一种利用苜蓿作为生物反应器生产鸡Β抗菌肽GAL3的方法.pdf

本发明公开了一种利用苜蓿作为生物反应器生产鸡β抗菌肽Gal-3的方法，属于植物转基因技术领域。本发明所述的含重组鸡β抗菌肽Gal-3的植物表达载体，将优化的β-Gal-3基因替换植物表达载体pCAMBIA3301上，获得含重组鸡β抗菌肽Gal-3的植物表达载体pCAMBIA330-Gal-3；一种利用苜蓿作为生物反应器生产鸡β抗菌肽Gal-3的方法，通过种植含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿植株，生产鸡β抗菌肽Gal-3。本发明所述的含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿植株可作为饲料添加剂应用。

1.  一种含重组鸡β抗菌肽Gal-3的植物表达载体，其特征在于：将编码氨基 酸按照紫花苜蓿密码子偏好性进行优化的β-Gal-3基因替换植物表达载体 pCAMBIA3301上NcoI和BstEII之间的GUS基因，获得含重组鸡β抗菌肽Gal-3的植 物表达载体pCAMBIA330-Gal-3；
所述的编码氨基酸按照紫花苜蓿密码子偏好性进行优化的β-Gal-3基因的基 因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.  一种含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿的制备方法，其特征在于：具 体步骤为通过农杆菌介导的遗传转化方法，将权利要求1所述的含重组鸡β抗 菌肽Gal-3的植物表达载体pCAMBIA330-Gal-3的T-DNA区域导入紫花苜蓿的叶 片，然后在筛选/再生培养基上筛选，获得抗性再生的含重组鸡β抗菌肽Gal-3 的转基因苜蓿植株。

3.  根据权利要求2所述的含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿的制备方法， 其特征在于：所述的筛选/再生培养基的配方为：MS培养基4.74g/L，蔗糖30g/L， 水解酪蛋白2g/L，2,4-D 2.00mg/L，KT 0.25mg/L，125mg/L cef，125mg/L carb， 1.5mg/L basta，pH＝5.8，琼脂粉8g/L。

4.  一种含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿植株由权利要求2或3所述的制 备方法获得。

5.  一种利用苜蓿作为生物反应器生产鸡β抗菌肽Gal-3的方法，其特征在 于：通过种植权利要求4所述的含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿植株，生产 鸡β抗菌肽Gal-3，获得含鸡β抗菌肽Gal-3的苜蓿。

6.  权利要求4所述的含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿植株作为饲料添 加剂应用。

一种利用苜蓿作为生物反应器生产鸡β抗菌肽Gal-3的方法
技术领域
本发明属于植物转基因技术领域，特别涉及一种利用苜蓿作为生物反应器 生产鸡β抗菌肽Gal-3的方法。
背景技术
抗微生物肽(antimicrobial peptides，AMPs)，又称抗菌肽(antibacterial  peptides；ABPs)或肽抗生素(peptide antibiotics)，是广泛存在于动物、植物以 及微生物体内的一类具有防卫功能的小分子活性肽，具有先天免疫功能，能够 对侵入体内的细菌、真菌、病毒及原虫等病原物产生抑制生长和灭活的作用。
鸡β抗菌肽的研究始于1994年，Harwig等和Evans等在鸡的白细胞发现4 种抗菌肽，命名为“gallinacins”(Gal-1、Gal-2、Gal-3和Gal-1α)。鸡β抗菌肽 不单具有抗细菌、霉菌、病毒、螺旋体活性，还具有抗肿瘤细胞毒性的功能， 并且参与了内源免疫和适应性免疫。由于禽类异嗜细胞没有氧化机制，所以β 防御素在禽类先天免疫方面发挥着更重要的作用。氧化机制涉及超氧化离子、 过氧化氢和髓过氧化物酶的作用，而非氧化机制仅由少数几种酶、阳离子蛋白 质和多肽完成。禽类异嗜细胞没有超氧化离子和髓过氧化物酶，它们更多地依 赖非氧化机制发挥作用，包括溶菌酶、阳离子蛋白质和多肽的作用。鸡β抗菌肽 就是一种阳离子多肽，所以说它是禽类的重要免疫因子。
豆科植物是人畜主要的植物蛋白质来源，紫花苜蓿是一种优良的豆科牧草， 素有“牧草之王”的美称，其适宜种植的范围广泛，能够耐受多种胁迫，且同 时兼具生物量大、再生性强、可多次收获等特质，因此是进行植物生物反应器 转基因研究与生产的理想受体材料。
发明内容
为克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种含 重组鸡β抗菌肽Gal-3的植物表达载体。
本发明的另一目的在于提供一种含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿的制 备方法。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法获得的含重组鸡β抗菌肽Gal-3的 转基因苜蓿植株。
本发明的另一目的在于提供一种利用苜蓿作为生物反应器生产鸡β抗菌肽 Gal-3的方法。
本发明的再一目的在于提供上述的含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿植 株在饲料添加剂中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种含重组鸡β抗菌肽Gal-3的植物 表达载体，将编码氨基酸按照紫花苜蓿密码子偏好性进行优化的β-Gal-3基因替换 植物表达载体pCAMBIA3301上NcoI和BstEII之间的GUS基因，获得含重组鸡β 抗菌肽Gal-3的植物表达载体pCAMBIA330-Gal-3；
所述的编码氨基酸按照紫花苜蓿密码子偏好性进行优化的β-Gal-3基因的基 因序列如SEQ ID NO.1所示；其编码的氨基酸的序列如SEQ ID NO.2所示。
一种含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿的制备方法，具体步骤为通过农 杆菌介导的遗传转化方法，将权利要求1所述的含重组鸡β抗菌肽Gal-3的植物 表达载体pCAMBIA330-Gal-3的T-DNA区域导入紫花苜蓿的叶片，然后在筛选/ 再生培养基上筛选，获得抗性再生的含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿植株。
所述的筛选/再生培养基的配方为：MS培养基4.74g/L，蔗糖30g/L，水解 酪蛋白2g/L，2,4-D 2.00mg/L，KT 0.25mg/L，125mg/L cef，125mg/L carb，1.5mg/L  basta，pH＝5.8，琼脂粉8g/L。
一种含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿植株由上述的制备方法获得。
一种利用苜蓿作为生物反应器生产鸡β抗菌肽Gal-3的方法，通过种植上述 的含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿植株，生产鸡β抗菌肽Gal-3，获得含鸡 β抗菌肽Gal-3的苜蓿。
上述获得的含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿植株作为饲料添加剂应 用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明利用紫花苜蓿作为生物反应器生产鸡β抗菌肽Gal-3的方法，利用农 杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化法把载体pCAMBIA330-Gal-3的T-DNA区域导入 紫花苜蓿的叶片，并对获得的3142株转基因植株进行筛选与鉴定，最终获得2 株单拷贝且高表达植株，经Elisa鉴定其表达的鸡β抗菌肽Gal-3约占可溶性总蛋 白的0.17％和0.26％。经截留分子量为3K和10k的聚醚砜膜超滤离心后获得了 分子量约为8KDa的鸡β抗菌肽Gal-3，体外抗菌活性鉴定表明其能够显著抑制 金色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门氏菌生长。将转β-Gal-3基因的紫花苜 蓿作为食料添加剂饲喂小鼠，其平均体重较饲喂非转基因的的紫花苜蓿作为食 料添加剂的小鼠明显增高，但肠道菌群无明显变化。
附图说明
图1是植物表达载体pCAMBIA330-Gal-3的结构图。
图2是农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化流程图；其中，A为预培养，B为愈伤 组织的侵染，C为胚状体的筛选，D为分化培养，E为生根培养。
图3是紫花苜蓿转基因植株的southern杂交结果图；其中，M为trans15K DNA 分子量，+为阳性质粒，-为阴性植株，1为转化事件A91，2为转化事件A375，3， 为转化事件C19，4为转化事件D57，5为转化事件E245。
图4是单拷贝紫花苜蓿转基因植株的蛋白检测结果图；其中，M为Blue Plus II 蛋白标准，-为阴性植株，1为转化事件A91，2为转化事件A375，3，为转化事件 C19，4为转化事件D57，5为转化事件E245。
图5是紫花苜蓿转β-Gal-3基因植株抑菌活性实验结果图；其中，A为紫花苜 蓿生产的鸡β抗菌肽Gal-3对金色葡萄球菌的抑制效果；B为紫花苜蓿生产的鸡β 抗菌肽Gal-3对大肠埃希氏菌的抑制效果；C为紫花苜蓿生产的鸡β抗菌肽Gal-3 对伤寒沙门氏菌的抑制效果。
图6是紫花苜蓿表达的鸡β抗菌肽Gal-3对小鼠肠道菌群的影响图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方 式不限于此。
实施例1：植物表达载体pCAMBIA330-Gal-3的构建
根据紫花苜蓿密码子偏好性在保持氨基酸序列(见序列表SEQ ID NO.2) 不发生改变的前提下进行基因序列的优化设计，获得SEQ ID NO.1所示的金银序 列，并在基因两端添加便于进行载体构建的酶切位点(NcoI和BstEII)，该片段 经NcoI和BstEII双酶切后与用相同酶切的pCAMBIA3301质粒所释放的大片段进 行连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞后在含有卡那霉素的LB固体培养基 上进行筛选，挑取阳性克隆并进行确认序列正确后，命名为pCAMBIA330-Gal-3 (见图1)。
实施例2：农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化
2.1培养基：
2.1.1细菌培养基：
YEB液体培养基(1L)：5g牛肉膏，1g胰蛋白胨，1g酵母提取物，5g/L蔗 糖，PH为7.4；灭菌后加MgSO₄至终浓度为2mM；100mM MgSO₄溶液，高温灭 菌后用。
YEB固体培养基：YEB液体培养基中加入1.5％的琼脂粉。
2.1.2植物组织培养培养基
侵染培养基(1L)：MS培养基4.74g，蔗糖30g pH＝5.6。
预培养/共培养培养基(1L)：MS培养基4.74g，蔗糖30g，水解酪蛋白2g/L， 2,4-D 2.00mg/L,KT 0.25mg/L,pH＝5.8。
抑菌培养基(1L)：MS培养基4.74g，蔗糖30g，水解酪蛋白2g/L，2,4-D 2.00 mg/L，KT 0.25mg/L，125mg/L cef，125mg/L carb，pH＝5.8,琼脂粉8g/L。
筛选/再生培养基(1L)：MS培养基4.74g，蔗糖30g，水解酪蛋白2g/L，2,4-D 2.00mg/L，KT 0.25mg/L，125mg/L cef，125mg/L carb，1.5mg/L basta，pH＝5.8, 琼脂粉8g/L。
萌发/生根培养基(MSO培养基1L)：MS培养基4.74g，蔗糖30g，2mg/L basta， pH＝5.8。
2.2操作步骤
2.2.1预培养：
将苜蓿叶片用手术刀或手术剪切或剪成两半，接种到预培养培养基上，培养 室光照培养7天(见图2A)。
同时准备好用于浸染的工程菌菌液，将带有目标载体的EHA105农杆菌分别 涂在含有50mg/L rifampicin、50mg/L kanamcin，pH7.0的YEB平板上活化，挑取 单菌落，用YEB液体培养基培养至OD600值在0.6-1.0之间，收集菌体，用浸染培 养基重悬至OD600值为1.0。
2.2.2转化
将与培养后的外植体放入农杆菌浸染液中浸泡10min。弃去菌液，放到共培 养培养基上，暗培养3天(见图2B)。
2.2.3抑菌：
共培养后，把外植体用含有250mg/L cef,250mg/L carb的MSO培养基洗涤3 次，用无菌滤纸吸干，接种到抑菌培养基上，光培养(16小时光照8小时黑暗) 7天。
2.2.4筛选、再生：
把外植体转移到筛选/再生培养基上筛选，每两周继代一次(见图2C)。
2.2.5萌发、生根：
待胚状体长到1cm左右(通常会自己从胚状体丛上脱落)，将其接种到萌发 培养基萌发(见图2D)。约20天后，胚状体萌发获得再生苗，将再生苗切下，接 种到生根培养基上生根(见图2E)。
实施例3：转Gal-3基因紫花苜蓿高表达植株的筛选
将转Gal-3基因紫花苜蓿植株的叶片剪下，在液氮中研磨成粉末，按1：2 (W/V)比例加入PBS缓冲液(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L  Na₂HPO₄，2mmol/L KH₂PO4)，冰浴至完全融化。漩涡30sec；4℃、15000r/min 离心20min，取上清即为总可溶性蛋白。
将提取的叶片总蛋白用包被液稀释100倍。鸡β抗菌肽Gal-3蛋白标准样用包 被液(1.59g/L Na₂CO₃，2.93g/L Na₂CO₃)稀释至2,500、1,250、625、312、156、 78、39pg/mL(绘制标准曲线)。分别取100μl于酶标板中，4℃包被过夜；第二 天倒掉样品溶液，用PBST缓冲液[含1％(V/V)Tween20的PBS]洗涤3次，每次 4min；加入封闭液[含10％(M/V)脱脂奶粉的PBS]150μl，37℃封闭2h；倒掉封 闭液，按上述方法洗涤后加入100μl用封闭液稀释的一抗(鼠抗鸡β抗菌肽Gal-3) 工作液，37℃包被1h；倒掉一抗工作液，如前述方法洗涤，加入100μl用封闭液 稀释的二抗(羊抗鼠)，包被1h；倒掉二抗工作液，如前法洗涤，加入显色剂100μl， 室温暗光反应15min；加入50μl 2mol/L H₂SO₄终止反应。并将在酶标仪上读取的 450nm吸光值代入标准曲线计算出对应样品中纤维细胞生长因子的含量。根据不 同浓度蛋白标准样的吸光值绘制标准曲线，当标准曲线的R²>0.98时，计算出对 应样品中鸡β抗菌肽Gal-3蛋白含量。
根据Elisa检测结果从3142株转基因植株中选择β抗菌肽Gal-3表达量最高的 5株，其表达的鸡β抗菌肽Gal-3约占可溶性总蛋白的0.07％(A91)、0.17％(A375)、 0.26％(C19)、0.04％(D57)和0.05％(E245)。
实施例4：转Gal-3基因紫花苜蓿高表达植株的拷贝数分析
将5株转Gal-3基因紫花苜蓿高表达植株的叶片剪下，在液氮中研磨成粉末 用CTAB法提取总DNA。取10μg DNA用EcoRI酶切，0.8％琼脂凝胶80V电泳3个 小时后转移到硝酸纤维素膜上，紫外交联两次，每次30秒，间隔2分钟。按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I试剂盒提供的方法进行 Southern blot分析，杂交探针为35S Promoter、β-Gal-3、NOS terminater之间大小 为0.8kb的DNA片段和Trans15KMarker。杂交结果如图3所示，除转化事件D57 以外的所有转化事件均为单拷贝转基因植株。
实施例5：转β-Gal-3基因紫花苜蓿高表达植株的表达分析和鸡β抗菌肽分离 纯化
将野生型紫花苜蓿和转β-Gal-3基因紫花苜蓿植株的叶片剪下，在液氮中研 磨成粉末，按1：2(W/V)比例加入PBS缓冲液(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl， 10mmol/L Na₂HPO₄，2mmol/L KH₂PO₄)，冰浴至完全融化。漩涡30sec；4℃、 15000r/min离心20min，取上清即为总可溶性蛋白。
取10μl蛋白溶液与等量2×上样缓冲液混合，沸水温浴5min，后进行16.5％ Tricine-SDS-PAGE电泳检测，并用考马斯亮蓝R250染色。并将相同条件下未进 行考马斯亮蓝R250染色的凝胶在200mA恒定电流条件下通过半干转膜仪转印到 0.2μm的尼龙膜上，用PBST缓冲液[含1％(V/V)Tween20的PBS]洗涤6次，每次 5min；加入封闭液[含10％(M/V)脱脂奶粉的PBS]100mL，37℃封闭2h；倒掉 封闭液，按上述方法洗涤后加入100mL用封闭液稀释的一抗(鼠抗鸡β抗菌肽 Gal-3)工作液，37℃包被1h；倒掉一抗工作液，如前述方法洗涤，加入100mL 用封闭液稀释的二抗(碱性磷酸酶标记、羊抗鼠)，包被1h；倒掉二抗工作液， 如前法洗涤，加入10mL显色剂BCIP/NBT，室温暗光反应直至出现预期杂交信号 强度后，用50ml双蒸水或TE缓冲液洗膜5min，以终止反应。Western再叫结果如 图4所示。
将总可溶性蛋白经0.22μm滤膜抽滤后，置于截流分子量为10KD的超滤离 心管中4000g离心15min，取流出液再置于截流分子量为3KD的超滤离心管中 5000g离心60min后，截留部分液体即为鸡β抗菌肽Gal-3纯化。经Elisa检测结果表 明其中鸡β抗菌肽Gal-3纯度达到90％以上，纯化效率大于40％。
实施例6：转基因紫花苜蓿表达的鸡β抗菌肽Gal-3的抑菌活性分析
将待测菌液调整浓度为10⁶个/ml后取1mL涂布在LB固体培养基平皿上，并用 打孔器将1mm厚滤纸打成直径5mm的圆盘，将其分别浸泡在提取的野生型紫花 苜蓿总蛋白和不同单拷贝转化事件的转基因植株的总蛋白中，取出后置于涂满 金色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门氏菌的LB固体培养基平皿上，37℃过 夜培养，观察抑菌环，结果如图5所示，不同单拷贝转化事件的转基因紫花苜蓿 表达的鸡β抗菌肽Gal-3均能对三种细菌产生抑制效果。
将经纯化后的鸡β抗菌肽Gal-3配置成为一定储存液以备使用。利用平板计数 法测定几种抗菌肽的最小杀菌浓度。以10mM磷酸钠溶液(pH 7.4)作为稀释 液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μl置于 96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(10⁶个/ml)于各孔中。37℃ 恒温培养12h。然后将细胞培养板置于酶标仪上测定OD600吸光值，吸光值越小 说明抑菌效果越好，依此测定紫花苜蓿生产的鸡β抗菌肽Gal-3对不同细菌的最小 杀菌浓度(MIC)。实验结果表明利用紫花苜蓿生产的鸡β抗菌肽Gal-3对金色葡萄 球菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门氏菌的最小抑菌浓度依此为：4、2、16μM。
实施例7：转基因紫花苜蓿表达的鸡β抗菌肽Gal-3的小鼠实验
将野生型紫花苜蓿和转鸡β抗菌肽Gal-3基因紫花苜蓿按照1:250(M/M)的 比例添加到小鼠饲料中，经30天饲喂试验结果表明，饲料中添加了转鸡β抗菌肽 Gal-3基因紫花苜蓿的小鼠体重较对照组平均增加0.428±0.162g/天，而饲料中添 加了野生型紫花苜蓿的小鼠体重较对照组仅平均增加0.167±0.085g/天。
分别将含有16μM鸡β抗菌肽Gal-3与16μM卡那霉素的无菌水作为两组试验 用小鼠的饮用水，一周后比较肠道菌群。肠道菌群计数结果如图6所示，饮用水 中添加鸡β抗菌肽Gal-3组的小鼠肠道菌群较对照组无明显变化，而饮用水中添加 卡那霉素组的小鼠肠道菌群出现了较大变化，尤其是在其作用下加白。因此， 可以认为转鸡β抗菌肽Gal-3基因紫花苜蓿植株和由其表达的鸡β抗菌肽Gal-3具 有替代传统抗生素作为饲料添加剂的潜力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。