一种红豆杉多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种红豆杉资源有效利用技术，具体涉及一种红豆杉多糖 及其制备方法和应用。
背景技术
早在1856年Lucas就从欧洲红豆杉(Taxus baccata)的叶中提取粉末碱 性部分taxine，但之后的进展很慢，直到20世纪60年代光谱技术飞速发 展才有了比较深人的研究。20世纪80年代美国和欧洲的科学家相继揭示 出紫杉醇的抗癌疗效，全世界掀起了研究红豆杉的高潮。虽然紫杉醇具有 很好的抗癌效果，但是由于红豆杉中紫杉醇含量很低，且多分布于树皮中， 部分生产商为了提高紫杉醇产量而大量砍伐红豆杉，使红豆杉资源遭到严 重的破坏。此外，被提取紫杉醇后的红豆杉基本都被废弃，造成严重的资 源浪费和环境污染。
为了解决红豆杉资源锐减、资源浪费与环境污染等问题，在红豆杉资 源的利用与开发上，不仅要研究和发展红豆杉种植的新技术，更重要的是 要将提取紫杉醇类物质后的红豆杉残余物进行再利用，深入研究其中新的 活性组份的开发。目前在红豆杉小分子活性物质的开发中，国内外都已取 得不少进展，除紫杉醇具有抗肿瘤生物活性之外，红豆杉中还含有二十多 种紫杉烷类二萜化合物以及其他水溶生物活性物质。近年来，对红豆杉资 源的利用也已不再停留在对小分子活性物质的研究，越来越多的研究表明 红豆杉中含有大量的生物活性物质——多糖，而且这些多糖具有抗肿瘤、 调节免疫等活性。
红豆杉多糖是从红豆杉中分离出来的具有生物活性的物质，具有增强 免疫力、防止心肌梗死及抗肿瘤等多种功能，具有广阔的应用前景。原菲 等用MTT法研究了红豆杉多糖TMP90W对体外培养的人乳腺癌细胞 MCF-7和肺癌细胞A549的生长抑制作用。TMP90W对MCF-7和A549 均有不同程度的抑制作用，且具有浓度依赖性。虽然其抑制作用较阳性对 照药物顺铂较小，但TMP90W的毒性小，所以可作为抗肿瘤候选药物。 Yin等先后从红豆杉中分离出多糖TMP70W和TMP70S-1，并采用MTT 法检测了两种红豆杉多糖对体外培养的肿瘤细胞的抑制作用。结果表明 TMP70W对K562细胞、MCF-7细胞均具有抑制作用；TMP70S-1对人宫 颈癌细胞Hela和人纤维肉瘤细胞HT1080也具有抑制作用，且具有浓度依 赖性。孔繁智等研究发现红豆杉多糖具有缓解和稳定晚期肺、胃、乳腺、 前列腺、大肠癌的疗效，可以保护人体的T细胞使癌症患者的免疫功能保 持在相对正常的状态。红豆杉多糖毒副作用小，药理作用强，能减少化疗 药物用量，降低化疗药物毒副作用，是癌症患者临床化疗的良好的辅助药 物，具备良好的药用前景。
鉴于红豆杉多糖显著的生物活性，深入开发新的红豆杉多糖并用于疾 病治疗就显得十分必要。
发明内容
本发明提供了一种红豆杉多糖，该红豆杉多糖对人胃癌细胞具有显著 的诱导凋亡作用。
一种红豆杉多糖，其制备方法依次包括脱脂、提取、醇沉以及分离纯 化，所述分离纯化包括：
(1)以NaCl溶液为洗脱剂，利用DEAE sepharose fast flow树脂柱 对醇沉获得的粗多糖进行分离，获得浓度为0.3M的NaCl溶液洗脱的目 标馏分；
(2)以去离子水为洗脱剂，利用Sephdex G-10凝胶柱对目标馏分进 行分离，在保留时间为30min时获得所述红豆杉多糖。
具体地，所述红豆杉多糖的制备方法包括：
1、脱脂：取红豆杉枝叶碎屑，置于索氏提取器中用石油醚回流提取， 以抽提后的是石油醚挥发后不留下油迹为脱脂终点，脱脂后的红豆杉枝叶 碎屑置于室温下通风晾干。
2、提取：
①先用水对红豆杉枝叶碎屑进行微波提取，再置于95℃水浴中提取， 分别获得水提取液和残余物；
作为优选，所述微波提取为：在900～1400W的功率下提取40～50s， 提取次数为至少三次，相邻的两次提取之间间隔4～5min；微波提取有利 于促使红豆杉枝叶中的水溶性物质更易释放出来，提高多糖提取率；间隔 进行多次提取可避免因一次提取时间太长温度太高而破坏里面的成分；
②对所述残余物进行碱提，过滤取上清，调节上清pH至7.0后将上 清与所述水提取液混合，浓缩获得浓缩液；
作为优选，采用浓度为1.0～1.2mol/L的碱液进行碱提，所述残余物与 碱液的固液比为1g:18～20L，在70～80℃下碱提110～120min；
更优选为：采用浓度为1.0mol/L的碱液进行碱提，残余物与碱液的 固液比为1g:20L，在75℃下碱提120min。
3、醇沉：用体积分数为75～80％的乙醇在温度低于4℃下对所述浓缩 液过夜醇沉，离心并清洗沉淀物，得到粗多糖。
4、分离纯化：
(1)以NaCl溶液为洗脱剂，利用DEAE sepharose fast flow树脂柱 对醇沉获得的粗多糖进行分离，获得浓度为0.3M的NaCl溶液洗脱的目 标馏分；
NaCl溶液的洗脱梯度依次为：0.1M、0.3M、0.5M、0.7M，洗脱速 度为11.5mL/min，洗脱体积均为1L；
(2)以去离子水为洗脱剂，利用Sephdex G-10凝胶柱对目标馏分进 行分离(去离子水流速为0.6mL/min)，在保留时间为30min时获得所述 红豆杉多糖。
对获得的红豆杉多糖进行凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatograp，GPC)和紫外光谱(Ultraviolet Spectrophotometry，UV) 分析，可知其重均分子量为73527Da，并且吸收峰为单一对称峰。
对获得的红豆杉多糖进行气相色谱分析，可知该红豆杉多糖由葡萄 糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖以摩尔比1：0.38：0.31： 3.11：1.34：1.92组成。
对获得的红豆杉多糖进行红外光谱分析，发现其红外吸收图谱中具有 以下吸收峰：3413cm-1，2923cm-1，2846cm-1，1735cm-1，1614cm-1，1415 cm-1，1328cm-1，1242cm-1，1139cm-1，1090cm-1，1072cm-1，1024cm-1， 957cm-1，893cm-1，838cm-1，771cm-1，表明该红豆杉多糖中的糖苷键主 要为α-型。
对获得的红豆杉多糖进行核磁共振分析，发现组成该红豆杉多糖的单 糖异头物均为α构型；多糖结构中还含有少量乙酰基。
对获得的红豆杉多糖进行高碘酸氧化和Smith降解分析，发现该红豆 杉多糖中含有1→、1→3、1→2、1→6或者1→2,6糖苷键；对获得的红豆 杉多糖进行甲基化分析，发现该红豆杉多糖的主链以(1→3)-阿拉伯糖 和(1→4)-半乳糖为基本骨架，分支主要含有(1→3,6)-阿拉伯糖和(1→3,6) -甘露糖，非还原性末端主要含有阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖。
本发明还提供了所述红豆杉多糖在制备抗胃癌药物中的应用。作为优 选，所述抗胃癌药物用于抑制SGC-7901细胞的生长增殖。并且，该红豆 杉多糖与5-FU联用时其对SGC-7901细胞的诱导凋亡效果能得到显著提 高，即两者具有协同作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明在提取过程中对红豆杉枝叶先进行微波提取在进行95℃ 热水提取，微波提取有利于促使红豆杉枝叶中的水溶性物质更易释放出 来，提高多糖提取率；
(2)本发明在分离纯化过程中利用依次利用DEAE sepharose fast flow 树脂柱和Sephdex G-10凝胶柱对粗多糖进行分离，最终获得重均分子量为 73527Da的红豆杉多糖，该红豆杉多糖对人胃癌细胞SGC-7901具有显著 的诱导凋亡作用。
附图说明
图1为红豆杉多糖CPTC-2在Sephdex G-10凝胶柱中的洗脱曲线；
图2为红豆杉多糖CPTC-2的紫外全波段扫描图谱；
图3为红豆杉多糖CPTC-2的GPC分析图谱；
其中，Minutes表示(停留时间)分钟，MV表示电压毫伏，Mw表示 重均分子量；
图4为标准混合单糖和红豆杉多糖CPTC-2水解单糖的GC分析图谱；
其中，min表示(保留时间)分钟，The peak height(nC)表示峰高 (nC表示每个峰组分的响应值)；A曲线表示标准混合单糖，B曲线表示 红豆杉多糖CPTC-2水解单糖；
图5为红豆杉多糖CPTC-2的红外光谱图；
其中，Wavenumber cm-1表示波数(cm-1)，Transmittance[％]表示透光 率(％)；
图6为红豆杉多糖CPTC-2的1H谱图；
图7为红豆杉多糖CPTC-2的13C谱图；
图8A为实施例2中正常SGC-7901细胞的流式细胞分析结果图；
其中，Count％表示各细胞周期阶段细胞百分数，Population表示细胞 类群，Cells表示总细胞，Apo表示凋亡细胞，G0/1表示细胞周期处于G0/1 期的细胞，S表示细胞周期处于S期的细胞，G2/M表示细胞周期处于G2/M 期的细胞；％Parent表示细胞百分数，Mean表示平均荧光强度，％CV表 示荧光强度变异系数(％)，PI-A表示荧光强度；下同；
图8B为实施例2中经CPTC-2处理后SGC-7901细胞的流式细胞分析 结果图；
图9A为实施例3中正常SGC-7901细胞的流式细胞分析结果图；
图9B为实施例3中经5-FU处理后SGC-7901细胞的流式细胞分析结 果图；
图9C为实施例3中经CPTC-2处理后SGC-7901细胞的流式细胞分析 结果图；
图9D为实施例3中经CPTC-2和5-FU联合处理后SGC-7901细胞的 流式细胞分析结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
实施例1 红豆杉多糖的提取和鉴定
1、红豆杉多糖的提取
本实施例一种红豆杉多糖的提取方法，包括以下步骤：
(1)脱脂：
取干燥的红豆杉枝叶碎屑10.0g，置于250mL索氏提取器中用沸点 为60～90℃石油醚回流提取，水浴温度为80℃；以抽提后的是石油醚挥发 后不留下油迹为脱脂终点，脱脂后的红豆杉枝叶碎屑置于室温下通风晾 干，累积在一起保存备用。
(2)提取：
①先用水对红豆杉枝叶碎屑进行微波提取(功率900W，提取时间45 s，提取次数为三次，相邻的两次提取之间间隔5min或待体系冷却后进行 下一次提取)，再置于95℃水浴中反复提取，直至提取得到的溶液经硫酸 苯酚法与DNS法测定基本不含多糖为止；分别获得水提取液和残余物；
②采用浓度为1.0mol/L的NaOH溶液对水洗后的残余物进行碱提， 残余物与NaOH溶液的固液比为1g:20L，在75℃下浸提120min；浸 提完成后过滤取上清，用HCl上清pH至7.0后将上清与步骤①中的水提 取液混合，旋转蒸发仪浓缩，获得浓缩液；
(3)醇沉：
用体积分数为75％的乙醇在4℃下对浓缩液过夜醇沉，5000r/min离 心，并依次用乙醇、丙酮、乙醚清洗沉淀物各三次；在自然通风条件下， 让沉淀物中的丙酮和乙醚挥发；溶剂挥发完全后，将沉淀物溶于水中， 过滤后进行透析、脱色、脱盐，冻干后的絮状物即为粗多糖CPTC。粗多 糖的提取率为3.45％，多糖含量为5.20％。
(4)分离纯化：
①取冻干后粗多糖CPTC，溶于Tris-HCl缓冲液，上DEAE sepharose fast flow阴离子交换柱，先用平衡缓冲液将未吸附的物质洗掉，接着用平 衡缓冲液配制的梯度NaCl溶液(NaCl溶液的洗脱梯度依次为：0.1M、 0.3M、0.5M、0.7M，洗脱体积均为1L)以11.5mL/min的流速洗脱， 并用自动分部收集器收集洗脱液，用硫酸苯酚法测定各洗脱液中的多糖含 量。将各组份收集，经旋转蒸发冻干。
经DEAE sepharose fast flow阴离子交换柱分离到三种多糖CPTC-1a、 CPTC-1b和CPTC-2，其中CPTC-1a、CPTC-1b均是0.1M的NaCl溶液洗 脱下来的，而CPTC-2是0.3M的NaCl溶液洗脱下来的。
②取多糖组分CPTC-2溶解于Tris-HCl缓冲液，上Sephdex G-10凝胶 柱，用去离子水以0.6mL/min的流速洗脱，用电导率仪测定洗脱液的电导 率以表征洗脱液中NaCl的含量，得到精制多糖CPTC-2(洗脱时间或保留 时间为30min)，洗脱曲线如图1所示。
2、红豆杉多糖的鉴定
(1)纯度测定
将精制多糖CPTC-2溶于水中配制成浓度为1mg/mL的多糖溶液，以 去离子水为空白对照，在200-400nm范围内进行紫外光谱全波段扫描， 扫描结果见图2。图2的结果表明精制多糖CPTC-2中不含蛋白和核酸， 为均一组分。
(2)分子量测定
多糖通过Sephdex G-10凝胶柱的洗脱体积和分子量密切相关，在一定 的分子量范围内，停留时间(RT)与多糖分子量的对数(lg![]()
)呈线性 关系。利用这一特点，先用不同分子量的标准葡聚糖(1000，5000，12000， 50000，150000，270000，410000，670000)为标准样品，绘制标准曲线， 操作条件：Waters高效液相色谱系统(515Waters Pump，Ultrahydrogel TM 250与Ultrahydrogel TM 2000串联柱，Waters2410示差折光检测器)，流 动相为NaNO3溶液，流速为0.8mL/min，柱温30℃；然后根据多糖样品 在相同色谱条件下的停留时间(RT)，通过标准曲线求出精制多糖CPTC-2 的重均分子量为73527Da。
对精制多糖CPTC-2进一步进行GPC分析，以表征多糖的均一度； GPC分析图谱如图3所示。如图3所示，精制多糖CPTC-2的吸收峰为单 一对称峰，表明其均一度较高。
(3)单糖组成的测定
各称取5mg葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖， 加入0.1％的氢氧化钠溶液3ml，适量的硼氢化钠，密封室温还原12h， 间或振摇；滴加乙酸分解过量硼氢化钠至无气泡，加入2ml甲醇(反复4 次)除去多余的硼酸根，减压旋干，剩余物在105℃烘箱中加热15min以 完全除去水分；按1:1(V/V)比例加入2ml乙酸酐和吡啶，100℃水浴加热 1h，反应液减压浓缩，用1ml二氯甲烷萃取，取萃取液进行GC分析； 色谱条件：Agilent6829N气相色谱仪(FID)，SE-54毛细管柱30m×0.32mm (Agilent公司)，汽化室温度250℃，检测器温度250℃，程序升温：200℃ (1min)以0.5℃/min升温至220℃(3min)。
取10mg精制多糖CPTC-2，放入l0ml安瓿瓶中，加入2mol/L三氟 醋酸(TFA)4ml，充入N2，封管，100℃下水解6h；将完全水解后的溶液 减压蒸干(<40℃)，然后加入甲醇蒸干，重复此操作5次，以完全除去TAF， 加蒸馏水溶解后冻干；取冻干后的水解多糖5mg，做和上述相同的衍生处 理，然后GC分析，分析条件同上，分析结果见图4。
图4的结果表明组成CPTC-2的单糖为葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉 伯糖、鼠李糖、半乳糖(其中阿拉伯糖的含量最高)，它们的摩尔比为： 1:0.38:0.31:3.11:1.34:1.92。
(4)红外光谱检测
称取2mg的精制多糖CPTC-2，与KBr混合研细后压片，直接在 Nicolet 5700型红外光谱仪(ThermoFisher Co.)下测定，光谱测定范围 4000-400cm-1，DTCS，KBr检测器和MCT检测器，分辨率优于0.09cm-1， 检测结果见图5。
图5中，在3413cm-1处峰值是由多糖中羟基上O-H的伸缩振动引起， 峰形很宽，可见羟基在分子间发生缔合，不是游离的羟基；在2923cm-1处峰值是由多糖中-CH2、-CH基团中C-H的反对称伸缩振动引起；2846 cm-1处峰值是由多糖中-CH2、-CH基团中C-H的对称伸缩振动引起；在 1735cm-1、1614cm-1处吸收峰为多糖中羰基或乙酰基上的-C＝O的伸缩振 动引起；在1415cm-1、1328cm-1、1242cm-1处的吸收峰是由多糖中C-O 伸缩振动、C-H或者O-H的弯曲振动引起；在1139cm-1、1090cm-1、1072 cm-1、1024cm-1处的吸收峰是由多糖中的C-O-C,C-O-H基团中的C-O、 C-C的伸缩振动引起；在957cm-1处的吸收峰为D-吡喃葡萄糖环的振动引 起；在893cm-1处的吸收峰为吡喃环β-型的C-H变角振动的特征峰，即β- 型糖苷键特征峰；在838cm-1处的吸收峰为α-型C-H变角振动的特征峰， 即α-型糖苷键特征峰；在771cm-1处的吸收峰为α-吡喃环对称伸缩振动。
(5)核磁共振分析
取多糖样品30mg装入核磁管，溶于0.5ml重水中，在核磁共振仪上 进行1H-NMR，13C-NMR等光谱分析。以D2O作溶剂，TMS作内标，600HZ 条件下进行核磁共振谱图的测定。分析结果见图6、图7、表1。
表1 CPTC-2的1H谱化学位移
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由表1可见，在δ5.22处的质子峰表明组成CPTC-2的糖主要为一种 构型，即α-吡喃型糖。此外，由13C谱图在δ79.1和δ79.3处的峰也可以 看出组成CPTC-2的单糖异头物构型为α构型。
(6)高碘酸氧化和Smith降解分析
①取15mmol/L NaIO450ml(320.8mg NaIO4，定容至100ml)，用 锡纸包好避光，取0.1ml稀释至25ml，223nm处测定吸光值大于0.6方 可使用(现配现用)；
②准确称取CPTC-2糖样5mg(记录下准确质量)，用少量水溶解于 25ml容量瓶中，然后加入15mmol/L NaIO4定容；用锡纸包好避光，放置 在低温暗处反应，间隔时间(0h、6h、12h、24h、36h、48h、60h……) 取样0.1ml，用蒸馏水稀释250倍，以蒸馏水作空白对照，在223nm波 长处测光密度值，直到光密度值恒定为止，记录反应结束时间(60h)；
③同时将剩余的15mmol/L NaIO4与反应样品同样放置作为对照，待 反应结束时取出0.1ml，稀释250倍后，用蒸馏水按不同比例稀释(见表 2)，每浓度三个重复，测定223nm处的光密度值，以OD值为纵坐标， NaIO4浓度为横坐标，制作标准曲线；
表2
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④通过查标准曲线，计算出高碘酸的消耗量。
高碘酸消耗量(mmol)＝(反应前高碘酸浓度-反应后高碘酸浓度)×反 应体积；
⑤取1ml上述步骤②中的氧化液，加1滴酚酞作指示剂，用0.005 mol/L NaOH溶液滴定，计算得甲酸生成量；
甲酸生成量(mmol)＝(NaOH的准确浓度×滴定用的体积)×反应体 积；
⑥Smith降解：加乙二醇终止高碘酸氧化反应，流水及蒸馏水各透析 24h；浓缩至5ml，加入KBH435mg还原过夜；用50％乙酸中和至pH为 6-7，流水及蒸馏水各透析24h，浓缩冻干。取冻干后的多糖醇，加入2mol/L TFA溶液3ml，100℃水解6h，水解液经减压浓缩至干以除去TFA，然 后做GC分析。
步骤④和⑤的计算结果表明，每摩尔糖残基消耗高碘酸1.052mol， 每摩尔糖残基生成甲酸的量为0.479mol。
高碘酸氧化完成时有甲酸生成，说明存在非还原性末端或1→6糖苷 键；高碘酸消耗量远远大于甲酸生成量的二倍，说明存在大量的只消耗高 碘酸而不生成甲酸的类型，可能存在1→2,6、1→4、1→4,6键型；每个糖 残基消耗高碘酸1.052mmol，生成0.479mmol甲酸，说明有62.5％的糖残 基被氧化，还有37.5％的糖残基没有被氧化，未被氧化的糖残基可能以主 要以1→3糖苷键存在。
从GC分析结果可知CPTC-2经Smith降解后的产物中含有甘油、赤 藓醇、阿拉伯糖和葡萄糖。产物中有甘油，说明CPTC-2中含有 1→,1→2,1→6或者1→2,6等糖苷键；产物中有赤藓醇，说明存在1→4糖 苷键；产物中含有阿拉伯糖和葡萄糖，说明CPTC-2中的阿拉伯糖和葡萄 糖含有不被高碘酸氧化的糖苷键，即1→3糖苷键。
(7)甲基化分析
①甲基化
CPTC-2多糖样品10mg，置50mL圆底烧瓶中，放入磁力搅拌子， 然后于放有五氧化二磷的真空干燥器中干燥1天；加5ml二甲亚砜，搅 拌溶解10min，加100mg氢氧化钠粉末，继续搅拌反应20min；逐滴加 入碘甲烷1ml(20min加完)，然后继续搅拌反应2h；加5ml水搅拌反 应10min，破坏过量碘甲烷；反应液转入透析袋(截留分子量1000Da)， 对流水透析2天；溶液转入圆底烧瓶，冷冻干燥；干燥后残余物重复上述 甲基化过程2～3次。
②衍生化
取甲基化产物2～3mg，加2mol/L三佛乙酸3ml，120℃水解2h， 取出，放冷至室温后，将水解液转入25ml梨形烧瓶，60℃水浴减压蒸干， 再加1～2ml甲醇蒸干3次，加50mg NaBH4和2ml水，混匀，室温还原 水解4h以上，逐滴加入冰醋酸破坏过量的NaBH4，至溶液pH 4～5，60℃ 水浴减压蒸至粘稠状，加甲醇：冰醋酸(5:1)溶液1～2ml蒸干几次，最终 蒸干至粉末状，置105℃烘箱中烘干10min，然后加入2～3ml乙酸酐， 105℃乙酰化1h，取出，趁热加入2ml水，摇匀，室温放置30min，间 或震摇，50℃水浴减压蒸干，加5ml水混悬，然后加5mL氯仿萃取，氯 仿层用水洗3次，然后用无水硫酸钠干燥，备用。
③GC-MS检测分析
色谱条件：色谱柱：HP-5ms，60m×0.25mm×0.25μm，Agilent；
载气：He；
载气流速：1mL/min；
进样口：250℃；
柱温箱程序升温：起始温度120℃，3℃/min升温至 190℃，2℃/min升温至250℃，保温5min；
进样体积：1μL；
质谱条件：EI源，70eV，230℃，扫描范围50～500m/e， 四极杆温度150℃。
CPTC-2的甲基化结果见表3。
表3 CPTC-2的甲基化结果
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表3的结果表明：完全甲基化的CPTC-2进一步经GC-MS分析后， 产生了9种残基，分别为2,3,4,6-Me4-Ara，2,4,6-Me3-Ara，2,3,4,6-Me4-Glc， 2,3,4,6-Me4-Gal，2,4-Me2-Ara，2,3,6-Me3-Gal，2,4,6-Me3-Glc， 2,3,4-Me3-Rha和2,4-Me2-Man，摩尔比分别为0.66:1.81:0.22:0.26: 0.09:1.00:0.06:0.20:0.18。由此可知，CPTC-2主要是以1→3-阿拉伯糖 和1→4-半乳糖为骨架，分支主要是由1→3,6-阿拉伯糖和1→3,6-甘露糖组 成，非还原性末端主要由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成。
实施例2 CPTC-2体外抗肿瘤活性实验
1、MTS法检测
用0.25％胰蛋白酶消化处于指数生长期的SGC-7901细胞，制成细胞 悬液，接种于96孔培养板上，每孔100μL，置5％CO2、37℃的培养箱 中培养24h；对于CPTC-2实验组，再向96孔培养板中加入用不含血清 的RPMI-1640基础培养液配置的红豆杉多糖，每孔100μL，使多糖终浓 度分别为0、12.5、25、50、100、150、200、300μg/ml，同时设置空白对 照、阴性对照和黄芪多糖(50μg/ml)阳性对照，每组3个重复；继续培 养48h后，每孔加入PBS配制的MTS(5mg/mL)20μL，继续培养2h， 直接用酶标仪在490nm波长处测OD值，按下公式计算抑制率(RI)：
抑制率(RI)＝(阴性对照组OD值-实验组OD值)/阴性对照组OD值 ×100％。计算结果见表4。
表4 CPTC-2对人胃癌SGC-7901细胞活性的影响
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从表4可以看出，随着浓度的增大，CPTC-2对人胃癌SGC-7901细 胞的增殖抑制率也呈现增长的趋势，在浓度为12.5μg/mL时，抑制率比较 低，为8.28％；当浓度增大到300μg/mL时，抑制率也增加到了36.53％， 而且与对照组相比，具有显著性差异(P＜0.01)，说明CPTC-2对人胃癌 SGC-7901细胞的增殖有显著抑制作用，并且具有浓度依赖性，计算得其 IC50值为758.75μg/mL。
2、流式细胞术分析
将SGC-7901细胞接种于6孔细胞培养板中，接种密度为1×105/孔， 培养24h后加入测试药品，其中设空白对照组、CPTC-2组(350μg/mL)， 继续培养48h，胰蛋白酶消化，1000r/min低速离心5min，4℃PBS洗涤 2次，离心后收集细胞团再用4℃预冷的70％乙醇固定，并置于-20％冰箱 中12h以上。固定毕，低速离心，细胞团用4℃PBS洗涤再离心，然后 加入PI混合染液(45mg/L PI，10mg/L RNaseA，0.1％TritonX-100)，避光 染色l h，流式细胞仪采集，ModFit LT2.0EP软件分析。分析结果如图8A 和8B所示。
从图8A和8B中可以看出，空白对照组和CPTC-2组中均出现了凋亡 的细胞(Apo，apoptotic cell)，其中对照组的凋亡率为2.9％，CPTC-2组的 凋亡率为4.4％，CPTC-2组明显高于对照组，说明CPTC-2能通过诱导 SGC-7901细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。
实施例3 CPTC-2联合5-FU的抗肿瘤增效作用
1、MTS法检测
实验设对照组、5-FU组(50μg/mL)、CPTC-2高、中、低剂量组(300、 150、50μg/mL)以及CPTC-2高、中、低(300、150、50μg/mL)+5-FU(50 μg/mL)组，每组3个重复。
用0.25％胰蛋白酶消化处于指数生长期的SGC-7901细胞，制成细胞 悬液，接种于96孔培养板上，每孔100μL，置5％CO2、37℃的培养箱 中培养24h，加入各组工作液，继续培养48h后，每孔加入PBS配制的 MTS(5mg/mL)20μL，继续培养2h，直接用酶标仪在490nm波长处测 OD值，按下公式计算抑制率(RI)：
抑制率(RI)＝(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％；计算 结果见表5。
表5 CPTC-2与5-FU联合作用对SGC-7901细胞活性的影响
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从表5可以看出对照组中SGC-7901细胞表现为正常增殖状态，单独 5-FU处理后，细胞数目较对照组显著降低(P<0.01)，细胞增殖受到抑制， 同时测出单独5-FU对SGC-7901细胞的抑制率为54.21％；单独CPTC-2 对SGC-7901细胞增殖的影响明显低于5-FU的效果，抑制率随着CPTC-2 的浓度的增大而增加，300μg/mL的时候的抑制率为44.21％；CPTC-2联 合5-FU作用后的细胞增殖数目显著降低，抑制率达到61.93％，明显高于 单独使用5-FU的作用效果。说明CPTC-2能明显提高5-FU对SGC-7901 细胞的增殖抑制作用。
2、流式细胞术分析
实验设对照组、5-FU组(50μg/mL)、CPTC-2组(300μg/mL)、 CPTC-2(300μg/mL)联合5-FU(50μg/mL)组，每组3个重复。
将SGC-7901细胞接种于6孔细胞培养板中，接种密度为1×105/孔， 培养24h后加入测试药品，继续培养48h，胰蛋白酶消化，1000r/min低 速离心5min，4℃PBS洗涤2次，离心后收集细胞团再用4℃预冷的70％ 乙醇固定，并置于-20℃冰箱中12h以上。固定毕，低速离心，细胞团用 4℃PBS洗涤再离心，然后加入PI混合染液(45mg/L PI，10mg/L RNaseA， 0.1％TritonX-100)，避光染色lh。流式细胞仪采集，ModFit LT2.0EP软件 分析。分析结果如图9A、9B、9C和9D所示。
从图9A、9B、9C和9D可以看出，CPTC-2组与对照组相比，凋亡 率为3.2％，稍微高于对照组，该组S期的细胞降低，细胞周期阻滞于G0/1 期；5-FU组与对照组比较，凋亡率为8.1％，相对于单独的CPTC-2组， 凋亡率明显增加，5-FU组G0/1期细胞明显增加，S期和G2/M期细胞明 显降低，细胞周期也是阻滞于G0/1期；CPTC-2联合5-FU组S期和G2/M 期细胞明显降低，凋亡率为14.5％，凋亡期细胞与对照组和单独的CPTC-2 组和单独的5-FU组相比，显著增加。由此可知红豆杉多糖能明显提高5-FU 对SGC-7901细胞的增殖抑制作用。