丹参酮衍生物及其制备和用途 【技术领域】
本发明涉及医药技术领域。具体地说， 本发明提供用于治疗心脑血管的药物丹参 酮衍生物及其制备和用途 --- 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物及其制备方法和用途。本发明还涉 及本发明丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物的制备和在制备心脑血管病预防和治疗的药物中的应 用。背景技术
丹参酮Ⅱ A(tanshinone Ⅱ A) 是从我国中药丹参中提取得到的。丹参酮Ⅱ A 磺酸 钠是由丹参酮Ⅱ A(Tanshinone Ⅱ A)( 化学学报， 1978， 3： 199-206)， 经磺化后得到的， 药物 的水溶性强， 疗效比丹参酮Ⅱ A 强。丹参酮Ⅱ A 磺酸钠能明显抑制高钾引起的钙内流增加， 与传统的钙拮抗剂维拉帕米有相似的作用。丹参酮Ⅱ A 磺酸钠通过对 KATP、 KCa 的钾通道 开放和钙通道阻滞的协同或联合作用， 可明显减少血管平滑肌上的自发电活动， 引起血管 舒张， 在心血管疾病的治疗中具有重要的应用价值。 到目前为止， 国内外公开的文献仅报道 了丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 (Tanshinone Ⅱ A Sulfonate sodium， C19H17NaO6S， 分子量 ： 396.39)， 尚没有报道丹参酮Ⅱ A 磺酸钠结晶水合物及其制备方法和用途。 发明内容
本发明的发明人在研究中令人意外地发现， 含有结晶水的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 ( 即， 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物 ) 的引湿性远低于不含结晶水的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠， 并且含有结 晶水的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠比不含结晶水的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠更能稳定的存在， 便于储存和 运输， 并在室温下具有良好的水溶性， 更易于制成水溶性的制剂。此外， 与丹参酮Ⅱ A 磺酸 钠无水物相比， 本发明的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物具有良好的滑动性， 从而改善制剂的可 操作性。基于上述发现， 本发明的发明人完成了本发明。
一方面， 本发明提供丹参酮Ⅱ A 磺酸钠结晶水合物， 其分子式为 C19H17NaO6S· nH2O， 其中 n ＝ 0.5 ～ 4.0。
在 一 个 实 施 方 案 中， 本 发 明 提 供 丹 参 酮 Ⅱ A 磺 酸 钠 水 合 物， 其分子式为 C19H17NaO6S·nH2O， 其中 n ＝ 0.5 ～ 3.0 或 n ＝ 0.5 ～ 2.5。
在一个具体实施方案中， 本发明提供丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物， 其中 n ＝ 2.5。
在另一个具体实施方案中， 本发明提供丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物， 其中 n ＝ 1.5。
在另一个具体实施方案中， 本发明提供丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物， 其中 n ＝ 0.5。
本发明的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物可具有不同的晶型， 例如， 从甲醇 - 水、 乙 醇 - 水或丙酮 - 水为结晶或重结晶体系而制备出来的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 0.5、 1.5、 2.5、 3.5 水合物的 X- 射线粉末衍射图谱可以有所不同。
另一方面， 本发明提供具有粉末 X 射线衍射特征的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 1.5 水合物。
在一个实施方案中， 利用粉末 X 射线衍射法测量， 在衍射角 2θ(3-80° ) 测量范围 内， 本发明的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 0.5 水合物可以在包括如下 2θ 值的位置具有相应的特征值： 约 3.7， 7.6， 9.0， 9.6， 15.3， 22.0， 26.0， 27.6， 29.8。
在另一个实施方案中， 利用粉末 X 射线衍射法测量， 在衍射角 2θ(3-80° ) 测量范 围内， 本发明的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 1.5 水合物可以在包括如下 2θ 值的位置具有相应的特 征值 ： 约 3.7， 6.2， 7.3， 8.8， 9.2， 11.5， 14.7， 15.4， 17， 17.7， 20.6， 21.2， 25.9， 27.1， 27.6， 29.4。
在另一个实施方案中， 利用粉末 X 射线衍射法测量， 在衍射角 2θ(3-80° ) 测量 范围内， 本发明的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 2.5 水合物可以在包括如下 2θ 值的位置具有相应的 特征值 ： 约 3.7， 4.3， 6.2， 7.3， 8.8， 9.3， 11.5， 14.7， 15.4， 17， 17.7， 21.2， 25.9， 27.3， 27.6， 29.4。
再一方面， 本发明提供本发明丹参酮Ⅱ A 磺酸钠结晶水合物的制备方法， 该方法 包括 ：
方法 A ： 将丹参酮Ⅱ A 于反应容器中， 加醋酸、 醋酐、 丙酸、 丙酸酐、 C1-C6 低取代卤 代烃， 包括二氯甲烷、 二氯乙烷、 氯仿、 四氯乙烷中的一种或者数种， 搅拌， 加醋酸、 醋酐、 丙 酸、 丙酸酐中的一种或者数种的硫酸或发烟硫酸或氯磺酸的溶液， 滴加完毕后， 在 30℃以下 搅拌 0.1-6h， 将反应物慢慢倒入水中， 加氯化钠、 碳酸钠、 碳酸氢钠、 氢氧化钠一种或数种的 溶液 ( 优选其饱和溶液 )， 待沉淀充分析出， 过滤， 沉淀物用饱和氯化钠溶液或饱和硫酸钠 溶液洗一次或数次， 再用水或 C1-C6 低分子醇， 包括甲醇、 乙醇、 异丙醇的一种或数种洗一 次或数次， 过滤， 用无水乙醇回流除去残存的氯化钠， 浓缩， 所得的固体用水、 C1-C6 低分子 醇， 包括甲醇、 乙醇、 异丙醇等， C3-C6 低级酮， 其中包括丙酮、 丁酮、 异己酮等， C2-C8 的低级 酯， 其中包括醋酸丁酯、 乙酸乙酯、 甲酸乙酯等， C1-C6 低取代卤代烃， 包括二氯甲烷、 二氯乙 烷、 氯仿等， C2-C6 低级醚， 包括乙醚、 甲乙醚、 异丙醚等， C5-C10 的直链或支链烷烃或环烷 烃， 包括戊烷、 正己烷、 石油醚、 环己烷等， 芳香烃， 其中包括苯， 甲苯等中的一种或几种， 进 行结晶， 放置， 冷却， 待结晶析出， 过滤， 干燥， 得丹参酮Ⅱ A 磺酸钠结晶水合物， 这种结晶过 程进行一次或数次， 以便获得纯化更高的产物 ； 或者
方法 B ： 将丹参酮Ⅱ A 于反应容器中， 加醋酸、 醋酐、 丙酸、 丙酸酐、 C1-C6 低取代卤 代烃， 包括二氯甲烷、 二氯乙烷、 氯仿、 四氯乙烷中的一种或者数种， 搅拌， 加 C1-C6 低取代 卤代烃， 包括二氯甲烷、 二氯乙烷、 氯仿、 四氯乙烷等中的一种或者数种的氯磺酸溶液， 滴加 完毕后， 在 30℃以下搅拌 0.1-6h， 将反应物慢慢倒入水中， 分离有机层， 所得的水溶液层中 加氯化钠、 碳酸钠、 碳酸氢钠、 氢氧化钠一种或数种的饱和溶液， 放置， 待沉淀充分析出， 过 滤， 沉淀物用饱和氯化钠溶液或饱和硫酸钠溶液洗一次或数次， 再用水或 C1-C6 低分子醇， 包括甲醇、 乙醇、 异丙醇等的一种或数种洗一次或数次， 所得的固体用水、 C1-C6 低分子醇， 包括甲醇、 乙醇、 异丙醇等， C3-C6 低级酮， 其中包括丙酮、 丁酮、 异己酮等， C2-C8 的低级酯， 其中包括醋酸丁酯、 乙酸乙酯、 甲酸乙酯等， C1-C6 低取代卤代烃， 包括二氯甲烷、 二氯乙烷、 氯仿等， C2-C6 低级醚， 包括乙醚、 甲乙醚、 异丙醚等， C5-C10 的直链或支链烷烃或环烷烃， 包括戊烷、 正己烷、 石油醚、 环己烷等， 芳香烃， 其中包括苯， 甲苯等中的一种或几种， 进行结 晶， 放置， 冷却， 待结晶析出充分， 过滤， 干燥， 得丹参酮Ⅱ A 磺酸钠结晶水合物， 这种结晶过 程可进行一次或数次。
在一个实施方案中， 制备丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物所用的结晶或重结晶溶剂优选 是水、 甲醇、 乙醇、 异丙醇， 丙酮、 丁酮、 异己酮、 乙酸甲酯、 乙酸乙酯、 二氯甲烷、 氯仿、 乙醚、异丙醚、 石油醚和苯中的一种或几种。
本发明的产物的干燥方式可以为在不同温度 ( 如 20-100℃ )、 干燥时间 (1 小时到 数日 )、 或附有其它干燥剂 ( 包括硅胶， 五氧化二磷、 无水氯化钙、 无水硫酸钠等 ) 的环境条 件下、 或使用常压或减压的方式对最后的产物进行干燥。其干燥温度优选在 60℃或以内。
再一方面， 本发明提供药物组合物， 其包含本发明的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物， 以 及药学上可接受的载体。
在一个实施方案中， 本发明的药物组合物被制备成注射用冻干粉针制剂、 无菌分 装粉针制剂、 大输液制剂、 小水针注射剂以及经胃肠道给药的制剂等制剂。
用于经肠道给药制剂包括片剂、 胶囊、 颗粒剂， 其中可含有药学上可接受的填充 剂， 如淀粉、 变性淀粉、 乳糖、 微晶纤维素、 环糊精、 山梨醇、 甘露醇、 磷酸钙、 氨基酸等 ； 药学 上可接受的崩解剂， 如淀粉、 变性淀粉、 微晶纤维素、 羧甲基淀粉钠、 交联聚乙烯吡咯烷酮、 低取代羟丙基纤维素、 表面活性剂 ； 药学上可接受的润湿剂和粘合剂， 如胶化淀粉、 甲基纤 维素、 羧甲基纤维素、 乙基纤维素、 聚乙烯吡咯烷酮、 海藻酸及其盐 ； 药学上可接受的润滑剂 和助流剂， 如硬脂酸、 硬脂酸镁、 聚乙二醇 4000-8000、 滑石粉、 微粉硅胶、 十二烷基硫酸镁 等； 药学上可接受的甜味剂和香精， 如阿斯巴甜、 甜蜜素、 糖精钠、 三氯蔗糖、 食用香精等。
本发明的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物可以被制备成冻干粉针制剂， 例如通过如下方 法制备 ： 取丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物， 可以加药学上可接受的助溶剂、 冻干支持剂或辅形 剂、 稳定剂、 注射用水， 搅拌使溶解， 若需要， 可用药学上可接受的酸碱调节 pH 为 3.5 ～ 8.5， 加活性碳 0.005 ～ 0.5 ％ (W/V) 搅拌 15 ～ 45min， 过滤， 补水， 无菌过滤， 按 5 ～ 80mg/ 瓶 ( 以主药计 ) 分装， 冷冻干燥， 压塞， 得成品。
本发明的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物还可以被制备成小容量注射液， 例如通过如下 方法制备 ： 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物加注射用水和药学上可接受的附加剂， 例如 ： 药学上可 接受的 pH 调节剂、 药学上可接受的抗氧剂、 惰性气体， 过滤、 除菌制成灭菌小容量注射液， 其 pH 值在 3.5 ～ 8.5 之间。
所述药学上可接受的冻干支持剂或辅形剂可以含有乳糖、 葡萄糖、 甘露醇、 山梨 醇、 木糖醇、 右旋糖酐、 氨基酸或其盐 ( 包括甘氨酸、 牛磺酸、 精氨酸等 )、 磷酸二氢钠、 磷酸 氢二钠、 去氧胆酸钠等的一种或几种。
所述药学上可接受的 pH 调节剂可以是药学上可接受的无机酸或有机酸、 无机碱 或有机碱， 也可以是广义的路易斯酸或碱， 可以含有一种或者几种， 可以是盐酸、 磷酸、 丙 酸、 醋酸及醋酸盐、 如醋酸钠等， 乳酸以及乳酸药用盐、 枸橼酸药用盐、 碳酸钠、 碳酸氢钠、 碳 酸氢钾、 氢氧化钠、 氢氧化钾、 磷酸盐、 酒石酸及其药用盐、 硼砂、 硼酸、 丁二酸、 己酸、 己二 酸、 反丁烯二酸、 顺丁烯二酸、 三羟基氨基甲烷、 二乙醇胺、 乙醇胺、 异丙醇胺、 二异丙醇胺、 2- 氨基 -2-( 羟甲基 )1， 3- 丙二醇胺、 1， 2- 己二胺、 N- 甲基葡萄胺、 二异丙胺以及它们的盐， 多羟基羧酸及药用盐， 如葡萄糖醛酸、 葡萄糖酸、 乳糖酸、 苹果酸、 苏糖酸、 葡庚糖酸、 氨基酸 及氨基酸盐等中的一种或者几种。
所述药学上可接受的抗氧剂和稳定剂可以是亚硫酸、 亚硫酸盐、 亚硫酸氢盐、 焦 亚硫酸盐、 连二亚硫酸盐、 硫代硫酸盐， 有机硫化合物硫脲、 谷胱甘肽、 二巯基丙醇、 巯基乙 酸及盐、 硫代乳酸及盐、 硫代二丙酸及盐、 苯酚类化合物， 如没食子酸及盐、 咖啡酸、 咖啡酸 盐、 阿魏酸、 阿魏酸盐、 二叔丁基对苯酚、 2， 5- 二羟基苯甲酸、 2， 5- 二羟基苯甲酸盐、 苯酚或其衍生物、 水杨酸或其盐 ； 氨基酸以及其盐 ； 抗坏血酸及抗坏血酸盐、 异抗坏血酸及异抗坏 血酸盐、 烟酰胺、 酒石酸、 硝酸盐、 磷酸盐、 醋酸药用盐、 柠檬酸盐、 EDTA 及 EDTA 盐、 如 EDTA 二钠、 EDTA 四钠、 N- 二 (2- 羟乙基 ) 甘氨酸、 α- 环糊精、 β- 环糊精、 γ- 环糊精、 葡糖 基 - 环糊精 (G1-CYD)、 麦芽糖基 -β- 环糊精、 羟丙基 β- 环糊精、 2- 羟丙基 β- 环糊精 (2-HP-β-CYD)、 3- 羟丙基 β- 环糊精 (3-HP-β-CYD)、 磺丁醚 -β- 环糊精 (SBE-β-CD)， 如 (SBE7-β-CD)、 SBE4-β-CD 等中的一种或者几种。
所述药学上可接受的助溶剂可以是葡萄糖、 木糖醇、 山梨醇、 甘露醇、 烟酰胺、 N- 甲 基葡萄胺、 N- 乙基葡萄胺、 磷酸及药学上可接受的磷酸盐 ( 可以是磷酸二氢钠、 磷酸氢二 钠、 磷酸钠、 磷酸二氢钾等 )、 乳酸、 乳酸钠、 枸橼酸、 枸橼酸钠、 多羟基羧酸及药用盐 ( 如葡 萄糖醛酸、 葡萄糖酸、 乳糖酸、 苹果酸、 苏糖酸、 葡庚糖酸等或其药用盐 )、 氨基酸及氨基酸 盐 ( 可以是盐酸精氨酸、 盐酸赖氨酸等 )、 盐酸、 硫酸、 酒石酸、 吐温 20-80、 泊洛沙姆 ( 包 括泊洛沙姆 124， 188， 237， 338， 407 等 )、 聚乙二醇 200-2000、 乙醇、 乙二醇、 丙三醇、 葡糖 基 - 环糊精 (G1-CYD)、 麦芽糖基 -β- 环糊精、 羟丙基 β- 环糊精、 2- 羟丙基 β- 环糊精 (2-HP-β-CYD)、 3- 羟丙基 β- 环糊精 (3-HP-β-CYD)、 磺丁醚 -β- 环糊精 (SBE-β-CD)， 如 (SBE7-β-CD)、 SBE4-β-CD 等、 以及水等中的一种或者几种。 所述药学上可接受的等渗调节剂可以是葡萄糖、 果糖、 木糖醇、 山梨醇、 甘露醇、 转 化糖、 麦芽糖、 右旋糖酐、 氯化钠、 氯化钾、 乳酸钠等中的一种或几种。
本发明的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物可作为钙拮抗剂用于预防或治疗人和哺乳动 物的冠心病、 心绞痛、 心肌梗死， 心律失常、 缺血性脑病， 包括脑血栓、 脑栓塞 ； 末梢循环障碍 疾病如各种动脉闭塞症、 脉管炎、 糖尿病引起的微循环障碍、 高血压、 高脂血症等疾病。
再一方面， 本发明提供本发明的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物在制备药物中的用途， 所述药物用于治疗或预防人和哺乳动物的冠心病、 心绞痛、 心肌梗死、 心律失常、 缺血性脑 疾病、 末梢循环障碍疾病， 包括各种动脉闭塞症、 脉管炎、 糖尿病引起的微循环障碍、 高血压 或高脂血症。
可替代地， 本发明提供使用本发明的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物预防或治疗上述疾 病的方法， 其包括将预防或治疗有效量的本发明的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物给予有此需要 的受试者。
用量用法 ： 一般情况下， 于成人， 肌内注射 ： 5-80mg/ 次， 一日 1-2 次。静脉注射 ： 5-80mg/ 次， 以 25 ％葡萄糖注射液 20ml 稀释。静脉滴注 ： 5-80mg， 以 5 ％葡萄糖注射液或 0.9％氯化钠注射液 250 ～ 500ml 稀释， 一日 1-2 次。儿童减半量以上使用。经胃肠道给药 用量用法 ： 10 ～ 70kg 体重的人或动物， 一般情况下 10 ～ 200mg/ 天， 分 1-3 次给药 ； 儿童减 半量以上使用。
参照中国药典 (2005 版 ) 要求进行的引湿性试验证明， 本发明的丹参酮Ⅱ A 磺酸 钠水合物比丹参酮Ⅱ A 磺酸钠无水物要低得多。
另外， 参照中国药典 (2005 版 ) 要求进行的加速稳定性试验证明， 本发明的丹参酮 Ⅱ A 磺酸钠结晶水合物比丹参酮Ⅱ A 磺酸钠无水物具有更好的存储稳定性， 因此能更长期 地稳定存储。
本发明的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物为红色或砖红色或棕红色结晶性粉末。不同 于丹参酮Ⅱ A 磺酸钠无水物因潮解导致在处理时要隔绝空气防止粘连等， 本发明的丹参酮
Ⅱ A 磺酸钠结晶水合物具有良好的滑动性， 从而改善制剂的可操作性 ； 并使制备的固体制 剂具有良好的溶出性能， 使得其容易被吸收进入血液循环， 改善生物利用度， 并有利于快速 发挥其作用。 附图说明
图 1 为丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 2.5 水合物的热分析图谱。
图 2 为丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 1.5 水合物的热分析图谱。
图 3 为丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 0.5 水合物的热分析图谱。 具体实施方式
热分析方法
测试条件 ： Setaram 公司 Setsys 16， NETZSCH STA449C， 样品量 5mg 左右， 升温速 度： 10K/min， N2 流速 ： 50ml/min， 温度 ： 一般为室温～ 400℃左右。
令人意外的是， 特征性的， 本发明的水合物的热分析 (TG-DTA 或者 TG-DSC) 图谱的 失重平台下具有对应的吸热峰， 热分析图谱显示出丹参酮Ⅱ A 磺酸钠的结晶水合物， 如其 0.5 水合物、 1.5、 2.5 水合物等。 粉末 X 衍射法
在武汉理工大学材料测试中心利用 D/MX- Ⅲ A X 射线衍射仪， 衍射角 2θ， 扫描范 围 3-80°， 测定了丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物的粉末 X 射线衍射图。
引湿试验
将丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物和丹参酮Ⅱ A 磺酸钠无水物样品， ： 取丹参酮Ⅱ A 磺酸 钠无水物和本发明的水合物约 5g， 置于干燥恒重的表面皿中， 精密称重， 25℃、 相对湿度为 75％， 分别于试验 0 小时和 48 小时取样， 计算引湿增重的百分率。结果显示， 丹参酮Ⅱ A 磺 酸钠无水物引湿性比本发明的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物高得多。
表 1. 引湿试验结果
稳定性实验
在 RH75 ％、 30 ℃避光的条件下， 将丹参酮Ⅱ A 磺酸钠的结晶水合物和丹参酮 Ⅱ A 磺酸钠的无水物样品分别密闭与西林瓶中进行加速稳定性试验， 色谱条件 ： 色谱柱 ： KromasilC18(250mm×4.6mm， 5μm)， 流动相 ： 甲醇 -0.02mol/L 磷酸二氢钾溶液 ( 磷酸调节 PH ＝ 4)(60 ∶ 40)， 检测波长 271nm， 流速 1ml/min， 测定有关物质增加的幅度 ( 结果见表 1 ～ 2)。
表 2. 加速稳定性试验结果
表中结果证明， 本发明的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠结晶水合物比丹参酮Ⅱ A 磺酸钠无水 物更稳定得多。
实施例 1 ： 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 2.5 水合物的制备
将丹参酮Ⅱ A( 市场上购买 )4 克、 冰醋酸 30ml， 醋酐 45ml 于干燥的三颈烧瓶中， 搅拌使溶解， 滴加 36ml 体积比 1/1 的冰醋酸 - 浓硫酸的混合液， 控制温度 25 ℃以下， 搅 拌反应 0.5-3 小时， 将反应物慢慢倒入水中， 加 20ml 饱和氯化钠溶液， 待固体析出完毕， 抽滤， 沉淀物用饱和氯化钠溶液洗 2 次， 冷 95 ％乙醇洗 2 次， 抽滤， 固体物用甲醇 5ml、 乙 醇 12ml、 氯仿 10ml、 乙醚 20ml、 水 2ml 的溶剂进行重结晶， 置 0℃以下放置， 待结晶析出充 分， 抽滤， 所得固体再以甲醇 10ml、 氯仿 15ml、 乙醚 15ml、 水 1ml 的溶剂重结晶， 置 0℃以下 放置， 待结晶析出充分， 抽滤， 将结晶于 50 ℃左右干燥 6 小时， 得红色结晶约 0.6g， 熔点 ： H2O 205-207 ℃ (ELECTROTHERMAL MELTING POINT APPARATUS， 未校正 ) ； λ 228nm、 max200、
256nm、 271nm ； 核磁共振氢谱 1H-NMR(300MHz， DMSO)δ7.86(1H)， δ7.57(1H)， δ3.08(2H)， δ2.33(3H)， δ1.73(2H)， δ1.62(2H)， δ1.29(6H)， δ3.4 的水峰在经重水交换后的氢谱中 13 13 消失 ； 核磁共振碳谱 ( C-NMR) 总碳数 19 个， C-NMR(300MHz， DMSO) ： δ182.9， δ175.9， δ158.7， δ154.6， δ150.1， δ143.5， δ134.1， δ127.6， δ127.1， δ120.6， δ120.3， δ117.5， δ38.0， δ35.0， δ32.1(2 个 C)， δ30.2， δ19.4， δ10.0(ppm) ； DEPT 谱 ： 伯碳 3 δ30.2， δ19.4 ； 叔碳 2 个。ESI-MS ： m/z ： 个： δ32.1(2 个 C)， δ10.0 ； 仲碳 3 个 ： δ38.0， KBr -1 396 ； EI ： m/z ： [M-Na]373， [M+Na]419 ； 红外光谱 ： v 2958、 2929、 2867、 max cm 3464( 宽 )、 1674、 1644、 1578、 1463、 1429、 1364、 1331、 1217、 1144、 1120、 1076、 1040、 923、 841、 709、 654 ； 卡氏法测定水分为 10.46％， 热分析 ： 平台失重约 10.26％， 这与样品含有 2.5 个结晶水的结 果 ( 理论值 10.21％ ) 在误差范围内 ( 见附图 1)， 元素分析理论值 ： C 51.70％， H5.02％， Na5.21％， S7.26％ ；
实测值 ： C 51.54％， H5.16％， Na5.08％， S7.39％。
实施例 2 ： 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 3 水合物的制备 按上法操作， 将结晶溶剂改为用乙醇、 氯仿、 乙醚、 水， 所用比例近似上例， 将结 晶固体物质在 30 ℃左右干燥 4 小时， 得橙红色结晶约 0.5g， 熔点 ： 188-193 ℃ ( 未校正 ) ； H20 λ max200、 228nm、 256nm、 271nm， ESI-MS ： m/z ： 396 ； EI ： m/z ： [M-Na]373， [M+Na]419 ； 卡氏法 测定水分为 14.07％， 热分析 ： 平台失重约 13.22％ ( 理论值 13.28％ )。
实施例 3 ： 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠无水物的制备
将实施例 2 的物质在 80℃左右， 在五氧化二磷存在下真空干燥 24-72 小时左右或 以上， 得其无水物， 卡氏法测定无水物的水分含量一般低于 1.3％。
实施例 4 ： 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 1.5 水合物的制备
将丹参酮Ⅱ A( 市场上购买 )4 克、 丙酸 30ml， 丙酸酐 45ml 于三颈烧瓶中， 搅拌， 滴 加 36ml 体积比 1/1 的冰醋酸 - 浓硫酸的混合液， 控制温度 25 ℃以下， 搅拌反应 0.5-3 小
时， 将反应物慢慢倒入水中， 加 75ml 饱和氯化钠溶液， 待固体析出完毕， 减压过滤， 沉淀物 用饱和氯化钠溶液洗 2 次， 冷 75 ％乙醇洗， 抽滤， 所得固体用无水乙醇回流， 抽滤， 液体减 压浓缩， 浓缩后的剩余物用甲醇 16ml、 氯仿 10ml、 乙酸乙酯 25ml、 水 1.5ml、 丙酮 4ml 重结 晶， 置 0℃以下放置， 待沉淀析出充分后， 抽滤， 固体并随后以近似比例的上述溶剂再重结 晶 1 次， 置 0℃以下放置， 待沉淀析出充分后， 抽滤， 所得固体在 60℃左右真空干燥 4 小时 左右， 得红色结晶约 0.5g ； 熔点 ： 214℃分解 ( 未校正 )， 紫外光谱 ： 取其 5μg/ml 的水溶液， 照分光光度法测定， 发现在波长 200nm、 228nm、 256nm 与 271nm 处有最大吸收， 以及 280nm KBr -1 的特征吸收 ； 红外光谱 ： v 2959、 2932、 2867、 1674、 1646、 1578、 1537、 max cm 3446( 宽 )、 1480、 1463、 1429、 1364、 1331、 1219、 1144、 1120、 1077、 1042、 923、 844、 709、 653 ； 核磁共振氢 1 谱 H-NMR(300MHz， DMSO)δ7.84(1H)， δ7.54(1H)， δ3.06(2H)， δ2.34(3H)， δ1.72(2H)， δ1.62(2H)， δ1.29(6H)， δ3.4 的水峰在经重水交换后的氢谱中消失 ； 核磁共振碳谱 13 13 ( C-NMR) 总 碳 数 19 个， C-NMR(300MHz， DMSO) ： δ182.8， δ175.7， δ158.6， δ154.6， δ150.0， δ143.4， δ134.0， δ127.6， δ127.1， δ120.6， δ120.3， δ117.5， δ38.0， δ35.0， δ32.1(2 个 C)， δ30.1， δ19.3， δ10.0(ppm) ； DEPT 谱 ： 伯碳 3 个 ： δ32.1(2 个 C)， δ10.0 ； 仲碳 3 个： δ38.0， δ30.1， δ19.3 ； 叔 碳 2 个。ESI-MS ： m/z ： 396 ； EI ： m/z ： [M-Na]373， [M+Na]419 ； 卡氏法测定水分为 6.62％， 热分析 ： 平台失重约 5.91％， 这与样品 含有 1.5 个结晶水的结果 ( 理论值 6.38％ ) 在误差范围内 ( 见附图 2)， 元素分析理论值 ： C 53.90％， H4.76％， Na5.43％， S7.57％ ； 实测值 ： C 53.72％， H4.91％， Na5.27％， S7.43％。
实施例 5 ： 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 0.5 水合物的制备
将丹参酮Ⅱ A( 市场上购买 )3.5 克、 丙酸 30ml， 丙酸酐 45ml 于三颈烧瓶中， 搅拌， 滴加 36ml 体积比 1/1 的丙酸 - 浓硫酸的混合液， 控制温度 25 ℃以下， 搅拌反应 0.5-3 小 时， 将反应物慢慢倒入水中， 搅拌中缓慢滴加饱和碳酸钠溶液 5ml， 再加 60ml 饱和氯化钠溶 液， 待固体析出完毕， 抽滤， 沉淀物用饱和氯化钠溶液洗 2 次， 冷 50％乙醇洗， 抽滤， 结晶用 无水乙醇回流， 过滤， 浓缩， 高度浓缩物用甲醇 15ml、 氯仿 20ml、 乙酸乙酯 10ml、 水 1ml 结 晶， 置 0℃以下放置， 待沉淀析出充分后， 抽滤， 固体并随后以近似比例的上述溶剂再重结晶 1 次， 置 0℃以下放置， 待沉淀析出充分后， 抽滤， 所得固体在 60℃左右、 五氧化二磷存在下 真空干燥 6 小时左右， 得红色结晶约 0.4g ； 熔点 ： 195-198℃分解 ( 未校正 )， 紫外光谱 ： 取 H2O 其 5μg/ml 的水溶液， 照分光光度法测定， λ max200nm、 228nm、 256nm、 271nm ； 核磁共振氢 1 谱 H-NMR(300MHz， DMSO)δ7.85(1H)， δ7.56(1H)， δ3.07(2H)， δ2.34(3H)， δ1.72(2H)， δ1.62(2H)， δ1.29(6H)， δ3.4 的水峰在经重水交换后的氢谱中消失 ； 核磁共振碳谱 13 13 ( C-NMR) 总 碳 数 19 个， C-NMR(300MHz， DMSO) ： δ182.9， δ175.9， δ158.7， δ154.6， δ150.1， δ143.5， δ134.1， δ127.6， δ127.1， δ120.6， δ120.3， δ117.5， δ38.0， δ35.0， δ32.1(2 个 C)， δ30.2， δ19.4， δ10.0(ppm) ； DEPT 谱 ： 伯碳 3 个 ： δ32.1(2 个 C)， δ10.0 ； 仲碳 3 个： δ38.0， δ30.2， δ19.4 ； 叔 碳 2 个。ESI-MS ： m/z ： 396 ； EI ： m/z ： KBr -1 [M-Na]373， [M+Na]419 ； 红外光谱： v 2933、 1672、 1620、 1574、 1536、 max cm 3486( 宽 )、 1460、 1330、 1216、 1040、 922， 842、 656， 卡氏法测定水分为 2.57％， 热分析 TG-DSC ： 平台失重 约 2.14％， 这与样品含有 0.5 个结晶水的结果 ( 理论值 2.22％ ) 在误差范围内 ( 见附图 3) ； 元素分析理论值 ： C 56.29％， H4.48％， Na5.67％， S7.91％ ； 实测值 ： 理论值 ： C 56.15％， H4.62％， Na5.48％， S7.76％。实施例 6 ： 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 1.5 水合物的制备
将丹参酮Ⅱ A( 市场上购买 )4 克、 干燥的二氯甲烷 250ml 和干燥的四氯乙烷 50ml 于三颈烧瓶中， 搅拌使溶解， 滴加 6.5ml 氯磺酸 ( 先溶于 40ml 干燥的二氯甲烷中 )， 控制 温度 10℃以下， 搅拌， TLC 监控反应到反应物斑点基本消失， 将反应物慢慢倒入 40ml 水中， 分离出水层， 搅拌中缓慢滴加饱和碳酸钠溶液， 至 PH 到 5 左右， 置 0℃以下放置， 待沉淀析 出充分后， 抽滤， 所得固体用甲醇约 16ml、 氯仿约 10ml、 乙酸乙酯约 25ml、 水约 1ml、 丙酮 约 2ml 进行结晶， 置 0 ℃以下放置， 待沉淀析出充分后， 抽滤， 所得固体并随后以近似比例 的上述溶剂再重结晶 1 次， 置 0℃以下放置， 待沉淀析出充分后， 抽滤， 所得固体在 60℃左 右、 真空干燥 4 小时左右， 得红色结晶约 0.2g ； 熔点 ： 212℃分解 ( 未校正 )， 紫外光谱取其 H2O 5μg/ml 的水溶液， 照分光光度法测定， ： λ 228nm、 256nm、 271nm ； ESI-MS ： m/z ： max200nm、 1 396 ； EI ： m/z ： [M-Na]373， [M+Na]419 ； 核 磁 共 振 氢 谱 H-NMR(300MHz， DMSO)δ7.84(1H)， δ7.54(1H)， δ3.06(2H)， δ2.34(3H)， δ1.72(2H)， δ1.62(2H)， δ1.29(6H)， δ3.4 的水 13 13 峰在经重水交换后的氢谱中消失 ； 核磁共振碳谱 ( C-NMR) 总碳数 19 个， C-NMR(300MHz， DMSO) ： δ 182.9 ， δ 175.7 ， δ 158.6 ， δ 154.6 ， δ 150.1 ， δ 143.4 ， δ 134.0 ， δ 127.6 ， δ127.1， δ120.6， δ120.3， δ117.4， δ38.0， δ35.0， δ32.1(2 个 C)， δ30.1， δ19.3， KBr -1 δ10.0(ppm) ； 红外光谱 ： v 2959、 2932、 2867、 1674、 1646、 1578、 1537、 max cm 3448( 宽 )、 1480、 1463、 1429、 1364、 1331、 1218、 1144、 1120、 1076、 1042、 923、 844、 709、 654 ； 卡氏法测定 水分为 6.57％， 热重分析 TG-DSC ： 平台失重约 6.16％， 这与理论值 6.38％在误差范围内。
实施例 7 ： 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物冻干制剂的制备
取丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 2.5 水合物 5g， 加甘露醇 15g， 磷酸二氢钠 4g， 酒石酸钠 2g、 抗 坏血酸 1g、 EDTA 二钠 0.02g， 加 30-50℃注射用水 800ml 左右， 搅拌使溶， 用 1-5M 左右的柠 檬酸和氢氧化钠溶液调节 pH 为 4.0 ～ 7.0， 补注射用水至 1000ml， 加活性碳 0.01 ～ 0.5％ (W/V) 搅拌 15-30min， 过滤， 用 0.22 微米微孔滤膜过滤或者采用截留相对分子质量 6000 ～ 20000 的超滤膜过滤， 测定半成品含量， 按 5、 10mg/ 瓶或 20mg/ 瓶 ( 按主药的无水物计 ) 分 装， 真空冷冻干燥， 压塞， 得冻干品。
实施例 8 ： 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物冻干制剂的制备
取丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 1.5 水合物或 0.5 水合物 10g， 加山梨醇 20g， 磷酸二氢钠 4g， 柠檬酸钠 2g、 EDTA 二钠 0.02g， 加 30-50℃注射用水 800ml 左右， 搅拌使溶， 用 1-5M 左 右的柠檬酸和氢氧化钠溶液调节 pH 为 5.0 ～ 7.5， 补注射用水至 1000ml， 加活性碳 0.01 ～ 0.5％ (W/V) 搅拌 15-30min， 过滤， 用 0.22 微米微孔滤膜过滤， 测定半成品含量， 按 10mg/ 瓶 或 20mg/ 瓶或 40mg/ 瓶分装 ( 按丹参酮Ⅱ A 磺酸钠计 )， 真空冷冻干燥， 压塞， 得冻干品。
实施例 9 ： 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物注射液的制备
丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 2.5 水合物或 1.5 水合物或 0.5 水合物 ( 按干品计 )5g， 葡萄 糖酸钠 4g， 柠檬酸钠 2g， 抗坏血酸 1g、 丙二醇 3ml、 EDTA 二钠 0.06g， 避强光下加注射用水、 通氮气、 搅拌使溶解， 1-5M 左右的柠檬酸和柠檬酸钠溶液调节 pH 为 4.0 ～ 7.0， 加活性碳 0.01％ (W/V) 搅拌 15 ～ 45min， 过滤， 补水至 2000ml， 用 0.22 微米微孔滤膜过滤或者采用 截留相对分子质量 6000 ～ 20000 的超滤膜过滤， 溶液通氮气饱和， 按 10、 20mg 或 40mg/ 支 分装， 灭菌得成品。
实施例 10 ： 丹参Ⅱ A 磺酸钠水合物注射液的制备称取葡萄糖 300g 加入注射用水中， 搅拌使溶解完全， 加入配液量 0.5％的活性炭， 加热 10-30 分钟左右， 经砂滤棒过滤脱炭 ； 将丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 1.5 水合物 10g 与上述滤 液混合均匀， 加磷酸二氢钠 10g， 酒石酸钠 2g、 磺丁醚 -β- 环糊精 1g， EDTA 二钠 0.1g， 溶解 完全后， 加注射用水至 5000ml， 用 1-3M 盐酸或乳酸或柠檬酸以及柠檬酸钠溶液调节 pH 值 在 3.5-6.0 的范围内， 加配液量 0.05％的活性炭， 加热搅拌 10-30 分钟左右， 过滤脱炭， 再经 0.22um 微孔滤膜精滤或者采用截留相对分子质量 6000 ～ 30000 的超滤膜过滤一到两次， 溶液通高纯氮气饱和， 检验半成品含量、 pH 值和澄明度等， 合格后溶液按 10、 20mg、 40mg 或 80mg/ 支灌封， 灭菌， 包装即得。
实施例 11 ： 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物氯化钠输液的制备
将丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 1.5 水合物或 0.5 水合物水合物 ( 按无水物计 )20g、 氯化钠 425g、 枸橼酸钠 5g、 酒石酸 5g、 EDTA 二钠 0.6g， 加入注射用水中， 溶液通高纯氮气饱和， 搅拌 使溶解完全， 用枸橼酸溶液和枸橼酸钠溶液调节 pH 值在 3.5-6.5 的范围内， 加注射用水至 50000ml， 加配液量 0.05％的活性炭， 加热搅拌 10-30 分钟左右， 过滤脱炭， 再经 0.22um 的 膜精滤或者采用截留相对分子质量 6000 ～ 20000 的超滤膜过滤， 经半成品化验， 待其含量、 pH 值和澄明度合格后， 在高纯氮气下， 灌装于 50ml、 100ml 或 250ml 瓶或塑料袋中， 灭菌， 包 装即得。 实施例 12 ： 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物片或胶囊 (20mg/ 粒 )
处方 ： 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 2.5 水合物 20g
微晶纤维素 65g
乳糖 10g
低取代羟丙基纤维素 5g
β- 环糊精 5g
5％ PVP-K30(50％的乙醇水溶液 ) 适量
硬脂酸镁 2g
将丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 2.5 水合物、 微晶纤维素、 乳糖、 β- 环糊精、 低取代羟丙基纤 维素过 100 目筛， 用 5％ PVP-K30 的 50％的乙醇水溶液适量为粘合剂制软材， 过 18-24 目筛 制粒， 干燥， 过 14-20 目筛整粒后， 加硬脂酸镁混合， 灌装胶囊或者压片。
实施例 13 ： 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物片或胶囊 (50mg/ 粒 )
处方 ： 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 1.5 水合物 50g
乳糖 165g
羧甲基淀粉钠 5g
5％ PVP-K30(50％的乙醇水溶液 ) 适量
硬脂酸镁 2g
将丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 1.5 水合物、 乳糖、 羧甲基淀粉钠过 100 目筛， 用 5％ PVP-k30 的 50％的乙醇水溶液适量为粘合剂制软材， 过 18-24 目筛制粒， 干燥， 过 14-20 目筛整粒后， 加硬脂酸镁混合， 灌装胶囊或者压片。
实施例 14 ： 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物片或胶囊 (100mg/ 粒 )
处方 ： 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 0.5 水合物 100g
乳糖 155g
淀粉 40g
低取代羟丙基纤维素 5g
5％羟丙基甲基纤维素的 50％的乙醇水溶液 适量
硬脂酸镁 2g
将丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 0.5 水合物、 微晶纤维素、 乳糖、 低取代羟丙基纤维素过 100 目筛， 用 5％羟丙基甲基纤维素的 50％的乙醇水溶液适量为粘合剂制软材， 过 18-24 目筛制 粒， 干燥， 过 14-20 目筛整粒后， 加硬脂酸镁混合， 灌装胶囊或者压片。
实施例 15 ： 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物颗粒的制备
包括乳丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 4 水合物或丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 3 水合物丹参酮Ⅱ A 磺酸 钠水合物等颗粒 (50mg/ 包 )
处方 ： 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物 50g( 以无水物计 )
甘露醇 155g
乳糖 20g
固体食用香精 1g
5％羟丙基甲基纤维素 适量 将丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物、 甘露醇、 乳糖、 食用香精过 100 目筛， 用 5％的羟丙基 甲基纤维素的 50％乙醇水溶液适量为粘合剂制软材， 过 18-24 目筛制粒， 60℃以下干燥， 过 14-20 目筛整粒后， 分包装。
实施例 16 ： 药理学试验
1、 对氯化钙诱发大白鼠心律失常的作用
取 SD 大鼠 50 只， 雌雄不拘， 体重 226±31g， 随机分为 5 组， 分别静脉注射给予生 理盐水、 奎尼丁、 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物 ( 生理盐水溶解 )6mg·kg-1。3 ％戊巴比妥钠 40mg· kg-1 麻醉后， 仰卧位固定于手术台上， 经舌静脉注射给药， 6min 左右后， 快速静脉注射 -1 (5s 内推完 )2.5％氯化钙 100mg·kg (0.4ml/100g)， 记录出现室颤及死亡动物数。
结 果 显 示， 丹 参 酮 Ⅱ A 磺 酸 钠 水 合 物 组 可 明 显 抑 制 氯 化 钙 诱 发 大 鼠 室 颤 (p ＜ 0.05)， 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物组可明显抑制氯化钙导致的大鼠心律失常死亡 ( 表 3)。
表 3. 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合物对氯化钙诱发大鼠心律失常的作用
2、 对大鼠缺血再灌注的作用
Wistar 雄性大鼠 36 只， 体重 250 ～ 300g， 随机分为 3 组 ： 假手术组、 缺血再灌组和 本发明药物组， 每组 12 只。本发明药物组 ： 采用丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 1.5 水合物的生理盐水 腹腔给药， 剂量为 40mg/kg， 每天两次， 连续 7 天， 最后一次给药 60min 后实施脑缺血手术 ；
假手术组和缺血再灌组分别给以等容积的生理盐水。
大鼠用 10 ％水合氯醛 (3.5ml/kg) 腹腔注射麻醉， 仰卧位固定， 参照文献用 Zea Longa 线拴改良法造模 [ 上海交通大学学报 ( 医学版 )2007， 27(10) ： 1218-1222] ； 假手术 组栓线只插入 10mm， 其余步骤同模型组， 动物苏醒后出现手术侧 Homer 征和对侧体运动障 碍即为模型制备成功。造模成功后本发明药物组一天给药 2 次， 剂量同前， 假手术组和缺血 再灌组分别给以等容积的生理盐水。造模后 2h 抽出线， 再灌注 24 小时后处死大鼠， 迅速取 脑称重。低温下用生理盐水制成 10％脑组织匀浆液， 低温离心， 3000r/min 离心 10min， 弃 沉淀， 取上清液， 按市售测试 SOD、 MDA、 NO、 NOS 相应试剂盒的说明书分别测定 SOD、 MDA、 NO、 NOS 含量或活性， 结果见表 4。
表 4. 本发明药物对大鼠脑缺血再灌注脑组织中
NO、 NOS、 MDA、 SOD 的影响
结果表明， 与假手术组相比， 缺血再灌模型组大鼠脑组织中 SOD 活性明显降低， MDA、 NO 含量及 NOS 活性明显增加 (P ＜ 0.01) ； 与缺血再灌模型组相比， 本发明药物组大鼠 脑组织中 SOD 活性明显升高， NOS 活性降低， MDA、 NO 含量明显减少 (P ＜ 0.01)。将本发明 的丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 0.5 水合物和丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 2.5 水合物分别进行缺血再灌上述试 验， 获得与丹参酮Ⅱ A 磺酸钠 1.5 水合物相类似的结果。这些结果证明， 本发明药物通过对 NOS 活性和 NO 含量进行调节从而发挥脑缺血再灌注损伤的保护作用。
研究表明， NO 是具有生物活性信使小分子， 可自由穿过细胞膜， 作用于胞内的靶分 子。在生物体内， NO 生成后很快被氧化灭活， 以硝酸根和亚硝酸根的形式存在于细胞的内 外液中。低浓度的 NO 能使血管扩张， 抑制血小板集聚与粘附， 使谷氨酸调控的离子通道下 调， 防止细胞内钙超载， 因而对细胞有保护作用 ； 但在高浓度下， NO 可与超氧阴离子反应生 2成超氧亚硝酸根离子， 超氧亚硝酸根离子可以降解为 OH 和 NO 自由基， 使细胞膜发生脂质 过氧化作用， 在细胞的膜水平造成强烈的神经毒性， 甚至导致神经元死亡等。
研究表明， NO 在脑缺血性损伤的发病中起重要作用， 缺血后数分钟 NO 含量明显增 高，之后缓慢下降， 于再灌注期 NO 再次升高。 其机制可能为 ： 脑缺血后神经元受损， 细胞膜 去极化过程增强， 突触前谷氨酸等兴奋性氨基酸生成大量增加， 使胞外谷氨酸浓度升高， 激 2+ 活 N- 甲基 -D- 天门冬氨酸 (NMDA) 受体， NMDA 受体激活后使突触后 Ca 内流增加， 激活一 氧化氮合酶 NOS， 促进 NO 的生成 ； 其二， 脑缺血后， ATP 大量消耗， 导致能量代谢障碍及 cAMP 依赖的蛋白激酶活性下降， 由于 NOS 脱磷酸化使得 NOS 的活性增强， 从而促进 NO 的生成。
一氧化氮合酶是一氧化氮合成的限速酶 NOS。 在脑缺血早期， NOS 介导生成的 NO 通 过扩张血管改善缺血区的血液供应， 具有短时保护性作用， 但随着 NO 的大量产生， 在缺血 区 NOS 因介导神经毒性效应并很快占优， 使脑缺血损伤加剧 ； 到晚期， 脑缺血脑组织损伤、 炎症反应刺激巨噬细胞、 神经小胶质细胞、 神经元等可大量产生诱导型 NOS， 诱导型 NOS 可 缓慢而持久大量地产生 NO， 过量的 NO 产生和释放， 加重神经元损害。因此， 降低诱导型 NOS
的产生可明显减少 NO 的释放， 从而降低 NO 的细胞毒性作用， 起到保护脑细胞的作用。
本实验的研究结果表明， 大鼠脑缺血再灌注损伤后， 脑组织中 NO 和 NOS 含量显著 增加， 说明 NO 和 NOS 参与了脑缺血再灌注损伤的发病机制， 给予本发明药物治疗后， NO 和 NOS 含量明显下降。 表明本发明药物通过对 NOS 活性和 NO 含量进行调节从而发挥脑缺血再 灌注损伤的保护作用。
脑缺血及再灌注损伤可导致脑细胞膜脂质过氧化反应， 产生过多的氧自由基， 损 伤脑细胞膜。脑缺血时由于组织氧和能量代谢的物质供应不足， ATP 生成减少， 离子泵失 + + + + 效， Na -K -ATP 酶活性降低， 使大量 Na 内流、 K 外流， Cl 和 H2O 被动进入细胞内， 引起神经 细胞急性渗透性肿胀死亡。Na+ 内流和 K+ 外流导致细胞膜电位下降产生去极化， 电压依赖 2+ 2+ +、 性 Ca 通道开放， Ca 大量内流 ； 同时由于 K 蛋白激酶 C 及递质的释放等作用， 受体依赖性 2+ Ca2+ 通道开放， Ca 大量内流。 细胞内钙超载可导致氧自由基产生增加、 花生四烯酸代谢增 强、 兴奋性氨基酸递质释放增加等， 兴奋性氨基酸又可引起细胞内 Ca2+ 超载造成神经细胞 凋亡。其中氧自由基增加是缺血再灌注损伤的一个重要因素。
3、 对钙反常心肌的保护作用
参照文献 ( 徐叔云等主编， 药理学试验方法第三版 p986-1000 ； 中国病理生理杂 志 .1987， 3： 154-158) 构建豚鼠离体心脏灌流造成心肌钙反常模型。将体重为 280-360g 的 健康豚鼠 48 只分为 6 组， 每组 8 只， 分别为正常对照组， 钙反常组， 异搏定阳性对照组， 三个 给药组， 实验前禁食一夜， 肝素 0.5mg/kg 腹腔内注射， 20 分钟后戊巴比妥钠 30mg/kg 腹腔注 射， 麻醉后开胸， 迅速取出心脏， 浸于用冰冷却的 Kreb’ s-Henseleit(K-H) 灌流液中， 主动 脉插管后将心脏放入恒温恒压离体心脏灌流装置， 参照文献 ( 中国病理生理杂志 .1987， 3： 154-158)， 于 37℃， 以 Langendrff 法灌流心脏， 三个给药组分别为钙反常加 32mg/L 的本发 明化合物， 正常对照组以含钙 Kreb’ s-Henseleit 液持续灌流 35min， 收集后 20min 冠脉流 出液， 其余 5 组均以含钙 K-H 液灌流 10min， 使心脏达稳定状态， 再以无钙 K-H 液灌流 5min， 随后恢复含钙 K-H 液灌 20min， 通过以上灌流程序造成钙反常模型。 其中阳性对照组全程灌 流液中加入 2.1mg/L 异搏定， 给药组全程灌流液中分别加入 32mg/ 丹参酮Ⅱ A 磺酸钠水合 物。收集恢复给钙 20min 冠脉流出液， 参照文献测定所收集各组冠脉流出液中的蛋白释放 量 mg/min/g drywt 以及心肌组织钙摄取量 μmol/g drywt。 发现与反常组相比结果差异呈 现显著性 (P ＜ 0.01)， 见表 5， 表 6。
表 5. 本发明化合物对钙反常心肌组织蛋白释放量的影响
表 6. 本发明化合物对钙反常心肌组织钙摄取率的影响由此可见， 本发明的化合物对心肌钙反常损伤具有明显的保护作用， 具有钙离子 拮抗作用， 能抑制钙内流， 减轻钙反常过程中心肌组织钙沉积和心肌损伤所致的蛋白释放。 2+
Ca 在维持心肌细胞兴奋收缩偶联中起着重要作用。正常心肌细胞中 Ca2+ 大部分 储存于线粒体、 肌浆网及肌纤维膜上， 胞浆游离 Ca2+ 浓度异常增高可致细胞钙超载或钙反 常， 导致心肌钙反常等， 是心律失常、 心肌缺血再灌注损伤、 心力衰竭、 动脉粥样硬化等的重 要因素。
例如当缺血心肌再灌注时， 心脏以无钙溶液短时间灌流后恢复含钙液灌流或心肌 缺血后再灌注， 大量而迅速的钙内流使得钙离子激活与胞浆膜结合的磷脂酶， 产生大量的 氧自由基， 进而触发一系列脂质过氧化反应， 使胞浆膜出现大量新的通道， 肌膜通透性大大 增强， 钙离子通过这些通道顺浓度梯度大量进入细胞内， 引起心肌细胞孪缩， 在这种情况下 2+ 还激活 Ca -ATP 激酶， 使得肌浆网和线粒体钙摄取增加， 由于这些过程都增加 ATP 的消耗， + 而 ATP 的降解会释放大量 H ， 钙离子以磷酸盐的形式在线粒体内沉积过程中也释放出大量 + 2+ H， 进入线粒体的 Ca 与磷酸根形成磷酸钙沉积， 干扰线粒体的氧化磷酸化， 使 ATP 生成减 + 2+ 少， 导致线粒体功能障碍 ； H 和过量的 Ca 进一步激活磷脂酶和蛋白酶， 引起细胞膜破坏， 细胞内成分如酶、 蛋白质等释放， 引起心肌破坏性损害， 电生理活动消失， 持续性肌挛缩， 能 量耗竭， 迅速而严重的结构损伤， 细胞骨架破坏， 引发心律失常、 心绞痛、 缺血再灌注损伤、 心力衰竭等问题。
而通常来说， 钙拮抗剂能抑制钙离子内流， 减少血管平滑肌的张力及其对内源性 加压物质的反应性 ； 防止心肌细胞内钙过多， 减少 ATP 的分解， 降低异常代谢物质 ( 包括自 由基 ) 在细胞内的堆积， 改善心肌舒张功能， 减少心肌耗氧， 缩小心肌梗死的范围并减少梗 死时血中酶含量的变化， 减少心肌作功、 降低氧耗、 扩张冠脉增加缺血区供血， 对心脏和缺 血的心肌有保护作用， 对心肌缺血再灌流时出现的心律失常有一定程度的预防作用。钙拮 抗剂通过抑制钙离子内流降低血管平滑肌张力， 可扩张外周血管、 脑、 肺、 肾、 肠系膜血管。 通过减少心肌细胞钙离子内流， 降低收缩功能， 即负性肌力作用， 防止钙超载， 避免钙对心 肌的损伤。通过减少血管壁钙离子沉积， 长期应用可防止动脉硬化。钙拮抗剂可增加红细 胞的变形能力， 降低血液粘滞度， 抑制血小板聚集， 延长出血时间。用于预防和治疗冠状动 脉粥样硬化性心脏病、 心绞痛、 心律失常、 肥厚性心肌病、 脑供血不足、 短暂脑缺血和缺血性 脑中风、 外周血管病、 雷诺氏综合征、 偏头痛等疾病。
可以理解， 从本专业角度， 很多细节的变化是可能的， 这并不因此限制本发明范围 和精神， 本发明并不限于上述实施例。