乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备方法.pdf

本发明公开了一种乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备方法，该方法利用氨基酸处理连接了配基的吸附微球，使其上的配基结合更牢固，降低了乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂脱落的几率和速率，提高了乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂在应用时的安全性。

1.  一种乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备方法，包括以下 步骤：
1)准备与乙型肝炎病毒表面蛋白亲和的配基，及作为载体的 微球；
2)活化微球表面基团；
3)利用交联剂使所述配基结合在微球上，得到吸附微球；
4)在溶液环境下，向吸附微球中添加氨基酸，氨基酸添加重 量与配基的重量比大于2.5：1000，待氨基酸结合到吸附微球上后， 洗去多余的氨基酸，得到乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂。

2.  根据权利要求1所述乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备 方法，其特征在于：所述氨基酸选自赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、 蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸、甘氨酸中 一种或几种的混合。

3.  根据权利要求1所述乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备 方法，其特征在于：所述氨基酸为组氨酸:甘氨酸:赖氨酸＝1:2.1:0.5 的混合物，所述配基为钠离子牛磺胆酸共转运多肽，所述微球为琼 脂糖微球。

4.  根据权利要求1所述乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备 方法，其特征在于：所述步骤4)中，向吸附微球中添加氨基酸后， 使氨基酸结合到吸附微球上的条件为，于25～40℃的环境中，静置 含有吸附微球与氨基酸的溶液30分钟以上。

5.  根据权利要求1所述乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备 方法，其特征在于：所述步骤4)中，洗去多余的氨基酸所采用的 洗涤液为PBS。

乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体指一种乙型肝炎病毒表面蛋白 吸附剂的制备方法。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒科 (hepadnaviridae)，基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA。由 于中国乙肝病毒的状况严重，所以国家已经制定了疫苗注射制度。 但研究已表明，很多乙肝病毒具有“免疫逃逸”的性能，即具备感染 疫苗接种者的能力，导致疫苗的应用前景不容乐观。
研究发现，血液中的毒蛋白是乙型肝炎的主要致病因子，乙肝 毒蛋白介导乙肝病毒对于肝细胞的感染。现有技术中公开了一种乙 型肝炎抗原蛋白的吸附材料及其制备方法，该方法采用与乙型肝炎 病毒表面蛋白(HBsAg)亲和的多肽(配基)与微球相连，通过多 肽结合乙型肝炎病毒表面蛋白膜蛋白(HBsAg)，从而达到清除血 液中乙肝毒蛋白，降低病毒对于肝细胞感染的效果。
目前制备该类型吸附剂所常用的微球是琼脂糖微球、聚乙烯醇 微球、壳聚糖微球等，与微球相连的配基有多肽，蛋白等。在制作 微球时，有的微球会需要先用酸、碱预处理，然后采用试剂活化微 球表面，有的直接则是直接活化；然后再加入交联剂或者偶联剂连 接微球和配基，交联剂(偶联剂)上的功能基团如羟基和配基上的 氨基发生反应，使配基结合在微球上。但是这些吸附剂在使用中， 随着时间推移，会有不同程度的配基脱落发生，而且容易受到温度、 水流等环境影响，可能是由于配基与交联剂之间的结合发生了逆向 反应而脱落，当配基脱落后血液中，可能引起免疫反应，具有一定 的安全风险。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中制备的乙型肝炎病毒表面 蛋白吸附剂上配基容易脱落的缺陷，提供一种操作简单、能大幅度 提高配基结合牢固度的乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备方法。
为实现上述目的，本发明所设计的乙型肝炎病毒表面蛋白吸附 剂的制备方法，包括以下步骤：
1)准备与乙型肝炎病毒表面蛋白亲和的配基，及作为载体的 微球；
2)活化微球表面基团；
3)利用交联剂使所述配基结合在微球上，得到吸附微球；
4)在溶液环境下，向吸附微球中添加氨基酸，氨基酸添加重 量与配基的重量比大于2.5：1000，待氨基酸结合到吸附微球上后， 洗去多余的氨基酸，得到乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂。
优选地，所述氨基酸选自赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、 苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸、甘氨酸中一种或几 种的混合。小分子性质稳定的氨基酸均可以采用，实验结果显示混 合的氨基酸效果优于单一的氨基酸，特别是大小不均等的氨基酸组 合对配基的固定效果较好。
优选地，所述氨基酸为组氨酸:甘氨酸:赖氨酸＝1:2.1:0.5的混 合物，所述配基为钠离子牛磺胆酸共转运多肽，所述微球为琼脂糖 微球。
优选地，所述步骤4)中，向吸附微球中添加氨基酸后，使氨 基酸结合到吸附微球上的条件为，于25～40℃的环境中，静置含有 吸附微球与氨基酸的溶液30分钟以上。适宜的温度可以促进氨基 酸结合到微球上去。
优选地，所述步骤4)中，洗去多余的氨基酸所采用的洗涤液 为PBS。
本发明原理：微球经过处理活化后其上基团暴露通过交联剂与 配基相连，但是该连接受多种因素影响，加入的氨基酸起到了封闭 裸露基团的作用，对未参加反应的微球及交联剂上裸露的基团进行 共价结合的过程，可能也影响了配基上的功能基团与交联剂的结合 部位，加固了配基与交联剂之间的结合，使配基不容易从微球上脱 落。理论上，氨基酸封闭对多种配基都有效。
本发明的有益效果：通过采用氨基酸处理已连接了配基的吸附 微球，使其上的配基结合更牢固，降低了乙型肝炎病毒表面蛋白吸 附剂脱落的几率和速率，提高了乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂在应 用时的安全性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施 例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1
乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备方法，包括以下步骤：
1)制备与乙型肝炎病毒表面蛋白亲和的钠离子牛磺胆酸共转 运多肽(NTCP)及载体的琼脂糖微球；
NTCP及琼脂糖微球如何制备为已公开的现有技术，本申请中 不做赘述。
2)活化琼脂糖微球表面基团：在2L的反应器中加入琼脂糖微 球溶液600ml，2mol/L的NaOH水溶液400ml，混匀，加入乙二 醇双缩水甘油醚400ml后，置于恒温摇床中，在37℃反应1小时。 结束反应，将琼脂糖微球过滤，用大量蒸馏水冲洗至pH＝7，将活 化好的凝胶状琼脂糖微球储存在4℃备用。
3)将NTCP通过化学交联的方法连接到上琼脂糖微球上：
将琼脂糖微球凝胶200ml加入至0.3mol/L的硼酸缓冲液 600ml中，pH值控制在8.0～10.0范围内，加入3g NTCP，在37℃ 反应12小时，停止，回收未反应的NTCP，得到结合了配基的吸附 微球溶液。
4)向吸附微球溶液中添加赖氨酸，赖氨酸添加重量与配基的 重量比为1：200，静置2h，再用蒸馏水冲洗，洗去多余的氨基酸， 得到乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂1，保存在0.2mol/L pH＝7.4 的磷酸缓冲液中。
实施例2
乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备方法，包括以下步骤：
1)制备与乙型肝炎病毒表面蛋白亲和的钠离子牛磺胆酸共转 运多肽(NTCP)及载体的琼脂糖微球；
NTCP及琼脂糖微球如何制备为已公开的现有技术，本申请中 不做赘述。
2)活化琼脂糖微球表面基团：在2L的反应器中加入琼脂糖微 球溶液600ml，2mol/L的NaOH水溶液400ml，混匀，加入乙二 醇双缩水甘油醚400ml后，置于恒温摇床中，在37℃反应1小时。 结束反应，将琼脂糖微球过滤，用大量蒸馏水冲洗至pH＝7，将活 化好的凝胶状琼脂糖微球储存在4℃备用。
3)将NTCP通过化学交联的方法连接到上琼脂糖微球上：
将琼脂糖微球凝胶200ml加入至0.3mol/L的硼酸缓冲液 600ml中，pH值控制在8.0～10.0范围内，加入3g NTCP，在37℃ 反应12小时，停止，回收未反应的NTCP，得到结合了配基的吸附 微球溶液。
4)向吸附微球溶液中添加苯丙氨酸和异亮氨酸的混合物，混 合物为苯丙氨酸:异亮氨酸＝1:1，氨基酸添加重量与配基的重量比 为3：1000，于恒温30℃水浴箱上静置1小时，再用PBS(0.01M pH  8.0)洗3次，洗去多余的氨基酸，得到乙型肝炎病毒表面蛋白吸附 剂2，保存在0.2mol/L pH＝7.4的磷酸缓冲液中。
实施例3
乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备方法，包括以下步骤：
1)制备与乙型肝炎病毒表面蛋白亲和的钠离子牛磺胆酸共转 运多肽(NTCP)及载体的琼脂糖微球；
NTCP及琼脂糖微球如何制备为已公开的现有技术，本申请中 不做赘述。
2)活化琼脂糖微球表面基团：在2L的反应器中加入琼脂糖微 球溶液600ml，2mol/L的NaOH水溶液400ml，混匀，加入乙二 醇双缩水甘油醚400ml后，置于恒温摇床中，在37℃反应1小时。 结束反应，将琼脂糖微球过滤，用大量蒸馏水冲洗至pH＝7，将活 化好的凝胶状琼脂糖微球储存在4℃备用。
3)将NTCP通过化学交联的方法连接到上琼脂糖微球上：
将琼脂糖微球凝胶200ml加入至0.3mol/L的硼酸缓冲液 600ml中，pH值控制在8.0～10.0范围内，加入3g NTCP，在37℃ 反应12小时，停止，回收未反应的NTCP，得到结合了配基的吸附 微球溶液。
4)向吸附微球溶液中添加缬氨酸和组氨酸的混合物，混合物 为缬氨酸:组氨酸＝1:6，氨基酸添加重量与配基的重量比为2.5： 1000，静置3h，再用蒸馏水冲洗，洗去多余的氨基酸，得到乙型肝 炎病毒表面蛋白吸附剂3，保存在0.2mol/L pH＝7.4的磷酸缓冲 液中。
实施例4
乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备方法，包括以下步骤：
1)制备与乙型肝炎病毒表面蛋白亲和的钠离子牛磺胆酸共转 运多肽(NTCP)及载体的琼脂糖微球；
NTCP及琼脂糖微球如何制备为已公开的现有技术，本申请中 不做赘述。
2)活化琼脂糖微球表面基团：在2L的反应器中加入琼脂糖微 球溶液600ml，2mol/L的NaOH水溶液400ml，混匀，加入乙二 醇双缩水甘油醚400ml后，置于恒温摇床中，在37℃反应1小时。 结束反应，将琼脂糖微球过滤，用大量蒸馏水冲洗至pH＝7，将活 化好的凝胶状琼脂糖微球储存在4℃备用。
3)将NTCP通过化学交联的方法连接到上琼脂糖微球上：
将琼脂糖微球凝胶200ml加入至0.3mol/L的硼酸缓冲液 600ml中，pH值控制在8.0～10.0范围内，加入3g NTCP，在37℃ 反应12小时，停止，回收未反应的NTCP，得到结合了配基的吸附 微球溶液。
4)向吸附微球溶液中添加氨基酸混合物，混合物为组氨酸:甘 氨酸:赖氨酸＝1:2.1:0.5，氨基酸添加重量与配基的重量比为1：100， 于恒温30℃水浴箱上静置30分钟，再用PBS(0.01M pH 8.0)洗3 次，洗去多余的氨基酸，得到乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂4，保 存在0.2mol/L pH＝7.4的磷酸缓冲液中。
实施例5
乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备方法，包括以下步骤：
1)制备与乙型肝炎病毒表面蛋白亲和的钠离子牛磺胆酸共转 运多肽(NTCP)及作为载体的玻璃微球；
NTCP及玻璃微球如何制备为已公开的现有技术，本申请中不 做赘述。
玻璃微球表面预处理：用65％浓硝酸煮洗平均直径85μm玻璃 微球10分钟，再用蒸馏水洗(去离子水洗3次，蒸馏水洗2次， 每次2分钟)，放入37℃烘箱烘干。
2)活化玻璃微球表面基团：取双蒸水、丙酮(分析纯)、硅烷 化偶联剂(γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)按体积比15:280: 6的比例配制成APTES活化溶液，再将玻璃微球浸入其中2小时； 用丙酮洗涤玻片5次(5min/次)，再将微球表面烘干。
3)将NTCP通过化学交联的方法连接到上玻璃微球上：
①把活化的微球放入0.2wt％PDC(重铬酸吡啶)溶液，置于 烘箱中2小时(维持温度37℃)；从PDC中取出微球，先用甲醇洗 涤5次(5min/次)，再用丙酮洗涤2次，最后用双蒸水洗涤一次， 晾干；
②将NTCP与微球混合，以微球体积(mL)：NTCP重量比(mg) 为1：20的比例混合，于37℃水浴2h，得到结合了配基的吸附微 球溶液。
4)向吸附微球溶液中添加氨基酸混合物，混合物为蛋氨酸:亮 氨酸:异亮氨酸＝1:1:1，氨基酸添加重量与配基的重量比为1：100， 于恒温37℃水浴箱上静置30分钟，再于恒温37℃水浴箱上微震荡 下PBS(0.01M pH 8.0)洗3次，洗去多余的氨基酸，得到乙型肝 炎病毒表面蛋白吸附剂5，然后室温晾干、备用。
实施例6
乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备方法，包括以下步骤：
1)制备与乙型肝炎病毒表面蛋白亲和的钠离子牛磺胆酸共转 运多肽(NTCP)及载体的壳聚糖微球；
NTCP及壳聚糖微球如何制备为已公开的现有技术，本申请中 不做赘述。
2)活化壳聚糖微球表面基团：称取10g壳聚糖交联微球于灭 菌的烧杯中，加入20mL一定浓度的环氧氯丙烷，用1M NaOH溶 液调节溶剂pH 8～9，然后在40℃、转速80rpm下、反应2h进行 活化，活化结束后，然后用丙酮、乙醇、洗去残存的环氧氯丙烷， 再用大量蒸馏水淋洗微球，抽干，得到壳聚糖活化微球。
3)将NTCP通过化学交联的方法连接到上壳聚糖微球上：
将NTCP的溶液滴加到环氧活化后的壳聚糖微球中，于37℃低 速振荡反应4h。反应结束后，用蒸馏水洗去多余的NTCP，吸干水 分，得到结合了配基的病毒吸附微球溶液。
4)向病毒吸附微球溶液中添加氨基酸混合物，混合物为组氨 酸:甘氨酸:赖氨酸＝1:1.5:3，氨基酸添加重量与配基的重量比为1： 100，于恒温37℃水浴箱上静置30分钟，再于恒温37℃水浴箱上 微震荡下PBS(0.01M pH 8.0)洗3次，洗去多余的氨基酸，得到 乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂6，然后室温晾干、备用。
对照例(未用氨基酸封闭)
乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备方法，包括以下步骤：
1)制备与乙型肝炎病毒表面蛋白亲和的钠离子牛磺胆酸共转 运多肽(NTCP)及载体的琼脂糖微球；
NTCP及琼脂糖微球如何制备为已公开的现有技术，本申请中 不做赘述。
2)活化琼脂糖微球表面基团：在2L的反应器中加入琼脂糖微 球溶液600ml，2mol/L的NaOH水溶液400ml，混匀，加入乙二 醇双缩水甘油醚400ml后，置于恒温摇床中，在37℃反应1小时。 结束反应，将琼脂糖微球过滤，用大量蒸馏水冲洗至pH＝7，将活 化好的凝胶状琼脂糖微球储存在4℃备用。
3)将NTCP通过化学交联的方法连接到上琼脂糖微球上：
将琼脂糖微球凝胶200ml加入至0.3mol/L的硼酸缓冲液 600ml中，pH值控制在8.0～10.0范围内，加入3g NTCP，在37℃ 反应12小时，停止，回收未反应的NTCP，得到结合了配基的吸附 微球溶液，于恒温37℃水浴箱上微震荡下PBS(0.01M pH 8.0)洗 3次，洗去多余多肽，得到乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂(对照)， 然后室温晾干、备用。
试验例
取上述实施例中得到的乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂1～6以 及对照例，添加至生理盐水中，然后置于恒温37℃水浴箱上，轻微 震荡，分别于0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h，检测其上NTCP 多肽分子的脱落情况，脱落的NTCP采用紫外法检测，然后将未脱 落的NTCP和吸附剂上的原有结合NTCP的量进行对比，结果如下：