨膜蛋白，其激活诱导细胞内钙流动、cAMP的下降和MAP激酶途径的激活。虽然该受体在三维结构上与H1受体相似，但是它们只有35％的同源性。
人们普遍推测：不同的生理学或生理病理学效应将表达一个或另一个组胺受体亚型的激活。这种受体选择性将证明组胺受体亚型的存在。H1受体的激活诱导蛋白Gq的激活，H2受体的激活诱导蛋白Gs的激活，H3受体的激活诱导蛋白Gi/o的激活(Lovenberg等人，1999)。功能上来讲，这些受体的激活是由不同的分子效应表达的。取决于所考虑的H3受体的配体，一些对H4受体具有亲和性。这些包括噻普酰胺(thioperamide)、clobenpropit、imetit和R-α-甲基组胺。此外，受体亚型的分布也是不同的。对于人类来讲，H4受体主要表达于外周组织，例如骨髓细胞和造血细胞(嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞和树突状细胞)。
除了它们的解剖学分布之外，组胺受体在生理病理学中的作用的特异性取决于这些过程中组胺的参与。已经很好地确定了组胺作为过敏症调节子的功能。最近的数据赋予了组胺在调节免疫反应中的功能，更确切地说是通过最近描述的H4受体。H4受体拮抗剂抑制T淋巴细胞的反应，根据细胞凋亡蛋白激酶依赖性过程，H4受体的灭活在体外抑制了针对抗原刺激的细胞免疫反应(Sugata等人，2007)。组胺是速发型过敏反应的重要调节子，但是其也干预抗原递呈细胞的调控(Dy等人，2004)。因此，H4受体的激活诱导免疫活性树突状细胞中的单核细胞分化。当H4受体被激活时，出现IL-12 p70的下降并引起单核细胞的分化(Gutzner等人，2005)。Takeshita等人(2003)公开H4受体直接干预多核中性粒细胞的募集，这种募集或趋向性依赖于肥大细胞。
因此，已经清楚地确定了趋向性的下降以及通过H4受体灭活引起的中性粒细胞渗透的下降。例如，在注射某些试剂例如角叉菜胶引起的炎症的模型中，或者在卵白蛋白刺激导致的炎症的模型中，H4受体拮抗剂的重要性显示作为控制外周炎症现象的假定试剂。主要部分涉及生理病理性症状：
·遗传性过敏皮炎，皮肤瘙痒；
·支气管炎症(哮喘、阻塞性支气管肺病)；
·肠炎症(肠应激综合征)；
·关节炎症(风湿性关节炎)；
·引起血管形成的瘤周基质的炎症及其结果：肿瘤的发生。
H4受体参与皮肤炎症/瘙痒
通过特异性配体例如JNJ7777120抑制H4受体限制了动物中的自我挠搔行为，其中在所述动物中预先通过皮下注射组胺诱导瘙痒(Bell等人，2004)。似乎H4受体拮抗剂的活性高于H1拮抗剂(例如地氯雷他定或西替利嗪)的活性。但是，在该模型中，这些“经典”抗组胺的活性不为零，因此显示H1抗组胺的抗瘙痒效应不依赖于其镇静特性。此外，对于一些剥夺了镇静效应的H1拮抗剂也显示出了这种抗瘙痒活性。另外，H4受体的外周定位确认了一种假设，根据该假设，H4受体的灭活使得能够局部控制影响，而不是中心控制。受体H4的表达确认了这些数据。确实，根据Lippert等人(2004)，人类皮肤肥大细胞表达组胺H4受体，这确认了组胺作为皮肤炎症的自分泌和副分泌调节子的作用。此外已经表明：在没有遗传性过敏症的病人的T淋巴细胞中，组胺通过抑制STAT1蛋白的激活经由H4受体发挥作用。这个信使是激活控制免疫反应和Th1/Th2平衡的转录因子的蛋白。在患有遗传性过敏症的病人的淋巴细胞的情形中，信号仍然是由组胺对H4受体的激活所介导，并最终由干扰素-γ的产生所表达。这个因子引起炎症现象的扩大。在没有遗传性过敏症的病人的细胞中，STAT1的表达已经被降低并且干扰素-γ水平低。因此，在患有遗传性过敏症的病人中H4受体的抑制比健康志愿者中更加有效(Horr等人，2006)。
因此可以得出结论：H1拮抗剂与H4拮抗剂偶联的组合效应将构成旨在限制瘙痒的皮肤病学上的结果(例如疥疮)及其并发症(损伤、感染)的治疗试剂的选择权利。
H4受体参与气道炎症
H4受体在支气管和肺泡上皮中的表达引起研究者探索其在支气管炎症现象(例如哮喘或阻塞性支气管肺病)中的参与。这些使用卵白蛋白刺激的病症的动物模型使得可以确定H4受体在该情况下的作用(Dunford等人，2006)。如前所见，通过特异性拮抗剂将H4受体灭活后限制了趋向性从而限制了中性粒细胞进入发炎的肺部上皮细胞。其结果是打乱了免疫和炎性级联。确实，当H4受体被中和后，CD4 T淋巴细胞不再被激活。此外，化学因子和细胞因子水平下降，结果是T淋巴细胞反应减少。因此，可以合乎逻辑地推出任何H4受体拮抗剂都是抵抗肺部上皮细胞中炎症现象的试剂，不论其来源：中毒，过敏反应或肿瘤诱导的慢性呼吸性窘迫。
H4受体参与肠道炎症
在Varga等人(2005)的研究中提供了H4受体拮抗剂抑制炎症现象的另一个例子。在动物中通过施用三硝基苯诱导结肠的炎症。预先以H4受体拮抗剂进行处理。在最后，经此预处理的动物比对照动物具有更少的组织学炎症得分。与此并行，观察到炎性因子例如TNF-α水平的下降。因此，H4受体抑制剂在病症例如肠应激综合征中显示了其重要性。
H4受体参与关节炎症
在与风湿性关节炎相联的炎症现象中也确定了H4受体的参与。Ikawa等人(2005)通过间接测量来自风湿性关节炎患者的滑膜细胞的样品中的转录本(RT-PCR)分析了H4受体的表达。分析显示在这些样品中H4受体的表达非常高，这提示组胺H4受体在与风湿性关节炎相联的炎性级联中发挥作用。因此，H4受体抑制剂在滑膜细胞的炎性病症中显示出一些重要性。
H4受体参与和肿瘤发生相关的血管形成
在一些肿瘤组织中发现了组胺脱羧酶(一种催化组胺合成的酶)的活性。这并不一定意味着组胺水平的升高引起肿瘤现象的出现，但是，已经清楚地确定：与组织癌化同时出现的炎症涉及组胺。在结肠肿瘤、乳腺肿瘤和子宫内膜肿瘤、小细胞肺肿瘤和黑色素瘤中有组胺脱羧酶的表达。Cianchi等人(2005)的研究成果证明该酶在Caco2、HT29和HCT116细胞中过度表达。在体外，组胺在结肠腺癌的这些培养物中诱导促炎性因子(即前列腺素E2)产量的增加和血管内皮生长因子(VEGF)产量的增加。有可能细胞分裂的增强通过H4受体产生组胺的这种激动效应。确实，这两种生物标记物参与瘤周血管网的发展(血管生成)。组胺对血管发生的激动效应被H4受体抑制剂以及环氧合酶1和2抑制剂所拮抗。虽然由于抗炎能力而知道COX抑制剂的作用，但是最近描述了H4受体拮抗剂的作用及其对于瘤周血管网发生这一现象的有效性。这些数据提示H4受体拮抗剂在血管生成中的用处。此外，这些研究的结果显示通过阻断H4受体而抑制组胺活性降低了培养的结肠腺癌细胞的细胞分裂。
由于以上原因，似乎候选抑制剂应该具有对于H1受体和H4受体的双重结合作用，从而具有抑制组胺介导的外周炎症的完全作用。
在涉及H4受体的皮肤病学病症的情况下，以及为了降低抗组胺诱导的副作用的目的，经皮途径具有优势，因为候选分子具有跨越角膜层并到达其皮下靶标——表达H4受体的肥大细胞的倾向。类似地，在气道炎性病症的情况下，优选为提供盖仑制剂形式，其可能直接到达支气管上皮中的靶标而限制目标药剂的全身渗透。
因此，除了特定的施药途径之外，对与药物的活性代谢物的血浆水平的限制还可以依赖于特定的肝脏代谢，所述肝脏代谢不产生能够加剧最初施用的药物的效应或提高副作用的频率和强度的活性代谢物。
此外，较长的产物半衰期意味着较低的施用频率，这会促进治疗依从性。
本发明的目标是证明10-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪(美喹他嗪的右旋对映异构体；本文中命名为V0162)、10-[(3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪(美喹他嗪的左旋对映异构体；本文中命名为V0114)和两种对映异构体的外消旋混合物10-[(3R，3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪(本文中命名为L0013)的特别的、出人预料的特性。
本发明涉及10-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪，10-[(3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪，或10-[(3R，3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪及其药学上可接受的盐在制备预防或治疗涉及组胺H4受体的病症的药物中的用途。
根据本发明的另一个特征，涉及组胺H4受体的病症选自：遗传性过敏性皮炎、瘙痒和支气管炎症，例如哮喘和阻塞性支气管肺病。
根据本发明的另一个特征，所述药物以适合于口服施用的形式提供，药物包含足以拮抗靶标组胺H4受体的量的活性成分。
根据本发明的另一个特征，所述药物以口服剂量单元提供，从而能够提供1μg/kg至10mg/kg，优选0.01mg/kg至1mg/kg的施用剂量。
根据本发明的另一个特征，所述药物以药片的形式提供。
根据本发明的另一个特征，所述药物以口服喷雾溶液或吸入式粉末的形式提供，特别适合于治疗哮喘或阻塞性支气管肺病。
根据本发明的另一个特征，所述药物用于预防或治疗同时涉及H4受体和毒蕈碱(muscarinic)受体的病症。
根据本发明的另一个特征，涉及前述受体的病症选自呼吸道病症。
根据本发明的另一个特征，前述病症选自肺气肿、哮喘或阻塞性支气管肺病。
根据本发明的另一个特征，本发明延伸至含有10-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪的产品。
根据本发明的另一个特征，所述药物以适合于以局部途径施用的形式提供。
根据本发明的另一个特征，所述药物以凝胶、乳剂或乳膏的形式提供，其中活性成分的浓度按重量计是0.01％至10％。
根据本发明的另一个特征，所述药物用于治疗遗传性过敏性皮炎和瘙痒。
遗传性过敏性皮炎是皮肤的炎性疾病，有时称为遗传性过敏性湿疹，其特征是各种来源(例如细菌、真菌或过敏原)的发痒损伤。
大体上讲，本发明的目标是治疗瘙痒，瘙痒一般被认为是与各种类型的皮肤病损伤相联的发痒的皮肤症状。
最后，本发明还延伸至一种产品，其含有10-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪，10-[(3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪，或10-[(3R，3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪或其药学上可接受的盐，以及H1抗组胺、肾上腺皮质素(corticoid)、长效或速效的抗毒蕈碱和β2-模拟物这类的药物；作为组合产品通过拮抗组胺H4受体以同时、分别或延长用于抗炎治疗。
以下实施例显示：
——上述三种化合物在微摩尔浓度时对于人类组胺H4受体的体外亲和性是有效的。
——化合物作为针对H4受体的反向激动剂发挥作用，这个特性在现有技术中从未被描述过。
——化合物V0114、V0162和L0013的皮肤穿透性和粘膜穿透性是显著的，对于该药效团是特异性的。
——这些化合物的半衰期长，这使得可以设想与这些产品的潜在适应症相容的剂量安排。
所有这些特性组合(作为本专利的例子聚集在一起)以出人预料的方式证明10-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪(右旋对映异构体；本文中命名为V0162)、10-[(3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪(左旋对映异构体；本文中命名为V0114)和外消旋混合物10-[(3R，3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪(本文中命名为L0013)是在涉及H4受体的病症(例如以上所列的那些)中有活性的化合物。
实施例1：10-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪(右旋对映异构体；本文中命名为V0162)、10-[(3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪(左旋对映异构体；本文中命名为V0114)和两种对映异构体的外消旋混合物10-[(3R，3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪(本文中命名为L0013)对人类组胺H4受体的体外亲和性
本研究的目标是确定化合物针对人类组胺H4受体的体外亲和常数。选择的模型是HEK-293细胞，其以稳定方式经过编码人类H4受体的cDNA转染(Liu等人，2001)。首先确定表达每种受体的类型对于配体的亲和性，同时确定其与受体100％结合。对于重组受体的最佳配体是10nM氚化组胺。受体结合定义如下：在过量的冷配体(coldligand)存在的情况下确定的总结合和非特异性结合之间的差异。结果按照以配体模型获得的最佳结合的百分率表示(100％)。
表1：体外受体结合
人类受体
在10μM测定的化合物
编号
抑制(％)
H4
(h)
(10-[(3S)-1-氮杂双环[2.2.2]
辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪)
10-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]
辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪)
(10-[(3R，3S)-1-氮杂双环
[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-
吩噻嗪)
V0114
V0162
33
52
结果显示：V0162、V0114和L0013是以出人预料的方式与人类组胺H4受体强烈结合的化合物。
在第二个系列的实验中，通过来自CHO细胞的膜制备物上的氚化组胺放射性配体的竞争精确测定了这三个化合物的亲和常数，该CHO细胞以稳定方式表达组胺H4受体。
表2：针对H4受体的体外亲和常数的测定
编号
所测的化合物
Ki(μM)
V0114
V0162
L0013
(10-[(3S)-1-氮杂双环
[2.2.2]辛烷-3-基甲
基]-10H-吩噻嗪)
10-[(3R)-1-氮杂双环
[2.2.2]辛烷-3-基甲
基]-10H-吩噻嗪)
(10-[(3R，3S)-1-氮杂双
环[2.2.2]辛烷-3-基甲
基]-10H-吩噻嗪)
2.49±0.37
1.18±0.16
1.63±0.20
这些结果显示：三个化合物显示出与组胺H4受体的亲和性。这些亲和性是微摩尔水平的。这些化合物针对H4受体的活性由以下事实得到加强：三个化合物V0162、V0114和L0013具有跨越皮肤屏障的强烈能力。此外，它们在生物中的长半衰期提示在受体靶标水平上的残余效应。
实施例2：化合物V0162、V0114和L0013作为H4受体的反向激动剂的鉴定
为了确定化合物10-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪(右旋对映异构体；本文中命名为V0162)、10-[(3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪(左旋对映异构体；本文中命名为V0114)和两种对映异构体的外消旋混合物10-[(3R，3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪(本文中命名为L0013)对H4受体的功能影响(激动剂、拮抗剂、反向激动剂)，进行了这些研究。
G蛋白属于在多种必需的细胞功能中作为分子开关的蛋白家族。其调控活性是基于它们在与GDP相关的非活性形式和与GTP相关的活性形式之间循环的能力，后者将作用信号传递至所谓的效应蛋白(位于信号级联的下游)。为了鉴定三个化合物V0162、V0114和L0013对H4受体的功能影响，使用G蛋白激活测试进行了研究。简而言之，测试依赖于各种化合物与受体结合过程中所诱导的与G蛋白结合的[35S]放射标记的GTP的量化。
在附图1和2中以图的形式报告了这些结果。
图1a中显示的G蛋白激活测试的结果表明：三个化合物V0114、V0162和L0013拮抗H4受体上的0.1μM组胺诱导的激活作用，如使用噻普酰胺和选择性的H4拮抗剂JNJ7777120所观察到的那样。已知H4受体具有组成型活性(constitutive activity)，图1b显示化合物V0114、V0162和L0013像噻普酰胺一样作为H4受体的反向激动剂发挥作用(在不存在激动剂时基础活性的下降)，而化合物JNJ7777120是中性拮抗剂。
化合物V0162、V0114、L0013和噻普酰胺的反向激动剂活性肯定是由于对H4受体的作用，因为图2a至2d显示中性拮抗剂JNJ7777120阻断该活性。这些结果综合起来第一次显示化合物V0162、V0114和L0013是H4受体的反向激动剂。这种对于受体灭活的功能将V0162、V0114和L0013与中性拮抗剂家族(例如JNJ7777120)区别开来。
实施例3：在小鼠中组胺诱导的足跖水肿模型中V0114和L0013的体内抗炎活性
本实验的目标是检测V0114、V0162和L0013对于小鼠中组胺诱导的足跖水肿的可能的抗炎活性。测试的原理受Kreutner等人(2000)出版物的启示。所有的组均由10只动物组成。在炎症生成试剂之前的不同时间：120、90、60和30分钟，在预处理中通过口服途径施用产品(25ml/kg)。60分钟之后，经异氟烷麻醉后在爪子中进行注射(10μl)。右爪接受13μg组胺二盐酸盐，左爪接受生理盐水溶液(组胺载体)。注射30分钟之后，通过断颈法使动物安乐死。对爪子进行取样并称重。通过爪子重量的差异(右爪重量减左爪重量)对水肿进行定量。
表3：口服施用之后，体内抗炎活性的确定
所测化合物
实验组
剂量(mg/kg)
预处理(分钟)
炎症的抑制
(％)
|
载体
10
10
-
-
-120
-90
-
-
10
10
-
-
-60
-30
-
-
|
V0114
10
10
10
10
3
3
3
3
-120
-90
-60
-30
-71
-72
-58
-63
V0162
10
10
10
10
3
3
3
3
-120
-90
-60
-30
+12
-5
+25
+2
L0013
10
10
10
10
3
3
3
3
-120
-90
-60
-30
-80
-82
-65
-54
与使用载体在相同的时间进行预处理的组相比，V0114和L0013诱导强烈的和统计学上显著的抗炎效应。当在爪子中注射炎症生成试剂之前90和120分钟进行预处理时，这个活性(对于V0114为-58％至-72％；对于L0013为-54％至-82％)更高。在这些实验条件下，事先120、90、60和30分钟通过口服途径施用V0114和L0013显示出强烈的针对小鼠爪子上的组胺水肿的抗炎效应。V0162不减少这种水肿，这证明其在该模型中没有抗组胺效应。但是，产品是通过口服途径施用的。然而在以下测试中，当直接通过静脉内途径施用时，产品V0162似乎是有活性的。结论是：该研究显示在体外证明的H4抗组胺活性在体内的动物中得到确认。
实施例4：在组胺诱导的小鼠支气管收缩模型中，通过静脉内途径施用V0114和L0013后的体内抗组胺活性
这些实验的目标是评价三个化合物V0162、V0114和L0013在Konzett(1940)天竺鼠模型中针对组胺诱导的支气管收缩的活性。以前我们发现三个化合物在体外显示出针对H4受体的抗组胺活性，而另一方面在体内时，当通过组胺产生炎症时，只有V0114和L0013显示出抗炎活性。似乎当通过口服途径施用时，V0162丧失了其活性。为了分析静脉内途径施用的三种产品的活性，进行了以下测试。使用恒压呼吸泵向动物通气，空气体积为过量的。空气不穿透进入肺，而是到达感应器并测定每次吸气。观测到的差异代表支气管紧张(tonus)的变化。组胺诱导的支气管收缩引起感应器所测的过量体积的升高。通过颈静脉(预先插管)途径施用各种化合物。然后通过静脉内途径以7μg/kg的剂量进行组胺刺激。
表4：静脉内施用化合物之后，体内抗组胺活性的确定
所测的
化合物
实验组
剂量
(mg/kg)
5分钟时的
抑制(％)
30分钟时的
抑制(％)
载体
8
-
0
0
V0114
6
5
5
5
12.5
25
37.5
50
-15±3
-29±3
-51±8
-48±6
-35+6
-71+5
-91+2
-97+2
V0162
5
5
5
25
37.5
50
-17+3
-23+4
-31+12
-9±8
-9±9
-4±10
L0013
6
10
6
5
12.5
25
37.5
50
-35±6
-35±5
-26±4
-37±5
-39±7
-61±5
-51±8
-57±7
在该模型中，组胺诱导支气管收缩。当通过静脉内途径施用时，三个化合物诱导对组胺效应的抑制。因此，施用途径似乎对于达到靶标是重要的。但是，当考虑到30分钟之后的测量时，这个结果被修改。V0162似乎丧失了其拮抗活性，而V0114的这种活性是最大的。
这些实验显示出，在体内经过静脉内施用时候，化合物抵抗在肺水平上产生这种调节子的现象中的组胺的作用。
实施例5：10-[(3R，3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪的皮肤穿透性
最近确定了H4受体在瘙痒中的重要性。因此，参与皮肤病瘙痒的靶向组胺H4受体的拮抗剂能够构成破坏与瘙痒有关的行为的选择的手段，从而避免瘙痒引起的皮肤损伤产生的重复感染。类似地，这样的H4抗组胺将证明可用于预防或减少如前所示的遗传性过敏症中观察到的症状。为此，这对H4抗组胺能跨越皮肤屏障从而到达其靶标皮下肥大细胞是有用的。这些实验的目的是评价10-[(3R，3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪的跨越皮肤屏障的能力。将人类皮肤外植体置于动态扩散室(扩散面积为0.636cm2)中，真皮与受体介质(水；0.9％NaCl 0.9％NaN3 0.1％/乙醇；75/25；v/v)接触。流速为1.5ml/h。在32℃进行本研究。在T＝0时加入含有化合物的溶液(500μl至2.5mg/ml，或10μCi/细胞)。在阻塞的情况下进行皮肤穿透性研究。在第3、6、9、12、16、20和24小时对接收液体进行取样。
结果显示：16小时后，几乎达到了化合物恒定最大流量，在24小时的时候，积累的数量为5.4μg/cm2/h；107μg/cm2。
在24小时的时候表皮和真皮中的化合物数量(图3b)显示出浓度梯度，因此该分子在皮肤中是均匀分布的：
——表皮＝56±17μg/cm2
——真皮＝45±14μg/cm2
——合计＝101μg/cm2
——受体区域＝107±28μg/cm2
本研究显示10-[(3R，3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪是具有良好的皮肤穿透性潜力的分子(大约100μg/cm2/24h)。24小时之后储存在皮肤中的化合物数量等于甚至高于24小时后接收液体中发现的积累数量。
实施例6：在大鼠阻塞性慢性支气管肺病模型中化合物V0114和V0162的抗炎活性的评价
在以下模型中评价了化合物在降低肺部炎症中的重要性。通过慢性雾化将动物暴露于镉剂量中。最终，动物产生炎性反应和肺气肿。在大鼠中验证了这个模型以证实其鉴定潜在的有效分子以治疗与H4受体激活介导的中性炎性反应的持续性相关的慢性呼吸疾病的用途。一旦发生该病症，每天以肺部施用剂量为10μg至50μg的目标化合物(通过雾化施用)处理动物。
结果显示所测化合物部分恢复了呼吸能力，最显著的呼吸速率，增加了吸气和呼气流量。此外，在实验结尾，抽取支气管肺泡液体样品，免疫活性细胞进行计数。结果显示当比较处理组和仅接受安慰剂的动物时，渗透的中性粒细胞下降。
这些实验综合起来确认了所测化合物通过拮抗组胺H4受体的抗炎活性。
三个化合物显示出针对H4受体的受体亲和性。我们确定它们是该受体的反向激动剂。在体外和体内显示了这些抗炎活性并在接受的模型中得到确认。此外，这些化合物具有药物动力学和皮肤穿透特性，这使得能够进行局部施用(皮肤或肺)。以前从未证明过这三个化合物对H4受体的特殊性质和产生的治疗用途。以上例证了这些性质(合在一起或单独考虑)。
这些实施例显示了在组胺H4受体介导的病症中合理使用10-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪，10-[(3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪，或10-[(3R，3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪。此外，以前确定的左旋衍生物(10-[(3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪)和外消旋混合物(10-[(3R，3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪)作为H1受体抑制剂的活性赋予这两个产品H4和H1抗组胺的双重特性。这个双重能力使这些化合物相对于迄今为止的现有技术中描述的抗组胺产品具有优越性。类似地，其它地方清楚确定的右旋衍生物(10-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪)的抗毒蕈碱活性由其H4抗组胺活性得到加强。现有技术中没有描述过化合物10-[(3R，3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪，10-[(3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪，和10-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪的这种双重性质。
另外，本发明显示了V0162和L0013的双重抗H4和抗M1/M3活性在抑制患有哮喘或阻塞性支气管肺病的病人中炎症现象和呼吸性窘迫中的重要性。
受体H4参与涉及免疫活性细胞(主要是嗜酸性粒细胞和巨噬细胞)的募集的病症。因此考虑到使用该受体的配体以限制肺气肿、阻塞性支气管肺病或哮喘中肺水平上的嗜酸性粒细胞的渗透和巨噬细胞的募集。该活性可明智地由解痉活性补充。
出人意料地，V0162或(10-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪)和L0013或(10-[(3R，3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪)证明具有补充性的抗胆碱活性。对于左旋对映异构体V0114或(10-[(3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪)在体内没有观测到该活性。
这两种性质组合在同一个化合物中使得能够预见V0162和/或L0013治疗呼吸病症(例如哮喘和阻塞性支气管肺病)的用途。
实施例7：V0162对毒蕈碱受体的亲和性
本测试的目标是评价化合物对于乙酰胆碱结合M1、M2和M3受体的抑制活性。为此，将固定数量的放射标记的乙酰胆碱与不同剂量的待测化合物V0162、L0013和V0114孵育。
人类受体
所测化合物
IC50(nM)
Kj(nM)
nH
M1
(h)
V0114
V0162
L0013
5.9
1.6
2.1
5.1
1.4
1.8
1.1
1.0
0.8
M2
(h)
V0114
V0162
L0013
94
10
20
66
7
14
1.0
1.1
0.9
M3
(h)
V0114
V0162
L0013
17
5.5
8
12
3.9
5.7
1.0
1.1
1.2
因此，在体外V0162和L0013显示出非常高的针对参与启动、调节和维持支气管肌肉收缩的毒蕈碱受体的亲和性。左旋对映异构体对乙酰胆碱与三个毒蕈碱受体的结合的抑制较弱。该差异在体内更加明显，因为只有V0162和L0013拮抗乙酰胆碱的效应。
实施例8：乙酰胆碱对于呼吸肌肉收缩的效应的抑制
将天竺鼠麻醉并人工通气。通过感应器测定穿透到肺部的空气。因此每次吸气被定量。然后通过静脉内注射乙酰胆碱诱导支气管收缩。乙酰胆碱的效应是直接的和瞬时的支气管紧张的修饰。在效应的峰值处以mm评价乙酰胆碱的支气管收缩效应。注射乙酰胆碱20分钟后，施用待测的各种产品：V0162、L0013和V0114。将产品的效应与阿托品的效应(参考方法)进行比较。
所测化合物
剂量(μg/kg)
抑制百分率(％)
n
载体
-
-
6
V0162
25
50
100
-9±3
-29±4
-37±5
5
5
5
V0114
25
50
100
-7±3
-6±1
-14±4
5
5
5
L0013
25
50
100
-8±1
-25±2
-24±6
5
5
5
阿托品
5
-76±8
5
结果显示V0162和L0013是两种能够诱导抑制乙酰胆碱诱导的支气管痉挛的产品。另一方面，V0114活性不高。
实施例9：L0013的支气管扩张效应，V0114无支气管扩张效应
在雄性Wistar大鼠中(8只大鼠/剂量)口服施用(per os)之后分析V0114(0.5、50和100mg/kg)对于呼吸功能的效应。在相同条件下施用的L0013(100mg/kg)用作参考物质。在相同实验条件下施用的茶碱(100mg/kg)用作参考物质。蒸馏水中的羧甲基纤维素(0.5％)用作对照载体。在测试期的结尾(即施用剂量之后360分钟)，评价动物的行为以及其瞳孔的直径(瞳孔缩小/瞳孔散大)。从每只大鼠抽取血液样品(除了那些与茶碱组有关的之外)以分析血液中物质的浓度。对照载体在吸气时间、呼气时间、吸气峰值流量、呼气峰值流量、呼吸体积、呼吸速率、松弛时间或呼吸暂停没有影响，且在360分钟的测试期之后改进了呼吸暂停。施用之后在呼吸暂停中观察到非常轻微的上升(在对照载体组中在120分钟时最大值为+24％，p＜0.01)。V0114(0.5、50和100mg/kg，p.o.)对于所评价的9个呼吸参数中任何一个都没有显著影响，这与360分钟的测试期之后的对照载体组相反。
L0013(100mg/kg，p.o.)显著提高了呼吸速率(最大值为+80％，对比于对照载体组中的-9％，施用之后60分钟，p＜0.05)。L0013倾向于降低吸气时间(-26％，对比于对照载体组中的+6％，施用之后60分钟)、呼气时间(-24％，对比于对照载体组中的+3％，施用之后60分钟)、松弛时间(-30％，对比于对照载体组中的-2％，施用之后120分钟，)和呼吸体积(-26％，对比于对照载体组中的-6％，施用之后60分钟)。它还倾向于增加吸气峰值流量(+14％，对比于对照载体组中的-13％，施用之后60分钟)、呼气峰值流量(+23％，对比于对照载体组中的-4％，施用之后120分钟)。这些效应表明刺激和支气管扩张呼吸特性。
茶碱(100mg/kg，p.o.)明显且迅速降低吸气时间(-60％，对比于对照载体组中的+6％，施用之后60分钟，p＜0.001)、呼气时间(-63％，对比于对照载体组中的+3％，施用之后60分钟，p＜0.001)和松弛时间(-61％，对比于对照载体组中的+0％，施用之后60分钟，p＜0.001)。茶碱明显且迅速提高吸气峰值流量(+116％，对比于对照载体组中的-13％，施用之后60分钟，p＜0.001)、呼气峰值流量(+121％，对比于对照载体组中的-7％，施用之后60分钟，p＜0.001)和呼吸速率(+223％，对比于对照载体组中的-9％，施用之后60分钟，p＜0.001)。此外，茶碱轻微降低呼吸暂停(-20％，对比于对照载体组中的+15％，施用之后300分钟，p＜0.01)并改进呼吸暂停(-37％，对比于对照载体组中的+19％，施用之后300分钟，p＜0.05)。茶碱还倾向于轻微地、逐渐降低呼吸体积(-17％，对比于对照载体组中的+2％，施用之后120分钟，NS)。这些效应表明了茶碱的刺激和支气管扩张呼吸特性。
在实验结尾(即，施用之后360分钟)，没有观察到施用V0114(0.5、50和100mg/kg)、L0013(100mg/kg)和茶碱(100mg/kg)之后的行为或病态迹象的改变。在以V0114处理的组中，施用之后360分钟，测定了大鼠瞳孔直径，注意到相对于施用50mg/kg有所增加。以同样的方式，在以L0013(100mg/kg)(作为对照物质)处理的大鼠中注意到瞳孔直径可评估的增加。
这些结果提示在雄性Wistar大鼠中口服施用的V0114(0.5、50和100mg/kg)在360分钟的测试期之后对于呼吸功能没有任何影响。
另一方面，L0013(100mg/kg)显示出刺激和支气管扩张呼吸特性的效应。
总之，这些结果表明V0162和L0013除了其H4受体抑制活性之外，还具有抗毒蕈碱的潜力。这两个特性对于制备预防、减少或治疗涉及毒蕈碱和组胺能H4受体的呼吸病症(例如阻塞性支气管肺病、哮喘或任何呼吸功能缺陷)的药物的目的中是重要的。
实施例10：对于呼吸困难的动物以溶液或吸入式粉末施用的V0162的有利效应
乙醇用作通过雾化施用V0162的溶剂。另外，制备了无水粉末制剂。在这些实验中评价了两种盖仑制剂形式：V0162的溶液和含有V0162的吸入粉末。通过V0162(10-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-基甲基]-10H-吩噻嗪)溶液的雾化处理大鼠或以含有V0162的无水粉末的粉化处理大鼠。以各种浓度施用V0162，动物置于暴露室(exposurechamber)。暴露于V0162 15分钟之后，进行乙酰甲胆碱刺激测试。以浓度渐增的乙酰甲胆碱处理动物。显示的数值是每个施用乙酰甲胆碱的步骤之后呼吸系统对气流产生的抗性的数值。结果显示，V0162减轻了呼吸困难，因此增加了剩余功能量(residual functional capacity)。
大鼠中的乙酰甲胆碱刺激测试，两个V0162的吸入制剂(粉末和溶液)的效应。
![]()
通过抑制H4受体的双重抗毒蕈碱和抗炎活性似乎赋予V0162(以粉末或溶液的形式吸入)可广泛开发用于治疗支气管炎症(例如阻塞性支气管病或哮喘)和呼吸性窘迫的真正特性。