绿色木霉真菌及其菌剂的制备和应用 技术领域 本发明涉及植物病害生物防治领域， 具体地说涉及一种能够防治多种植物病害的 绿色木霉菌株， 以及利用该菌株制备生防菌剂的方法和该生防菌剂的应用。
技术背景 植物病害是农业生产的大敌， 据联合国粮农组织 (FAO) 统计每年因植物遭受病害 造成的减产平均损失为总产量的 10％～ 15％。几个世纪以来， 化学农药在植物病虫草害的 防治工作中发挥着积极的作用， 为农业的稳产、 增产及挽回损失等做出了重要的贡献。 但过 量施用和滥用农药业导致了许多负面影响， 如地力衰退、 环境污染、 产生抗药性等。尤其近 年来， 农产品中农药残留超标造成人畜中毒事件不断发生， 严重威胁了人们的生活质量， 限 制了我国农产品的外贸出口。 随着社会文明的发展进步， 人们对无污染、 无公害绿色食品呼 声日益提高， 生物防治已经成为植物病害防治的研究热点， 它在生产方式、 食品安全、 营养 健康、 生态平衡和生物多样性上都和人类未来的发展方向具有良好的相融性。
生防菌作为生物防治的重要一环， 一直是植物病害生物防治研究的热点。生防菌 的种类繁多， 生产上广泛应用的有真菌、 细菌、 放线菌等。其中木霉菌 (Trichoderma.spp) 是被人们较早研究并被开发应用到生产中的生防微生物。它广泛存在于土壤、 植物根际种 子表面等生态环境中， 易于分离和培养， 而且对许多病原真菌和病原细菌有拮抗作用， 具有 良好的生防应用前景。该属真菌具有生长速度快， 适应性强， 产孢量大等优点， 有的菌丝体 内还有厚垣孢子， 易于工业化生产， 并能产生多种抗生物质及酶类， 抑制或减弱病原菌产生 抗药性。因此， 在发展可持续农业呼声越来越高的今天， 它作为一类资源丰富的拮抗微生 物， 在植物病害生物防治中具有举足轻重的作用。据不完全资料统计， 木霉至少对 18 个 属 29 种病原真菌在体外或体内有拮抗作用， 已广泛用于多种植物真菌病害的防治， 特别是 对丝核菌、 镰刀菌、 齐整小核菌、 疫霉菌、 腐霉菌、 链格孢菌等引起的病害具有较好的防治效 果。国内外许多科研人员也已成功的利用木霉菌防治了许多重要的植物病害， 如辣椒白绢 病， 豇豆枯萎病， 棉花立枯病及猝倒病等。近年来， 采用木霉菌防治纹枯病的研究也屡见报 道。
随着人类对生态环境的进一步重视以及农业可持续性发展的需要， 生物防治技术 势必将进一步发展， 特别是现代生物技术的应用必然会开拓生防科技的新领域。微生物农 药的研究和应用在新世纪之初迎来一个前所未有的历史机遇和技术挑战， 产业发展前景十 分广阔。因此， 微生物农药在未来的 10 ～ 20 年里将迅速发展， 在保护环境、 保证人类健康， 在促进农业可持续发展进程中发挥愈来愈重要的作用。
发明内容 本发明旨在为多种植物病害提供一种可用于生物防治的具有高效、 广谱杀菌活性 的绿色木霉菌株， 以及利用该菌株制备生防菌剂的方法， 此外， 还提供了这种绿色木霉在植 物病害防治上的应用。
本发明的目的是通过以下方案实现的。
本发明的绿色木霉真菌菌株命名为绿色木霉 (Trichoderma viride) 菌株 ZBS6， 该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 菌种保藏号为 CGMCC No.3538， 保藏日期为 ： 2009 年 12 月 23 日。其菌落在 PDA 培养平板上圆形或近圆形， 菌丝 生长初期为白色绒状， 后期呈现同心轮纹状的浓绿产孢区。显微镜下观察， 菌丝纤细无色， 具分隔， 多分枝 ； 分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出， 呈环状排列， 具几次重复分枝， 着生分生 孢子的小梗瓶形或锥形 ； 分生孢子多为球形， 绿色或蓝绿色。
本发明所提供的生防菌剂， 由绿色木霉 (Trichoderma viride) 菌株 ZBS6 制备而 成， 为液态或固态菌剂。
上述生防菌剂的制备方法为 ：
(1). 液态菌剂制备方法
将保存的绿色木霉菌株 ZBS6 移入 PDA 培养基平板上， 26℃光暗交替培养 4d， 无菌 7 条件下刮取分生孢子， 用无菌水配制 1×10 的分生孢子悬浮液， 按 1ml 孢子悬浮液 /100ml PDB 培养基进行接种， 置于 26℃， 150rpm 条件下振荡培养 3d， 电动搅拌器以 2000rpm 转速搅 拌 2min， 与 1.9L 磷酸缓冲液混合 ( 内含 0.1％的助剂吐温 100 和 0.2％的防腐剂苯甲酸 )， 即得到液态生防菌剂。 (2). 固态菌剂制备方法
将保存的绿色木霉菌株 ZBS6 移入 PDA 培养基平板上， 26℃光暗交替培养 4d， 无菌 7 条件下刮取分生孢子， 用无菌水配制 1×10 的分生孢子悬浮液， 按 2ml 孢子悬浮液 /100g 基 质培养基进行接种， 26℃光暗交替培养 8-10d 后， 混匀即得固态生防菌剂。
所述的基质培养基物质配成为 ： 麦麸， 玉米粉， 稻糠， 水， 质量比为 ： 2 ∶ 1 ∶ 2 ∶ 5， 即 100g 基质培养基中含有 20g 麦麸， 10g 玉米粉， 20g 稻糠及 50g 水， 混匀后高压湿热灭菌 备用。
本发明所述生防菌剂的施用方法为 ： 液态菌剂通过常规的灌根、 浸种、 喷雾等方法 施用。固态菌剂主要通过根施、 穴施等方法使用。可单独使用， 也可以与对本生防菌株无副 作用的其它杀菌剂、 植物调节剂混合使用。一般在作物播种期或病害始发期施用。播种前， 采用液态菌剂与种子拌种， 或直接根施、 穴施 ； 或在病害始发期， 通过灌根施入作物根际或 通过叶面喷雾， 花蕾和果实表面喷雾施用。
本发明所提供的绿色木霉真菌菌株抑菌谱广， 对包括小麦赤霉病菌， 西瓜枯萎病 菌， 黄瓜灰霉病菌， 梨黑星病菌， 小麦全蚀病菌， 黄瓜疫病菌， 苹果褐斑病菌， 芝麻枯萎病菌， 山药炭疽病菌， 小麦纹枯病菌， 棉花黄萎病菌， 辣椒枯萎病菌、 水稻纹枯病菌和苹果腐烂病 菌等植物病原菌均有较好的抑菌作用， 除对山药炭疽病菌的抑菌率低于 50％外， 其余均在 70％以上， 表现出竞争、 重寄生作用， 对部分病菌还表现出拮抗作用。
本发明提供了由绿色木霉菌株 ZBS6 制备而成的生防菌剂， 室内和田间试验证明 对多种作物病害， 如黄瓜灰霉病、 黄瓜霜霉病、 水稻纹枯病、 小麦纹枯病、 小麦全蚀病、 小麦 白粉病等具有显著的防治效果。
本发明的优点在于 ： 绿色木霉 ZBS6 菌株抑菌谱广泛， 抑菌效果明显， 生防菌剂种 类多， 施用方法范围广， 对多种病害在室内及田间均有较好的抑菌效果。 同时， 对人畜安全， 对环境没有污染， 对生物多样性及生态平衡没有影响， 具有很好的相融性。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。具体实施方式
下述实施例中所用方法， 如无特别说明， 均为常规方法。
实施例 1 ： 绿色木霉 ZBS6 菌株的分离筛选
(1) 木霉的分离纯化将采来的土样阴干、 研磨后， 称取 5g， 放入 150ml 盛有 45ml 生 理盐水的三角瓶中。采用土壤稀释分离法， 吸取 1mL 的稀释液加入到含有 9mL 水的试管中， -2 振荡混匀， 制得 10 土壤稀释液。取 0.1ml 土壤稀释液涂布于含有丙酸钠及硫酸链霉素的 PDA 培养基中， 倒置在 25℃的恒温培养箱中培养 3d。 挑取分离到的木霉菌落， 进行单孢分离 纯化后， 转入 PDA 斜面培养基， 待菌丝及孢子长满斜面后， 加入灭菌石蜡油进行封存备用。
(2) 供 试 病 原 菌 包 括 小 麦 赤 霉 病 菌 (Fusarium graminearum)， 西瓜枯萎病菌 (Fusarium oxysporium)， 黄 瓜 灰 霉 病 菌 (Botrytis cirerea)， 梨 黑 星 病 菌 (Venturia nashicola)，小 麦 全 蚀 病 菌 (Gaeumannomyces grami)，黄 瓜 疫 病 菌 (Phytophthora melonis)， 苹果褐斑病菌 (Marssonina coronaria)， 芝麻枯萎病菌 (Fusarium oxysporum)， 山 药 炭 疽 病 菌 (Colletotrid umgloeosporiodes)，小 麦 纹 枯 病 菌 (Rhizocto-nia cerealis)，棉 花 黄 萎 病 菌 (Verticillium dahliae)，辣 椒 枯 萎 病 菌 (Fusarium oxysporum)、 水稻纹枯病菌 (Rhizoctonia solani) 和苹果腐烂病菌 (Valsmali Miyabe et Yamada)。
(3) 拮抗木霉的筛选对分离纯化到的木霉菌株， 以供试病原真菌为靶标， 采用平板 对峙培养法进行初步筛选。具体方法为 ： 在 9cm PDA 平板上对峙接种活化 3d 的全蚀病菌 及木霉菌饼 (d ＝ 0.8cm)， 两者各距培养皿边缘 1cm， 25℃明暗交替培养， 以单独接种病原菌 的平板作为对照， 每处理重复 3 次， 培养 4d， 定时观察， 记录菌落半径及寄生率， 并计算生长 速率及平板培养 4d 时木霉对病原菌的抑制率。
抑制率 (％ ) ＝ [( 对照菌落半径 - 对峙培养菌落半径 )/ 对照菌落半径 ]×100
(4) 结果从小麦田土中共分离获得 12 株木霉， 分别编号为 ZBS1-ZBS12。木霉菌株 在 PDA 培养基上生长菌落呈近圆形， 初期为白色绒状， 后期呈现绿色至深绿色， 部分木霉呈 现同心轮纹状密实的产孢区。生长速度快， 4d 左右即可长满全皿并大量产孢。
本实施例中， 以小麦全蚀病菌等 12 个病原菌为靶标菌， 通过对峙筛选， 获得了一 株对各种被测试病害均有较强抑菌效果的木霉菌株 ZBS6， 具体抑菌效果见表 1。
表 1 木霉菌株 ZBS6 对各病原菌的抑菌效果
注： “+++” ： 抑菌率 80％以上 ； “++” ： 抑菌率 50-80％ ； “+” ： 抑菌率 20-50 ； “-” ： 抑 菌率＜ 30％
实施例 2 ： ZBS6 菌株的鉴定
(1) 形态学分类鉴定 采用菌落形态观察及显微观测法鉴定木霉， 并检索文献确 定其种类。
(2) 分子鉴定 拮抗木霉基因组 DNA 提取参考吴发红等真菌 DNA 提取方法进行提 取， 并用 ddH2O 溶解 DNA 至 500ng/μl。用于扩增木霉 ITS 序列的上下游引物由上海生工 生物工程技术服务有限公司合成， 分别为 ITS4 ： 5’ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ 和 ITS6 ： 5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ 。以拮抗木霉的基因组 DNA 为模板， 利用引物 ITS4 及 ITS6 进行 PCR 扩增。PCR 反应体系为 25μl ： 10×PCR Buffer 2.5μl， 模板 1μl， dNTP(10mM each)0.5μl， 引物 ITS4(10mM)1μl， ITS6(10mM)1μl， DNA 聚合酶 (5U/μl)0.25μl， 加入 去离子水至 25μl。PCR 扩增条件 ： 94℃ 5min ； 94℃ 1min ； 55℃ 30sec ； 72℃ 1min ； 33 个 循环 ；72℃ 10min。PCR 反应产物采用 1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。600bp 大小目的条带 采用 DNA 回收试剂盒 (AXYGEN 公司 ) 回收纯化后， 与 T- 载体 (Takara PMD-19T) 连接， 转化 感受态细胞， 然后在含有 Amp、 IPTG、 X-Gal 的平板上进行蓝白斑筛选， 并进行菌落 PCR 筛选 出重组质粒。经验证为目的片段的阳性克隆送至上海生工生物有限公司进行测序。测序结 果通过检索 Genbank(http://www.nebi.nlm.nih.gov/Blast/)， 采用 BLAST 进行序列一致 并运用 CLUSTAL 性比较。 同时， 下载木霉属其它种及其它属真菌的模式菌株 rDNA ITS 序列， X(Version 1.8) 软件进行对位排列， 辅以人工校对， 得到的序列使用 MEGA3.1 分子进化遗 传分析软件分析。 在 Kimura 2-parameter 法计算遗传距离的基础上， 采用邻接法构建 NJ 系 统发生树， 系统树各分支的置信度用自举检验法 (bootstrap) 检验， 共进行 1000 次循环。
(3) 结果形态学观察结果表明， 分离纯化后的木霉菌株 ZBS6 菌落在 PDA 培养平板 上圆形或近圆形， 菌丝生长初期为白色绒状， 后期呈现同心轮纹状的浓绿产孢区。显微镜 下观察， 菌丝纤细无色， 具分隔， 多分枝 ； 分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出， 呈环状排列， 具 几次重复分枝， 着生分生孢子的小梗瓶形或锥形 ； 分生孢子多为球形， 绿色或蓝绿色， 检索 文献初步判断木霉菌株 ZBS6 为绿色木霉 (Trichoderma viride)。为进一步确定拮抗木霉 ZBS6 菌株分类地位， 我们以该菌株基因组 DNA 为模板， 用 ITS 序列通用引物扩增出 1 条长度
为 600bp 左右的预期片段， 符合 ITS 在所有真菌中都高度保守且长度恒定的报道。经上海 生工生物技术有限公司进行 DNA 测序， 测得 ZBS6 的 ITS 基因全序列， 包括 ITS1 区、 5.8S 区 及 ITS2 区， 可读序列长度全长为 526bp。将可读的 526bp 序列提交 GenBank， 应用 BLAST 同 源性搜索， 与数据库中各菌株序列进行相似性分析， 与 Trichoderma virens 的菌株一致性 达 100％。 由菌株 ZBS6 及其他模式菌株 rDNA ITS 序列构建的系统进化树分析可以看出， 菌 株 ZBS6 的序列与 Trichoderma viride 聚成一类， 单独构成一个分支， 遗传距离最短， 树支 可靠性达到 81％， 结合其生物学特性及形态学特征， 鉴定该菌株为绿色木霉。
ZBS6-ITS DNA 全序列 ：
1 CCGAGTTTAC AACTCCCAAA CCCAATGTGA ACGTTACCAA ACTGTTGCCT CGGCGGGATC
61 TCTGCCCCGG GTGCGTCGCA GCCCCGGACC AAGGCGCCCG CCGGAGGACC AACCAAAACT
121 CTTATTGTAT ACCCCCTCGC GGGTTTTTTA CTATCTGAGC CATCTCGGCG CCCCTCGTGG
181 GCGTTTCGAA AATGAATCAA AACTTTCAAC AACGGATCTC TTGGTTCTGG CATCGATGAA
241 GAACGCAGCG AAATGCGATA AGTAATGTGA ATTGCAGAAT TCAGTGAATC ATCGAATCTT
301 TGAACGCACA TTGCGCCCGC CAGTATTCTG GCGGGCATGC CTGTCCGAGC GTCATTTCAA
361 CCCTCGAACC CCTCCGGGGG GTCGGCGTTG GGGATCGGCC CTTTACGGGG CCGGCCCCGA 421 AATACAGTGG CGGTCTCGCC GCAGCCTCTC CTGCGCAGTA GTTTGCACAC TCGCATCGGG
481 AGCGCGGCGC GTCCACAGCC GTTAAACACC CCAAACTTCT GAAATG
实施例 3 ： 一种微生物菌剂的制备
(1) 液态菌剂的制备 将保存的绿色木霉菌株 ZBS6 移入 PDA 培养基平板上， 25℃ 7 光暗交替培养 4d， 无菌条件下刮取分生孢子， 用无菌水配置 1×10 的分生孢子悬浮液， 按 1ml 孢子悬浮液 /100ml PDB 培养基进行接种， 置于 25℃， 150rpm 条件下振荡培养 3d， 电动 搅拌器以 2000rpm 转速搅拌 2min， 与 1.9L 磷酸缓冲液混合 ( 内含 0.1％的助剂吐温 100 和 0.2％的防腐剂苯甲酸 )， 即得到液态生防菌剂。
(2) 固态菌剂的制备 将保存的绿色木霉菌株 ZBS6 移入 PDA 培养基平板上， 25℃ 7 光暗交替培养 4d， 无菌条件下刮取分生孢子， 用无菌水配置 1×10 的分生孢子悬浮液， 按 2ml 孢子悬浮液 /100g 基质培养基进行接种， 26℃光暗交替培养 8-10d 后， 混匀即得固态生 防菌剂 ( 基质培养基为 ： 麦麸， 玉米粉， 稻糠， 水， 其质量比为 ： 2 ∶ 1 ∶ 2 ∶ 5， 即 100g 基质 培养基中含有 20g 麦麸， 10g 玉米粉， 20g 稻糠及 50g 水， 混匀后高压湿热灭菌备用 )。
(3) 施用方法 液态菌剂通过常规的灌根、 浸种、 喷雾等方法施用。固态菌剂主要 通过根施、 穴施等方法施用。可单独使用， 也可以与对本生防菌株无副作用的其它杀菌剂、 植物调节剂混合使用。一般在作物播种期或病害始发期施用。播种前， 采用液态菌剂与种 子拌种， 或直接根施、 穴施 ； 或在病害始发期， 通过灌根施入作物根际或通过叶面喷雾， 花蕾 和果实表面喷雾施用。
实施例 4 菌株 ZBS6 在防治黄瓜灰霉病上的应用
(1) 室内对峙
对峙培养结果显示， ZBS6 对黄瓜灰霉病菌菌具有极强的抑菌效果。在 PDA 培养基 上， ZBS6 日平均生长速率在 26.7mm 以上， 对峙培养中， 其日平均生长速度也在 19.5mm 左右， 较灰霉病菌具有明显的生长优势， 表现出强烈的竞争效果 ； 同时， 对峙培养中的灰霉菌菌丝 生长速率 (6.2mm/d) 明显低于单独接种的病原菌菌丝生长速率 (12.8mm/d)， 表明拮抗木霉
在生长过程中分泌出次生代谢产物等抑制了病原菌的正常生长。对峙培养 3 天后， 木霉菌 株 ZBS6 开始寄生病菌菌落， 至第 4 天， 其抑菌率达到 72.7％， 寄生率达到 100％。
(2) 温室大棚防病
实验地点 ： 开封市中牟县刘集镇大冉庄 ( 黄瓜种植大棚 1)
黄瓜品种 ： 津优 1 号
实验时间 ： 2009 年 9-12 月
实验处理 ： ①清水对照
②液态菌剂原液喷雾防治 (10 月中旬后每 10d 喷雾一次， 连续处理 3 次 )
③液态菌剂 10 倍液喷雾防治 (10 月中旬后每 10d 喷雾一次， 连续处理 3 次 )
④ 50％多菌灵可湿粉剂 500 倍液
调查方法 ： (1)11 月 15 日调查病情指数
(2) 每小区采用 5 点取样， 每点调查 2 株， 调查每株的全部叶片黄瓜灰霉病分级标 准：
0级： 无病斑 ；
1级： 单叶片有病斑 3 个
3级： 单叶片有病斑 4-6 个 5级： 单叶片有病斑 7-10 个 7级： 单叶片有病斑 11-20 个， 部分密集成片 9级： 单叶片有病斑密集占叶面积四分之一以上
通过对温室大棚黄瓜的防治实验， 发现 ZBS6 菌剂对大棚番茄灰霉病有较好的防 治效果， 结果见表 2。经 ZBS6 菌剂原液防治后， 其发病率仅为 15％， 明显低于对照的 52％， 防治效果也达到 70.97％， 高于多菌灵防效的 70.28％。
表2： ZBS6 菌剂对大棚番茄灰霉病防治实验结果
实施例 5 菌株 ZBS6 在防治黄瓜霜霉病上的应用 ( 温室大棚防病 ) 实验地点 ： 开封市中牟县刘集镇大冉庄 ( 黄瓜种植大棚 2)黄瓜品种 ： 津优 1 号 实验时间 ： 2009 年 9-12 月 实验处理 ： ①清水对照 ②液态菌剂原液喷雾防治 (10 月中旬后每 10d 喷雾一次， 连续处理 3 次 ) ③液态菌剂 10 倍液喷雾防治 (10 月中旬后每 10d 喷雾一次， 连续处理 3 次 ) ④ 40％乙磷铝可湿性粉剂 200 倍液 调查方法 ： (1)11 月 15 日调查病情指数 (2) 每小区随机取四点调查， 每点调查两株， 每株调查全部叶片黄瓜霜霉病分级标 0级： 无病斑 ； 1级： 病斑面积占整个叶面积的 5％以下 ； 3级： 病斑面积占整个叶面积的 6％ -15％ ； 5级： 病斑面积占整个叶面积的 16％ -25％ ； 7级： 病斑面积占整个叶面积的 26％ -50％ ； 9级： 病斑面积占整个面积的 50％以上。准：
如表 3 试验结果所示， ZBS6 菌剂原液及十倍稀释液对大棚黄瓜霜霉病有极好的防 治效果， 经处理后， 其发病率分别为 41.67％和 33.33％， 低于对照的 75.00％ ； 同时其防效 分别达到 73.87％和 70.11％， 均高于 40％乙磷铝的防效。
表3： ZBS6 菌剂对大棚黄瓜霜霉病防治实验结果
实施例 6 菌株 ZBS6 在防治水稻纹枯病上的应用 ( 田间防病 ) 实验地点 ： 河南省原阳农科所试验地 小麦品种 ： 原稻 1 号 实验时间 ： 2009 年 7 月 施药方法 ： 液态菌剂原液喷雾防治 实验处理 ： ①清水对照②液态菌剂原液喷雾防治 ③ 5％井冈霉素水剂喷雾防治 调查方法 ： (1) 最后一次施药后 10 天进行调查 (2) 每小区对角线五点取样， 每点调查相连 5 株， 共 25 株， 纪录病株数和病级数 水稻纹枯病分级标准 ： 0级： 全株无病 ； 1级： 第四叶片及其以下各叶鞘、 叶片发病 ( 以剑叶为第一片叶 ) ； 3级： 第三片叶及其以下各叶鞘、 叶片发病 ； 5级： 第二片叶及其以下各叶鞘、 叶片发病 ； 7级： 剑叶叶片及其以下各叶鞘、 叶片发病 ； 9级： 全株发病， 提早枯死。
水稻纹枯病的田间防治实验结果如表 4 所示。经 ZBS6 液态菌剂原液喷雾处理后， 其发病率仅为 33.33％， 明显低于对照的 60.00， 但是高于对照药剂处理的 26.67％ ； 其对水 稻纹枯病的防治效果达到 76.68％， 与对照药剂防效相当。
表 4ZBS6 菌剂对水稻纹枯病田间防治效果
实施例 7 菌株 ZBS6 在防治小麦纹枯病上的应用
(1) 室内对峙
对峙培养结果显示， ZBS6 对小麦纹枯病菌具有极强的抑菌效果。 在 PDA 培养基上， ZBS6 日平均生长速率在 26.7mm 以上， 对峙培养中， 其日平均生长速度也在 21.5mm 左右， 较 纹枯病菌具有较明显的生长优势， 表现出强烈的竞争效果 ； 同时， 对峙培养中的纹枯菌菌丝 生长速率 (7.2mm/d) 明显低于单独接种的病原菌菌丝生长速率 (13.4mm/d)， 表明拮抗木霉 在生长过程中分泌出次生代谢产物等抑制了病原菌的正常生长。对峙培养 3 天后， 木霉菌 株 ZBS6 开始寄生病菌菌落， 小麦纹枯病菌的生长受到明显的抑制， 至第 4 天， 其抑菌率达到 75.5％， 寄生率也达到 100％， 此后抑制率一直保持这一水平。
(2) 代谢产物拮抗实验
将玻璃纸剪成直径大小 9cm 的圆片， 高温灭菌后， 无菌条件下贴在 PDA 培养基表 面。将 ZBS6 菌饼接种于贴有玻璃纸的 PDA 培养基表面， 设覆盖玻璃纸但不接菌的培养基为 对照。25℃条件下， 明暗交替培养， 待菌株 ZBS6 长满皿后， 将含有菌落的玻璃纸移掉， 将小 麦纹枯病菌菌饼接入含木霉代谢物的培养皿中， 25℃条件下黑暗培养， 每处理重复 3 次， 7d 后观察结果。实验结果表明， 在含有木霉代谢物的培养皿中， 小麦纹枯病菌完全受到抑制， 不能长出新鲜菌丝， 而对照中， 小麦纹枯病菌生长正常， 7d 即可长满全皿。 说明 ZBS6 可以产 生某种或多种代谢物来抑制小麦纹枯病菌的生长。
(3) 室内盆栽
本实验在河南省农业科学院的温室内进行， 供试小麦品种为 9023， 供试病原菌为 小麦纹枯病菌， 采用带菌麦粒培养基拌土的方式进行病原菌接种 ( 带菌麦粒培养基 ： 土＝ 1 ∶ 15)， 供试药剂对照为 50％多菌灵 WP( 江阴市福达农化有限公司 ) 及 5％井冈霉素水剂， 每处理 3 个重复， 每重复用土 500g， 播种 20 粒种子。
试验共设 7 个处理。
①清水对照
②接菌对照
③ ZBS6 液态菌剂原液浸种 2h， 直接播种 ④ ZBS6 液态菌剂播种 7d 后灌根， 每株 5ml 菌剂量 ⑤固态菌剂拌土处理 ( 菌剂 ： 土＝ 1 ∶ 49) ⑥ 50％多菌灵 WP 灌根 ⑦ 5％井冈霉素水剂 50× 液浸种
分级标准 ： 0级： 不发病1级： 叶鞘发病但茎杆不发病
3级： 叶鞘发病， 并侵入茎了， 但茎杆病斑环茎不足 1/2
5级： 茎杆病斑环茎超过 1/2， 但不倒伏或折断
7级： 枯死、 倒伏、 枯白穗
通过温室盆栽试验， 结果表明， 在所有生防处理中， 以 ZBS6 液态菌剂进行灌根处 理的防效最高， 达到 70.89， 仅略低于 5％井冈霉素效果， 但是高于 50％多菌灵。而 ZBS6 液 态菌剂浸种处理效果不明显， 防效不到 50％， 可能由于菌剂未能充分被麦粒吸附。此外， 经 ZBS6 菌剂处理后， 小麦出苗率均有一定程度的提高。
表 5ZBS6 菌剂对小麦纹枯病的防治作用
实施例 8 菌株 ZBS6 在防治小麦全蚀病上的应用
(1) 室内对峙
对峙培养结果显示， ZBS6 对小麦全蚀病菌具有极强的抑菌效果。 在 PDA 培养基上， ZBS6 日平均生长速率在 26.7mm 以上， 对峙培养中， 其日平均生长速度也在 24.8mm 左右， 较 全蚀病菌具有明显的生长优势， 表现出强烈的竞争效果 ； 同时， 对峙培养中的全蚀病菌菌丝 生长速率 (5.1mm/d) 明显低于单独接种的病原菌菌丝生长速率 (11.4mm/d)， 表明拮抗木霉 在生长过程中分泌出次生代谢产物等抑制了病原菌的正常生长。对峙培养 3 天后， 木霉菌 株 ZBS6 开始寄生病菌菌落， 小麦全蚀病菌的生长受到明显的抑制， 至第 4 天， 其抑菌率达到 82.5％， 寄生率也达到 80％， 此后抑制率一直保持这一水平。
(2) 代谢产物拮抗实验
将玻璃纸剪成直径大小 9cm 的圆片， 高温灭菌后， 无菌条件下贴在 PDA 培养基表 面。将 ZBS6 菌饼接种于贴有玻璃纸的 PDA 培养基表面， 设覆盖玻璃纸但不接菌的培养基为 对照。25℃条件下， 明暗交替培养， 待菌株 ZBS6 长满皿后， 将含有菌落的玻璃纸移掉， 将小 麦全蚀病菌菌饼接入含木霉代谢物的培养皿中， 25℃条件下黑暗培养， 没处理重复 3 次， 7d 后观 察结果。 实验结果表明， 在含有木霉代谢物的培养皿中， 小麦全蚀病菌完全受到抑制， 不能长出新鲜菌丝， 而对照中， 小麦全蚀病菌生长正常， 7d 即可长满全皿。 说明 ZBS6 可以产 生某种或多种代谢物来抑制小麦全蚀病菌的生长。
(3) 田间防病
实验地点 ： 河南省原阳农科所试验地
小麦品种 ： 矮抗 58
实验时间 ： 2009 年 10 月 -2010 年 5 月
施药方法 ： 播种后固态菌剂穴施及播种前液态菌剂浸种
实验处理 ： ①清水对照
②固态菌剂穴施 (2g/ 穴 )
③液态菌剂原液浸种
④全蚀净拌种
调查方法 ： (1) 拔节期进行根系调查一次， 收获前 7-10 天调查每小区的白穗率 (2) 每小区随机五点取样调查， 调查白穗每点取 1m 双行调查总穗数及白穗数。根系调查每点取
20 株根样， 用铁锹将整株挖出， 水中清洗干净， 在白色背景下调查根系发病情况。
小麦全蚀病分级标准 ：
0级： 无病
1级： 根系发病面积占 1％ -5％
3级： 根系发病面积占 6％ -20％
5级： 根系发病面积占 21％ -40％
7级： 根系发病面积占 41％ -60％
9级： 根系发病面积占 61％以上
由表 6 可以看出， ZBS6 菌剂对小麦全蚀病菌具有一定的防治效果， 采用不同的处 理方法， 其发病率均明显降低 ； 防效也均在 50％以上， 略低于对照药剂全蚀病的防治效果， 其中， 采用穴施的方法， 效果相对更好。
表 6ZBS6 菌剂对小麦全蚀病田间防治效果
实施例 9 菌株 ZBS6 在防治小麦白粉病上的应用 ( 田间防病 )
实验地点 ： 河南省农科院二基地 ( 原阳 )
小麦品种 ： 泛麦 8 号
实验时间 ： 2009 年 5 月
施药方法 ： 液态菌剂原液喷雾防治
调查方法 ： (1) 施药前调查病情基数， 施药后两周再调查病情指数
(2) 每小区对角线 5 点取样， 每点调查 4 株， 共 20 株。记录病株数， 计算病情指数 及防治效果。
小麦白粉病分级标准
0级： 无病 ；
1级： 病斑面积占整片叶面积的 5％以下 ；
3级： 病斑面积占整片叶面积的 6 ～ 15％ ；
5级： 病斑面积占整片叶面积的 15 ～ 25％ ；
7级： 病斑面积占整片叶面积的 26 ～ 50％ ；
9级： 病斑面积占整片叶面积的 50％以上。
小麦白粉病的田间防治实验结果如表 7 所示。 ZBS6 菌剂对小麦白粉病的防治效果 达到 60.36％， 与对照药剂防效相当。
表 7 ZBS6 菌剂对小麦白粉病田间防治效果
技术背景 植物病害是农业生产的大敌， 据联合国粮农组织 (FAO) 统计每年因植物遭受病害 造成的减产平均损失为总产量的 10％～ 15％。几个世纪以来， 化学农药在植物病虫草害的 防治工作中发挥着积极的作用， 为农业的稳产、 增产及挽回损失等做出了重要的贡献。 但过 量施用和滥用农药业导致了许多负面影响， 如地力衰退、 环境污染、 产生抗药性等。尤其近 年来， 农产品中农药残留超标造成人畜中毒事件不断发生， 严重威胁了人们的生活质量， 限 制了我国农产品的外贸出口。 随着社会文明的发展进步， 人们对无污染、 无公害绿色食品呼 声日益提高， 生物防治已经成为植物病害防治的研究热点， 它在生产方式、 食品安全、 营养 健康、 生态平衡和生物多样性上都和人类未来的发展方向具有良好的相融性。
生防菌作为生物防治的重要一环， 一直是植物病害生物防治研究的热点。生防菌 的种类繁多， 生产上广泛应用的有真菌、 细菌、 放线菌等。其中木霉菌 (Trichoderma.spp) 是被人们较早研究并被开发应用到生产中的生防微生物。它广泛存在于土壤、 植物根际种 子表面等生态环境中， 易于分离和培养， 而且对许多病原真菌和病原细菌有拮抗作用， 具有 良好的生防应用前景。该属真菌具有生长速度快， 适应性强， 产孢量大等优点， 有的菌丝体 内还有厚垣孢子， 易于工业化生产， 并能产生多种抗生物质及酶类， 抑制或减弱病原菌产生 抗药性。因此， 在发展可持续农业呼声越来越高的今天， 它作为一类资源丰富的拮抗微生 物， 在植物病害生物防治中具有举足轻重的作用。据不完全资料统计， 木霉至少对 18 个 属 29 种病原真菌在体外或体内有拮抗作用， 已广泛用于多种植物真菌病害的防治， 特别是 对丝核菌、 镰刀菌、 齐整小核菌、 疫霉菌、 腐霉菌、 链格孢菌等引起的病害具有较好的防治效 果。国内外许多科研人员也已成功的利用木霉菌防治了许多重要的植物病害， 如辣椒白绢 病， 豇豆枯萎病， 棉花立枯病及猝倒病等。近年来， 采用木霉菌防治纹枯病的研究也屡见报 道。
随着人类对生态环境的进一步重视以及农业可持续性发展的需要， 生物防治技术 势必将进一步发展， 特别是现代生物技术的应用必然会开拓生防科技的新领域。微生物农 药的研究和应用在新世纪之初迎来一个前所未有的历史机遇和技术挑战， 产业发展前景十 分广阔。因此， 微生物农药在未来的 10 ～ 20 年里将迅速发展， 在保护环境、 保证人类健康， 在促进农业可持续发展进程中发挥愈来愈重要的作用。
发明内容 本发明旨在为多种植物病害提供一种可用于生物防治的具有高效、 广谱杀菌活性 的绿色木霉菌株， 以及利用该菌株制备生防菌剂的方法， 此外， 还提供了这种绿色木霉在植 物病害防治上的应用。
本发明的目的是通过以下方案实现的。
本发明的绿色木霉真菌菌株命名为绿色木霉 (Trichoderma viride) 菌株 ZBS6， 该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 菌种保藏号为 CGMCC No.3538， 保藏日期为 ： 2009 年 12 月 23 日。其菌落在 PDA 培养平板上圆形或近圆形， 菌丝 生长初期为白色绒状， 后期呈现同心轮纹状的浓绿产孢区。显微镜下观察， 菌丝纤细无色， 具分隔， 多分枝 ； 分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出， 呈环状排列， 具几次重复分枝， 着生分生 孢子的小梗瓶形或锥形 ； 分生孢子多为球形， 绿色或蓝绿色。
本发明所提供的生防菌剂， 由绿色木霉 (Trichoderma viride) 菌株 ZBS6 制备而 成， 为液态或固态菌剂。
上述生防菌剂的制备方法为 ：
(1). 液态菌剂制备方法
将保存的绿色木霉菌株 ZBS6 移入 PDA 培养基平板上， 26℃光暗交替培养 4d， 无菌 7 条件下刮取分生孢子， 用无菌水配制 1×10 的分生孢子悬浮液， 按 1ml 孢子悬浮液 /100ml PDB 培养基进行接种， 置于 26℃， 150rpm 条件下振荡培养 3d， 电动搅拌器以 2000rpm 转速搅 拌 2min， 与 1.9L 磷酸缓冲液混合 ( 内含 0.1％的助剂吐温 100 和 0.2％的防腐剂苯甲酸 )， 即得到液态生防菌剂。 (2). 固态菌剂制备方法
将保存的绿色木霉菌株 ZBS6 移入 PDA 培养基平板上， 26℃光暗交替培养 4d， 无菌 7 条件下刮取分生孢子， 用无菌水配制 1×10 的分生孢子悬浮液， 按 2ml 孢子悬浮液 /100g 基 质培养基进行接种， 26℃光暗交替培养 8-10d 后， 混匀即得固态生防菌剂。
所述的基质培养基物质配成为 ： 麦麸， 玉米粉， 稻糠， 水， 质量比为 ： 2 ∶ 1 ∶ 2 ∶ 5， 即 100g 基质培养基中含有 20g 麦麸， 10g 玉米粉， 20g 稻糠及 50g 水， 混匀后高压湿热灭菌 备用。
本发明所述生防菌剂的施用方法为 ： 液态菌剂通过常规的灌根、 浸种、 喷雾等方法 施用。固态菌剂主要通过根施、 穴施等方法使用。可单独使用， 也可以与对本生防菌株无副 作用的其它杀菌剂、 植物调节剂混合使用。一般在作物播种期或病害始发期施用。播种前， 采用液态菌剂与种子拌种， 或直接根施、 穴施 ； 或在病害始发期， 通过灌根施入作物根际或 通过叶面喷雾， 花蕾和果实表面喷雾施用。
本发明所提供的绿色木霉真菌菌株抑菌谱广， 对包括小麦赤霉病菌， 西瓜枯萎病 菌， 黄瓜灰霉病菌， 梨黑星病菌， 小麦全蚀病菌， 黄瓜疫病菌， 苹果褐斑病菌， 芝麻枯萎病菌， 山药炭疽病菌， 小麦纹枯病菌， 棉花黄萎病菌， 辣椒枯萎病菌、 水稻纹枯病菌和苹果腐烂病 菌等植物病原菌均有较好的抑菌作用， 除对山药炭疽病菌的抑菌率低于 50％外， 其余均在 70％以上， 表现出竞争、 重寄生作用， 对部分病菌还表现出拮抗作用。
本发明提供了由绿色木霉菌株 ZBS6 制备而成的生防菌剂， 室内和田间试验证明 对多种作物病害， 如黄瓜灰霉病、 黄瓜霜霉病、 水稻纹枯病、 小麦纹枯病、 小麦全蚀病、 小麦 白粉病等具有显著的防治效果。
本发明的优点在于 ： 绿色木霉 ZBS6 菌株抑菌谱广泛， 抑菌效果明显， 生防菌剂种 类多， 施用方法范围广， 对多种病害在室内及田间均有较好的抑菌效果。 同时， 对人畜安全， 对环境没有污染， 对生物多样性及生态平衡没有影响， 具有很好的相融性。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。具体实施方式
下述实施例中所用方法， 如无特别说明， 均为常规方法。
实施例 1 ： 绿色木霉 ZBS6 菌株的分离筛选
(1) 木霉的分离纯化将采来的土样阴干、 研磨后， 称取 5g， 放入 150ml 盛有 45ml 生 理盐水的三角瓶中。采用土壤稀释分离法， 吸取 1mL 的稀释液加入到含有 9mL 水的试管中， -2 振荡混匀， 制得 10 土壤稀释液。取 0.1ml 土壤稀释液涂布于含有丙酸钠及硫酸链霉素的 PDA 培养基中， 倒置在 25℃的恒温培养箱中培养 3d。 挑取分离到的木霉菌落， 进行单孢分离 纯化后， 转入 PDA 斜面培养基， 待菌丝及孢子长满斜面后， 加入灭菌石蜡油进行封存备用。
(2) 供 试 病 原 菌 包 括 小 麦 赤 霉 病 菌 (Fusarium graminearum)， 西瓜枯萎病菌 (Fusarium oxysporium)， 黄 瓜 灰 霉 病 菌 (Botrytis cirerea)， 梨 黑 星 病 菌 (Venturia nashicola)，小 麦 全 蚀 病 菌 (Gaeumannomyces grami)，黄 瓜 疫 病 菌 (Phytophthora melonis)， 苹果褐斑病菌 (Marssonina coronaria)， 芝麻枯萎病菌 (Fusarium oxysporum)， 山 药 炭 疽 病 菌 (Colletotrid umgloeosporiodes)，小 麦 纹 枯 病 菌 (Rhizocto-nia cerealis)，棉 花 黄 萎 病 菌 (Verticillium dahliae)，辣 椒 枯 萎 病 菌 (Fusarium oxysporum)、 水稻纹枯病菌 (Rhizoctonia solani) 和苹果腐烂病菌 (Valsmali Miyabe et Yamada)。
(3) 拮抗木霉的筛选对分离纯化到的木霉菌株， 以供试病原真菌为靶标， 采用平板 对峙培养法进行初步筛选。具体方法为 ： 在 9cm PDA 平板上对峙接种活化 3d 的全蚀病菌 及木霉菌饼 (d ＝ 0.8cm)， 两者各距培养皿边缘 1cm， 25℃明暗交替培养， 以单独接种病原菌 的平板作为对照， 每处理重复 3 次， 培养 4d， 定时观察， 记录菌落半径及寄生率， 并计算生长 速率及平板培养 4d 时木霉对病原菌的抑制率。
抑制率 (％ ) ＝ [( 对照菌落半径 - 对峙培养菌落半径 )/ 对照菌落半径 ]×100
(4) 结果从小麦田土中共分离获得 12 株木霉， 分别编号为 ZBS1-ZBS12。木霉菌株 在 PDA 培养基上生长菌落呈近圆形， 初期为白色绒状， 后期呈现绿色至深绿色， 部分木霉呈 现同心轮纹状密实的产孢区。生长速度快， 4d 左右即可长满全皿并大量产孢。
本实施例中， 以小麦全蚀病菌等 12 个病原菌为靶标菌， 通过对峙筛选， 获得了一 株对各种被测试病害均有较强抑菌效果的木霉菌株 ZBS6， 具体抑菌效果见表 1。
表 1 木霉菌株 ZBS6 对各病原菌的抑菌效果
注： “+++” ： 抑菌率 80％以上 ； “++” ： 抑菌率 50-80％ ； “+” ： 抑菌率 20-50 ； “-” ： 抑 菌率＜ 30％
实施例 2 ： ZBS6 菌株的鉴定
(1) 形态学分类鉴定 采用菌落形态观察及显微观测法鉴定木霉， 并检索文献确 定其种类。
(2) 分子鉴定 拮抗木霉基因组 DNA 提取参考吴发红等真菌 DNA 提取方法进行提 取， 并用 ddH2O 溶解 DNA 至 500ng/μl。用于扩增木霉 ITS 序列的上下游引物由上海生工 生物工程技术服务有限公司合成， 分别为 ITS4 ： 5’ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ 和 ITS6 ： 5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ 。以拮抗木霉的基因组 DNA 为模板， 利用引物 ITS4 及 ITS6 进行 PCR 扩增。PCR 反应体系为 25μl ： 10×PCR Buffer 2.5μl， 模板 1μl， dNTP(10mM each)0.5μl， 引物 ITS4(10mM)1μl， ITS6(10mM)1μl， DNA 聚合酶 (5U/μl)0.25μl， 加入 去离子水至 25μl。PCR 扩增条件 ： 94℃ 5min ； 94℃ 1min ； 55℃ 30sec ； 72℃ 1min ； 33 个 循环 ；72℃ 10min。PCR 反应产物采用 1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。600bp 大小目的条带 采用 DNA 回收试剂盒 (AXYGEN 公司 ) 回收纯化后， 与 T- 载体 (Takara PMD-19T) 连接， 转化 感受态细胞， 然后在含有 Amp、 IPTG、 X-Gal 的平板上进行蓝白斑筛选， 并进行菌落 PCR 筛选 出重组质粒。经验证为目的片段的阳性克隆送至上海生工生物有限公司进行测序。测序结 果通过检索 Genbank(http://www.nebi.nlm.nih.gov/Blast/)， 采用 BLAST 进行序列一致 并运用 CLUSTAL 性比较。 同时， 下载木霉属其它种及其它属真菌的模式菌株 rDNA ITS 序列， X(Version 1.8) 软件进行对位排列， 辅以人工校对， 得到的序列使用 MEGA3.1 分子进化遗 传分析软件分析。 在 Kimura 2-parameter 法计算遗传距离的基础上， 采用邻接法构建 NJ 系 统发生树， 系统树各分支的置信度用自举检验法 (bootstrap) 检验， 共进行 1000 次循环。
(3) 结果形态学观察结果表明， 分离纯化后的木霉菌株 ZBS6 菌落在 PDA 培养平板 上圆形或近圆形， 菌丝生长初期为白色绒状， 后期呈现同心轮纹状的浓绿产孢区。显微镜 下观察， 菌丝纤细无色， 具分隔， 多分枝 ； 分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出， 呈环状排列， 具 几次重复分枝， 着生分生孢子的小梗瓶形或锥形 ； 分生孢子多为球形， 绿色或蓝绿色， 检索 文献初步判断木霉菌株 ZBS6 为绿色木霉 (Trichoderma viride)。为进一步确定拮抗木霉 ZBS6 菌株分类地位， 我们以该菌株基因组 DNA 为模板， 用 ITS 序列通用引物扩增出 1 条长度
为 600bp 左右的预期片段， 符合 ITS 在所有真菌中都高度保守且长度恒定的报道。经上海 生工生物技术有限公司进行 DNA 测序， 测得 ZBS6 的 ITS 基因全序列， 包括 ITS1 区、 5.8S 区 及 ITS2 区， 可读序列长度全长为 526bp。将可读的 526bp 序列提交 GenBank， 应用 BLAST 同 源性搜索， 与数据库中各菌株序列进行相似性分析， 与 Trichoderma virens 的菌株一致性 达 100％。 由菌株 ZBS6 及其他模式菌株 rDNA ITS 序列构建的系统进化树分析可以看出， 菌 株 ZBS6 的序列与 Trichoderma viride 聚成一类， 单独构成一个分支， 遗传距离最短， 树支 可靠性达到 81％， 结合其生物学特性及形态学特征， 鉴定该菌株为绿色木霉。
ZBS6-ITS DNA 全序列 ：
1 CCGAGTTTAC AACTCCCAAA CCCAATGTGA ACGTTACCAA ACTGTTGCCT CGGCGGGATC
61 TCTGCCCCGG GTGCGTCGCA GCCCCGGACC AAGGCGCCCG CCGGAGGACC AACCAAAACT
121 CTTATTGTAT ACCCCCTCGC GGGTTTTTTA CTATCTGAGC CATCTCGGCG CCCCTCGTGG
181 GCGTTTCGAA AATGAATCAA AACTTTCAAC AACGGATCTC TTGGTTCTGG CATCGATGAA
241 GAACGCAGCG AAATGCGATA AGTAATGTGA ATTGCAGAAT TCAGTGAATC ATCGAATCTT
301 TGAACGCACA TTGCGCCCGC CAGTATTCTG GCGGGCATGC CTGTCCGAGC GTCATTTCAA
361 CCCTCGAACC CCTCCGGGGG GTCGGCGTTG GGGATCGGCC CTTTACGGGG CCGGCCCCGA 421 AATACAGTGG CGGTCTCGCC GCAGCCTCTC CTGCGCAGTA GTTTGCACAC TCGCATCGGG
481 AGCGCGGCGC GTCCACAGCC GTTAAACACC CCAAACTTCT GAAATG
实施例 3 ： 一种微生物菌剂的制备
(1) 液态菌剂的制备 将保存的绿色木霉菌株 ZBS6 移入 PDA 培养基平板上， 25℃ 7 光暗交替培养 4d， 无菌条件下刮取分生孢子， 用无菌水配置 1×10 的分生孢子悬浮液， 按 1ml 孢子悬浮液 /100ml PDB 培养基进行接种， 置于 25℃， 150rpm 条件下振荡培养 3d， 电动 搅拌器以 2000rpm 转速搅拌 2min， 与 1.9L 磷酸缓冲液混合 ( 内含 0.1％的助剂吐温 100 和 0.2％的防腐剂苯甲酸 )， 即得到液态生防菌剂。
(2) 固态菌剂的制备 将保存的绿色木霉菌株 ZBS6 移入 PDA 培养基平板上， 25℃ 7 光暗交替培养 4d， 无菌条件下刮取分生孢子， 用无菌水配置 1×10 的分生孢子悬浮液， 按 2ml 孢子悬浮液 /100g 基质培养基进行接种， 26℃光暗交替培养 8-10d 后， 混匀即得固态生 防菌剂 ( 基质培养基为 ： 麦麸， 玉米粉， 稻糠， 水， 其质量比为 ： 2 ∶ 1 ∶ 2 ∶ 5， 即 100g 基质 培养基中含有 20g 麦麸， 10g 玉米粉， 20g 稻糠及 50g 水， 混匀后高压湿热灭菌备用 )。
(3) 施用方法 液态菌剂通过常规的灌根、 浸种、 喷雾等方法施用。固态菌剂主要 通过根施、 穴施等方法施用。可单独使用， 也可以与对本生防菌株无副作用的其它杀菌剂、 植物调节剂混合使用。一般在作物播种期或病害始发期施用。播种前， 采用液态菌剂与种 子拌种， 或直接根施、 穴施 ； 或在病害始发期， 通过灌根施入作物根际或通过叶面喷雾， 花蕾 和果实表面喷雾施用。
实施例 4 菌株 ZBS6 在防治黄瓜灰霉病上的应用
(1) 室内对峙
对峙培养结果显示， ZBS6 对黄瓜灰霉病菌菌具有极强的抑菌效果。在 PDA 培养基 上， ZBS6 日平均生长速率在 26.7mm 以上， 对峙培养中， 其日平均生长速度也在 19.5mm 左右， 较灰霉病菌具有明显的生长优势， 表现出强烈的竞争效果 ； 同时， 对峙培养中的灰霉菌菌丝 生长速率 (6.2mm/d) 明显低于单独接种的病原菌菌丝生长速率 (12.8mm/d)， 表明拮抗木霉
在生长过程中分泌出次生代谢产物等抑制了病原菌的正常生长。对峙培养 3 天后， 木霉菌 株 ZBS6 开始寄生病菌菌落， 至第 4 天， 其抑菌率达到 72.7％， 寄生率达到 100％。
(2) 温室大棚防病
实验地点 ： 开封市中牟县刘集镇大冉庄 ( 黄瓜种植大棚 1)
黄瓜品种 ： 津优 1 号
实验时间 ： 2009 年 9-12 月
实验处理 ： ①清水对照
②液态菌剂原液喷雾防治 (10 月中旬后每 10d 喷雾一次， 连续处理 3 次 )
③液态菌剂 10 倍液喷雾防治 (10 月中旬后每 10d 喷雾一次， 连续处理 3 次 )
④ 50％多菌灵可湿粉剂 500 倍液
调查方法 ： (1)11 月 15 日调查病情指数
(2) 每小区采用 5 点取样， 每点调查 2 株， 调查每株的全部叶片黄瓜灰霉病分级标 准：
0级： 无病斑 ；
1级： 单叶片有病斑 3 个
3级： 单叶片有病斑 4-6 个 5级： 单叶片有病斑 7-10 个 7级： 单叶片有病斑 11-20 个， 部分密集成片 9级： 单叶片有病斑密集占叶面积四分之一以上
通过对温室大棚黄瓜的防治实验， 发现 ZBS6 菌剂对大棚番茄灰霉病有较好的防 治效果， 结果见表 2。经 ZBS6 菌剂原液防治后， 其发病率仅为 15％， 明显低于对照的 52％， 防治效果也达到 70.97％， 高于多菌灵防效的 70.28％。
表2： ZBS6 菌剂对大棚番茄灰霉病防治实验结果
实施例 5 菌株 ZBS6 在防治黄瓜霜霉病上的应用 ( 温室大棚防病 ) 实验地点 ： 开封市中牟县刘集镇大冉庄 ( 黄瓜种植大棚 2)黄瓜品种 ： 津优 1 号 实验时间 ： 2009 年 9-12 月 实验处理 ： ①清水对照 ②液态菌剂原液喷雾防治 (10 月中旬后每 10d 喷雾一次， 连续处理 3 次 ) ③液态菌剂 10 倍液喷雾防治 (10 月中旬后每 10d 喷雾一次， 连续处理 3 次 ) ④ 40％乙磷铝可湿性粉剂 200 倍液 调查方法 ： (1)11 月 15 日调查病情指数 (2) 每小区随机取四点调查， 每点调查两株， 每株调查全部叶片黄瓜霜霉病分级标 0级： 无病斑 ； 1级： 病斑面积占整个叶面积的 5％以下 ； 3级： 病斑面积占整个叶面积的 6％ -15％ ； 5级： 病斑面积占整个叶面积的 16％ -25％ ； 7级： 病斑面积占整个叶面积的 26％ -50％ ； 9级： 病斑面积占整个面积的 50％以上。准：
如表 3 试验结果所示， ZBS6 菌剂原液及十倍稀释液对大棚黄瓜霜霉病有极好的防 治效果， 经处理后， 其发病率分别为 41.67％和 33.33％， 低于对照的 75.00％ ； 同时其防效 分别达到 73.87％和 70.11％， 均高于 40％乙磷铝的防效。
表3： ZBS6 菌剂对大棚黄瓜霜霉病防治实验结果
实施例 6 菌株 ZBS6 在防治水稻纹枯病上的应用 ( 田间防病 ) 实验地点 ： 河南省原阳农科所试验地 小麦品种 ： 原稻 1 号 实验时间 ： 2009 年 7 月 施药方法 ： 液态菌剂原液喷雾防治 实验处理 ： ①清水对照②液态菌剂原液喷雾防治 ③ 5％井冈霉素水剂喷雾防治 调查方法 ： (1) 最后一次施药后 10 天进行调查 (2) 每小区对角线五点取样， 每点调查相连 5 株， 共 25 株， 纪录病株数和病级数 水稻纹枯病分级标准 ： 0级： 全株无病 ； 1级： 第四叶片及其以下各叶鞘、 叶片发病 ( 以剑叶为第一片叶 ) ； 3级： 第三片叶及其以下各叶鞘、 叶片发病 ； 5级： 第二片叶及其以下各叶鞘、 叶片发病 ； 7级： 剑叶叶片及其以下各叶鞘、 叶片发病 ； 9级： 全株发病， 提早枯死。
水稻纹枯病的田间防治实验结果如表 4 所示。经 ZBS6 液态菌剂原液喷雾处理后， 其发病率仅为 33.33％， 明显低于对照的 60.00， 但是高于对照药剂处理的 26.67％ ； 其对水 稻纹枯病的防治效果达到 76.68％， 与对照药剂防效相当。
表 4ZBS6 菌剂对水稻纹枯病田间防治效果
实施例 7 菌株 ZBS6 在防治小麦纹枯病上的应用
(1) 室内对峙
对峙培养结果显示， ZBS6 对小麦纹枯病菌具有极强的抑菌效果。 在 PDA 培养基上， ZBS6 日平均生长速率在 26.7mm 以上， 对峙培养中， 其日平均生长速度也在 21.5mm 左右， 较 纹枯病菌具有较明显的生长优势， 表现出强烈的竞争效果 ； 同时， 对峙培养中的纹枯菌菌丝 生长速率 (7.2mm/d) 明显低于单独接种的病原菌菌丝生长速率 (13.4mm/d)， 表明拮抗木霉 在生长过程中分泌出次生代谢产物等抑制了病原菌的正常生长。对峙培养 3 天后， 木霉菌 株 ZBS6 开始寄生病菌菌落， 小麦纹枯病菌的生长受到明显的抑制， 至第 4 天， 其抑菌率达到 75.5％， 寄生率也达到 100％， 此后抑制率一直保持这一水平。
(2) 代谢产物拮抗实验
将玻璃纸剪成直径大小 9cm 的圆片， 高温灭菌后， 无菌条件下贴在 PDA 培养基表 面。将 ZBS6 菌饼接种于贴有玻璃纸的 PDA 培养基表面， 设覆盖玻璃纸但不接菌的培养基为 对照。25℃条件下， 明暗交替培养， 待菌株 ZBS6 长满皿后， 将含有菌落的玻璃纸移掉， 将小 麦纹枯病菌菌饼接入含木霉代谢物的培养皿中， 25℃条件下黑暗培养， 每处理重复 3 次， 7d 后观察结果。实验结果表明， 在含有木霉代谢物的培养皿中， 小麦纹枯病菌完全受到抑制， 不能长出新鲜菌丝， 而对照中， 小麦纹枯病菌生长正常， 7d 即可长满全皿。 说明 ZBS6 可以产 生某种或多种代谢物来抑制小麦纹枯病菌的生长。
(3) 室内盆栽
本实验在河南省农业科学院的温室内进行， 供试小麦品种为 9023， 供试病原菌为 小麦纹枯病菌， 采用带菌麦粒培养基拌土的方式进行病原菌接种 ( 带菌麦粒培养基 ： 土＝ 1 ∶ 15)， 供试药剂对照为 50％多菌灵 WP( 江阴市福达农化有限公司 ) 及 5％井冈霉素水剂， 每处理 3 个重复， 每重复用土 500g， 播种 20 粒种子。
试验共设 7 个处理。
①清水对照
②接菌对照
③ ZBS6 液态菌剂原液浸种 2h， 直接播种 ④ ZBS6 液态菌剂播种 7d 后灌根， 每株 5ml 菌剂量 ⑤固态菌剂拌土处理 ( 菌剂 ： 土＝ 1 ∶ 49) ⑥ 50％多菌灵 WP 灌根 ⑦ 5％井冈霉素水剂 50× 液浸种
分级标准 ： 0级： 不发病1级： 叶鞘发病但茎杆不发病
3级： 叶鞘发病， 并侵入茎了， 但茎杆病斑环茎不足 1/2
5级： 茎杆病斑环茎超过 1/2， 但不倒伏或折断
7级： 枯死、 倒伏、 枯白穗
通过温室盆栽试验， 结果表明， 在所有生防处理中， 以 ZBS6 液态菌剂进行灌根处 理的防效最高， 达到 70.89， 仅略低于 5％井冈霉素效果， 但是高于 50％多菌灵。而 ZBS6 液 态菌剂浸种处理效果不明显， 防效不到 50％， 可能由于菌剂未能充分被麦粒吸附。此外， 经 ZBS6 菌剂处理后， 小麦出苗率均有一定程度的提高。
表 5ZBS6 菌剂对小麦纹枯病的防治作用
实施例 8 菌株 ZBS6 在防治小麦全蚀病上的应用
(1) 室内对峙
对峙培养结果显示， ZBS6 对小麦全蚀病菌具有极强的抑菌效果。 在 PDA 培养基上， ZBS6 日平均生长速率在 26.7mm 以上， 对峙培养中， 其日平均生长速度也在 24.8mm 左右， 较 全蚀病菌具有明显的生长优势， 表现出强烈的竞争效果 ； 同时， 对峙培养中的全蚀病菌菌丝 生长速率 (5.1mm/d) 明显低于单独接种的病原菌菌丝生长速率 (11.4mm/d)， 表明拮抗木霉 在生长过程中分泌出次生代谢产物等抑制了病原菌的正常生长。对峙培养 3 天后， 木霉菌 株 ZBS6 开始寄生病菌菌落， 小麦全蚀病菌的生长受到明显的抑制， 至第 4 天， 其抑菌率达到 82.5％， 寄生率也达到 80％， 此后抑制率一直保持这一水平。
(2) 代谢产物拮抗实验
将玻璃纸剪成直径大小 9cm 的圆片， 高温灭菌后， 无菌条件下贴在 PDA 培养基表 面。将 ZBS6 菌饼接种于贴有玻璃纸的 PDA 培养基表面， 设覆盖玻璃纸但不接菌的培养基为 对照。25℃条件下， 明暗交替培养， 待菌株 ZBS6 长满皿后， 将含有菌落的玻璃纸移掉， 将小 麦全蚀病菌菌饼接入含木霉代谢物的培养皿中， 25℃条件下黑暗培养， 没处理重复 3 次， 7d 后观 察结果。 实验结果表明， 在含有木霉代谢物的培养皿中， 小麦全蚀病菌完全受到抑制， 不能长出新鲜菌丝， 而对照中， 小麦全蚀病菌生长正常， 7d 即可长满全皿。 说明 ZBS6 可以产 生某种或多种代谢物来抑制小麦全蚀病菌的生长。
(3) 田间防病
实验地点 ： 河南省原阳农科所试验地
小麦品种 ： 矮抗 58
实验时间 ： 2009 年 10 月 -2010 年 5 月
施药方法 ： 播种后固态菌剂穴施及播种前液态菌剂浸种
实验处理 ： ①清水对照
②固态菌剂穴施 (2g/ 穴 )
③液态菌剂原液浸种
④全蚀净拌种
调查方法 ： (1) 拔节期进行根系调查一次， 收获前 7-10 天调查每小区的白穗率 (2) 每小区随机五点取样调查， 调查白穗每点取 1m 双行调查总穗数及白穗数。根系调查每点取
20 株根样， 用铁锹将整株挖出， 水中清洗干净， 在白色背景下调查根系发病情况。
小麦全蚀病分级标准 ：
0级： 无病
1级： 根系发病面积占 1％ -5％
3级： 根系发病面积占 6％ -20％
5级： 根系发病面积占 21％ -40％
7级： 根系发病面积占 41％ -60％
9级： 根系发病面积占 61％以上
由表 6 可以看出， ZBS6 菌剂对小麦全蚀病菌具有一定的防治效果， 采用不同的处 理方法， 其发病率均明显降低 ； 防效也均在 50％以上， 略低于对照药剂全蚀病的防治效果， 其中， 采用穴施的方法， 效果相对更好。
表 6ZBS6 菌剂对小麦全蚀病田间防治效果
实施例 9 菌株 ZBS6 在防治小麦白粉病上的应用 ( 田间防病 )
实验地点 ： 河南省农科院二基地 ( 原阳 )
小麦品种 ： 泛麦 8 号
实验时间 ： 2009 年 5 月
施药方法 ： 液态菌剂原液喷雾防治
调查方法 ： (1) 施药前调查病情基数， 施药后两周再调查病情指数
(2) 每小区对角线 5 点取样， 每点调查 4 株， 共 20 株。记录病株数， 计算病情指数 及防治效果。
小麦白粉病分级标准
0级： 无病 ；
1级： 病斑面积占整片叶面积的 5％以下 ；
3级： 病斑面积占整片叶面积的 6 ～ 15％ ；
5级： 病斑面积占整片叶面积的 15 ～ 25％ ；
7级： 病斑面积占整片叶面积的 26 ～ 50％ ；
9级： 病斑面积占整片叶面积的 50％以上。
小麦白粉病的田间防治实验结果如表 7 所示。 ZBS6 菌剂对小麦白粉病的防治效果 达到 60.36％， 与对照药剂防效相当。
表 7 ZBS6 菌剂对小麦白粉病田间防治效果
14102071145 A CN 102071149
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