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1、10申请公布号CN102088858A43申请公布日20110608CN102088858ACN102088858A21申请号200980125450022申请日2009063008382025820080702EP61/093,78720080903USA01N47/44200601A01P3/0020060171申请人米雷特实验室股份公司地址西班牙巴塞罗那72发明人泽维尔罗卡巴亚拉泊维拉塞吉菲格拉斯罗卡罗杰赛格利特庞斯伊娃皮拉伊罗雷斯74专利代理机构中原信达知识产权代理有限责任公司11219代理人张颖樊卫民54发明名称阳离子表面活性剂作为杀孢子剂的应用57摘要由脂肪酸和酯化二碱价氨基酸例如。
2、来源于月桂酸和精氨酸缩合得到的阳离子表面活性剂，特别是精氨酸单盐酸盐的月桂酰胺的乙酯LAE，可用于处理感染了孢子的物体。孢子可来源于细菌或真菌。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2010123086PCT申请的申请数据PCT/EP2009/0581972009063087PCT申请的公布数据WO2010/000744EN2010010751INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书17页CN102088863A1/2页21由脂肪酸和酯化二碱价氨基酸缩合获得的下式1的阳离子表面活性剂在杀孢子处理中的应用其中X是BR、CL或HSO4，有机或无机酸的反离子。
3、，或基于酚类化合物的阴离子；R1是来自与氨基酸基团通过酰胺键成键的、8至14个原子的饱和脂肪酸或羟酸的直链烷基链；R2是1至18个碳原子的直链或支链烷基链、或芳基；R3是并且N是0至4。2权利要求1的应用，其中式1的阳离子表面活性剂是式2的精氨酸单盐酸盐的月桂酰胺的乙酯LAE3权利要求1或2的应用，用于处理细菌来源的孢子。4权利要求1或2的应用，用于处理真菌来源的孢子。5权利要求3或4的应用，其中用于制备溶液的溶剂是水、丙二醇、乙醇、甘油或这些液体的混合物。6权利要求5的应用，其中溶液包含其它成分，例如防腐剂、抗氧化剂、表面活性剂、增稠剂、酶抑制剂、有机和无机盐、有机和无机酸、以及液态和固态载。
4、体。权利要求书CN102088858ACN102088863A2/2页37权利要求3至6任一项的应用，其中制剂中阳离子表面活性剂的浓度在00001重量至5重量的范围内。8前述权利要求任一项的应用，其中阳离子表面活性剂与剂量水平在10至100,000PPM之间、优选在100至10,000PPM之间的聚山梨酸酯组合。9前述权利要求任一项的应用，其中阳离子表面活性剂与另一种杀孢子剂组合。10权利要求9的应用，其中另一种杀孢子剂是剂量水平在10PPM至10,000PPM之间，优选在100PPM至1,000PPM之间的三聚磷酸钠。11前述权利要求任一项的应用，其中孢子存在于食品、化妆品中以及仪器表面上。。
5、权利要求书CN102088858ACN102088863A1/17页4阳离子表面活性剂作为杀孢子剂的应用0001本申请涉及阳离子表面活性剂的新应用。0002阳离子表面活性剂被认为是用于食品、化妆品和制药工业的防腐剂。阳离子表面活性剂被证明高效对抗微生物增殖，同时对于摄入人和哺乳动物中通常是安全的。因为这些，阳离子表面活性剂是工业中有吸引力的工具。0003已经证明，由脂肪酸和酯化二碱价氨基酸DIBASICAMINOACID缩合得到的式1的阳离子表面活性剂是对抗微生物的高效防护性物质。00040005其中0006X是来源于有机或无机酸的反离子，优选BR，CL或HSO4，或基于酚类化合物的阴离子；0。
6、007R1是来自与氨基酸基团通过酰胺键连接的、具有8至14个原子饱和脂肪酸或羟酸的直链烷基链；0008R2是具有1至18个碳原子的直链或支链烷基链、或芳基；0009R3是0010NH300110012其中N是0至4。0013可作为反离子X的来源的有机酸可以是柠檬酸、乳酸、乙酸、富马酸、马来酸、葡糖酸、丙酸、山梨酸、苯甲酸、碳酸、谷氨酸或其它氨基酸、月桂酸和脂肪酸例如油酸和亚油酸，而无机酸可以是磷酸、硝酸和硫氰酸。0014可以作为阴离子X的基础的酚类化合物是例如丁基化羟基茴香醚BHA和相关的丁基化羟基甲苯、叔丁基氢醌和对羟基苯甲酸酯类例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲说明书CN102088858A。
7、CN102088863A2/17页5酸乙酯、对羟苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯。0015以上化合物类别中最优选的化合物是精氨酸单盐酸盐的月桂酰胺的乙酯，以下称为LAECASNO60372772。该化合物作为抗微生物剂的应用，现在是公知的。在实际用途中，LAE被证明耐受良好并对人类显示出极低的毒性。LAE具有下面显示的式2的化学结构。00160017化合物LAE以其对抗不同微生物例如细菌、霉菌和酵母的活性而著称，所述微生物可以存在于食品中WO03/034842，也可以存在于化妆品制剂和制品中WO03/013453，WO03/013454和WO03/043593。0018所述阳离子表面活性剂的常规制。
8、备在西班牙专利ES512643和国际专利申请WO96/21642、WO01/94292和WO03/064669中描述。0019LAE，又名月桂酸精氨酸酯，由LABORATORIOSMIRET，SALAMIRSA，西班牙制造。月桂酸精氨酸酯被FDA食品和药物管理局在GRN000164项下列为GRAS物质公认安全。USDA美国农业部已经批准它用于肉类和禽类制品FSIS指令71201以及作为新鲜肉类和禽类制品的加工助剂。0020已经研究了以上式2的阳离子表面活性剂在大鼠中的代谢；这些研究显示出快速吸收并代谢成天然存在的氨基酸和脂肪酸月桂酸，最终作为二氧化碳和尿素被排泄出去。毒理学研究证明，LAE对动。
9、物和人类完全无害。0021因此，LAE和相关化合物特别适合用于所有易腐食品的保存。LAE和相关化合物同样适合用于化妆品中。0022上面已经谈及，阳离子表面活性剂以其对不同微生物例如细菌、真菌和酵母增殖的抑制作用而著称。LAE的最低抑菌浓度显示在下面表1中。0023表10024说明书CN102088858ACN102088863A3/17页60025优选将所述化合物在使用前直接溶解于下列优选的食品级溶剂之一中水，乙醇，丙二醇，异丙醇，其它二醇，二醇的混合物和二醇与水的混合物，二醋精，三醋精，甘油，山梨糖醇，甘露糖醇和木糖醇。如果应该在特定PH值下进行处理，则使用相应的缓冲溶液可能是可取的。另一方。
10、面，化合物能够便于以其固态形式使用或用固态载体例如盐、糖、麦芽糖糊精、水胶体和山梨醇配制。0026上面式1的阳离子表面活性剂的抗细菌活性和对抗其它微生物例如真菌和酵说明书CN102088858ACN102088863A4/17页7母的生物活性，已有充分的文件证明。0027由于某些细菌产生内生孢子的能力，往往限制了对细菌性感染的有效处理。0028内生孢子是厚壁菌FIRMICUTE门的少数细菌产生的休眠的、坚韧的和非增殖性的结构。大多数内生孢子的主要功能是确保细菌存活过环境胁迫时期。因此它们对紫外线和射线、干燥、溶菌酶、温度、饥饿和化学消毒剂有抗性。内生孢子通常在土壤和水中发现，在那里它们可以长时。
11、间存活。它们也在食品、化妆品和仪器表面发现。一些细菌则改为产生外生孢子或孢囊。0029内生孢子对大多数通常会杀死从其形成的营养细胞的药剂有抗性。家用清洁产品通常没有作用，大多数醇类、四元化合物和去污剂也没有作用。但是，烷基化剂例如环氧乙烷有效对抗内生孢子。0030虽然对极热和放射线有抗性，但烧灼或压热处理能够破坏内生孢子。暴露于极热下足够久的时间一般将有一些作用，不过许多内生孢子能够在煮沸或蒸煮下存活数小时。长时间暴露于高能射线例如X射线和射线也将杀死大多数内生孢子。0031本发明的目的是提供杀死内生孢子的另一种药剂。0032本发明人所进行的研究的令人意外的结果是，上式1的阳离子表面活性剂表现。
12、出杀孢子活性。以前记述过所述阳离子防腐剂没有这样的杀孢子活性。0033观察到所述阳离子表面活性剂对抗细菌和霉菌孢子的活性，例如对抗细菌和霉菌的内生孢子的活性。0034本发明人得到的另一个意外的观察结果是，所述阳离子表面活性剂还表现出对真菌产生的内生孢子的杀孢子活性。0035这使得能够高效处理可能受到存在的不同来源孢子的感染的任意物体。0036本发明使用的阳离子表面活性剂由脂肪酸和酯化二碱价氨基酸缩合而来，具有上式1，式1的阳离子表面活性剂的最优选种类是上式2的月桂酸精氨酸盐的乙酯。0037所述阳离子表面活性剂可能作为适当溶剂中的溶液施用起来最方便，但是它也可以执行应该通过施加固态形式或固态制剂。
13、进行清洁的物体的处理。0038如果所述阳离子表面活性剂作为溶液应用，要清洁的物体是计划被人类或动物消耗的任何产品，溶液的液体基质可以是适合于在食品制备中使用的任何液体。这样的液体是水、丙二醇、乙醇或甘油。这些液体的混合物也可以。0039水可以是指自来水、去矿质水、蒸馏水、或任何适当的盐的水溶液。0040优选将所述阳离子表面活性剂溶解在水性溶液中。作为溶液的介质，水例如自来水或去矿质水是最适合的，盐水溶液也是可以的。0041添加其它溶剂也可以，例如任何有机溶剂，只要这种另外添加的溶剂对以后被人类消费者耗用没有负面作用即可。通常，添加其它溶剂没有特别的优点，运用自来水溶液已足以用于一般目的。004。
14、2如果处理是针对不打算直接被人类或动物耗用的物体，则所述组合物不受相同的严格要求和可以选择更具侵蚀性的溶液。这样的物体可以是工业环境中可能被产生内孢子的细菌和霉菌污染的表面。0043为了对孢子有想要的作用，式1的阳离子表面活性剂需要达到充分的浓度。已经注意到，当溶液包含式1的阳离子表面活性剂、更特别是优选的实施方案LAE达0001说明书CN102088858ACN102088863A5/17页8至5重量浓度时，就达到了这种充分的浓度。更优选的浓度在001至25重量范围之内，最优选的浓度在005至01重量的范围内。0044在表面上施加固态形式将导致所处理的表面上式1的阳离子表面活性剂、更特别是优。
15、选实施方案LAE的浓度达到足以在这样的表面上实现想要的生物作用的水平。这样的充分浓度水平预期将在10至20,000PPM、更优选200至15,000PPM、并且更加优选500至12,000PPM的范围内。这些浓度依据包含施加到待处理表面的阳离子表面活性剂的溶液的浓度来给出。如果表面用式1的阳离子表面活性剂的固态制剂处理，则其应用量应该是要使得式1的阳离子表面活性剂的量在005至200MG/DM2范围内，优选量为05至150MG/DM2，更优选量为1至100MG/DM2和最优选量为5至80MG/DM2。0045与其他产品组合也是可以的，例如与磷酸盐、聚山梨酸酯、螯合剂、乳链球菌肽NISINE、溶。
16、菌酶及其他已经被认作杀孢子剂的产品组合。例如用于杀孢子处理的水性组合物可包含适当量的三磷酸钠。这样的适当量在10至10,000PPM之间，优选的范围在100至1,000PPM之间。当与聚山梨酸酯组合时，所述适当量在10至100,000PPM之间，聚山梨酸酯20是优选的聚山梨酸酯。当与乳链球菌肽组合时，所述适当量在10至600PPM之间，当与溶菌酶组合时，所述适当量在20至400PPM的范围内。0046实施例10047LAE的杀孢子活性根据欧洲标准EN137042002进行测定“化学消毒剂用于食品、工业、家庭和公共机构领域的化学消毒剂的杀孢子活性评价的定量悬液试验试验方法和必要条件CHEMICA。
17、LDISINFECTANTQUANTITATIVESUSPENSIONTESTFIRTHEEVALUATIONOFSPORICIDALACTIVITYOFCHEMICALDISINFECTANTSUSEDINFOOD，INDUSTRIAL，DOMESTICANDINSTITUTIONALAREASTESTMETHODANDREQUIREMENTS”。0048本实施例的目的是证明LAE对来自试验生物体枯草芽孢杆菌的细菌内生孢子的活性。0049从营养琼脂上生长的培养物制备包含来自枯草芽孢杆菌ATCC6633的内生孢子的试验悬液，其中加入了增强孢子形成的其它成分。用无菌水采集培养板，通过反复离心和在。
18、水中再悬浮来提纯内生孢子。0050中和剂中和剂混合物由127聚山梨酸酯80、60TAMOLSN该品牌为萘甲醛缩合物的钠盐、17卵磷脂、1蛋白胨和01胱氨酸组成。该溶液是用来中和任何化学物质，以便它们不会影响细菌的后续生长。0051该给定产品的杀孢子活性定义为其在该方法制定的条件下，减少悬液中至少103的枯草芽孢杆菌细菌芽孢量的能力。0052LAE由LAMIRSA生产。0053该产品在设定的60分钟时段期间与细菌芽孢的悬液接触。悬液中能够添加干扰物质，在本例中为含03牛血清清蛋白的蒸馏水。接着，通过添加事先选好的中和剂来中和产品的作用，然后对存活的孢子进行计数。0054程序00551从枯草芽孢杆。
19、菌的孢子形成培养物获得孢子悬液。00562对枯草芽孢杆菌的孢子悬液进行计数。00573评价在没有所述产品的情况下，中和剂对孢子的可能的毒性作用。说明书CN102088858ACN102088863A6/17页900584评价中和剂对产品的中和作用。00594评价所述产品的抑制作用。00605计算结果。0061结果00620063结果表示为在下述方面中，孢子悬液生存力的降低0064验证产品的中和作用，0065验证中和剂的无毒性，0066产品的杀孢子活性。0067方法和试验验证结果表2000680069CFU集落形成单位0070所述验证试验得到的结果表明，所使用的中和剂聚山梨酸酯80的2水溶液没有。
20、毒性，并中和产品的作用，因为在这两种情况下，活孢子数与各试验中使用的溶液类似。0071杀孢子活性如下计算0072RNX01/NA0073N是孢子悬液的CFU/ML。0074NA是杀孢子活性的CFU/ML。0075计算出下述溶液的降低007650PPMLAE是R35X102CFU/ML0077100PPMLAE是R34X102CFU/ML0078150PPMLAE是R43X102CFU/ML0079250PPMLAE是R103CFU/ML0080数据显示，从LAE浓度50PPM开始，抑制孢子萌发。说明书CN102088858ACN102088863A7/17页100081如果使用产品在EN137。
21、042000设置的条件下接触60分钟之后，导致枯草芽孢杆菌细菌芽孢数量的减少等于或超过103，则产品被认为是杀孢子的。0082因此，LAE在等于或超过250PPM的浓度下，表现出对枯草芽孢杆菌内生孢子的杀孢子活性。在杀孢子活性测试中，物种是平常的物种。所述物种与引起炭疽的细菌生物体属于相同的属。由于它们的遗传学相似性，枯草芽孢杆菌已经被用作炭疽病细菌炭疽杆菌的孢子的非致病代替。本结果预计可适用于炭疽病。0083实施例20084LAE杀真菌活性的测定根据欧洲标准UNEEN1275进行“化学消毒剂和杀菌剂杀真菌活性，试验方法和必要条件CHEMICALDISINFECTANTANDANTISEPTI。
22、CFUNGICIDEACTIVITYTESTMETHODANDREQUIREMENTS”。0085所给出产品的杀真菌活性定义为其在所述方法制定的条件下，减少悬液中至少104的黑曲霉真菌孢子量的能力。0086LAE由LAMIRSA生产。0087所述产品在设定的时段60分钟期间，与真菌孢子的悬液接触。这段时间之后，通过添加聚山梨酸酯80的2水溶液中和所述产品的作用，然后进行存活孢子的计数。0088程序00891从黑曲霉的孢子形成培养物获得孢子悬液。00902对黑曲霉的孢子悬液进行计数。00913评价在没有所述产品的情况下，中和剂对孢子的可能的毒性作用。00924评价中和剂对产品的中和作用。0093。
23、5评价产品的杀真菌作用。00946计算结果。0095结果00960097结果表示为在下述方面中，孢子悬液生存力的降低0098验证所述产品的中和作用，0099验证所述中和剂的无毒性，0100所述产品的杀真菌活性。0101方法和试验验证结果表20说明书CN102088858ACN102088863A8/17页1101020103CFU集落形成单位0104杀真菌活性如下计算0105RNX01/NA0106N真菌孢子悬液的CFU/ML0107NA杀真菌活性的CFU/ML0108计算出下述溶液中的降低0109100G/MLLAE是R31X102CFU/ML0110200G/MLLAE是R13X103CF。
24、U/ML0111300G/MLLAE是R14X103CFU/ML0112400G/MLLAE是R17X103CFU/ML0113500G/MLLAE是R104CFU/ML0114可见，从100PPM开始，抑制了真菌孢子萌发。0115从500PPM开始，观察到真菌孢子萌发的完全抑制。0116如果使用产品在UNEEN1275设置的条件下接触60分钟之后，导致黑曲霉真菌孢子数量的减少等于或超过104，则所述产品被认为是杀真菌的。0117因此，LAE在等于或超过500PPM的浓度下是杀真菌的。0118实施例30119根据欧洲标准EN137042002进行LAE杀孢子活性的测定“化学消毒剂用于食品、工业。
25、、家庭和公共机构领域的化学消毒剂的杀孢子活性评价的定量悬液试验试验方法和必要条件”0120本实施例的目的是证明LAE对来自试验生物体嗜热脂肪地芽孢杆菌GEOBACILLUSSTEAROTHERMOPHILUS的细菌内生孢子的活性。0121从营养琼脂上生长的培养物制备包含出自嗜热脂肪地芽孢杆菌ATCC12980的内说明书CN102088858ACN102088863A9/17页12生孢子的试验悬液，其中加入了增强孢子形成的其它成分。用无菌水采集培养板，通过反复离心和在水中再悬浮来提纯内生孢子。0122中和剂中和剂混合物由30G/L聚山梨酸酯80的水溶液组成。该溶液是用来中和任何化学物质，以便它们。
26、不会影响细菌的后续生长。0123所给定产品的杀孢子活性定义为其在所述方法制定的条件下，减少悬液中至少103的嗜热脂肪地芽孢杆菌细菌芽孢量的能力。0124LAE由LAMIRSA生产。0125该产品在设定的60分钟时段期间与细菌芽孢的悬液接触。悬液中可添加干扰物质，在本例中为水。接着，通过添加事先选好的中和剂来中和产品的作用，然后对存活的孢子进行计数。0126程序01271从嗜热脂肪地芽孢杆菌的孢子形成培养物获得孢子悬液。01282对嗜热脂肪地芽孢杆菌的孢子悬液进行计数。01293评价在没有所述产品的情况下，中和剂对孢子的可能的毒性作用。01304验证所述稀释中和方法。01315评价产品的抑制性杀。
27、孢子作用。01326计算结果。0133结果01340135结果表示为在下述方面中，孢子悬液生存力的降低0136验证所述产品的中和作用，0137验证所述中和剂的无毒性，0138产品的杀孢子活性。0139方法和试验验证结果表4001400141CFU集落形成单位0142所述验证试验得到的结果表明，所使用的中和剂30G/L聚山梨酸酯80的水溶液没有毒性，并中和产品的作用，因为在这两种情况下，活孢子数与各试验中使用的溶液说明书CN102088858ACN102088863A10/17页13类似。0143杀孢子活性遵循标准EN137042002的准则计算0144RNX01/NA0145N是孢子悬液的CF。
28、U/ML0146NA是杀孢子活性的CFU/ML0147计算出不同浓度LAE的嗜热脂肪地芽孢杆菌降低R是014858G/MLLAE是R103CFU/ML0149115G/MLLAE是R103CFU/ML0150173G/MLLAE是R103CFU/ML0151230G/MLLAE是R103CFU/ML0152460G/MLLAE是R103CFU/ML0153如果使用产品在EN137042002设置的条件下接触60分钟之后，导致嗜热脂肪地芽孢杆菌细菌芽孢数量的减少R等于或超过103，则所述产品被认为是杀孢子的。0154因此，LAE在等于或超过173G/ML的浓度下，表现出对嗜热脂肪地芽孢杆菌内生孢。
29、子的杀孢子活性。0155实施例40156根据欧洲标准EN137042002进行LAE杀孢子活性的测定“化学消毒剂用于食品、工业、家庭和公共机构领域的化学消毒剂的杀孢子活性评价的定量悬液试验试验方法和必要条件”。0157本实施例的目的是证明LAE对来自试验生物体热解糖热厌氧杆菌THERMOANAEROBACTERIUMTHERMOSACCHAROLYTICUM的细菌内生孢子的活性。0158从营养琼脂上生长的培养物制备包含来自热解糖热厌氧杆菌ATCC7956的内生孢子的试验悬液，其中加入了增强孢子形成的其它成分。用无菌水采集培养板，通过反复离心和在水中再悬浮来提纯内生孢子。0159中和剂中和剂混合。
30、物由30G/L聚山梨酸酯80的水溶液组成。该溶液是用来中和任何化学物质，以便它们不会影响细菌的后续生长。0160所给定产品的杀孢子活性定义为其在所述方法制定的条件下，减少悬液中至少103的热解糖热厌氧杆菌细菌芽孢量的能力。0161LAE由LAMIRSA生产。0162该产品在设定的60分钟时段期间与细菌芽孢的悬液接触。悬液中可添加干扰物质，在本例中为水。接着，通过添加事先选好的中和剂来中和产品的作用，然后对存活的孢子进行计数。0163程序01641从热解糖热厌氧杆菌的孢子形成培养物获得孢子悬液。01652对热解糖热厌氧杆菌的孢子悬液进行计数。01663评价在没有所述产品的情况下，中和剂对孢子的可。
31、能的毒性作用。01674验证所述稀释中和方法。01685评价产品的抑制性杀孢子作用。01696计算结果。说明书CN102088858ACN102088863A11/17页140170结果01710172结果表示为在下述方面中，孢子悬液生存力的降低0173验证所述产品的中和作用，0174验证所述中和剂的无毒性，0175产品的杀孢子活性。0176方法和试验验证结果表2001770178CFU集落形成单位0179所述验证试验得到的结果表明，所使用的中和剂30G/L聚山梨酸酯80的水溶液没有毒性，并中和产物的作用，因为在这两种情况下，活孢子数与各试验中使用的溶液类似。0180杀孢子活性遵循标准EN13。
32、7042002的准则计算0181RNX01/NA0182N是孢子悬液的CFU/ML0183NA是杀孢子活性的CFU/ML0184计算出下述溶液中的降低018532G/MLLAE是R103CFU/ML018651G/MLLAE是R103CFU/ML0187102G/MLLAE是R103CFU/ML0188205G/MLLAE是R103CFU/ML0189如果使用产品在EN137042002设置的条件下接触60分钟之后，导致热解糖热厌氧杆菌细菌孢子数量的减少R等于或超过103，则所述产品被认为是杀孢子的。0190因此，LAE在等于或超过102G/ML的浓度下，表现出对热解糖热厌氧杆菌内生孢子的杀孢。
33、子活性。0191实施例50192根据欧洲标准EN137042002进行LAE杀孢子活性的测定“化学消毒剂用于食品、工业、家庭和公共机构领域的化学消毒剂的杀孢子活性评价的定量悬液试验试验方法和必要条件”。说明书CN102088858ACN102088863A12/17页150193本实施例的目的是证明LAE对来自试验生物体产芽胞梭状芽胞杆菌CLOSTRIDIUMSPOROGENES的细菌内生孢子的活性。0194从营养琼脂上生长的培养物制备包含来自产芽胞梭状芽胞杆菌ATCC7955的内生孢子的试验悬液，其中加入了增强孢子形成的其它成分。用无菌水采集培养板，通过反复离心和在水中再悬浮来提纯内生孢子。。
34、0195中和剂中和剂混合物由30G/L聚山梨酸酯80的水溶液组成。该溶液是用来中和任何化学物质，以便它们不会影响细菌的后续生长。0196所给定产品的杀孢子活性定义为其在所述方法制定的条件下，减少悬液中至少103的产芽胞梭状芽胞杆菌细菌芽孢量的能力。0197LAE由LAMIRSA生产。0198该产物在设定的60分钟时段期间与细菌芽孢的悬液接触。悬液中可添加干扰物质，在本例中为水。接着，通过添加事先选好的中和剂来中和产物的作用，然后对存活的孢子进行计数。0199程序02001从产芽胞梭状芽胞杆菌的孢子形成培养物获得孢子悬液。02012对产芽胞梭状芽胞杆菌的孢子悬液进行计数。02023评价在没有所述。
35、产物的情况下，中和剂对孢子的可能的毒性作用。02034验证所述稀释中和方法。02045评价产物的抑制性杀孢子作用。02056计算结果。0206结果02070208结果表示为在以下方面中，孢子悬液生存力的降低0209验证所述产物的中和作用，0210验证所述中和剂的无毒性，0211产物的杀孢子活性。0212方法和试验验证结果表200213说明书CN102088858ACN102088863A13/17页160214CFU集落形成单位0215所述验证试验得到的结果表明，所使用的中和剂30G/L聚山梨酸酯80的水溶液没有毒性，并中和产物的作用，因为在这两种情况下，活孢子数与各试验中使用的溶液类似。02。
36、16杀孢子活性遵循标准EN137042002的准则计算0217RNX01/NA0218N是孢子悬液的CFU/ML0219NA是杀孢子活性的CFU/ML0220计算出下述溶液中的降低R022113G/MLLAE是R103CFU/ML022226G/MLLAE是R103CFU/ML022351G/MLLAE是R103CFU/ML022464G/MLLAE是R103CFU/ML0225如果使用产品在EN137042002设置的条件下接触60分钟之后，导致产芽胞梭状芽胞杆菌细菌孢子数量的减少等于或超过103，则所述产品被认为是杀孢子的。0226因此，LAE在等于或超过51G/ML的浓度下，表现出对产芽。
37、胞梭状芽胞杆菌内生孢子的杀孢子活性。0227实施例60228根据欧洲标准EN137042002进行LAE与三磷酸钠联合杀孢子活性的测定“化学消毒剂用于食品、工业、家庭和公共机构领域的化学消毒剂的杀孢子活性评价的定量悬液试验试验方法和必要条件”。0229本实施例的目的是证明LAE与三磷酸钠的组合对出自试验生物体嗜热脂肪地芽孢杆菌的细菌内生孢子的活性。0230从营养琼脂上生长的培养物制备包含来自嗜热脂肪地芽孢杆菌ATCC12980的内生孢子的试验悬液，其中加入了增强孢子形成的其它成分。用无菌水采集培养板，通过反复离心和在水中再悬浮来提纯内生孢子。0231中和剂中和剂混合物由30G/L聚山梨酸酯80。
38、的水溶液组成。该溶液是用来中和任何化学物质，以便它们不会影响细菌的后续生长。0232所给定产品的杀孢子活性定义为其在所述方法制定的条件下，减少悬液中至少103的嗜热脂肪地芽孢杆菌细菌芽孢量的能力。0233LAE由LAMIRSA生产。0234试验了下列溶液02351LAE1和聚山梨酸酯2075的溶液；02362三聚磷酸钠5和聚山梨酸酯2010的溶液；02373包含LAE1、三聚磷酸钠02、聚山梨酸酯2075和氯化钠04的溶液；02384包含LAE1、三聚磷酸钠50和聚山梨酸酯2075的溶液。0239该产物在设定的60分钟时段期间与细菌芽孢的悬液接触。悬液中可添加干扰物质，在本例中为含03牛血清清。
39、蛋白的蒸馏水。接着，通过添加事先选好的中和剂来中和说明书CN102088858ACN102088863A14/17页17产物的作用，然后对存活的孢子进行计数。0240程序02411从嗜热脂肪地芽孢杆菌的孢子形成培养物获得孢子悬液。02422对嗜热脂肪地芽孢杆菌的孢子悬液进行计数。02433评价在没有所述产物的情况下，中和剂对孢子的可能的毒性作用。02444验证所述稀释中和方法。02455评价产物的抑制性杀孢子作用。02466计算结果。0247结果02480249结果表示为在以下方面中，孢子悬液生存力的降低0250验证所述产物的中和作用，0251验证所述中和剂的无毒性，0252产物的杀孢子活性。。
40、0253方法和试验验证结果表20说明书CN102088858ACN102088863A15/17页1802540255CFU集落形成单位0256所述验证试验得到的结果表明，所使用的中和剂30G/L聚山梨酸酯80的水溶液没有毒性，并中和产物的作用，因为在这两种情况下，活孢子数与各试验中使用的溶液类似。0257按照标准EN137042002的准则，利用下列表达式计算杀孢子活性0258RNX01/NA0259N是孢子试验悬液的CFU/ML数量。0260NA是在产物的杀孢子活性试验之后孢子试验的CFU/ML数量0261发现以不同浓度进行试验的产品对嗜热脂肪地芽孢杆菌生存力的降低是说明书CN102088。
41、858ACN102088863A16/17页1902620263说明书CN102088858ACN102088863A17/17页200264TPP三聚磷酸钠0265根据标准EN137042002，当发现至少降低103CFU/ML时，评定产物对于嗜热脂肪地芽孢杆菌ATCC12980具有杀孢子活性。0266浓度255MG/ML的F1在20下接触1小时之后具有杀孢子活性。其是204G/ML的LAE。0267浓度256MG/ML的F2在20下接触1小时之后具有杀孢子活性。其是102G/ML的三聚磷酸盐0268浓度637MG/ML的F3在20下接触1小时之后具有杀孢子活性。其是51G/ML的LAE0269浓度256MG/ML的F4在20下接触1小时之后具有杀孢子活性。其是20G/ML的LAE。说明书CN102088858A。