异喹啉生物碱的提取方法.pdf

异喹啉生物碱的提取方法属于农药领域，具体涉及一类具有杀虫活性的异喹啉生物碱的提取分离及其应用。异喹啉生物碱具有杀虫活性高，对环境不造成污染，对害虫天敌和有益生物安全；异喹啉生物碱的杀虫作用机理独特，不同于常规化学杀虫剂，害虫不易产生抗药性。所以从植物中提取分离出异喹啉生物碱用于害虫防治，能克服化学杀虫剂的局限性，促进害虫无公害防治技术的发展，生产优质无公害绿色食品。

1.  异喹啉生物碱的提取方法，其特征在于：将广西地不容块根洗净，切片后晾干，在60℃以下烘干、粉碎、过368μm筛，称取干粉放入容器中，加入干粉重5倍的溶剂，浸提，过滤，浸提2～3次，时间2～3天，将滤液合并，用旋转蒸发仪在水浴中减压浓缩，蒸干溶剂，得植物提取物，提取物用3％盐酸液溶解，过滤，滤液用等体积氯仿萃取3～4次，合并氯仿层，将氯仿层蒸干溶剂后得弱碱性生物碱部分，对弱碱性生物碱部分进行柱层析分离，取定量弱碱性生物碱样品用丙酮溶解，用3倍110～149μm的普通硅胶拌样，20倍48～74μm硅胶装柱，以氯仿/甲醇洗脱系统梯度洗脱，以200mL为一流分，共获得50个流分，相同流分合并后得12个组分；
测定各组分的触杀活性，取对害虫触杀活性最高的3～5流分，其余11个组分对害虫的触杀活性均很低弃去；
将流分1、2、6～8、43～49静置，让溶剂挥发，析出结晶，通过用丙酮多次重结晶，分别获得纯化合物7、8、3、6，除3～5流分外的其它流分中因成分复杂，或是物质量甚微，弃去；
对3～5流分再用硅胶柱进行柱层析分离，石油醚/丙酮洗脱系统梯度洗脱，以50mL为一个流分，得83个流分，相同流分合并，得7个组分，即1～9、10～11、12～35、36～43、44～48、49～82、83，1～9流分经TLC板检验无成分，36～43、49～82流分蒸干溶剂后剩余量甚微，83流分为冲柱物，成分复杂，10～11、12～35、44～48流分静置，让溶剂挥发，析出结晶，经过多次重结晶后，分别获得纯化合物8、1和2；
经结构鉴定，化合物1、2、3分别为l-罗默碱、d-异紫堇定和紫堇定，是具有杀虫活性的异喹啉生物碱，化合物6、7、8分别为巴马亭、氯仿巴马亭和l-四氢巴马亭。

异喹啉生物碱的提取方法
                        技术领域
本发明属于农药领域，具体涉及一类具有杀虫活性的异喹啉生物碱的提取分离及其应用。
                        背景技术
目前农药正朝着高效、低毒、低残留、低抗性风险的环境协调农药方向发展，而植物性农药正符合这一发展要求。植物性农药来源于自然界，在环境中有其顺畅的降解途径，对环境不造成污染，对环境的不良影响小；杀虫作用方式多种多样，作用机理独特，在害虫体内可以有多个作用靶标，害虫不容易产生抗药性，与现有常规化学杀虫剂也无交互抗性；对害虫的选择性强，对天敌和野生生物安全。植物性农药能克服化学农药的局限性，解决化学农药引起的环境污染、农药残留和害虫抗药性等问题，满足有机农业生产中防治病虫害对农药的需求。植物性农药结构新颖多样，在农药创制中也有重要意义。
生物碱类杀虫剂是一类应用和研究较多的植物性杀虫剂，目前已从植物中分离出生物碱6000多种，其中有很多生物碱具有杀虫活性。人们很早就使用烟草、百部、藜芦、苦参、雷公藤、博落回、苦豆子等植物来杀虫。经过长期的研究，已经明确了这些植物中的杀虫成分是生物碱，如烟碱、百部碱、藜芦生物碱、苦参总碱、雷公藤碱等。生物碱是合成新杀虫剂的重要先导化合物，以烟碱为模板，开发出一类高效、低毒、作用机理独特的新烟碱类杀虫剂，而以毒扁豆碱为模板，发展了氨基甲酸酯类杀虫剂。
异喹啉生物碱在植物中分布广泛，种类较多，目前已知结构的有1000多种。主要分布于防已科、毛茛科、小檗科、木兰科、罂粟科、番荔枝科、樟科、芸香科、使君子科、睡莲科等植物中。异喹啉生物碱以异喹啉或四氢异喹啉为基本母核，多数是以苄基异喹啉为前体衍生而成。该类化合物有多种生理活性，在医学上有多种用途，如延胡索乙素有镇静止痛作用，紫堇定有抗癌功效，去氢千金藤碱有降压作用，小檗碱能抗菌消炎等等。但是异喹啉生物碱在农药领域的应用还未有任何文献报道。
                        发明内容
本发明的目的在于：从植物中分离出有杀虫活性的异喹啉生物碱，用于防治有害昆虫。异喹啉生物碱具有杀虫活性高，对环境无副作用，对害虫天敌和有益生物安全；异喹啉生物碱的杀虫作用机理独特，不同于常规化学杀虫剂，害虫不易产生抗药性。所以从植物中提取异喹啉生物碱用于害虫防治，能克服化学杀虫剂的局限性，促进害虫无公害防治技术的发展，生产优质无公害绿色食品。
本发明所提供的异喹啉生物碱，其母体结构是四环化合物，化学结构式为：

N原子上有一个取代基R₇，苯环上有7个取代基，即R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₈。其中取代基R₇是-CH₃，或-H。
取代基R₁是-OCH₂O-，或-OCH₃，或-OH。
取代基R₂是-OCH₂O-，或-OCH₃，或-OH。
取代基R₃是-H，或-OCH₃，或-OH，或F，或Cl，或Br。
取代基R₄是-H，或-OCH₂O-，或-OCH₃，或-OH，或F，或Cl，或Br。
取代基R₅是-H，或-OCH₂O-，或-OCH₃，或-OH，或F，或Cl，或Br。
取代基R₆是-H₂，或-OH。
取代基R₈是-H，或-OCH₃，或F，或Cl，或Br。
(一)、异喹啉生物碱的提取
为了更好地理解本发明，现给出从植物中提取和分离异喹啉生物碱的方法。本发明包括但不限于该种提取分离方法。本方法可以从多种含有异喹啉生物碱的植物中提取分离异喹啉生物碱。
从广西地不容植物中提取异喹啉生物碱的方法，将广西地不容块根洗净，切片后晾干，在60℃以下烘干、粉碎、过368μm筛，称取干粉放入容器中，加入干粉重5倍的溶剂，浸提，过滤，浸提2～3次，时间2～3天，将滤液合并，用旋转蒸发仪在水浴中减压浓缩，蒸干溶剂，得植物提取物，提取物用3％盐酸液溶解，过滤，滤液用等体积氯仿萃取3～4次，合并氯仿层，将氯仿层蒸干溶剂后得弱碱性生物碱部分，对弱碱性生物碱部分进行柱层析分离，取定量弱碱性生物碱样品用丙酮溶解，用3倍110～149μm的普通硅胶拌样，20倍48～74μm硅胶装柱，以氯仿/甲醇洗脱系统梯度洗脱，以200mL为一流分，共获得50个流分，相同流分合并后得12个组分；
测定各组分的触杀活性，取对害虫的触杀活性最高的3～5流分，其余11个组分对害虫的触杀活性均很低，弃去；
测定了各组分对褐飞虱的触杀活性，结果见表1。在12个组分中，第3组分即3～5流分对褐飞虱长翅雌成虫的触杀活性最高，用1μg/头点滴处理，24h和48h校正死亡率分别为68.18％和93.94％。其余11个组分对褐飞虱的触杀活性均很低，用1μg/头点滴处理，24h和48h校正死亡率分别为0％～16.67％和0％～21.54％。说明对褐飞虱的杀虫成分主要包含在3～5流分中。
表1  弱碱性生物碱柱层析各组分对褐飞虱雌成虫的触杀活性^a)
                          校正死亡率^b)(x±SE)(％)
组分       流分
                         24h                       48h
1          1        15.12±3.34b                17.90±3.22bc
2          2         12.34±1.58bc              21.35±1.84b
3          3～5      68.07±3.04a               95.38±2.60a
4          6～8      7.32±1.40cd               10.23±1.13de
5          9～16     16.62±2.77b               16.62±2.57bcd
6          17～18    0±0e                      0±0f
7          19        0±0e                      4.35±2.48ef
8          20～25    4.55±2.62de               6.13±1.47ef
9          26～35    0±0e                      0±0f
10         36～42    0±0e                      4.69±2.63ef
11         43～49    11.49±2.59bc              14.45±1.12cd
12         50        3.12±1.56de               4.57±2.51ef
^a)剂量为1μg/头。
^b)数据为3次重复平均值。同列数据后标有相同字母者表示在5％水平上差异不显著(DMRT)。
将流分1、2、6～8、43～49静置，让溶剂挥发，析出结晶，通过用丙酮多次重结晶，分别获得纯化合物7、8、3、6，除3～5流分外的其它流分中因成分复杂，或是物质量甚微，弃去；
对3～5流分再用硅胶柱进行柱层析分离，石油醚/丙酮洗脱系统梯度洗脱，以50mL为一个流分，得83个流分，相同流分合并，得7个组分，即1～9、10～11、12～35、36～43、44～48、49～82、83，1～9流分经TLC板检验无成分，36～43、49～82流分蒸干溶剂后剩余量甚微，83流分为冲柱物，成分复杂，10～11、12～35、44～48流分静置，让溶剂挥发，析出结晶，经过多次重结晶后，分别获得纯化合物8、1和2；
经过柱层析和溶剂重结晶后，从弱碱性生物碱部分分离出6个纯化合物，编号为化合物1、2、3、6、7、8。
通过对核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、质谱的解析，以及与有关文献报道的数据进行比较，确定化合物1、2、3分别为l-罗默碱(l-roemerine)、d-异紫堇定(d-isocorydine)和紫堇定(corydine)，它们属于阿朴菲型异喹啉生物碱。化合物6、7、8分别为巴马亭(palmatine)、氯仿巴马亭(palmatinechloroform)、l-四氢巴马亭(l-tetrohydropalmatine)，它们属于原小檗碱型异喹啉生物碱，不在本发明所述的异喹啉生物碱范围内。
化合物1、2、3的结构鉴定：
化合物1(l-罗默碱)：在石油醚-乙醚中重结晶，为乳黄色簇晶。溶于丙酮、乙醚、乙醇。EI-MS(m/z)：281(M⁺)，278，236，124，109，44。核磁共振氢谱和碳谱数据归属见表2。综合以上数据，并与文献(闵知大等，1980)报道的数据进行比较，鉴定化合物1为l-罗默碱。化学结构见附图2，EI-MS谱图见附图5。
化合物2(d-异紫堇定)：用丙酮重结晶，为淡黄色柱状晶体。溶于丙酮、乙醚、乙醇、氯仿，不溶于水。EI-MS(m/z)：341(M⁺)，326，310，155，139。核磁共振氢谱和碳谱数据归属见表2。综合以上数据，并与文献(龚运淮，1986；田成国等，1988)报道的数据进行比较，鉴定化合物2为d-异紫堇定。化学结构见附图3，EI-MS谱图见附图6。
化合物3(紫堇定)：用丙酮重结晶，为银白色针状晶体。溶于丙酮、乙醚、乙酸乙酯、氯仿。EI-MS(m/z)：341(M⁺)，326，310，155。核磁共振氢谱和碳谱数据归属见表2。综合以上数据，并与文献(于德泉等，1999；陈嬿等，1994)报道的数据进行比较，鉴定化合物3为紫堇定。化学结构见附图4，EI-MS谱图见附图7。
表2  化合物1、2、3的核磁共振谱(¹H、¹³C)数据
                           化合物2                        化合物3                         化合物1
位置(position)
                δ_C^a)       δ_H^b)          δ_C           δ_H                δ_C              δ_H
1                143.0                        143.5                               143.1
2                152.3                        150.0                               148
3                113.2    6.83，1H，s         113.1       6.70，1H，s             108.2         6.60，s
4                29.2                         29.2                                28.9          2.61～2.71，m
5                53.5                         62.1                                53.8          3.12～3.17，m
6                62.1                         63.9                                62.7          3.26～3.35，m
7                36.6                         36.3                                34.3          2.61～2.71，m
8                119.7    6.82，1H(d，J＝8.4) 125.1       7.01，1H(d，J＝8.4)     127.3
                                                                                                7.23～7.32，(3H，
9                112.3    6.90，1H(d，J＝8.4) 112.2       7.13，1H(d，J＝8.4)     127.6
                                                                                                m)
10               150.9                        152.9                               127.8
11               145.0                        145.0                               128.5         8.02，m
12               126.6                        126.5                               117.0
13               129.6                        119.0                               129.1
14               131.2                        121.0                               126.0
15               130.2                        131.7                               135.9
16               121.0                        129.6                               131.6
17               44.2     2.45，3H，s         44.3        2.45，3H，s             43.2          2.96，s
C₂-OCH₃       56.2     3.66，3H，s         53.6        3.69，3H，s                           6.12，d(1.0)
C₁-OCH₃       64.1     3.81，3H，s                                                           5.97，d(1.0)
C₁₁-OCH₃                                    56.3        3.80，1H，s
C₁₀-OCH₃      56.6     3.89，3H，s          56.4        3.90，1H，s
^a)13C化学位移；^b)1H化学位移。
                        具体实施方式
将广西地不容块根洗净泥土和杂质，切成薄片后放在室内通风处阴干，再在60℃以下的恒温鼓风干燥箱内烘干，用植物粉碎机粉碎，过368μm筛。称取干粉600g放入容积为5L的玻璃瓶中，加入3kg甲醇，在室温下浸提2天，过滤。共浸提2次，将滤液合并，用旋转蒸发仪在水浴中减压浓缩，蒸干溶剂，得植物提取物112.2g。称取100g提取物放入500ml烧杯中，加入3％盐酸液溶300ml，用玻璃棒充分搅拌使其溶解，过滤。滤液移至1000ml分液漏中，加入300ml。氯仿萃取3～4次，合并氯仿层，将氯仿层蒸干溶剂后得弱碱性生物碱部分8.5g。对弱碱性生物碱部分进行柱层析分离。称取样品7g，用15ml丙酮溶解，用20g 110～149μm的普通硅胶拌样，200g 48～74μm硅胶装柱，以氯仿/甲醇洗脱系统梯度洗脱。以200mL为一流分，共获得50个流分。相同流分合并后得12个组分。
静置流分6～8，析出结晶。用丙酮多次重结晶，获得57.6mg纯化合物3。
对3～5流分再用硅胶柱进行柱层析分离，石油醚/丙酮洗脱系统梯度洗脱，以50ml为一个流分，得83个流分。12～35、44～48流分静置，析出结晶。经过多次重结晶后，分别获得846.8mg纯化合物1和125.4mg纯化合物2。
经结构鉴定，化合物1、2、3分别为l-罗默碱、d-异紫堇定和紫堇定。
流分1、2、6～8、43～49静置，让溶剂挥发，析出结晶。通过用丙酮多次重结晶，分别获得纯化合物7、8、3、6。其它流分(除3～5流分外)中因成分复杂，或是物质量甚微，不能获得纯化合物。
对3～5流分再用硅胶柱进行柱层析分离，石油醚/丙酮洗脱系统梯度洗脱，以50mL为一个流分，得83个流分。相同流分合并，得7个组分，即1～9、10～11、12～35、36～43、44～48、49～82、83。1～9流分经TLC板检验无成分，36～43、49～82流分蒸干溶剂后剩余量甚微，83流分为冲柱物，成分复杂。10～11、12～35、44～48流分静置，让溶剂挥发，析出结晶。经过多次重结晶后，分别获得纯化合物8、1和2。
异喹啉生物碱对昆虫的杀虫活性高，比目前使用的化学杀虫剂的活性高出许多倍。异喹啉生物碱是一类新的杀虫化合物，以前从未作为杀虫剂应用，昆虫对其适应性差，大多数昆虫对该类化合物比较敏感，因而该类化合物对昆虫表现出极高的杀虫活性。实验证明，异喹啉生物碱可通过昆虫体壁进入体内，具有触杀作用；也可通过昆虫取食，从消化道进入体内，具有胃毒杀虫作用。
异喹啉生物碱的杀虫作用机理独特，与现有化学杀虫剂不同，在昆虫体内有多个作用靶标，害虫不容易对其产生抗药性，与常规化学杀虫剂也无交互抗性，因而可用于防治抗性害虫。实验证明，异喹啉生物碱对昆虫的乙酰胆碱酯酶无影响，但能抑制昆虫体内的ATP酶，提高昆虫的腺苷酸环化酶(AC)的活性和环磷酸腺苷(cAMP)的含量。ATP酶是昆虫神经系统中一种重要的酶，它能维持神经膜内外的离子梯度，保证神经冲动的正常传导。如果Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase和Ca²⁺-ATPase被抑制，神经细胞轴突膜外的Ca²⁺减少，使膜的限阈降低，造成膜不稳定，轴突更容易去极化，产生一系列动作电位。再加上Na⁺-K⁺-ATPase被抑制后，胞内多余的Na⁺不能及时被移出，使细胞处于持续兴奋状态，从而导致神经传导阻断，最后使昆虫死亡。cAMP是一种第二信使化合物，在生物细胞信号传递中起重要作用。在细胞中由AC催化ATP脱去一个焦磷酸形成，并由磷酸二酯酶(PDE)分解。cAMP信号传递系统传递细胞信号的途径是：在细胞膜上存在受体、G蛋白、AC三种蛋白质，胞外刺激信号被受体接受后，通过刺激性G蛋白(Gs)传递给AC，使其激活，在细胞内产生cAMP信号，cAMP激活蛋白激酶A(PKA)，使蛋白质磷酸化，进而调节细胞地各种生理生化功能。异喹啉生物碱通过提高昆虫体内AC的活性和cAMP的含量，从而改变昆虫的生理生化代谢，这可能是导致昆虫死亡的原因之一。
(二)、异喹啉生物碱的杀虫活性
1.异喹啉生物碱对害虫的触杀活性
(1)、异喹啉生物碱对褐飞虱的触杀活性
d-异紫堇定、紫堇定和l-罗默碱是从广西地不容块根提取物中分离获得的异喹啉生物碱，用毛细管微量点滴法(谭福杰，1987)测定了3个异喹啉生物碱对褐飞虱长翅雌成虫的触杀活性，结果见表3。在3个化合物中，l-罗默碱对褐飞虱有很高的触杀活性。用0.5μg/头剂量处理时，48h校正死亡率为96.18％～98.74％；用1μg/头剂量处理时，48h校正死亡率为92.50％～98.10％。d-异紫堇定和紫堇定对褐飞虱的触杀活性均很低，用0.5μg/头剂量处理时，48h的校正死亡率分别是12.09％～16.05％和4.78％～7.14％；用1μg/头剂量处理时，48h校正死亡率分别为10.76％～18.08％和14.02％～18.28％。
表3    3个异喹啉生物碱对褐飞虱长翅雌成虫的触杀活性
                    校正死亡率^a)(x±SE)(％)
化合物                  0.5μg/头                         1μg/头
                 24h               48h             24h              48h
d-异紫堇定   8.00±1.70ab      14.07±1.98b    9.64±2.60b     14.42±3.66b
紫堇定       2.91±1.45b       5.96±1.18c     10.35±1.65b    16.15±2.13b
l-罗默碱     12.38±2.84a      97.46±1.28a    59.04±4.61a    95.30±2.80a
^a)数据为3次重复平均值。同列数据后标有相同字母者表示在5％水平上差异不显著(DMRT)。
为了进一步明确l-罗默碱的杀虫活性，用毛细管微量点滴法测定了l-罗默碱对水稻褐飞虱长翅雌成虫的触杀毒力，并与目前防治褐飞虱的化学杀虫剂马拉硫磷的毒力进行了比较，结果见表4。l-罗默碱对褐飞虱的LD₅₀值为0.03143～0.05711μg/头，其触杀毒力分别是广西地不容块根提取物及其初步分离物非酚性弱碱性生物碱毒力的35.68倍和7.02倍，说明随着有效成分的浓缩和纯化，对褐飞虱的杀虫活性大幅度提高。与防治褐飞虱的化学杀虫剂马拉硫磷比较，l-罗默碱的毒力比马拉硫磷高，是马拉硫磷毒力的7.48倍，说明l-罗默碱对褐飞虱的触杀活性很高。
表4    l-罗默碱对褐飞虱长翅雌成虫的触杀毒力
                                   LD₅₀     95％置信限         相关系数                     相对
样品          毒力回归方程                                                    P       df
                                 (μg/头)       (μg/头)          (r)                        毒力
l-罗默碱    y＝7.3736+1.7532x     0.0443     0.03143-0.05711     0.9823     0.0028    3      35.68
非酚性弱碱  y＝5.9577+1.8859x     0.3106     0.2039-0.4173       0.9906     0.0011    3      5.08
块根提取物  y＝4.4259+2.8925x     1.5794     1.0987-2.0600       0.9835     0.0026    3      1
马拉硫磷    y＝5.7795+1.6248x     0.3313     0.2346～0.4281      0.9885     0.0017    3      4.77
(2)、异喹啉生物碱对桃蚜的触杀活性
采用毛细管点滴法测定了3种异喹啉生物碱对桃蚜无翅成虫的触杀活性，结果见表5。d-异紫堇定、紫堇定对桃蚜有很高的触杀活性，用0.5μg/头点滴处理，24h的校正死亡率分别为87.22％～92.06％和93.14％～96.28％；用1μg/头处理，24h的校正死亡率均为100％。l-罗默碱对桃蚜的触杀活性低。
表5     3个异喹啉生物碱对桃蚜无翅成虫的触杀活性
                                    校正死亡率^a)(x±SE)(％)
化合物                    0.5μg/头                            1μg/头
                   24h              48h                24h                48h
d-异紫堇定    89.64±2.42b      92.32±1.51b      100.00±0.00a      100.00±0.00a
紫堇定        94.86±1.42a      96.25±1.03a      100.00±0.00a      100.00±0.00a
l-罗默碱      16.08±1.11c      17.69±3.15c      22.12±1.75b       24.33±1.24b
^a)数据为3次重复平均值。同列数据后标有相同字母者表示在5％水平上差异不显著(DMRT)。
对桃蚜的触杀毒力测定结果见表6。d-异紫堇定、紫堇定对桃蚜无翅成虫有很高的触杀毒力，致死中浓度即LD₅₀值分别为0.0411～0.0781μg/头和0.0440～0.0835μg/头，其毒力分别是化学杀虫剂乐果的2.38和2.22倍。
    表6     d-异紫堇定、紫堇定对桃蚜无翅成虫的触杀毒力
                                        LD₅₀       95％置信限        相关系数                       相对
样品              毒力回归方程                                                        P        df
                                      (μg/头)       (μg/头)           (r)                          毒力
d-异紫堇定      y＝6.6383+1.3377x      0.0596      0.0411～0.0781      0.9975      0.0004      3     16.36
紫堇定          y＝6.9768+1.6537x      0.0638      0.0440～0.0835      0.9866      0.0025      3     15.29
块根提取物      y＝5.0151+1.3862x      0.9752      0.6946～1.2559      0.9927      0.0008      3     1
乐果            y＝6.2099+1.4262x      0.1418      0.1006～0.1830      0.9968      0.0005      3     6.88
测定方法：采用毛细管微量点滴法。样品用丙酮溶解，配成一定浓度的药液备用。用软毛笔将大小一致的无翅成蚜挑到吸水纸上，用毛细管将0.05μl药液点滴在虫体的背面。每个浓度共点滴90头虫左右，重复3次。处理过的试虫放入9cm培养皿中的保湿青菜叶上饲养，并将培养皿移入温度(25±1)℃，相对湿度75％～85％，每日光照16h的光照培养箱中。分别于处理后24h、48h检查死亡率，以软毛笔尖触及虫体无反应为死亡标准。测定触杀毒力时，用丙酮将样品配成5个系列浓度的药液，24h检查死亡率，并用最小二乘法计算毒力回归方程、致死中量(LD₅₀)、LD₅₀的95％置信限等。
2、异喹啉生物碱对害虫的胃毒毒力
(1)、l-罗默碱对褐飞虱的胃毒毒力
测定方法：采用稻茎吸药法，参照Xenou-Kokoletsi et al(2002)的方法并加以改进。先用少量甲醇或丙酮将提取物或化合物溶解，加入1％表面活性剂，再用自来水配制成5个系列浓度的药液(对照用自来水加表面活性剂)。药液装入管径4cm的大试管中，再将大试管直立在抽气瓶中。剪取分蘖期水稻稻茎3支，浸入大试管的药液中，塞紧抽气瓶塞子，抽气30min左右，待稻茎表面基本无气泡冒出时，打开瓶塞放气，使药液吸入稻茎中。5min后取出稻茎，放入清水中漂洗2min，洗去稻茎表面的药液，晾干。将用药液处理过的稻茎1支插在养虫笼的海绵垫剪口中，接入褐飞虱3龄若虫25头，每浓度重复3次，共用虫75头。试虫放在温度25±1℃，相对湿度75％～85％，每日光照16h的光照培养箱中饲养，48h检查死虫数，用最小二乘法计算毒力回归方程、致死中浓度(LC₅₀)、LC₅₀值的95％置信限等。
试验结果：结果见表7。l-罗默碱对褐飞虱的LC₅₀值为0.4762～0.9791mg/mL，是块根提取物毒力的23.02倍。说明l-罗默碱对褐飞虱有较高的胃毒活性。
表7    l-罗默碱对褐飞虱3龄若虫的胃毒毒力
                                         LC₅₀          95％置信限       相关系数                        相对
样品              毒力回归方程                                                           P        df
                                       (mg/mL)           (mg/mL)           (r)                           毒力
l-罗默碱        y＝5.1921+1.3916x       0.7277       0.4762～0.9791       0.9964      0.0003      3      23.02
块根提取物      y＝2.5404+2.0094x      16.7529      11.0737～22.432      10.9850      0.0022      3      1
(2)、d-异紫堇定、紫堇定对桃蚜的胃毒毒力
测定方法：参照M.Xenou-Kokoletsi and C.Christias(2002)的方法。先用甲醇或丙酮将样品溶解，加入1％表面活性剂，再用自来水配制成所需浓度的药液(对照用自来水加表面活性剂)。先将药液倒进抽气瓶中，再将带叶柄的完整木槿叶片浸入抽气瓶的药液中，然后抽气，直到叶片表面无气泡冒出时，松开抽气瓶的放气活塞放气，使叶片将药液吸入。把叶片从药液中取出，放在自来水中漂洗2分钟，将叶片表面的药液洗去。用吸水纸吸干叶片上的水，放入9cm培养皿中，每皿放叶片3张，用湿棉球包裹叶柄保湿。用软毛笔将大小一致的无翅成蚜接入培养皿的叶片上，每皿接虫30，每浓度处理虫90头，重复3次。将培养皿放在温度(25±1)℃，相对湿度75％～85％，每日光照16h的光照培养箱中饲养。48h后检查死亡率，以软毛笔尖触及虫体无反应为死亡标准。用最小二乘法计算毒力回归方程、致死中浓度(LC₅₀)、LC₅₀的95％置信限等。
试验结果：结果见表8。d-异紫堇定、紫堇定对桃蚜的致死中浓度即LC₅₀值分别为1.3295～2.3492mg/mL和0.9598～1.7211mg/mL，它们对桃蚜的胃毒毒力分别是块根提取物毒力的18.81和25.80倍。说明d-异紫堇定、紫堇定对桃蚜有较高的胃毒活性。
表8    d-异紫堇定、紫堇定对桃蚜的胃毒毒力
                                     LC₅₀        95％置信限      相关系数                            相对
样品           毒力回归方程                                                       P          df
                                   (mg/mL)         (mg/mL)          (r)                               毒力
d-异紫堇定  y＝4.6897+1.1722x      1.8394      1.3295～2.3492      0.9945      0.0004        3        18.81
紫堇定      y＝4.8074+1.5139x      1.3405      0.9598～1.7211      0.9838      0.0031        3        25.80
块根提取物  y＝2.0541+1.9142x      34.59       24.02～45.16        0.9845      0.0027        3        1
3、异喹啉生物碱对害虫的防治效果
(1)、l-罗默碱对褐飞虱的防治效果
将l-罗默碱配制成5％l-罗默碱乳油，进行了防治褐飞虱的田间药效试验。结果见表9。5％l-罗默碱乳油对褐飞虱有很好的防治效果，施药后3天、7天、14天，l-罗默碱浓度为100mg/L时，防效分别为92.74％～96.90％、94.90％～99.78％和96.47％～100％；浓度为50mg/L时，防效分别为83.61％～87.27％、92.06％～95.86％和94.79％～99.31％；浓度为33.33mg/L时，防效分别为78.86％～85.76％、89.12％～92.60％和93.35％～97.09％；对照药剂马拉硫磷浓度为400mg/L时，防效分别为98.72％～82.04％、81.66％～88.08％和87.12％～92.20％。所以在田间推荐用药浓度为33.33～50mg/L。
试验方法：试验设5个处理：l-罗默碱33.33mg/L、50mg/L、100mg/L；马拉硫磷400mg/L；清水对照。每个处理各设4次重复，共20个小区。小区面积20m²，小区随机排列。于褐飞虱发生数量较大时，用背负式手动喷雾器喷雾施药。每667m²用药液60kg，施药一次。分别于施药前、施药后3天、7天、14天调查虫口数。调查方法：每小区按平行跳跃法取10点，每点用盆拍法调查2丛水稻。用下列公式计算防治效果，并用“DMRT”法测验处理间防效的差异显著性。

其中：CK₀为对照区施药前活虫数；CK₁为对照区施药后活虫数；Pt₀为处理区施药前活虫数；Pt₁为处理区施药后活虫数。
5％l-罗默碱乳油配制方法：准确称取l-罗默碱2.5克，溶于42.5克二甲苯中，加入5克宁乳0203，用电磁搅拌器搅拌10分钟，过滤，即得5％l-罗默碱乳油。
表9    5％l-罗默碱乳油对褐飞虱的防治效果
                                      防治效果^a)(％)
     处理
                        药后3天          药后7天           药后14天
l-罗默碱33.33mg/L    82.31±3.45bc     90.86±1.74c      95.22±1.87bc
l-罗默碱50mg/L       85.44±1.83b      93.96±1.90b      97.05±2.26ab
l-罗默碱100mg/L      94.82±2.08a      97.34±2.44a      98.61±2.14a
马拉硫磷400mg/L      80.38±1.66c      84.87±3.21d      89.66±2.54c
^a)数据为4次重复平均值。同列数据后标有相同字母者表示在5％水平上差异不显著(DMRT)。
(2)、d-异紫堇定、紫堇定对桃蚜的防治效果
将d-异紫堇定、紫堇定配制成5％乳油，进行了防治桃蚜的田间药效试验。结果见表10。两种异喹啉生物碱对桃蚜有很好的防治效果，施药后1天、7天、14天，d-异紫堇定的防效分别为89.21～96.87％、90.42～97.53％和83.90～90.37％；  紫堇定的防效分别为91.61～97.33％、87.92～94.88％和80.89～85.66％；对照药剂乐果的防效分别为84.27％、82.00％和78.30％。所以d-异紫堇定、紫堇定在田间推荐用药浓度为33.33～50mg/L。
试验方法：试验设7个处理：d-异紫堇定33.33mg/L、50mg/L、100mg/L；紫堇定33.33mg/L、50mg/L、100mg/L；乐果400mg/L；清水对照。每个处理各设4次重复，共28个小区。小区面积10m²，小区随机排列。试验在小白菜田进行，于桃蚜发生数量较大时，用背负式手动喷雾器喷雾施药。每667m²用药液40kg，施药一次。分别于施药前、施药后1天、7天、14天调查虫口数。调查方法：每小区按对角线取5点，每点固定调查2株小白菜，记录其上的活虫数。用下列公式计算防治效果，并用“DMRT”法测验处理间防效的差异显著性。

其中：CK₀为对照区施药前活虫数；CK₁为对照区施药后活虫数；Pt₀为处理区施药前活虫数；Pt₁为处理区施药后活虫数。
5％乳油配制方法：与5％l-罗默碱乳油配制方法相同。
表10  d-异紫堇定、紫堇定对桃蚜的防治效果
                                            防治效果^a)(％)
      处理
                            药后1天            药后7天             药后14天
d-异紫堇定33.33mg/L      89.21±2.32a        90.42±4.51a        84.62±3.03a
d-异紫堇定50mg/L         93.46±0.59a        92.88±4.06ab       83.90±2.44ab
d-异紫堇定100mg/L        96.87±1.20b        97.53±1.64abc      90.37±3.37b
紫堇定33.33mg/L          92.15±1.54b        87.92±3.99bc       80.89±3.14b
紫堇定50mg/L             91.61±1.80b        89.02±4.35c        81.40±3.51bc
紫堇定100mg/L            97.33±1.55c        94.88±3.03c        85.66±3.46bc
乐果400mg/L              84.27±2.11d        82.00±2.64d        78.30±3.51c
^a)数据为4次重复平均值。同列数据后标有相同字母者表示在5％水平上差异不显著(DMRT)。
(三)、l-罗默碱对褐飞虱体内乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的影响
用l-罗默碱0.25μg/头的剂量点滴处理褐飞虱长翅雌成虫，处理后22h取样制备酶液，测定虫体内AChE的活性，结果见表11。处理和对照褐飞虱体内AChE的活性分别为0.0519和0.0503 OD/mg.min。经t检验，处理与对照酶活性无显著差异，说明l-罗默碱对褐飞虱活体AChE活性无影响。
试验方法：采用改进的Ellman法(Gorun，1978)测定。取酶液0.1mL(对照以0.1mL生理盐水代替)，加入0.4mmol/L的乙酰硫代胆碱(Asch)0.1mL。混合液置于27℃条件下反应15min，加入1.8mL二硫双对硝基苯甲酸(DTNB)试剂终止酶反应并显色，用7230G型分光光度计在412nm处测定光密度值(OD值)。每处理重复3次，酶活性以OD/mg.min表示。
表11    l-罗默碱对褐飞虱长翅雌成虫活体AChE活性的影响
处理                                比活^a)(x±SE)(OD/mg.min)
对照                                    0.0503±0.0009a
处理                                    0.0519±0.0005a
^a)数据为3次重复平均值。同列数据后标有相同字母者表示在5％水平上差异不显著(t检验)。
(四)、l-罗默碱对褐飞虱ATPase的抑制作用
1.l-罗默碱对褐飞虱ATPase的活体抑制作用
用l-罗默碱0.25μg/头剂量点滴处理褐飞虱长翅雌成虫，处理后22h(出现中毒症状)取样测定褐飞虱体内Na⁺-K⁺-ATPase、Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase和Ca²⁺-ATPase的活性，结果见表12。从表中可知，处理后22h，Na⁺-K⁺-ATPase的活性明显低于对照，酶活性抑制率为31.64％；Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase的活性也明显低于对照，酶活性抑制率为25.19％；Ca²⁺-ATPase的活性明显低于对照，酶活性抑制率为11.76％。说明l-罗默碱对褐飞虱ATPase活性在活体条件下有明显的抑制作用。
试验方法：
Na⁺-K⁺-ATPase活性测定：参照冯北元等(1981)的方法进行。酶反应体积为100μL。取9支小试管(直径6mm，长4cm)分成3组(每组重复3管)：组1：反应体系中含50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)，5mmol/L MgCl₂，150mmol/L NaCl，20mmol/L KCl，1.8mmol/L ATP，含约8μg蛋白质的酶液。组2：反应体系中含50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)，5mmol/L MgCl₂，0.5mmol/LOuabain，1.8mmol/L ATP，含约8μg蛋白质的酶液。组3：反应体系中含50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)，5mmol/L MgCl₂，含约8μg蛋白质的酶液，加入50μL 15％三氯醋酸后再加1.8mmol/L ATP。各组在加入ATP前置于37℃水浴中预保温5min，加底物ATP后，立即置于37℃水浴中反应15min，反应结束后立即向组1、组2中加50μL15％三氯乙酸终止反应。将试管置冰浴中，将反应液定量地转入带磨口塞的5mL试管中，用少量双蒸水洗小试管2～3次。合并洗液使最终体积为1mL。各试管加入2.0mL AMT溶液，摇匀。精确计时1min后再加入0.4mL 24％柠檬酸钠溶液，室温放置40min以上。用7230G型分光光度计在波长660nm处测定OD值。每处理重复3次。
Na⁺-K⁺-ATPase比活的计算：分别将组1、组2的消光值减去组3的消光值，在标准曲线上查出磷(Pi)的量(nmol)，换算成比活单位(Pinmol/mg蛋白.min)。组1与组2的比活之差即为Na⁺-K⁺-ATPase的比活。
Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase活性测定：参照Yamaguchi et al(1979)及冯北元等(1981)的方法进行。反应总体积为100μL。反应体系中含有50mmol/LTris-HCl(pH7.4)、1mmol/L MgCl₂、0.1mmol/L CaCl₂、100mmol/L KCl、含约8μg蛋白的酶液、0.5mmol/L Ouabain。将试管放入37℃水浴中，预保温5min，加入底物ATP(ATP在反应体系中的浓度为1.8mmol/L。对照管先加15％三氯醋酸50μL后再加ATP)，于37℃水浴中反应15min，加入15％三氯醋酸50μL终止酶反应，用去离子水将各试管反应液补至1mL。然后加入2mLAMT液，摇匀。精确计时1min后再加入0.4mL 24％柠檬酸钠溶液，混匀后产生鲜绿色的复合物。室温放置40min以上，用7230G型分光光度计在波长660nm处测定OD值。计算反应管与对照管的消光值之差，在标准曲线上查出Pi的含量，换算成比活单位，即为Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase活力。每处理重复3次。
Ca²⁺-ATPase活性测定：参照Yamaguchi et al(1979)及冯北元等(1981)的方法进行。反应总体积为100μL。反应体系中含50mmol/L Tris-HCl(pH＝7.4)、5mmol/L CaCl₂、含约8μg蛋白质的酶液、0.5mmol/L Ouabain。将试管放入37℃水浴中，预保温5min，加入底物ATP(ATP在反应体系中的浓度为1.8mmol/L。对照管先加15％三氯醋酸50μL后再加ATP)，于37℃水浴中反应15min，加入15％三氯醋酸50μL终止酶反应，用去离子水将各试管反应液补至1mL。然后加入2mL AMT液，摇匀。精确计时1min后再加入0.4mL 24％柠檬酸钠溶液，混匀。室温放置40min以上，用7230G型分光光度计在波长660nm处测定OD值。计算反应管与对照管的消光值之差，在标准曲线上查出Pi的含量，换算成比活单位，即为Ca²⁺-ATPase活力。每处理重复3次。
表12   l-罗默碱对褐飞虱长翅雌成虫体内ATPase活性的影响
             Na⁺-K⁺-ATPase            Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase          Ca²⁺-ATPase
处理
        比活^a)(x±SE)   抑制率    比活^a)(x±SE)   抑制率  比活^a)(x±SE)   抑制率
        (nmol/mg.min)       (％)     (nmol/mg.min)       (％)   (nmol/mg.min)       (％)
对照    358.76±2.35a       -        505.67±2.55a       -      583.32±4.84a       -
处理    245.26±5.01b       31.64    378.27±3.52b       25.19  514.74±2.19b       11.76
^a)数据为3次重复平均值。同列数据后标有相同字母者表示在5％水平上差异不显著(t检验)。
2.l-罗默碱对褐飞虱ATPase的离体抑制作用
将l-罗默碱用丙酮配成一定浓度的母液，再用去离子水稀释至所需浓度(现配现用)，将药液与酶液一起混合温育，然后按上述ATPase活性测定方法测定剩余酶活性，结果分别见表13、14和15。从表中可看出，在离体情况下，l-罗默碱对3种酶活性均有抑制作用。随着l-罗默碱浓度的增加，对3种酶活性的抑制作用也增加。l-罗默碱对Na⁺-K⁺-ATPase、Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase和Ca²⁺-ATPase活性的抑制中浓度即IC₅₀值分别为42.64μg/mL、57.22μg/mL和96.04μg/mL。
表13    l-罗默碱对褐飞虱长翅雌成虫Na⁺-K⁺-ATPase的离体抑制作用
浓度(μg/mL)        比活(nmol/mg.min)        抑制率(％)
0                        282.39                -
11.11                    214.20                24.15
33.33                    178.41                36.82
50                       137.57                51.28
100                      97.77                 65.38
200                      30.09                 89.34
直线回归方程：y＝2.5279+1.5168x，IC₅₀＝42.64μg/mL，置信限35.58～49.69，r＝0.9661
表14    l-罗默碱对褐飞虱长翅雌成虫Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase的离体抑制作用
浓度(μg/mL)             比活(nmol/mg.min)                  抑制率(％)
0                             391.89                         -
1.24                          342.72                         12.55
3.71                          320.56                         18.20
11.11                         281.07                         28.28
33.33                         255.69                         34.75
100                           139.35                         64.44
直线回归方程：y＝3.6886+0.7461x，IC₅₀＝57.22μg/mL，置信限46.41～68.04，r＝0.9653
表15    l-罗默碱对褐飞虱长翅雌成虫Cay²⁺-ATPase的离体抑制作用
浓度(μg/mL)            比活(nmol/mg.min)                   抑制率(％)
0                            431.71                           -
1.24                         396.42                           8.17
3.71                         372.90                           13.62
11.11                        350.14                           18.89
33.33                        290.47                           32.72
100                          190.15                           55.95
直线回归方程：y＝3.4461+0.7838x，IC₅₀＝96.04μg/mL，置信限75.23～116.85，r＝0.9804
(五)、l-罗默碱对褐飞虱腺苷酸环化酶(AC)活性及环磷酸腺苷(cAMP)
含量的影响
AC是一种分布于细胞膜上与G蛋白耦联的酶，在G蛋白激活下，催化ATP生成cAMP。cAMP是一种细胞内第二信使化合物，是影响多种激素和神经递质发挥作用的物质，它在调节细胞内各种生理生化代谢具有重要作用。cAMP在细胞内含量的变化，直接影响细胞的各种生理功能。本试验用l-罗默碱0.25μg/头剂量点滴处理褐飞虱长翅雌成虫，处理后22h取样，用放射免疫法(试剂盒由上海中医药大学核医学研究室提供。具体测定方法参照试剂盒的说明书)测定了虫体内AC的活性及cAMP的含量，结果见表16和表17。从表中可知，用l-罗默碱处理后，AC活性比对照明显增加，处理后22h酶活性比对照增加27.64％。cAMP的含量与对照比较也有明显增加，处理后22hcAMP含量比对照增加21.52％。说明l-罗默碱处理褐飞虱后，能使虫体内AC的活性及cAMP的含量明显增加。
表16    l-罗默碱对褐飞虱长翅雌成虫体内AC活性的影响
处理                 AC比活^a)(x±SE)(pmol/mg.20min)               比对照增加(％)
对照                        0.4624±0.0081b                            -
处理                        0.5902±0.0114a                            27.64
^a)数据为3次重复的平均值。同列数据后标有相同字母者表示在5％水平上差异不显著(t检验)。
表17    l-罗默碱对褐飞虱长翅雌成虫体内cAMP含量的影响
处理                    cAMP含量^a)(x±SE)(pmol/mg)                比对照增加(％)
对照                        0.2045±0.0066b                            -
处理                        0.2485±0.0025a                            21.52
^a)数据为3次重复的平均值。同列数据后标有相同字母者表示在5％水平上差异不显著(t检验)。
上述结果表明，用本发明的提取方法可从广西地不容块根中提取分离出异喹啉生物碱l-罗默碱，其对褐飞虱有很高的触杀活性和较高的胃毒活性，在田间对褐飞虱有很好的防治效果，用l-罗默碱浓度为33.33～50mg/L的药液进行喷雾施药，能有效控制褐飞虱。它通过抑制褐飞虱的ATP酶，阻断神经传导，以及提高虫体内cAMP含量，影响昆虫的生理生化代谢，从而导致昆虫死亡。
附图说明
图1为异喹啉生物碱化学结构式
图2为l-罗默碱(l-roemerine)化学结构式
图3为d-异紫堇定(d-isocorydine)化学结构式
图4为紫堇定(corydine)化学结构式
图5为l-罗默碱的EI-MS谱图
图6为d-异紫堇定的EI-MS谱图
图7为紫堇定的EI-MS谱图