双调蛋白特异性-双螺旋寡核糖核苷酸,包含双螺旋寡核糖核苷酸的双螺旋寡核糖核苷酸结构,和包含以上成分的用于预防或治疗呼吸道疾病的组合物
技术领域
本发明涉及一种与呼吸道疾病相关的基因特异性-双链寡核糖核苷酸 和一种包含所述双链寡核糖核苷酸的高效双链寡核糖核苷酸结构，在本发明 中，该双链寡核糖核苷酸结构包含一亲水性化合物和疏水性化合物，它们通 过一个简单的共价键或者由连接物-介导的一个共价键结合在双链RNA (siRNA)的两端，从而使上述双链寡核糖核苷酸被有效的传递到细胞内， 且该双链寡核糖核苷酸结构通过其在水溶液中相互间的疏水作用可被转化成 纳米粒。所述双链寡核糖核苷酸结构中的该双链寡核糖核苷酸对双调蛋白 具有较好的特异性，是一种特别好的双调蛋白特异性-siRNA (amphiregulin-specific siRNA)，其中双调蛋白基因是一种与呼吸道疾 病相关的基因。
此外，本发明还涉及一种制备所述双链寡核糖核苷酸结构的方法和一种 用于预防或治疗呼吸道疾病尤其是慢性阻塞性肺疾病(COPD)和/或特发性肺 纤维变性(IPF)的药物组合物，该药物组合物包括上述双链寡核糖核苷酸结 构。
背景技术
在治疗疾病药物的发展中和靶标确认中，抑制基因表达的技术是一个 重要的工具。为靶基因导入一转基因的技术，作为抑制靶基因表达的传统技 术，已经被公开，该技术包括在启动子的反义链方向导入转基因的方法 (Sheehy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:8805-8808,1988；Smith et al., Nature,334:724-726,1988)和在启动子的有义链方向导入转基因的方法 (Napoli et al.,Plant Cell,2:279-289,1990；van der Krol et al.,Plant Cell,2:291- 299,1990；US Patent No.5,034,323；US Patent No.5,231,020；and US Patent No. 5,283,184)。
同时，最近报道了转录后的基因沉默或者RNA干扰(RNAi)是由一 个具有20-25个碱基对的双链RNA片段的累积引起的，该双链RNA是由 RNA模板合成的(Hamilton&Baulcumbe,Science,286:950-952,1999)。上述 双链DNA片段被命名为“短干扰核糖核酸(在下文中用siRNA指代)”。 此后，siRNA被证实是抑制各种生命有机体的基因表达的一个重要的因素， 包括哺乳动物(Fire et al.,Nature,391:806-811,1998；Timmons&Fire,Nature, 395:854,1998；Kennerdell&Carthew,Cell,95:1017-1026,1998；Elbashir et al., Nature,411:494-497,2001；WO 99/32619)。此外，已知双链siRNA被细胞内 的RISC(RNA诱导沉默复合物)蛋白复合物转化为单链RNA，然后结合 到目标mRNA上使目标mRNA失活(Novina&Sharp,Nature,430:161-164, 2004)。利用上述siRNA来抑制基因表达的技术，被用来抑制靶细胞内的靶 基因的表达，和观察由此引发的改变，也被有利地用在致力于鉴定靶细胞内 的靶基因的功能的研究上。特别地，抑制易传染病毒或癌细胞中的靶基因的 功能这种方式被认为可有效的用于治疗相关疾病的方法的发展。在实验动物 上进行的体外研究和体内研究结果表明，靶基因被siRNA诱导沉默是有可 能的(McCaffrey et al.,Nature Biotechnology,21:639-644,2003；Giladi et al., Molecular Therapy,8:769-776,2003；Konishi et al.,epatology,38:842-850,2003； Sen et al.,Virus Research,96:27-35,2003；Yokota et al.,EMBO Reports,4:602- 608,2003；Song et al.,Nature Medicine,9:347-351,2003；McCaffrey et al., Nature,418:38-39,2002)。例如，国际专利公开号为WO 03/070969的专利中 公开了一种通过利用siRNA抑制Bc12蛋白质在癌细胞中的表达来治疗癌细 胞的方法，国际专利公开号为WO 04/009769的专利中公开了一种通过利用 siRNA抑制血管原性VEGF蛋白的表达来治疗癌细胞的方法。
同样地，因为siRNA可以以序列特异性的方式互补地结合在靶 mRNA上来调节靶基因的表达，siRNA与传统的抗体药物或化学药物(小 分子药物)相比，可以被有利地用在非常广范围的应用中。(Progress Towards in Vivo Use of siRNAs.MOLECULAR THERAPY.200613(4):664- 670)。
siRNA具有极好的效果且可被用在广泛范围内的应用中，但为了使 siRNA发展到治疗药物中，还需要改善siRNA的体内稳定性和细胞内的传 递有效性，从而有效地将siRNA传送到它的靶细胞中(Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development.Drug Discov Today.2006Jan；11(1-2):67-73)。
为了改善siRNA的体内稳定性并解决与siRNA的先天性免疫刺激相 关的问题，对以下技术的研究已在积极进行中：通过修改siRNA上的一些 核苷酸或siRNA骨架的方法来改善其体内稳定性从而使siRNA对核酸酶具 有抵抗性的技术，或是利用载体比如病毒载体、脂质体或者纳米颗粒的技 术。
包含病毒载体如腺病毒或逆转录酶病毒的传送系统具有高转染效能， 但携带了免疫原性和致瘤性的风险。另一方面，相比于病毒载体，非病毒载 体包括纳米颗粒被评估具有低细胞内传递效能，但也有其优势，包括体内高 安全性，靶向特异性传送，有效的摄入和包裹RNA寡核苷酸进入细胞或组 织，以及低细胞毒性和低免疫刺激性。因此，相比于病毒传送系统，这些非 病毒载体被认为是一种有前景的传送方法(Nonviral delivery of synthetic siRNAs in vivo.J Clin Invest.2007December 3；117(12):3623–3632)。
一种利用非病毒传送系统中的纳米载体的方法里，纳米颗粒是用各种 多聚物制成的，比如脂质体，一种阳离子多聚物复合物及类似物，siRNA被 附载在这些纳米颗粒上(即纳米载体)，然后被传送至细胞内。上述方法 中，主要用到聚合的纳米颗粒，聚合微胞，阳离子脂质体和类似物。在它们 当中，由阳离子脂质构成的阳离子脂质体与细胞中内涵体的阴离子脂质相互 作用使内涵体不稳定，从而将siRNA传送至细胞内(Proc.Natl.Acad.Sci.15； 93(21):11493-8,1996)。
此外，已知可以在siRNA过客链(有义链)的末端区域结合一个化 合物或类似物来增加siRNA的体内效能，以改善其药代动力学特征(Nature 11；432(7014):173-8,2004)。在这个例子中，siRNA的稳定性会根据结合在 siRNA有义链(过客链)或反义链(引导链)的末端的化合物的性质而有所 不同。例如，在阳离子化合物存在的条件下，结合了多聚化合物如聚乙二醇 (PEG)的siRNA与siRNA的阴离子磷酸基团相互作用形成一个复合物， 从而得到具有更好的siRNA稳定性的载体(J Control Release 129(2):107-16, 2008)。特别地，由多聚物复合物制成的微胞相比于其它药物传送系统比如 微球或者纳米颗粒，微胞体积很小，大小分布高度一致，且自发形成。因 此，这些微胞在易于把握制剂的质量，容易确保微胞的再现性方面有优势。
进一步地，为了改善siRNA在细胞内的传送效能，一项利用siRNA 配合物来确保siRNA的稳定性并增加siRNA的细胞膜渗透性的技术已经发 展起来了(Korean Patent Registration No.883471)，上述siRNA配合物是由一 亲水性的化合物(例如，聚乙二醇(PEG))，该化合物是生物相容的多聚 物，通过一个简单的共价键或一个连接物-介导的共价键结合到siRNA上而 得到的。然而，即使经过化学修饰并结合到聚乙二醇(PEG)上，siRNA在 体内的稳定性依然低且不容易被传送至目标器官内。为了解决这些缺点，包 含结合在寡核糖核苷酸上的亲水化合物和疏水化合物的双链寡核糖核苷酸结 构，尤其是双链寡核糖核苷酸如siRNA，已经被改进了。这些结构通过疏 水化合物的疏水作用形成了被命名为SAMiRNA(自动组装的微胞抑制性 RNA)的自动组装的纳米颗粒(see Korean Patent Registration No.1224828)。 SAMiRNA技术相比于传统的传送技术的优势在于能得到体积很小的匀质的 纳米颗粒。
同时，已知双调蛋白与上皮生长因子受体结合激活上皮生长因子受体 (EGFR)通路，与细胞的增值有关。据报道称双调蛋白的表达可以被双调蛋 白特异性-siRNA抑制，且上述抑制作用展示出对特定类型的乳腺癌的治疗 效果(Cancer Res.2008；68:225-2265)。而且，据报道称炎症乳腺癌中的细胞 渗入可被一种双调蛋白特异性-shRNA抑制(J Cell Physiol.2011226(10):2691- 2701)，当双调蛋白的表达被shRNA抑制时，暴露在香烟烟雾中的大鼠的肺 动脉重构就被抑制了(Arch Biochem Biophys,1；508(1):93-100)。已知双调蛋 白涉及气道平滑肌(ASM)增生和血管生成，特别地，双调蛋白刺激了哮 喘病人体内的气道重构(J Korean Med Sci 2008；23:857-863)，且双调蛋白和 由急性哮喘引发的组织重构中分泌过量的上皮生长因子(EGF)，均涉及哮喘 病人的气道重构(J Alergy Clin Immunol 2009；124:913-920)。
慢性阻塞性肺疾病(下文中用“COPD”指代)是一种典型的肺疾病 哮喘重叠症，由于它涉及不可逆的气道阻塞，所以不同于哮喘。呼吸道疾病 显示出逐渐递增的且不完全可逆的气流限制，该气流限制与由反复感染、有 害气体的吸入或吸烟引发的肺的非正常炎症反应有关(Am J Respir Crit Care Med,163:1256-1276,2001)。COPD的严重性已受到全世界的重视。在1990 年COPD是排名第六的死因，但到2020年，COPD有望成为排名第三的死 因。COPD是发生率上升中的前十大死因中唯一的一种疾病。它也有望成为 排名第四的因伤住院的原因，从而使社会和经济负担迅速增大(Lancet, 349:1498-1504,1997)。慢性肺阻塞性疾病(COPD)是因由气道和软组织炎 症造成的细支气管和软组织病变引起的，其特点是闭塞性支气管炎和肺气肿 (软组织损伤)。COPD的实例包括慢性阻塞性支气管炎，慢性细支气管炎 和肺气肿。在COPD的病例中，嗜中性粒细胞的数量增加，分泌细胞因子 如GM-CSF,TNF-α,IL-8或MIP-2。此外，气道发生炎症，肌肉壁变厚，粘 液分泌增加引发气道阻塞。当气道被阻塞时，肺泡将扩大并受到损伤，从而 使得肺泡的二氧化碳交换氧气的能力遭到破坏，形成呼吸衰竭。在韩国， 8％的45岁及以上的成年人患有慢性阻塞性肺疾病，但是人们的注意力还是 在肺癌上。在治疗慢性非阻塞性肺疾病的传统方法中，主要用到具有抗炎活 性或支气管扩张效果的治疗药物，而用基因治疗药物对慢性非阻塞性肺疾病 做基本预防和治疗是很少的。具有抗炎活性的代表性治疗药物包括糖皮质激 素，白三烯修饰物，茶碱及类似物。在它们当中，糖皮质激素具有很好的效 果，但由于其副作用它的服用方式是吸入，且糖皮质激素没有选择性地抑制 炎症反应，它抑制所有的免疫反应，因此在一些病例中甚至抑制了必要的免 疫反应。白三烯修饰物具有很少的副作用，但效果有限，因此不能单独使用 来控制哮喘。因为这个原因，白三烯修饰物作为辅助药物用得最多。茶碱治 疗慢性非阻塞性肺疾病的效果不是很好，且可引发副作用。因此，为了预防 和治疗慢性阻塞性肺疾病，急需一种新的具有很好的疗效且引发的副作用少 的治疗药物。
同时，特发性肺纤维化(下文表示为“IPF”)是这样一种疾病，当 发生各种致使肺硬化的改变而引发肺组织结构的重大改变时，慢性炎性细胞 渗入肺泡壁，使肺功能逐渐被损害，导致死亡。目前能够有效治疗IPF的方 法还未知，患有IPF的病人预后不佳，平均存活时间为诊断后3-5年。据报 道称，在国外IPF的发生率大概是每十万个人中有3-5个人患有IPF。而 且，已知IPF发生在50岁以上年纪的人身上，且男性发病率比女性高。
目前IPF发展的原因还没有被明确指出，据报道称IPF在吸烟者身上 的发病率高，抗抑郁药，胃食管的回流引起的慢性肺吸入，金属粉尘，木屑 或者溶剂的吸入等等都是与IPF发展有关的危险因素。然而，在大部分IPF 病人中未能发现具有一定因果关系的因素。
已知，当IPF没有得到治疗时，它会持续恶化，约50％或50％以上 的IPF病人会在诊断后的3-5年内去世。而且，当IPF完全发展为纤维症 后，任何治疗都不能缓解它了。因此，当IPF在早期得到治疗时，治疗IPF 的可能性就会高。作为IPF的治疗药物，目前已知的类固醇和硫唑嘌呤的结 合物，或环磷酰胺未显示出特别的效果。此外，各种纤维化抑制剂已尝试性 的用于动物试验和少数病人身上，但未证明有显著的效果。特别地，对于 IPF晚期病人的非肺移植的治疗方法，目前还没有被报道过。因此，急需发 展一种更有效的IPF治疗药物。
[现有技术文献]
[专利文件]
专利文件1:U.S.Pat.No.5,034,323
专利文件2:U.S.Pat.No.5,231,020
专利文件3:U.S.Pat.No.5,283,184
专利文件4:韩国专利授权公报883471号
专利文献5：韩国公开专利第2009-0042297号
[非专利文件]
非专利文件1:Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:8805-8808,1988
非专利文件2:Smith et al.,Nature,334:724-726,1988
非专利文件3:Plant Cell,2:279-289,1990
非专利文件4:Plant Cell,2:291-299,1990
发明内容
本发明旨在解决发生在现有技术中的上述问题，本发明的目的是提供一 种能以对双调蛋白具有特异性的方式高效地抑制双向蛋白基因的表达的新颖 的双链寡核糖核苷酸，尤其指siRNA，一种包含所述新颖寡核糖核苷酸的 双链寡核糖核苷酸结构以及制备该双链寡核糖核苷酸结构的方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗呼道疾病尤其指 COPD和/或IPF的药物组合物，该组合物包含双调蛋白特异性-双链寡核糖 核苷酸或者包含所述双链寡核糖核苷酸的双链寡核糖核苷酸结构作为活性成 分。
本发明的又另一个目的是通过利用双调蛋白特异性-双链寡核糖核苷 酸或者包含上述双链寡核糖核苷酸的双链寡核糖核苷酸结构，提供一种用于 治疗呼吸道疾病尤其指COPD和/或IPF的药物组合物。
本发明的其它特征和实施方式在以下的具体描述和所附权利要求书中更 加清晰。
附图说明
图1是显示分别经30种不同siRNAs各20nM处理过的变异细胞中的双 调蛋白mRNA的相对表达水平的图表，上述30种siRNAs分别包含一条有 义链，所述有义链分别具有SEQ ID NO:1至30的序列。
NC：双调蛋白mRNA在由未经双调蛋白特异性-siRNA处理过的细 胞(对照组)得来的所有RNA中的表达水平。NC的值设定为100％，相对 于NC来衡量分别由每一种siRNA引起的双调蛋白的相对表达水平。
图2是显示分别经不同浓度(0.2、0.1和5nM)的siRNA处理过的成 纤维细胞株中双调蛋白mRNA的相对表达水平的图表，上述不同浓度的 siRNAs分别包含一条有义链，所述有义链分别具有SEQ ID NO:8，9和28 的序列。
图3是显示分别经不同种类的siRNAs各20nM处理过的变异细胞中的 双调蛋白mRNA的相对表达水平的图表，上述siRNAs分别包含一条有义 链，所述有义链分别具有SEQ ID NO:31至50的序列。
具体实施方式
除另有定义外，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领 域内的普通技术人员对上述术语通常的理解相同的含义。一般地，本文使用 的术语和试验方法是本领域中熟知和常用的。
本发明提供了一种具有抑制双调蛋白表达能力的双链寡核糖核苷酸。本 发明的双链寡核糖核苷酸的例子包括但不限于siRNA(短干扰性RNA)， shRNA(短发夹RNA)和miRNA(微小RNA)。
此外，应理解，用作拮抗剂miRNA的单链miRNA抑制剂也在本发明 的双链寡核糖核苷酸范围内。
下文中，将用siRNA的实例来描述本发明的双链寡核糖核苷酸。然 而，对于本领域内的技术人员来说，显然本发明的双链寡核糖核苷酸不限于 siRNA，除siRNA之外具有相同特征的物质也可适用于双链寡核糖核苷酸 上。
特别地，本发明提供了一种双调蛋白特异性-siRNA，该siRNA包含 第一寡核糖核苷酸，它是具有任意一条选自以下SEQ ID NO:1至230的序 列的有义链，以及第二寡核糖核苷酸，它是具有与有义链互补的序列的反义 链：
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5′-agaguugaacaggugauua-3′(SEQ ID NO:25),
5′-gaaccacaaauauccggcu-3′(SEQ ID NO:26),
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5′-ccacaccggaaaugacauu-3′(SEQ ID NO:30),
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5′-cuggauuggaccucaauga-3′(SEQ ID NO:33),
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5′-gacaauacgucaggaaaua-3′(SEQ ID NO:41),
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5′-uccaugaaaacucacagca-3′(SEQ ID NO:88),
5′-gcugccuuuaugucugcug-3′(SEQ ID NO:89),
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5′-agagcaccuggaagcagua-3′(SEQ ID NO:93),
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5′-gugaaaugccuucuaguag-3′(SEQ ID NO:96),
5′-cuacucugggaagcgugaa-3′(SEQ ID NO:97),
5′-cugggaagcgugaaccauu-3′(SEQ ID NO:98),
5′-acuacucagaagaguauga-3′(SEQ ID NO:99),
5′-caugcaaaugucagcaaga-3′(SEQ ID NO:100),
5′-ugagguuaccucaagaagu-3′(SEQ ID NO:101),
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5′-uucacggagaaugcaaaua-3′(SEQ ID NO:103),
5′-cugcuggauuggaccucaa-3′(SEQ ID NO:104),
5′-ugauucagucagaguugaa-3′(SEQ ID NO:105),
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5′-cucaagaagugagaugucu-3′(SEQ ID NO:107),
5′-uucugcauucacggagaau-3′(SEQ ID NO:108),
5′-agguuaccucaagaaguga-3′(SEQ ID NO:109),
5′-aaugccuucuaguagugaa-3′(SEQ ID NO:110),
5′-augauucagucagaguuga-3′(SEQ ID NO:111),
5′-aaacaagacggaaagugaa-3′(SEQ ID NO:112),
5′-uuucugcauucacggagaa-3′(SEQ ID NO:113),
5′-caaauaccuggcuauauug-3′(SEQ ID NO:114),
5′-gaagcaguaacaugcaaau-3′(SEQ ID NO:115),
5′-gacuacucagaagaguaug-3′(SEQ ID NO:116),
5′-gaugauucagucagaguug-3′(SEQ ID NO:117),
5′-ugcauucacggagaaugca-3′(SEQ ID NO:118),
5′-gcugaggaacgaaagaaac-3′(SEQ ID NO:119),
5′-uggauuugagguuaccuca-3′(SEQ ID NO:120),
5′-agugagaugucuucaggga-3′(SEQ ID NO:121),
5′-gagguuaccucaagaagug-3′(SEQ ID NO:122),
5′-cuucgacaagagaauggaa-3′(SEQ ID NO:123),
5′-cucuugauacucggcucag-3′(SEQ ID NO:124),
5′-gucagaguugaacagguag-3′(SEQ ID NO:125),
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5′-cauguaaugcagaauuuca-3′(SEQ ID NO:128),
5′-gauugacaguaguuuauca-3′(SEQ ID NO:129),
5′-guccagcuuagaagacaau-3′(SEQ ID NO:130),
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本文用到的术语“双调蛋白特异性-siRNA”指的是对编码双调蛋白的 基因具有特异性的siRNA。此外，对于本领域内的技术人员来说，显然包 含一条有义链和一条反义链的双调蛋白特异性-siRNA，上述siRNA的有义 链包含一个或多个核苷酸的置换，删除或插入，且具有选自SEQ ID NO:1 至230的序列，其反义链具有与有义链互补的序列，只要它对双调蛋白具有 特异性，也在本发明的范畴内。
基于本发明的双调蛋白特异性-siRNA具有与编码双调蛋白的mRNA 互补结合的核苷酸序列，从而能有效抑制双调蛋白的表达。而且，siRNA的 一条或两条链的3’端可包含一个具有一个或两个或更多的未配对的核苷酸 突出。
此外，为了增加siRNA的体内稳定性，siRNA可包含用于赋予核酸 酶抗性和减少非特异性免疫反应的各种化学修饰。
本发明的siRNA的第一或者第二寡核糖核苷酸的修饰可以是选自以 下修饰中的至少一种，或者两种及以上的结合：一个或多个核苷酸的糖结构 的2’碳位置上的OH基团被–CH3(甲基),-OCH3(甲氧基),-NH2,-F(氟基),- O-2-甲氧乙基-O-丙烷基,-O-2-甲硫基,-O-3-丙氨基,-O-3-二甲基氨丙基,-O- N-甲基乙酰胺或-O-二甲氨基乙氧基取代的修饰；核苷酸中的糖结构的氧 被硫取代的修饰；核苷酸与磷硫酰、硼氢化磷酸盐或甲基膦酸酯键之间的化 学键的修饰；对PNA(核酸肽)，LNA(锁核酸)或UNA(未锁核酸)的 修饰(Ann.Rev.Med.55,61-652004；US 5,660,985；US 5,958,691；US 6,531,584；US 5,808,023；US 6,326,358；US 6,175,001；Bioorg.Med.Chem.Lett. 14:1139-1143,2003；RNA,9:1034-1048,2003；Nucleic Acid Res.31:589-595, 2003；Nucleic Acids Research,38(17)5761–5773,2010；Nucleic Acids Research, 39(5)1823–1832,2011)。
根据本发明，在这些双调蛋白特异性-siRNAs中，包含具有选自SEQ ID NO:1至30的序列的有义链的siRNA是对小鼠双调蛋白特异的，包含具 有选自SEQ ID NO:31至230的序列的有义链的siRNA是对人类双调蛋白 特异的。本发明发现分别包含具有任意一条SEQ ID NO:1至230的序列的 有义链的siRNA均能有效抑制双调蛋白的表达。
另一方面，本发明提供了一种双链寡核糖核苷酸结构，即siRNA配 合物，为了确保siRNA在体内的有效传送并增加siRNA的稳定性，在上述 siRNA配合物中，一个或多个亲水性的多聚物和疏水性的多聚物分别结合在 双调蛋白特异性-siRNA的两端。这里用到的术语“双链寡核糖核苷酸结构 ”指的是一种包含一个或多个分别结合在siRNA或shRNA两端的亲水性多 聚物和疏水性多聚物的一种双链寡核糖核苷酸结构。
上述双链寡核糖核苷酸结构通过疏水多聚物部分的疏水作用形成自组 装的纳米颗粒(参见Korean Patent Laid-Open Publication No.2010-123214)。 该配合物的优势在于它具有很高的体内传送效力和体内稳定性，且颗粒大小 分布一致，因此该配合物的质量控制(QC)容易从而使得用该配合物制备 药物的过程变得简单。
特别地，根据本发明的双调蛋白特异性-双链寡核糖核苷酸结构优选 地具有以下结构式(1)代表的结构：
结构式(1)
A-X-R-Y-B
其中A代表亲水性化合物，B代表疏水性化合物，X和Y各单独代表 简单的共价键或者由连接物-介导的共价键，R代表双调蛋白特异性-siRNA 。
更优选地，根据本发明的双调蛋白特异性-的双链寡核糖核苷酸结构具 有以下结构式(2)代表的结构：
结构式(2)
A-X-S-Y-B
AS
在上述结构式(2)中，A代表亲水性化合物，B代表疏水性化合物， X和Y各单独代表简单的共价键或者由连接物介导的共价键，S代表双调蛋 白特异性-siRNA的有义链，AS代表双调蛋白特异性-siRNA的反义链。
更优选地，包含双调蛋白特异性-siRNA的双调蛋白特异性-双链寡核 糖核苷酸结构具有以下结构式(3)代表的结构：
结构式(3)
A-X-5′ S 3′-Y-B
AS
在上述结构式(3)中，A代表亲水性化合物，B代表疏水性化合物， X和Y各单独代表简单的共价键或者由连接物介导的共价键，S代表双调蛋 白特异性-siRNA的有义链，AS代表双调蛋白特异性-siRNA的反义链。
包含有结构式(1)至(3)表示的双调蛋白特异性-siRNA的双链寡核糖核 苷酸结构中的反义链的5’端可结合1到3个磷酸基团。且，对本领域内的技 术人员来说，显然shRNA可替代结构式(1)至(3)中的siRNA。
优选地，以上结构式(1)至(3)中的亲水性化合物为分子量200-10,000的 阳离子或非离子型多聚物化合物，更优选地，为分子量1,000-2,000的非离 子型多聚物化合物。例如，在本发明中用到的亲水性多聚物化合物优选地为 非离子型亲水性多聚物化合物，比如聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮或聚恶唑啉 ，但不限于上述物质。
结构式(1)至(3)中的疏水性化合物(B)的作用是通过疏水相互作用形 成由结构式(1)表示的寡核苷酸结构组成的纳米颗粒。优选地，疏水性化 合物具有250-1,000的分子量，可以是类固醇衍生物，甘油酯衍生物，丙三 醇醚，聚丙二醇，C12-C50的非饱和或饱和碳氢物，二酰基卵磷脂，脂肪酸 ，磷脂，脂肪胺或类似物，但不限于上述物质。对本领域内的技术人员来说 ，显然可以用任何疏水性化合物，只要它符合本发明的目的，
类固醇衍生物可选自胆固醇，胆甾烷醇，胆酸，胆固醇甲酸盐和胆固 醇胺，在所述类固醇衍生物中甘油酯衍生物可以选自单-甘油酯，双-甘油酯 和三-甘油酯，及类似物。这里，甘油酯脂肪酸优选C12-C50的饱和或不饱和 脂肪酸。
特别地，在上述疏水性化合物中，优选使用饱和或不饱和碳氢化合物 或胆固醇，因为饱和或不饱和碳氢化合物或胆固醇容易参与到合成本发明的 寡核苷酸结构的过程中。上述疏水性化合物可结合到亲水性化合物的末端， 且可结合到siRNA的有义链或反义链上的任何位置。
本发明结构式(1)至(3)中的亲水性化合物或疏水性化合物通过单 个共价键或由连接物介导的共价键(X或Y)结合到双调蛋白特异性-siRNA 上。介导上述共价键的连接物是共价结合在双调蛋白特异性-siRNA末端的 亲水性或疏水性化合物上，且不受特别限制只要它在特定环境中，如果需要 的话能提供可降解的键。因此，本发明用到的连接物可以是任何化合物，结 合它为了在制备本发明的双链寡核糖核苷酸结构的过程中激活双调蛋白特异 性-siRNA和/或亲水性(或疏水性)化合物。上述共价键可以是可降解键和 不可降解键中的一个。在这里，不可降解键的例子包括但不限于，酰胺键和 磷酸键，可降解键的例子包括但不限于，二硫键，可降解酸键，酯键，酐键 ，可生物降解的键和可酶解的键。
任何具有特异性结合到双调蛋白上的性质的siRNA均可用作在结构式 (1)至(3)中R(或S和AS)代表的双调蛋白特异性-siRNA，没有限制。 优选地，在本发明中用到的siRNA包含了有义和反义链链，所述有义链具有 任意一条SEQ ID NO:1至230的序列，所述反义链具有与有义链互补的序列 。
在又另一方面，本发明提供了包含双调蛋白特异性-双链寡核糖核苷 酸结构的纳米颗粒。
如上所述，包含了双调蛋白特异性-siRNA的双调蛋白特异性-双链寡 核糖核苷酸结构是一种包含亲水性化合物和疏水性化合物的两性结构，在该 两性结构中，亲水性部分通过与体内水分子的相互作用(例如氢键)而面向 结构的外侧定位，疏水性化合物部分通过与水分子之间的疏水作用而朝向结 构内侧定位，由此形成热力学稳定的纳米颗粒。也就是说，疏水性化合物 位于纳米颗粒的中心，亲水性化合物位于双调蛋白特异性-siRNA的外侧， 包裹双调蛋白特异性-siRNA，从而形成纳米颗粒。如上所述形成的纳米颗 粒增强了双调蛋白特异性-siRNA的细胞内传送并增加了双调蛋白特异性- siRNA的效能。
本发明的纳米颗粒的特点在于，它们可以仅由包含具有相同序列的 siRNAS的双链寡核糖核苷酸结构组成，或者仅由包含具有不同序列的 siRNAS的双链寡核糖核苷酸结构组成。也就是说，在对双调蛋白具有相同 的目标基因特异性的同时，siRNAs可以有不同的序列。而且，上述纳米颗 粒也可包括由对癌症特异性目标基因而非双调蛋白具有特异性的siRNAs组 成的双链寡核糖核苷酸结构。
优选地，包括在本发明纳米颗粒的双链寡核糖核苷酸结构中的双调蛋 白特异性-siRNA包含具有SEQ ID NO:1至230的序列中任一条的有义链， 和具有与有义链互补的序列反义链，但不限于上述物质，且对于本领域的技 术人员而言，显然任何具有双调蛋白特异性且符合本发明目的的siRNA都 可使用。
本发明还提供了预防或治疗呼吸道疾病的组合物，该组合物包括双调 蛋白特异性-siRNA，包含了上述双调蛋白特异性-siRNA的双链寡核糖核苷 酸结构和/或包含了上述双链寡核糖核苷酸结构的纳米颗粒。
根据本发明，上述包括双调蛋白特异性-siRNA，包含了上述双调蛋白 特异性-siRNA的双链寡核糖核苷酸结构和/或包含了上述双链寡核糖核苷酸 结构的纳米颗粒的组合物通过抑制肺动脉重构和气道重构显示出预防或治疗 呼吸道极影的效果。因此，本发明的该组合物对预防或治疗呼吸道疾病有效 ，上述呼吸道疾病包括哮喘，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，特发性肺纤维 变性(IPF)，急性/慢性支气管炎，过敏性鼻炎，咳嗽，痰多，急性下呼吸道 感染(支气管炎和细支气管炎)，以及急性上呼吸道感染如喉咙痛，扁桃体 炎或喉炎。
除上述活性成分外，本发明的该组合物可包含一种或多种药物可接受 的载体。上述药物可接受载体应与活性成分相容，可以是选自以下物质中的 一种：生理盐水，蒸馏水，林格液，缓冲盐水，葡萄糖溶液，麦芽糊精溶液 ，甘油，乙醇及上述成分中两种或两种以上成分的混合物。若需要，上述组 合物可含有其它传统的添加剂比如抗氧化剂、缓冲液或抑菌剂。此外，上述 组合物可额外地添加稀释液，分散剂，表面活性剂，粘合剂和润滑剂来制备 可注射的配方，如水溶液，悬浮液和乳剂。特别地，上述组合物优选地选用 冻干剂。可用本发明所属技术领域中的传统方法制备冻干剂，也可在冻干剂 中添加稳定剂。此外，可根据针对的疾病或成分的不同通过本领域内的适合 的方法或Remington's Pharmaceutical Science,Mack Publishing Company, Easton PA中公开的方法优选地制备上述组合物。
一般可由本领域内的技术人员根据病人的身体状况和疾病的严重性来 决定本发明的组合物中活性成分的含量和服用该组合物的方法。此外，该组 合物可制备成各种剂型，包括粉剂，片剂，胶囊，液体制剂，可注射用的溶 液，膏剂和糖浆剂，也可通过使用一个剂量单位或多剂量容器比如封闭的安 瓿或者小瓶的形式来提供。
本发明的组合物可以口服或者不经肠道给予。本发明的该组合物可通 过以下方式给予，例如，口服，静脉注射，肌肉注射，动脉注射，髓给药， 皮内注射，心脏注射，经皮给药，皮下注射，腹膜注射，直肠内给药，舌下 给药或局部给药，但不限于上述方式。特别地，为了治疗呼吸道疾病，本发 明的组合物可通过支气管内点滴法给予至肺部。该组合物的剂量可根据病人 的体重，年龄，性别，健康状况和饮食而不同，本领域内的技术人员可以容 易地确定该组合物的服用时间，服用方式，排泄率，疾病的严重性，或类似 问题。此外，本发明的组合物可通过已知技术制备成适合临床服用的剂型。
而且，本发明提供了根据本发明的双调蛋白特异性-siRNA，包含双调 蛋白特异性-siRNA的双链寡核糖核苷酸结构，或包含上述成分的组合物或 纳米颗粒在制备用于预防或治疗呼吸道疾病的药物中的用途。另外，本发明 提供了预防或治疗呼吸道疾病的方法，该方法包括向有需要的病人给予本发 明的双链寡核糖核苷酸结构或包含上述结构的组合物或纳米颗粒。
实施例
下文将用具体的实施例来进一步详细地描述本发明。对本领域内的普 通技术人员来说，显然这些实施例仅是为了达到详细阐述的目的而不是来限 制或改变本发明的范围。
实施例1：目标核苷酸序列的设计和siRNA的制备
根据小鼠的双调蛋白mRNA序列(NM_009704_ver1)，设计了可结合上 siRNA的目标核苷酸序列(有义链)，制备出一个包含一条与目标核苷酸 序列互补的反义链的siRNA(Nucleic Acids Research,12:4539-4557,1984)。 特别地，根据上述双调蛋白mRNA的序列(NM_009704)，利用由Bioneer (韩国)开发的基因设计软件，设计了可结合上siRNA的目标核苷酸序 列。本发明的双调蛋白siRNA具有包含了由19个核苷酸组成的有义链和 与有义链序列互补的反义链的双链结构。通过利用β-氰乙基亚磷酰胺连 接RNA骨架结构中的磷酸二酯键，制备了上述siRNA(Nucleic Acids Research,12:4539-4557,1984)。特别地，一系列包括解阻断，耦合，氧化 ，和加帽的过程通过利用RNA合成剂在结合了核苷酸的固体支持物上反 复进行(384Synthesizer,BIONEER,KOREA)，从而得到包含了具有所期望 长度的RNA的反应产物。利用配备了Daisogel C18柱(Daiso,日本)的 HPLC918(日本分析工业,日本)将上述RNA从反应产物中分离纯化出来， 并利用MALDI-TOF质谱仪对其进行分析，确认它是否与期望的核苷酸序 列一致。接下来，RNA的有义链与反义链互相结合，从而制备包含具有 SEQ ID NO:1至30各一序列的有义链的双链siRNAs。
实施例2：通过siRNA抑制成纤维(NIH3T3)细胞株内的双调蛋白的 表达
用上述双调蛋白特异性-siRNAs(实施例1制备的)转化小鼠成纤维 细胞(NIH3T3)株，上述双调蛋白特异性-siRNAs分别具有SEQ ID NO: 1至30的序列，且分析了在转化的成纤维(NIH3T3)细胞内的双调蛋白的 表达模式，也就是，siRNAS抑制双调蛋白的表达的程度。
2-1：成纤维细胞株的培养
将从美国典型培养物保藏中心(ATCC)得到的小鼠成纤维细胞株 (NIH3T3)于37℃和5％(v/v)CO2条件下置于RPMI-1640培养基 (GIBCO/Invitrogen，美国，10％(v/v)胎牛血清,![]()
青霉素和![]()
![]()
链霉素)中培养。
2-2：目标siRNA向成纤维化细胞株的转染
将实施例2-1培养的1×105成纤维细胞置于12孔培养板内的RPMI 1640(GIBCO,美国)中在37℃和5％(v/v)CO2条件下培养18小时，然后除 去培养基，之后把![]()
的Opti-MEM培养基分配到每一个孔内。
同时，将![]()
脂质体LipofectamineTM 2000(Invitrogen,美国)与![]()
Opti-MEM培养基的混合物在室温下反应5分钟，向![]()
Opti-MEM培 养基内加入![]()
实施例1制备的含有具有任一一条SEQ ID NO:1至30 的序列的有义链的siRNA![]()
来制备最终浓度为20nM的siRNA 溶液。所述脂质体Lipofectamine 2000混合物和每一种siRNA溶液混合， 在室温下培育20分钟来制备转染液。
下一步，将![]()
上述每一种转染液分别分配到每一个含有肿瘤细胞 株和Opti-MEM的孔内并培育6小时，然后除去Opti-MEM培养基。然后 将![]()
RPMI 1640培养基分配到每一个孔中，并在37℃和5％(v/v)CO2条件下培育24小时。
2-3：对双调蛋白mRNA的定量分析
从实施例2-2的转染细胞株中提取出总RNA，并用它合成其cDNA， 用实时PCR对双调蛋白mRNA的表达水平进行相对定量。
2-3-1：从转染细胞中分离RNA以及cDNA的合成
利用RNA提取试剂盒(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER,韩国)从经实施例2-2转染的细胞株中提取出总RNA，并利用 RNA反转录酶(AccuPower CycleScript RT Premix/dT20,Bioneer,韩国)用以 下方式合成为cDNA。特别地，向![]()
Eppendorf管中的AccuPower CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer,韩国)里加入1μg/管的所提取的RNA ，并添加经DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的蒸馏水至总体积![]()
然 后，利用基因扩增系统(MyGenieTM 96 Gradient Thermal Block,BIONEER, 韩国)将上述RNA和引物在30℃条件下杂交一分钟，保持温度52℃4分 钟即合成cDNA。杂交和cDNA合成的过程重复6次，然后保持温度95℃ 5分钟使酶失活，从而扩增cDNA。
2-3-2：双调蛋白mRNA的相对定量分析
以实施例2-3-1合成的cDNA作为模板，利用实时PCR以以下方式对 双调蛋白mRNA的相对水平进行定量。特别地，用蒸馏水将实施例2-3-1 合成的cDNA稀释五倍，为了分析双调蛋白mRNA的表达水平，向96孔 板的每一个孔中加入![]()
上述稀释过的cDNA，![]()
2×GreenStarTM PCR master mix(BIONEER,韩国)，![]()
蒸馏水和![]()
双调蛋白qPCR引物(每 种引物![]()
BIONEER,韩国)来制备混合物。同时，GAPDH(甘 油醛-3-磷酸脱氢酶)，一种持家基因(后文中表示为HK基因)，作为标 准基因用来归一化双调蛋白mRNA的表达水平。利用ExicyclerTM 96 Real- time Quantitative Thermal Block(BIONEER,韩国)将上述含有混合物的96 孔板进行以下反应。特别地，将上述混合物在95℃条件下反应15分钟， 激活酶并除去cDNA的第二结构，然后混合物进行42个循环的反应，每 一个循环包括变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃30s，SYBR green 扫描以及最后72℃条件下3分钟的延伸。接下来，混合物在55℃保持1 分钟，分析55℃～95℃的溶解曲线。PCR扩增完后，通过计算经GAPDH 基因归一化的mRNA值(归一化因数，NF)来校正双调蛋白的Ct(循环 阈值)值，然后利用一个未经siRNA处理的对照值来计算ΔCt值。用ΔCt 值和公式2(-ΔCt)×100(见图1)对因双调蛋白特异性-siRNA引起的双调蛋 白mRNA的表达水平进行相对定量，上述双调蛋白特异性-siRNA含有具 有SEQ ID NO:1至30各一序列的有义链。
为了选出高效能的siRNAs，挑出了15种不同的siRNAs，所述 siRNAs分别包含一条有义链，该有义链具有SEQ ID NO:2,6至9,11,17 至21,23,24,28和29各一序列，这些最终浓度为20nM的siRNAs显示出 经其处理过后双调蛋白mRNA的表达水平相比于空白对照组有70％或者 更高的下降。
实施例3：被选用的siRNAs对成纤维(NIH3T3)细胞株中双调蛋白的 表达的抑制
用所述双调蛋白特异性-siRNAs(选自实施例2)转化小鼠成纤维 (NIH3T3)细胞株，所述双调蛋白特异性-siRNAs分别包含一条有义链，该 有义链具有SEQ ID NO:2,6至9,11,17至21,23,24,28和29各一序列， 分析了经改变后的成纤维(NIH3T3)细胞中的双调蛋白mRNA的表达模式 。
3-1：成纤维细胞株的培养
将从美国典型培养物保藏中心(ATCC)得到的小鼠成纤维细胞株 (NIH3T3)于37℃和5％(v/v)CO2条件下置于RPMI-1640培养基 (GIBCO/Invitrogen，美国，10％(v/v)胎牛血清,![]()
青霉素和![]()
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链霉素)培养。
3-2：目标siRNA到成纤维细胞株的转染
将实施例2-1培养的1×105成纤维细胞置于12孔培养板内的RPMI 1640(GIBCO,美国)中在37℃和5％(v/v)CO2条件下培养18小时，然后除 去培养基，之后将![]()
的Opti-MEM培养基分配到每一个孔内。
同时，使![]()
脂质体LipofectamineTM 2000(Invitrogen,美国)与![]()
Opti-MEM培养基的混合物在室温下反应5分钟，向![]()
Opti-MEM培 养基内加入![]()
选自实施例2的含有具有SEQ ID NO:2,6至9,11,17至 21,23,24,28和29各一序列的有义链的siRNA![]()
来制备最终浓 度为20nM的siRNA溶液。上述脂质体Lipofectamine 2000混合物和每一 种siRNA溶液混合，在室温下培育20分钟来制备转染液。
下一步，将![]()
上述每一种转染液分别分散到每一个含有肿瘤细胞 株和Opti-MEM的孔内并培育6小时，然后除去Opti-MEM培养基。然后 将![]()
RPMI 1640培养基分散到每一个孔，并在37℃和5％(v/v)CO2条 件下培育24小时。
3-3：双调蛋白mRNA的定量分析
从实施例3-2的转染细胞株中提取出总RNA，并用它合成cDNA，用 实时PCR对双调蛋白mRNA的表达水平进行相对定量。
3-3-1：从转染细胞中分离RNA以及cDNA的合成
利用RNA提取试剂盒(AccuPrep细胞总RNA提取试剂盒,BIONEER, 韩国)从经实施例2-2转染的细胞株中提取出总RNA，并利用RNA反转录 酶(AccuPower CycleScript RT Premix/dT20,Bioneer,韩国)用以下方式合成 cDNA。特别地，向![]()
Eppendorf管中的AccuPower CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer,Korea)里加入1μg/管的上述RNA，并添加经DEPC (焦碳酸二乙酯)处理过的蒸馏水至总体积![]()
然后，利用基因扩增 系统(MyGenieTM 96 Gradient Thermal Block,BIONEER,韩国)将上述RNA 和引物在30℃条件下杂交一分钟，保持温度52℃4分钟即合成cDNA。 杂交和cDNA合成的过程重复6次，然后保持温度95℃5分钟使酶失活 ，从而扩增cDNA。
3-3-2：双调蛋白mRNA的相对定量分析
以实施例3-3-1合成的cDNA作为模板，利用实时PCR以以下方式对 双调蛋白mRNA的相对水平进行定量。特别地，用蒸馏水将实施例3-3-1 合成的cDNA稀释五倍，为了分析双调蛋白mRNA的表达水平，向96孔 板的每一个孔中加入![]()
上述稀释过的cDNA，![]()
2×GreenStarTM PCR master mix(BIONEER,韩国)，![]()
蒸馏水和![]()
双调蛋白qPCR引物(每 种引物![]()
BIONEER,韩国)来制备混合物。同时，GAPDH(甘 油醛-3-磷酸脱氢酶)，一种持家基因(后文中用HK基因指代)，作为标 准基因用来归一化双调蛋白mRNA的表达水平。利用ExicyclerTM 96 Real- time Quantitative Thermal Block(BIONEER,韩国)将上述含有混合物的96 孔板进行以下反应。特别地，将上述混合物在95℃条件下反应15分钟， 激活酶并除去cDNA的第二结构，然后混合物进行42个循环的反应，每 一个循环包括变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃30s，SYBR绿扫 描以及随后的72℃条件下3分钟的延伸。接下来，混合物在55℃保持1 分钟，分析55℃-95℃的溶解曲线。PCR扩增完后，通过计算经GAPDH 基因归一化的mRNA值(归一化因数，NF)来校正双调蛋白的Ct(循环 阈值)值，然后利用未经siRNA处理的对照值来计算ΔCt值。用ΔCt值 和公式2(-ΔCt)×100对因双调蛋白特异性-siRNA引起的双调蛋白mRNA的 表达水平的变化进行相对定量，上述双调蛋白特异性-siRNA含有一条有 义链，该有义链具有SEQ ID NO:2,6至9,11,17至21,23,24,28和29的 序列。
为了选择高效能的siRNAs，挑出了3种不同的siRNAs，所述siRNAs 分别包含一条有义链，该有义链具有任一一条SEQ ID NO::8,9和28的 序列，这些最终浓度为20nM的siRNAs显示出(经其处理过后)双调蛋 白mRNA的表达水平相比于空白对照组有70％或者更高的下降。检查所 选siRNAs的IC50值来确定siRNAs的浓度，经该浓度的siRNAs处理后目 标基因的表达被抑制了50％。
实施例4：被选用的siRNAs对成纤维(NIH3T3)细胞株中双调蛋白的 表达的抑制
用具有实施例3所选的SEQ ID NO:8，9和28的序列的有义链的双 调蛋白特异性-siRNAs转化成纤维细胞(NIH3T3)，为了确定所述siRNAs 的IC50值，分析了经转化后的成纤维(NIH3T3)细胞中的双调蛋白mRNA 的表达模式。
4-1：成纤维细胞株的培养
将从美国典型培养物保藏中心(ATCC)得到的小鼠成纤维细胞株于 37℃和5％(v/v)CO2条件下置于RPMI-1640培养基(GIBCO/Invitrogen，美 国，10％(v/v)胎牛血清,![]()
青霉素和![]()
链霉素)中培养。
4-2：目标siRNA到成纤维细胞株的转染
将实施例2-1培养的1×105成纤维细胞置于12孔培养板内的RPMI 1640(GIBCO,美国)中在37℃和5％(v/v)CO2条件下培养18小时，然后除 去培养基，之后将![]()
的Opti-MEM培养基分配到每一个孔内。
同时，使![]()
脂质体LipofectamineTM 2000(Invitrogen,美国)与![]()
Opti-MEM培养基的混合物在室温下反应5分钟，向249.8，249和![]()
Opti-MEM培养基内加入0.2，1和![]()
选自实施例3的含有一具有任一一 条SEQ ID NO::8，9和28的序列的有义链的siRNA![]()
来制备最 终浓度为0.2，1和5nM的siRNA溶液。所述脂质体Lipofectamine 2000 混合物和每一种siRNA溶液混合，在室温下培育20分钟来制备转染液。
下一步，将![]()
上述每一种转染液分别分配到每一个含有肿瘤细胞 株和Opti-MEM的孔内并培育6小时，然后除去Opti-MEM培养基。然后 将![]()
RPMI 1640培养基分配到每一个孔，并在37℃和5％(v/v)CO2条 件下培育24小时。
4-3：双调蛋白mRNA的定量分析
从实施例4-2的转染细胞株中提取总RNA，并用它合成cDNA，用实 时PCR对双调蛋白mRNA的表达水平进行相对定量。
4-3-1：从转染细胞中分离RNA以及cDNA的合成
利用RNA提取试剂盒(AccuPrep细胞总RNA提取试剂盒,BIONEER, 韩国)从经实施例2-2转染的细胞株中提取出总RNA，并利用RNA反转录 酶(AccuPower CycleScript RT Premix/dT20,Bioneer,韩国)用以下方式合成 cDNA。特别地，向![]()
Eppendorf管中的AccuPower CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer,Korea)里加入1μg/管的上述RNA，并添加经DEPC (焦碳酸二乙酯)处理过的蒸馏水至总体积![]()
然后，利用基因扩增 系统(MyGenieTM 96 Gradient Thermal Block,BIONEER,韩国)将上述RNA 和引物在30℃条件下杂交一分钟，保持温度52℃4分钟即合成cDNA。 杂交和cDNA合成的过程重复6次，然后保持温度95℃5分钟使酶失活 ，从而扩增cDNA。
4-3-2：双调蛋白mRNA的相对定量分析
以实施例4-3-1合成的cDNA作为模板，利用实时PCR以以下方式对 双调蛋白mRNA的相对水平进行定量。特别地，用蒸馏水将实施例4-3-1 合成的cDNA稀释五倍，为了分析双调蛋白mRNA的表达水平，向96孔 板的每一个孔中加入![]()
上述稀释过的cDNA，![]()
2×GreenStarTM PCR master mix(BIONEER,韩国)，![]()
蒸馏水和![]()
双调蛋白qPCR引物(每 种引物![]()
BIONEER,韩国)来制备混合物。同时，GAPDH(甘 油醛-3-磷酸脱氢酶)，一种持家基因(后文中用HK基因指代)，作为标 准基因用来归一化双调蛋白mRNA的表达水平。利用ExicyclerTM 96 Real- time Quantitative Thermal Block(BIONEER,韩国)将上述含有混合物的96 孔板进行以下反应。特别地，将上述混合物在95℃条件下反应15分钟， 激活酶并除去cDNA的第二结构，然后混合物进行42个循环的反应，每 一个循环包括变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃30s，SYBR绿扫 描以及随后的72℃条件下3分钟的延伸。接下来，混合物在55℃保持1 分钟，分析55℃-95℃的溶解曲线。PCR扩增完后，通过计算经GAPDH 基因归一化的mRNA值(归一化因数，NF)来校正双调蛋白的Ct(循环 阈值)值，然后利用未经siRNA处理的对照值来计算ΔCt值。用ΔCt值 和公式2(-ΔCt)×100(见图2)对因双调蛋白特异性-siRNA引起的双调蛋白 mRNA的表达水平的变化进行相对定量。
因此，发现分别具有SEQ ID NO::8,9和28的序列的有义链的 siRNAs，在低浓度0.2nM时均显示出使双调蛋白mRNA的表达水平下降 50％或者更高的能力，意味着这些siRNAs展示出抑制双现蛋白的表达的 高效能。
实施例5：目标核苷酸序列的设计和siRNA的制备
根据人类双调蛋白mRNA的序列(NM_001657)，设计了可结合上 siRNA的目标核苷酸序列(有义链)，并制备了包含与目标核苷酸序列互 补的反义链的siRNA。特别地，利用由Bioneer(韩国)开发的基因设计 程序(Turbo si-Designer)根据双调蛋白mRNA序列(NM_001657_ver1)设计 了可结合上siRNA的目标核苷酸序列。本发明的双调蛋白siRNA具有一 个双链结构，该双链结构包括一条由19个核苷酸组成的有义链和一条与 有义链序列互补的反义链。此外，制备了siCONT(5’- CUUACGCUGAGUACUUCGA-3’作为有义链)，一种不抑制任何基因的表 达的siRNA。特别地，一系列包括解阻断，耦联，氧化，和加帽的过程通 过利用RNA合成剂在结合了核苷酸的固体支持物上反复进行(384 Synthesizer,BIONEER,KOREA)，从而得到包含了具有所期望长度的RNA 的反应产物。利用配备了Daisogel C18柱子(Daiso,日本)的HPLC918(日 本分析工业,日本)将上述RNA从反应产物中分离纯化出来，并利用 MALDI-TOF质谱仪(Shimadzu，日本)对其进行分析确认它是否与期望 的核苷酸序列一致。接下来，RNA的有义链与反义链互相结合，从而制 备包含了各具有SEQ ID NO:31至230的序列的有义链的siRNA，和 siCONT。
实施例6：siRNA对人类肺癌细胞株内的双调蛋白的表达的抑制
用分别具有SEQ ID NO:31至230的有义链的各siRNA(实施例1制 备的)转化人类肺癌细胞株(A549)，分析因siRNA的处理而造成的转化细 胞内，双调蛋白的表达模式。
6-1：人类肺癌细胞株的培养
将从美国典型培养物保藏中心(ATCC)得到的人类肺癌(A549)细胞 株于37℃和5％(v/v)CO2条件下置于RPMI-1640培养基 (GIBCO/Invitrogen，美国，10％(v/v)胎牛血清,![]()
青霉素和![]()
![]()
链霉素)中培养。
6-2：目标siRNA到人类肺癌细胞株的转染
将实施例6-1培养的1×105人类肺癌(A549)细胞置于6孔培养板内 的DMEM中在37℃和5％(v/v)CO2条件下培养18小时，然后除去培养基 ，之后将![]()
的Opti-MEM培养基分配到每一个孔内。
同时，使![]()
脂质体LipofectamineTM RNAi Max(Invitrogen,美国)与 ![]()
Opti-MEM培养基的混合物在室温下反应5分钟，向![]()
Opti- MEM培养基内加入5或![]()
实施例5制备的含有具有任意一条SEQ ID NO:8，9和28的序列的有义链的siRNA![]()
来制备最终浓度为20 nM的siRNA溶液。所述脂质体Lipofectamine max混合物和每一种 siRNA溶液混合，在室温下反应15分钟来制备转染液。
下一步，将![]()
上述每一种转染液分别分配到每一个含有肿瘤细胞 株和Opti-MEM的孔内并培育6小时，然后除去Opti-MEM培养基。然后 将![]()
RPMI 1640培养基分配到每一个孔，并在37℃和5％(v/v)CO2条 件下培育24小时。
6-3：双调蛋白mRNA的定量分析
以与实施例2-3-1所述的相同的方式从实施例6-2的转染细胞株中提取 出总RNA，并用它合成cDNA，然后用实时PCR对双调蛋白mRNA的表 达水平进行相对定量。
6-3-1：双调蛋白mRNA的相对定量分析
用从实施例6-2转染的细胞株中以与实施例2-3-1相同的方式制备的 cDNA为模板，利用实时PCR以以下方式对双调蛋白mRNA的相对水平 进行定量。特别地，用蒸馏水将制备的cDNA稀释五倍，为了分析双调蛋 白mRNA的表达水平，向96孔板的每一个孔中加入![]()
上述稀释过的 cDNA，![]()
2×GreenStarTM PCR master mix(BIONEER,韩国)，![]()
蒸馏 水和![]()
双调蛋白qPCR引物(hAREG-F,ACACCTACTCTGGGAAGCGT； hAREG-R,GCCAGGTATTTGTGGTTCGT；每种引物![]()
BIONEER,韩国)来制备混合物。同时，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶； hGAPDH-F,GGTGAAGGTCGGAGTCAACG；hGAPDH-R,ACCATG TAGTTGAGGTCAATGAAGG)，一种持家基因(后文中表示为HK基因 )，作为标准基因用来归一化双调蛋白mRNA的表达水平。利用 ExicyclerTM 96 Real-time Quantitative Thermal Block(BIONEER,韩国)将上 述含有混合物的96孔板进行以下反应。特别地，将上述混合物在95℃条 件下反应15分钟，激活酶并除去cDNA的第二结构，然后混合物进行42 个循环的反应，每一个循环包括变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃ 30s，SYBR绿扫描以及随后的72℃条件下3分钟的延伸。接下来，混合 物在55℃保持1分钟，分析55℃-95℃的溶解曲线。PCR扩增完后，通过 计算经GAPDH基因归一化的mRNA值(归一化因数，NF)来校正双调 蛋白的Ct(循环阈值)值，然后利用未经siRNA处理的对照值来计算 ΔCt值。用ΔCt值和公式2(-ΔCt)×100(见图3)对因具有SEQ ID NO:31 至50各序列的有义链的双调蛋白特异性-siRNA引起的双调蛋白mRNA的 表达水平的变化进行相对定量。可见几乎所有的双调蛋白特异性-siRNAs 都抑制双调蛋白mRNA的表达，且与对照组相比，在经双调蛋白特异性- siRNAs处理过的细胞内，双调蛋白mRNA的表达水平下降了很多。在这 些双调蛋白特异性-siRNAs中，包含具有SEQ ID NO:39至41，43至45 ，47，49和50的序列中任一条的有义链的siRNA展现了最大的抑制双调 蛋白mRNA的表达的能力。
此外，发现一可显示出对双调蛋白表达的高效能抑制作用的siRNA， 所述siRNA包含具有SEQ ID NO:51至230各序列的有义链，所述siRNA 类似于包含具有SEQ ID NO:31至50各序列的有义链的siRNA。
工业应用性
如上所述，本发明的双调蛋白特异性-双链寡siRNA能非常有效地抑 制双调蛋白的表达。因此，包含以下成分的组合物能有效地用于预防或质 量呼吸道疾病：双调蛋白特异性-双链寡siRNA，包含了双链寡siRNA的 双链寡结构，和/或包含了双链寡结构的纳米颗粒。
虽然已详细地描述了本发明的具体特征，对于本领域内的技术人员来 说，显然该描述仅是对优选地实施方案的描述，而不限制本发明的范围。 因此，本发明的实质范围仅受所附权利要求及其等同物的限制。
序列目录Free Text
已附上电子文档。
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