一种基于磁性微球的左氧氟沙星表面印迹材料的制备方法.pdf

本发明涉及一种基于磁性微球的左氧氟沙星表面印迹材料的制备方法。制备过程主要包括三个步骤：磁性微球的制备，分子印迹材料在微球上的包覆以及模板分子的洗脱。本发明提供的合成方法较为简便，制得的磁性微球表面分子印迹材料对左氧氟沙星具有特异识别功能、高吸附容量、快速吸附能力和对氧氟沙星手性拆分的能力，并且应有良好的磁性响应和高机械强度，不仅可用于各种固相萃取装置的吸附填料或涂层材料，亦可用于分子印迹传感器及芯片的制备，对沙星类药物特异性识别、手性拆分和高灵敏度检测研究将具有重要意义。

1.  一种基于磁性微球的左氧氟沙星表面印迹材料的制备方法，其特征在于制备步骤为：
a.磁性微球的制备：三氯化铁、乙酸钠和丙烯酸钠加入由乙二醇和二乙二醇组成的混合溶剂中，超声1h得到黄色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应，反应结束后冷却至室温，用甲醇和水洗数次，于60℃真空干燥至恒重，备用；
b.将模板分子、功能单体加入反应溶剂中混合，振荡2h，得到预组装溶液，备用；
c.将步骤b制得的磁性微球加入反应溶剂中超声分散，加入步骤b制得的预组装溶液、交联剂和引发剂，超声分散，然后倒入含分散剂聚乙烯吡咯烷酮的溶剂中，机械搅拌下通N₂除氧，60℃下反应；
d.反应结束后磁场分离除去上清液，磁性纳米粒子用体积比为9∶1的甲醇/乙酸混合溶液反复超声洗涤，直至上清液经紫外检测不到模板分子为止，于60℃真空干燥至恒重，得到磁性微球表面分子印迹材料。

2.  据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤a中三氯化铁的摩尔浓度为0.05～0.5mol/L，乙二醇和二乙二醇的比例为1∶5～5∶1，反应时间为4～24h。

3.  根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤b中，模板分子为喹诺酮类药物左氧氟沙星(1evofloxacin)，功能单体为甲基丙烯酸、丙烯酸、2-乙烯基吡啶、4-乙烯基吡啶和丙烯酰胺；溶剂为甲苯、氯仿、乙腈、二甲基亚砜和水；模板分子和功能单体的摩尔比为1∶1～1∶10。

4.  根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤c中，交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯，模板分子和交联剂的摩尔比为1∶5～1∶40；引发剂为偶氮二异丁腈，引发剂用量为功能单体和交联剂双键质量总量的0.02％～0.5％，反应时间为6-36h。

一种基于磁性微球的左氧氟沙星表面印迹材料的制备方法
技术领域
本发明属于新材料科学领域，特别涉及一种基于磁性微球的表面印迹材料的制备方法，该印迹材料可对左氧氟沙星进行特异性识别。
背景技术
为克服生物大分子识别过程的种种缺点，人们根据对生物大分子识别过程专一性的认识，合成了具有分子识别能力的人工合成聚合物材料——分子印迹聚合物(MIPs)，以分离、纯化化合物。因为分子印迹聚合物具有构效预定性、特异识别性和广泛适用性三大特点，且拥有对严苛的化学环境显惰性、稳定性好、使用寿命长等优点，其在分离提纯、生物传感器、免疫分析以及模拟酶等方面均显示出巨大潜力，逐渐成为分析工作者研究的热点。
目前，诸如本体聚合、原位聚合、悬浮聚合、分散聚合等多种制备方法已广泛应用。然而，以上数种传统方法制得的印迹聚合物有效印迹位点的密度很低，因此制得的材料对目标分子的结合容量小，结合速度慢。基于纳米结构的分子印迹材料则具有较高的比表面积，印迹材料上大多结合位点位于或接近材料表面，对目标分子具有高亲和力，可对其快速吸附，有望解决上述传统分子印迹遇到的难题。
左氧氟沙星作为喹诺酮类(quinolone)抗菌剂的一种，具有4-喹诺酮基本结构，可对细菌DNA螺旋酶进行选择性抑制，目前被广泛应用于临床。基于药代动力学研究、药物不良反应研究、环境监测的需要，急需建立复杂基质中(如血样、尿样)中痕量左氧氟沙星的分析方法。传统的固相萃取材料和色谱填料简化了分析过程，但仍存在诸多缺陷，比如特异选择性低、操作复杂费时，难以满足当下快速高效的检测需求，新型的载体和涂层材料的研究成为复杂基质中痕量左氧氟沙星监测分析的关键。
作为一种新型的纳米材料，磁性微球本质上是具有磁性的纳米-微米级粒子，其中以四氧化三铁纳米粒子为代表，在很多领域具有广泛的应用价值。将磁性微球作为基质，开发新型的分子印迹材料，可解决传统分子印迹技术遇到的困难：(1)磁性微球具有高机械强度和抗形变力，所以磁性微球表面印迹材料能够克服传统印迹材料的溶胀效应导致的印迹空间形状变形、识别位点移动等缺点，这一特性不仅保证了识别位点和印迹三维孔穴的构型稳定，而且可使其作为HPLC固定相时能够耐高压，具有较高的柱效；(2)磁性微球具有较高的比表面积，使得大量的识别位点处于印迹层的表面，模板分子的去除和再结合将变得非常容易， 从而加快合成后的模板清洗过程，同时避免分析时的模板泄漏现象，更可大大提高了印迹效率；(3)磁性微球具有优异的磁性能，基于它的分子印迹材料可在外加磁场作用下，快速高效地与样品溶液分离。当此种材料用于样品富集时，不需要进行过滤、离心等耗时复杂的前处理过程。当其应用于微通道领域时，磁性微球作为固定相在外加磁场作用下，可以定位在管道中的指定区域，从而方便地调节其填充长度以达到最佳拆分效果，还可以在使用后通过撤除外加磁场进行微通道的重复利用。这在构型复杂，通道曲折的微芯片电色谱领域中具有独特的应用前景。
发明内容
技术问题：
本发明的目的是克服传统分子印迹材料的缺点，提供一种新型磁性微球表面分子印迹材料的制备方法，利用该方法制备出的印迹材料应对左氧氟沙星具有特异识别功能、高吸附容量和快速吸附能力并且应有良好的磁性响应和高机械强度，从而实现对左氧氟沙星高选择性的分离富集和高灵敏度的检测。
技术方案：
1.本发明的技术解决方案为：
a.磁性微球的制备：三氯化铁、乙酸钠和丙烯酸钠加入由乙二醇和二乙二醇组成的混合溶剂中，超声1h得到黄色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应，反应结束后冷却至室温，用甲醇和水洗数次，于60℃真空干燥至恒重，备用；
b.将模板分子、功能单体加入反应溶剂中混合，振荡2h，得到预组装溶液，备用；
c.将步骤a制得的磁性微球加入反应溶剂中超声分散，加入步骤b制得的预组装溶液、交联剂和引发剂，超声分散，然后倒入含分散剂聚乙烯吡咯烷酮的溶剂中，机械搅拌下通N₂除氧，60℃下反应。
d.反应结束后磁场分离除去上清液，磁性纳米粒子用体积比为9∶1的甲醇/乙酸混合溶液反复超声洗涤，直至上清液经紫外检测不到模板分子为止，于60℃真空干燥至恒重，得到磁性微球表面分子印迹材料。
2.据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤a中三氯化铁的摩尔浓度为0.05～0.5mol/L，乙二醇和二乙二醇的比例为1∶5～5∶1，反应时间为4～24h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤b中，模板分子为喹诺酮类药物左氧氟沙星(1evofloxacin)，功能单体为甲基丙烯酸、丙烯酸、2-乙烯基吡啶、4-乙烯基吡啶和丙烯酰胺；溶剂为甲苯、氯仿、乙腈、二甲基亚砜和水；模板分子和功能单体的 摩尔比为1∶1～1∶10。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤c中，交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯，模板分子和交联剂的摩尔比为1∶5～1∶40；引发剂为偶氮二异丁腈，引发剂用量为功能单体和交联剂双键质量总量的0.02％～0.5％，反应时间为6～36h。
附图说明
图1是本发明制备的磁性微球表面分子印迹材料的合成路线示意图。
图2是本发明制得磁性纳米粒子表面分子印迹材料和非印迹材料的饱和吸收曲线。
具体实施方案
一、制备实例
以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。
实施例1
2.4g三氯化铁、3.4g乙酸钠和3.4g丙烯酸钠加入由33.75mL乙二醇和11.25mL二乙二醇组成的混合溶剂中，超声1h得到黄色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应10h，反应结束后冷却至室温，用甲醇和水洗数次，于60℃真空干燥至恒重，备用；
将1mmol左氧氟沙星、4mmol甲基丙烯酸加入10mL二甲基亚砜中混合，振荡2h，得到预组装溶液，备用；
将1.0g上述制得的磁性微球加入4mL二甲基亚砜中超声分散，加入上述制得的预组装溶液、20mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和50mg偶氮二异丁腈，超声分散30min，然后倒入含0.4g聚乙烯吡咯烷酮的二甲基亚砜/水(体积比9∶1)混合溶剂中，机械搅拌下通N₂除氧，60℃下反应。
反应结束后磁场分离除去上清液，磁性纳米粒子用体积比为9∶1的甲醇/乙酸混合溶液反复超声洗涤，直至上清液经紫外检测不到模板分子为止，于60℃真空干燥至恒重，得到磁性微球表面分子印迹材料。
实施例2
2.4g三氯化铁、3.4g乙酸钠和3.4g丙烯酸钠加入由33.75mL乙二醇和11.25mL二乙二醇组成的混合溶剂中，超声1h得到黄色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应10h，反应结束后冷却至室温，用甲醇和水洗数次，于60℃真 空干燥至恒重，备用；
将1mmol左氧氟沙星、4mmol甲基丙烯酸加入10mL二甲基亚砜中混合，振荡2h，得到预组装溶液，备用；
将1.0g上述制得的磁性微球加入4mL二甲基亚砜中超声分散，加入上述制得的预组装溶液、20mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和50mg偶氮二异丁腈，超声分散30min，然后倒入含0.4g聚乙烯吡咯烷酮的二甲基亚砜中，机械搅拌下通N₂除氧，60℃下反应。
反应结束后磁场分离除去上清液，磁性纳米粒子用体积比为9∶1的甲醇/乙酸混合溶液反复超声洗涤，直至上清液经紫外检测不到模板分子为止，于60℃真空干燥至恒重，得到磁性微球表面分子印迹材料。
实施例3
2.4g三氯化铁、3.4g乙酸钠和3.4g丙烯酸钠加入由33.75mL乙二醇和11.25mL二乙二醇组成的混合溶剂中，超声1h得到黄色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应10h，反应结束后冷却至室温，用甲醇和水洗数次，于60℃真空干燥至恒重，备用；
将1mmol左氧氟沙星、4mmol丙烯酸加入10mL二甲基亚砜中混合，振荡2h，得到预组装溶液，备用；
将1.0g上述制得的磁性微球加入4mL二甲基亚砜中超声分散，加入上述制得的预组装溶液、20mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和50mg偶氮二异丁腈，超声分散30min，然后倒入含0.4g聚乙烯吡咯烷酮的二甲基亚砜/水(体积比9∶1)混合溶剂中，机械搅拌下通N₂除氧，60℃下反应。
反应结束后磁场分离除去上清液，磁性纳米粒子用体积比为9∶1的甲醇/乙酸混合溶液反复超声洗涤，直至上清液经紫外检测不到模板分子为止，于60℃真空干燥至恒重，得到磁性微球表面分子印迹材料。
实施例4
2.4g三氯化铁、3.4g乙酸钠和3.4g丙烯酸钠加入由33.75mL乙二醇和11.25mL二乙二醇组成的混合溶剂中，超声1h得到黄色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应10h，反应结束后冷却至室温，用甲醇和水洗数次，于60℃真空干燥至恒重，备用：
将1mmol左氧氟沙星、4mmol2-乙烯基吡啶加入10mL二甲基亚砜中混合，振荡2h，得到预组装溶液，备用；
将1.0g上述制得的磁性微球加入4mL二甲基亚砜中超声分散，加入上述制得的预组装溶液、20mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和50mg偶氮二异丁腈，超声分散30min，然后倒入含0.4g聚乙烯吡咯烷酮的二甲基亚砜/水(体积比9∶1)混合溶剂中，机械搅拌下通N₂除氧，60℃下反应。
反应结束后磁场分离除去上清液，磁性纳米粒子用体积比为9∶1的甲醇/乙酸混合溶液反复超声洗涤，直至上清液经紫外检测不到模板分子为止，于60℃真空干燥至恒重，得到磁性微球表面分子印迹材料。
实施例5
2.4g三氯化铁、3.4g乙酸钠和3.4g丙烯酸钠加入由33.75mL乙二醇和11.25mL二乙二醇组成的混合溶剂中，超声1h得到黄色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应10h，反应结束后冷却至室温，用甲醇和水洗数次，于60℃真空干燥至恒重，备用；
将1mmol左氧氟沙星、4mmol4-乙烯基吡啶加入10mL二甲基亚砜中混合，振荡2h，得到预组装溶液，备用；
将1.0g上述制得的磁性微球加入4mL二甲基亚砜中超声分散，加入上述制得的预组装溶液、20mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和50mg偶氮二异丁腈，超声分散30min，然后倒入含0.4g聚乙烯吡咯烷酮的二甲基亚砜/水(体积比9∶1)混合溶剂中，机械搅拌下通N₂除氧，60℃下反应。
反应结束后磁场分离除去上清液，磁性纳米粒子用体积比为9∶1的甲醇/乙酸混合溶液反复超声洗涤，直至上清液经紫外检测不到模板分子为止，于60℃真空干燥至恒重，得到磁性微球表面分子印迹材料。
实施例6
2.4g三氯化铁、3.4g乙酸钠和3.4g丙烯酸钠加入由33.75mL乙二醇和11.25mL二乙二醇组成的混合溶剂中，超声1h得到黄色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应10h，反应结束后冷却至室温，用甲醇和水洗数次，于60℃真空干燥至恒重，各用：
将1mmol左氧氟沙星、4mmol甲基丙烯酸加入10mL氯仿中混合，振荡2h，得到预组装溶液，备用；
将1.0g上述制得的磁性微球加入4mL氯仿中超声分散，加入上述制得的预组装溶液、20mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和50mg偶氮二异丁腈，超声分散30min，然后倒入含0.4g聚乙烯吡咯烷酮的氯仿中，机械搅拌下通N₂除氧，60℃下反应。
反应结束后磁场分离除去上清液，磁性纳米粒子用体积比为9∶1的甲醇/乙酸混合溶液反复超声洗涤，直至上清液经紫外检测不到模板分子为止，于60℃真空干燥至恒重，得到磁性微球表面分子印迹材料。
实施例7
2.4g三氯化铁、3.4g乙酸钠和3.4g丙烯酸钠加入由33.75mL乙二醇和11.25mL二乙二醇组成的混合溶剂中，超声1h得到黄色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应10h，反应结束后冷却至室温，用甲醇和水洗数次，于60℃真空干燥至恒重，备用；
将1mmol左氧氟沙星、4mmol甲基丙烯酸加入10mL乙腈中混合，振荡2h，得到预组装溶液，备用；
将1.0g上述制得的磁性微球加入4mL乙腈中超声分散，加入上述制得的预组装溶液、20mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和50mg偶氮二异丁腈，超声分散30min，然后倒入含0.4g聚乙烯吡咯烷酮的乙腈中，机械搅拌下通N₂除氧，60℃下反应。
反应结束后磁场分离除去上清液，磁性纳米粒子用体积比为9∶1的甲醇/乙酸混合溶液反复超声洗涤，直至上清液经紫外检测不到模板分子为止，于60℃真空干燥至恒重，得到磁性微球表面分子印迹材料。
实施例8
2.4g三氯化铁、3.4g乙酸钠和3.4g丙烯酸钠加入由33.75mL乙二醇和11.25mL二乙二醇组成的混合溶剂中，超声1h得到黄色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应10h，反应结束后冷却至室温，用甲醇和水洗数次，于60℃真空干燥至恒重，备用；
将1mmol左氧氟沙星、6mmol甲基丙烯酸加入10mL二甲基亚砜中混合，振荡2h，得到预组装溶液，备用；
将1.0g上述制得的磁性微球加入4mL二甲基亚砜中超声分散，加入上述制得的预组装溶液、20mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和50mg偶氮二异丁腈，超声分散30min，然后倒入含0.4g聚乙烯吡咯烷酮的二甲基亚砜/水(体积比9∶1)混合溶剂中，机械搅拌下通N₂除氧，60℃下反应。
反应结束后磁场分离除去上清液，磁性纳米粒子用体积比为9∶1的甲醇/乙酸混合溶液反复超声洗涤，直至上清液经紫外检测不到模板分子为止，于60℃真空干燥至恒重，得到磁性微球表面分子印迹材料。
实施例9
2.4g三氯化铁、3.4g乙酸钠和3.4g丙烯酸钠加入由33.75mL乙二醇和11.25mL二乙二醇组成的混合溶剂中，超声1h得到黄色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应10h，反应结束后冷却至室温，用甲醇和水洗数次，于60℃真空干燥至恒重，备用；
将1mmol左氧氟沙星、4mmol甲基丙烯酸加入10mL二甲基亚砜中混合，振荡2h，得到预组装溶液，备用；
将1.0g上述制得的磁性微球加入4mL二甲基亚砜中超声分散，加入上述制得的预组装溶液、15mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和50mg偶氮二异丁腈，超声分散30min，然后倒入含0.4g聚乙烯吡咯烷酮的二甲基亚砜/水(体积比9∶1)混合溶剂中，机械搅拌下通N₂除氧，60℃下反应。
反应结束后磁场分离除去上清液，磁性纳米粒子用体积比为9∶1的甲醇/乙酸混合溶液反复超声洗涤，直至上清液经紫外检测不到模板分子为止，于60℃真空干燥至恒重，得到磁性微球表面分子印迹材料。
实施例10
2.4g三氯化铁、3.4g乙酸钠和3.4g丙烯酸钠加入由33.75mL乙二醇和11.25mL二乙二醇组成的混合溶剂中，超声1h得到黄色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应10h，反应结束后冷却至室温，用甲醇和水洗数次，于60℃真空干燥至恒重，备用；
将1mmol左氧氟沙星、4mmol甲基丙烯酸加入10mL二甲基亚砜中混合，振荡2h，得到预组装溶液，备用；
将1.0g上述制得的磁性微球加入4mL二甲基亚砜中超声分散，加入上述制得的预组装溶液、20mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯和50mg偶氮二异丁腈，超声分散30min，然后倒入含0.4g聚乙烯吡咯烷酮的二甲基亚砜/水(体积比8∶2)混合溶剂中，机械搅拌下通N₂除氧，60℃下反应。
反应结束后磁场分离除去上清液，磁性纳米粒子用体积比为9∶1的甲醇/乙酸混合溶液反复超声洗涤，直至上清液经紫外检测不到模板分子为止，于60℃真空干燥至恒重，得到磁性微球表面分子印迹材料。
二、本发明制备的磁性微球表面分子印迹材料的结合动力学实验
实验器材：美国安捷伦公司的1200型高效液相色谱仪。
实验方法：配制一定浓度的加替沙星溶液，取等量的MIPs和NIP作为吸附剂，使用高效液相色谱测定不同吸附时间后的上清液的浓度，计算复合材料对底物的吸附量Q(μg/mg)。计算公式为：Q＝(C₀-C₁)V/m
其中C₀表示吸附前溶液中模板的浓度(μg/mL)；C₁表示吸附后溶液中模板的浓度(μg/mL)；V表示溶液的体积(mL)；m表示加入的分子印迹聚合物的质量(mg)。
具体实施步骤如下：
精密称取5.0mg实施例1制备的MIPs和NIP，分别置于2mL的离心管中，加入2mL浓度为200ug/mL的左氧氟沙星溶液，室温下振荡，于0.1、0.2、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8h取出，磁场分离，取上清液用高效液相色谱仪测定其峰面积，依据标准曲线计算不同吸附时间加替沙星的浓度，计算聚合物对底物的结合量Q。
三、本发明制备的磁性微球表面分子印迹材料的吸附等温实验
实验器材：美国安捷伦公司的1200型高效液相色谱仪。
实验方法：配制一系列不同浓度的加替沙星溶液，取等量的MIPs和NIP作为吸附剂吸附2h，离心后，紫外可见分光光度法测定上清液的浓度，计算分子印迹聚合物饱和结合量Q(μg/mg)。计算公式为：Q＝(C₀-C₁)V/m
其中C₀表示吸附前溶液中模板的浓度(μg/mL)；C₁表示吸附后溶液中模板的浓度(μg/mL)；V表示溶液的体积(mL)；m表示加入的分子印迹聚合物的质量(mg)。
通过吸附等温线，绘制Scatchard曲线。Scatchard方程可表示为：Q/C＝(Q_max-Q)/K_d
其中，K_d(μg/mL)为结合位点的平衡离解常数；Q_max(μg/mg)是结合点的最大表观结合量，Q(μg/mg)为MIPs的单位结合量；C(μg/mL)是模板在吸附液中的平衡浓度。
具体实施步骤如下：
精密称取5.0mg实施例1制备的MIPs，分别置于2ml的离心管中，加入2mL不同初始浓度的加替沙星溶液，浓度范围为：100～5001μg/mL。室温下振荡2h达到吸附平衡后，磁场分离，取上清液用高效液相色谱仪测定其峰面积，依据标准曲线计算不同吸附时间加替沙星的浓度，计算聚合物饱和结合量Q。
四、本发明制备的磁性微球表面分子印迹聚合物的选择性实验
实验器材：美国安捷伦公司的1200型高效液相色谱仪。
实验方法：选择与氧氟沙星具有相似结构的化合物作为对照底物，对比MIPs和NIP对不同底物的吸附情况，采用饱和结合量Q来表征MIPs和NIP对氧氟沙星及对照底物的分子识别特性。
具体实施步骤如下：
精密称取5.0mg实施例1制备的MIPs和NIP，分别置于2ml的离心管中，加入2mL一定浓度的氧氟沙星、加替沙星、环丙沙星溶液。室温下振荡2h达到吸附平衡后，磁场分离，取上清液用紫外分光光度计测定其吸光度，计算分子印迹聚合物饱和结合量Q。