一种用菜豆间座壳菌真菌代谢的化合物及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种真菌代谢产生的化合物，尤其是一种利用新分离获得的菜豆间座壳菌HLY2代谢产生的化合物乙酸2-(8-甲基-9-氧杂-双环[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基)-6-氧-3，6-二氢-2H-吡喃-3-基酯(Mycoepoxydiene)，以及可将化合物Mycoepoxydiene作为抗肿瘤药物或其他生物活性的先导物。
背景技术
菜豆间座壳菌(Diaporhe phaseolorum)分离于福建省漳州市九龙江口浮宫镇草埔头村红树林生态区红树植物腐叶，该属真菌为植物寄生菌(裘纬蕃主编，菌物学大全，北京：科学出版社，1998)，该菌株在半海水配方PDA(马铃薯琼脂培养基)培养基上，生长良好，菌丝纯白，无明显色素产生，不产孢子，培养10天以后，产生黑色子座。
化合物乙酸2-(8-甲基-9-氧杂-双环[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基)6-氧-3，6-二氢-2H-吡喃-3-基酯(Mycoepoxydiene)最早见于1999年的报道(Ping Cai，Andrew T et al.Mycoeoxydiene represents a novel class of fungal metabolites[J].Tetrahedron Letters，1999，40：1479-1482)，它从一株稀有真菌OS-F66617发酵液中分离得到，但文献未报道其具有抗肿瘤生理活性。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种用菜豆间座壳菌(Diaporhe phaseolorum)真菌代谢的化合物Mycoepoxydiene。
本发明的另一目的在于提供一种制备化合物Mycoepoxydiene的方法。
本发明的另一目的在于将化合物Mycoepoxydiene作为抗肿瘤药物或其他生物活性的先导物。
本发明所采用的真菌为本申请发明人从福建省漳州市九龙江口浮宫镇草埔头(地名)红树林生态区的红树植物腐叶中分离得到地菌株HLY2，经鉴定为菜豆间座壳菌(Diaporhe phaseolorum)。该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，登记入册的保藏编号为CCTCCNO：M 204061，保藏的培养物名称及注明的鉴别特征为菜豆间座壳菌HLY2 Diaporhe sp.HLY2，保藏日为2004年8月24日。
本发明所说的真菌代谢产生的化合物乙酸2-(8-甲基-9-氧杂-双环[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基)-6-氧-3，6-二氢-2H-吡喃-3-基酯(Mycoepoxydiene)的结构式为：
本发明所说的化合物Mycoepoxydiene的制备方法其步骤为：
1)液体培养及发酵液处理：取斜面上菌种接种于半海水配方马铃薯液体培养基(PDA)中培养至发酵，发酵液经过滤，除去菌体，收集发酵液，分装后(装瓶量1L/3L))加入体积为发酵液0.8～1.2倍的乙酸乙酯进行萃取，萃取时间为5～15h，收集萃取所得的有机相，在45～55℃减压浓缩至膏状；
2)化合物的分离：取质量为上样量6～10倍的硅胶(60-100目)，用干法装柱至硅胶的沉降不再变动，采用真空液相色谱法进行洗脱，洗脱溶剂系统按极性从小到大的顺序，由环己烷开始，环己烷与乙酸乙酯不同体积比混合溶剂，乙酸乙酯，乙酸乙酯与甲醇不同体积混合溶剂，最后至甲醇为洗脱溶剂，总共20级洗脱梯度进行洗脱，收集每个梯度的洗脱液，45～55℃减压浓缩至干，共收集20个回收组分，少量氯仿溶解后(若不溶，可加入适量甲醇至完全溶解)至于小管中自然挥干溶剂；
3)选取步骤2)中收集的第8管回收组分，进行进一步硅胶柱分离。取质量为上样量6～10倍的硅胶(60-100目)，用干法装柱至硅胶的沉降不再变动，采用真空液相色谱法进行洗脱，洗脱溶剂系统按极性从小到大的顺序，由环己烷∶三氯甲烷＝4∶1开始，直至三氯甲烷∶甲醇＝1∶8，总共18个洗脱梯度进行洗脱，收集每个梯度的洗脱液，45～55℃减压浓缩至干，共收集18个回收组分，少量氯仿溶解后(若不溶，可加入适量甲醇至完全溶解)至于小管中自然挥干溶剂；
4)将步骤3)中回收组分的第7管的管壁上出现的透明针状晶体，用甲醇溶解完全后常温自然挥发溶剂进行重结晶，得到透明针状晶体，制得的真菌代谢产物为乙酸2-(8-甲基-9-氧杂-双环[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基)6-氧-3，6-二氢-2H-吡喃-3-基酯(Mycoepoxydiene)。
在步骤2)中所用的洗脱溶剂系统洗脱梯度为：环己烷、环己烷∶乙酸乙酯＝49∶1、环己烷∶乙酸乙酯＝48∶2、环己烷∶乙酸乙酯＝46∶4、环己烷∶乙酸乙酯＝42∶8、环己烷∶乙酸乙酯＝38∶12、环己烷∶乙酸乙酯＝34∶16、环己烷∶乙酸乙酯＝25∶25、环己烷∶乙酸乙酯＝16∶34、环己烷∶乙酸乙酯＝10∶40、乙酸乙酯、乙酸乙酯∶甲醇＝46∶4、乙酸乙酯∶甲醇＝42∶8、乙酸乙酯∶甲醇＝34∶16、乙酸乙酯∶甲醇＝25∶25、乙酸乙酯∶甲醇＝16∶34、乙酸乙酯∶甲醇＝1∶3、乙酸乙酯∶甲醇＝1∶4、乙酸乙酯∶甲醇＝1∶9、甲醇。
在步骤3)中所说的洗脱溶剂梯度为：环己烷∶三氯甲烷＝4∶1、环己烷∶三氯甲烷＝3∶1、环己烷∶三氯甲烷＝2∶1、环己烷∶三氯甲烷＝1∶1、环己烷∶三氯甲烷＝1∶3、环己烷∶三氯甲烷＝1∶5、环己烷∶三氯甲烷＝1∶6、环己烷∶三氯甲烷＝1∶9、三氯甲烷、三氯甲烷∶甲醇＝30∶1、三氯甲烷∶甲醇＝20∶1、三氯甲烷∶甲醇＝15∶1、三氯甲烷∶甲醇＝10∶1、三氯甲烷∶甲醇＝8∶1、三氯甲烷∶甲醇＝5∶1、三氯甲烷∶甲醇＝1∶1、三氯甲烷∶甲醇＝1∶4、三氯甲烷∶甲醇＝1∶8。
在步骤2)中，所采用的柱的柱高可为8cm，直径Φ为6cm。
在步骤3)中，所采用的柱的柱高可为6.5cm，直径Φ为6cm。
化合物的分析进行晶体X-Ray(X衍射)，MS(质谱)，生物活性等测试。
根据X-Ray衍射数据和ESI(电喷雾)质谱数据，对化合物乙酸2-(8-甲基-9-氧杂-双环[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基)-6-氧-3，6-二氢-2H-吡喃-3-基酯(Mycoepoxydiene)进行结构鉴定，可确定化合物结构。根据对化合物Mycoepoxydiene的生物活性测定，利用细胞毒MTT(噻唑蓝)法(参见文献Mosmann F.Rapid colorinetric assay for celluar growth and survival：application to proliferation and cytotoxiciy assay[J].J.Immunol Methods，1983，65：55-63)测定化合物的抗肿瘤活性，发现其对人口腔皮样癌KB细胞IC50＜6.25μg/mL，对人骨肉瘤MG63细胞IC50＝34.6μg/mL。由此证明，化合物Mycoepoxydiene具有抗肿瘤活性，可将化合物Mycoepoxydiene作为抗肿瘤药物或其他生物活性的先导物。
【附图说明】
图1为化合物Mycoepoxydiene的立体构型图。
【具体实施方式】
以下实施例将对本发明作进一步的说明。
实施例1
取斜面上菌种接种于半海水PDA中培养至发酵，发酵液经纱布过滤，除去菌体，收集上清，将收集到的上清分装于3L三角瓶中(1L/瓶)，加入同体积乙酸乙酯搅拌萃取6h；收集有机相，用旋转蒸发仪50℃减压浓缩至膏状。取质量为上样量的8倍的硅胶(80目)，用干法装柱，柱内径选为6cm，柱长为8cm，用真空泵抽吸至硅胶的沉降不再变动；浓缩后的样品用硅胶(60目)拌样后压实平铺于柱面，然后在样品面覆盖厚为1cm的海砂。采用真空液相色谱法进行洗脱。洗脱溶剂系统按极性从小到大的顺序，由环己烷开始，环己烷与乙酸乙酯不同体积比混合溶剂，乙酸乙酯，乙酸乙酯与甲醇不同体积混合溶剂，最后至甲醇为洗脱溶剂，总共20级洗脱梯度进行洗脱，每个梯度洗脱溶剂为一个柱床体积，250mL收集每个梯度的洗脱液，50℃减压浓缩至干，共收集20个回收组分。少量氯仿溶解后(若不溶，可加入适量甲醇至完全溶解)至于小管中自然挥干溶剂。
取上一个步骤中的第8管回收组分，进行进一步硅胶柱分离。取质量为上样量10倍的硅胶(80目)，用干法装柱至硅胶的沉降不再变动，柱内径为6cm，柱长6.5cm，拌样后的样品压实平铺于柱面，然后在样品面覆盖厚为1cm的海砂。采用真空液相色谱法进行洗脱。洗脱溶剂系统按极性从小到大的顺序，由环己烷∶三氯甲烷＝4∶1开始，直至三氯甲烷∶甲醇＝1∶8，总共18个洗脱梯度进行洗脱，每个洗脱溶剂为一倍柱床体积200mL。收集每个梯度的洗脱液，50℃减压浓缩至干，共收集18个回收组分。少量氯仿溶解后(若不溶，可加入适量甲醇至完全溶解)至于小管中自然挥干溶剂。该步骤中回收组分的第7管的管壁上出现大量透明针状晶体，用适量甲醇溶解完全后常温自然挥发溶剂进行重结晶，得到透明针状晶体，制得的真菌代谢产物为乙酸2-(8-甲基-9-氧杂-双环[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基)-6-氧-3，6-二氢-2H-吡喃-3-基酯(Mycoepoxydiene)。
挑取合适晶体进行晶体X-Ray测试，其余取部分进行MS，生物活性等测试，保存。
化合物的结构鉴定采用晶体X-Ray分析测定，根据晶体数据、ESI数据，可确定上述化合物的结构，其立体构型图如图1所示。其晶体参数与文献报道一致(Ping Cai，Andrew Tet al.Mycoeoxydiene represents a novel class of fungal metabolites[J].Tetrahedron Letters，1999，40：1479-1482)。
利用细胞毒MTT法(见文献Mosmann F.Rapid colorinetric assay for cellular growth andsurvival：application to proliferation and cytotoxicity assay[J].J.Immunol Methods，1983，65：55-63)测定化合物的抗肿瘤活性，发现其对人口腔皮样癌KB细胞IC50＜6.25μg/mL，对人骨肉瘤MG63细胞IC50＝34.6μg/mL。由此可见，本发明所说的化合物Mycoepoxydiene可作为抗肿瘤药物或其他生物活性的先导物。
实施例2
其制备工艺与实施例1类似，其区别在于将收集到的上清分装于3L三角瓶中(1L/瓶)，加入体积为发酵液0.8倍的乙酸乙酯搅拌萃取10h；收集有机相，用旋转蒸发仪45℃减压浓缩至膏状。取质量为上样量的6倍的60目硅胶，用干法装柱。浓缩后的样品用100目硅胶拌样后压实平铺于柱面，然后在样品面覆盖厚为1cm的海砂。减压浓缩的温度为55℃。在进行进一步硅胶柱分离时，取质量为上样量8倍的60目硅胶。
利用细胞毒MTT法测定化合物的抗肿瘤活性，发现其对人口腔皮样癌KB细胞IC50＜6.25μg/mL，对人骨肉瘤MG63细胞IC50约为34μg/mL。由此可见，本发明所说的化合物Mycoepoxydiene可作为抗肿瘤药物或其他生物活性的先导物。
实施例3
其制备工艺与实施例1类似，其区别在于将收集到的上清分装于3L三角瓶中(1L/瓶)，加入体积为发酵液1.2倍的乙酸乙酯搅拌萃取15h；收集有机相，用旋转蒸发仪55℃减压浓缩至膏状。取质量为上样量的10倍的100目硅胶，用干法装柱。浓缩后的样品用80目硅胶拌样后压实平铺于柱面，然后在样品面覆盖厚为1cm的海砂。减压浓缩的温度为45℃。在进行进一步硅胶柱分离时，取质量为上样量6倍的100目硅胶。
利用细胞毒MTT法测定化合物的抗肿瘤活性，发现其对人口腔皮样癌KB细胞IC50＜6.25μg/mL，对人骨肉瘤MG63细胞IC50约为34μg/mL。由此可见，本发明所说的化合物Mycoepoxydiene可作为抗肿瘤药物或其他生物活性的先导物。