一株降解石油的细菌及其应用.pdf

一株降解石油的细菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域中一株降解石油的微生物及其应用，特别涉及一株降解石油的细菌及其应用。
背景技术
当今世界正在进行一场以生物工程及应用为标志的新技术革命，而生物开发能源技术成为生物工程中经济潜力最大、最有希望和前途的领域之一，现代化分析仪器和手段也使微生物科学进入一个崭新的发展时期，这些因素推动了微生物强化采油技术的研究和应用。
石油是一种非再生的能源，经过一次采油和二次采油后，地层中仍有约60％-70％的原油无法开采出来。如何提高采收率，从地下采出更多的原油，多年来一直是许多国家不断研究的课题。目前普遍采用的是用化学方法开采原油，如碱、表面活性剂、聚合物组成的ASP三元复合驱油体系(牟建海，李干佐.[J].化工科技市场.2000，23(7)：17)。从1980年以来，很多国家开展了用微生物方法提高原油采收率的技术，经过二十多年的努力，该技术取得了极大进展。这种使用化学或生物制剂提高采收率的技术被称为三次采油技术，国外亦称强化采油(EOR，Enhanced OilRecovery)技术。为了将它们区分开来，用微生物提高采收率技术也可以称为四次采油技术或微生物强化采油(MEOR，Microbial Enhanced Oil Recovery)技术，它是指利用微生物生产有用的代谢产品或者利用微生物能够分解碳氢化合物的性能，从而提高原油采收率的技术。
微生物强化采油技术是一项科技含量高、发展迅猛的新技术，是现代生物技术在采油工程领域中开拓性的应用，对于高含水和接近枯竭的老油田更显示出其强大的生命力。微生物强化采油技术主要包括两类(李虞庚.石油微生物学.[M].上海：上海交通大学出版社.1996)：一类是利用微生物产品如生物聚合物和生物表面活性剂作为油田用化学剂进行驱油，称为微生物地上发酵提高采收率工艺，即生物工艺法，目前该技术在国内外已趋成熟；另一类是利用微生物及其代谢产物提高采收率，主要是利用微生物地下发酵和利用油层中固有微生物的活力，称为微生物地下发酵提高采收率方法。
降解石油微生物的分离是实现微生物强化采油技术的基础，菌种的好坏是微生物采油的关键。目前，已分离得到一些降解石油的微生物，如宾西法尼亚原油协会的Beck报道了用硫酸盐还原菌进行释放原油的实验，研究表明硫酸盐还原菌在细菌石油分解中出现的良好效果(1947年)，该实验后来由厄普德格拉斐和雷恩进一步证实(1954年)。拉里维雷(1955年)观测了铜绿假单胞菌、分枝杆菌、枯草芽孢杆菌、脂解酶念球菌等在甘油等培养物中的表面张力，表面张力下降明显，但利用烃类并不好。
发明创造内容
本发明的目的是提供一株能够降解石油的细菌。
能够降解石油的菌株是蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP，已于2004年04月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC №1141。
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP CGMCC №1141自黑龙江省大庆市的第一采油厂的油水样中分离得到，其菌落乳白色色，湿润，直径0.6mm-1.0mm，细胞为杆状；细胞直径≤1μm；形成芽孢，芽孢不膨大，芽孢非圆形；生理生化特征如表1所示：
表1.蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP生理生化特征

试验项目          结果试验项目      结果碳水化合物产酸葡萄糖            +木糖              -L-阿拉伯糖        -甘露醇            -利用葡萄糖产气    -利用柠檬酸盐      +硝酸盐还原        +50℃生长          -pH5.7生长         +7％NaCl生长       +革兰氏染色    阳性淀粉水解      -明胶液化      +分解酪素      +接触酶        +氧化酶        -厌氧生长      +VP试验        +VP＜pH6       +VP＞pH7       -甲基红试验    -
注：“+”表示生长或反应阳性；“-”表示不生长或反应阴性。
实验证明，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP CGMCC №1141能有效地改善原油的性质，原油酸值提高8倍以上，轻组份增加，含蜡含胶降低率30-50％，原油流变性变好，油水间界面张力降低，发酵液中有机酸等物质含量增加；其代谢原油途径为次末端氧化，产生了一种新型脂类表面活性剂。该菌株可广泛应用于采油工程领域特别是微生物强化采油领域。
图1为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP的溶油照片
图2为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP产表活剂的溶血照片
图3为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP作用原油前后的培养瓶照片
图4为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP作用后原油全烃色谱图
图5为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP作用前后原油流变性变化曲线
图6为空白油样芳烃分子量
图7为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP作用后油样芳烃分子量
图8a为空白油样非烃显微-红外分析图谱
图8b为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP作用后油样非烃显微-红外分析图谱
图9为烷烃微生物氧化一般途径
图10为烷烃次末端氧化途径
图11a为有机酸混合标样的色谱图
图11b为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP样品中有机酸色谱图
图12a为乙酸的质谱图
图12b为丙酸的质谱图
图12c为丁酸的质谱图
图12d为异戊酸的质谱图
图13a为有机醇标样的色谱图
图13b为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP样品的有机醇色谱图
图14为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP样品中提取的B物质的红外光谱图
图15为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP样品中提取的C物质的红外光谱图
实施例中的百分比浓度均为质量百分比浓度。
实施例1、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP的分离
1、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP的分离分为取样和富集培养，筛选和纯化两个步骤，具体方法如下：
(1)取样和富集培养
取黑龙江省大庆市的第一采油厂的油水样后立即富集培养，使所需的菌种在数量上占优势，抑制不需要的菌种生长。富集培养基用的是无机盐培养基：K₂HPO₄：0.1-1％，NaH₂PO₄：0.1-0.5％，(NH₄)₂SO₄：0.05-0.2％，MgSO₄·7H₂O：0.01-0.5％，FeCl₂：0.001-0.01％，CaCl₂：0.001-0.01％，酵母浸粉：0.02-0.2％，原油0.5-20％。pH：6.8-7.5121℃，灭菌15-20min。45℃120rpm摇床培养5-7天。
(2)蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP的筛选和纯化
筛选用的两种选择性培养基是原油无机盐固体培养基和血平板培养基。
a.原油无机盐固体培养基上的筛选
这种选择性培养基中除了原油之外未加任何碳源，筛选出的菌种就是可以以原油为唯一碳源生长的菌种。在无菌条件下制备步骤(1)所述的富集无机盐固体培养基平板，把稀释后的原油倒入制备好的无机盐固体培养基平板上(原油的加入量为1ml原油/L培养基)，待原油均匀地平铺在无机盐平板表面凝固后，将步骤(1)中地富集培养液均匀涂布在平板上。45℃培养3-5天，结果如图1所示，可以明显地看出长菌地方的原油被利用，无机盐平板上的原油层变薄形成透明圈。选择能形成透明圈的菌种，待进一步纯化。
b.血平板培养的筛选
将步骤(1)中的富集培养液均匀涂布在血平板上。45℃培养1-2天，结果如图2所示，表明培养后的菌落周围形成明显的溶血透明圈，挑选这样的菌落待进一步纯化。由于生物表面活性剂具有能够溶血的特性，溶血的单菌落即是产生生物表面活性剂的菌种。血平板培养基的组成：牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，酵母膏0.01％，氯化钠0.5％，琼脂2％，羊血5％。
C.将通过上述选择性培养基得到的单菌落显微镜下染色观察，如果不纯，再一次地利用上述的培养基分离，直到得到纯的菌落。为了获得厌氧和兼性的菌种，把通过上述的两种选择性培养基获得的菌种在厌氧工作站中45℃培养5天，获得以原油为唯一碳源的一株菌HP，该菌株具有良好的产表面活性剂、产酸产气、改善原油物性等特性。
可选用下述两种方法对该菌株进行长期的菌种保藏：①低温保藏：取处于对数生长期的菌种，用15％无菌甘油作保护剂在-70℃保存；②冷冻干燥制备干粉：离心发酵液得到菌体，用脱脂牛奶作保护剂，冷冻干燥制成干粉。
实施例2、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP对原油的降解
1、分散乳化效果
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP菌种在含有K₂HPO₄ 0.1％，NaH₂PO₄ 0.2％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，CaCl₂·2H₂O 0.001％，FeSO₄·7H₂O 0.001％，酵母0.1％，PH 7.0-7.2，碳源为10％原油的培养基中，45℃，120rpm摇床培养5天后的结果如图3所示，表明与对照(未加菌)相比，发酵液的颜色明显加深，而且，作用后原油具有不挂瓶的特点。由于微生物以原油为唯一碳源生长，改变了原油的性质，使原油的组分发生了变化。图3中，左侧培养瓶为对照，右侧培养瓶为蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)HP的发酵培养液。发酵后的原油在显微镜下观察，发现原油中有菌液存在。细菌存在油水界面上，并以油为碳源，适应环境产生驱油物质，从而起到乳化、润湿、分散原油的作用。
2、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP作用前后原油全烃色谱图
取步骤1中发酵5天后的原油，按常规方法作原油的全烃分析。结果如表2和图4所示，表2表明从全烃色谱分析各项参数的变化看到，该菌株可选择性的降解原油中的某些高碳数烷烃，长链烃含量相对减少，短链烃或低链烃含量相对增加，原油的轻质组分增加；另外，∑C₂₁/∑C₂₂和C₂₁+C₂₂/C₂₈+C₂₉是描述油气运移的参数，那么∑C₂₁/∑C₂₂和C₂₁+C₂₂/C₂₈+C₂₉的比值增加，表示原油运移的方向，随着高分子化合物含量相对减少，轻组分化合物含量相对增加。图4表明由于高分子量烃类的热降解而向低碳数范围转移，色谱图逐渐变为前高锋型，正烷烃碳数分布曲线向轻组份方向移动。原油的流动性变好。
    表2.菌株HP发酵后的原油的饱和烃色谱检测结果样品碳数范围主峰碳∑C21∑C22 C21+C22 C28+C29空白Nc9-nc35nc230.67 1.66HPnc9-nc34nc161.30 1.82
3、原油流变性变化情况
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP菌种在含有K₂HPO₄ 0.1％，NaH₂PO₄ 0.2％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，CaCl₂·2H₂O 0.001％，FeSO₄·7H₂O 0.001％，酵母0.1％，PH 7.0-7.2，碳源为10％原油的培养基中，45℃，分别在120rpm摇床培养5天后，按常规方法分析微生物作用前后原油流变性，结果如图5所示，表明作用后原油流变性明显变好，粘度降低。当转子转数为6l/s时，作用前原油粘度为101mpa·s，该菌株作用后原油粘度降低到43.4mPa·s，原油粘度降低了57.03％，原油粘度大幅下降。
4、原油含蜡、含胶变化
在步骤1中分析了原油烷烃分布情况后，为了进一步探讨菌株作用前后原油含蜡、胶的变化情况，按常规方法做了原油含蜡、含胶变化实验，结果如表3所示，表明菌种作用前后原油的蜡和胶质的含量都有不同程度的变化，该菌株作用后原油含蜡量下降至14.3％，含胶量下降到14.7％。
表3.菌种作用前后原油蜡、胶的变化表样品名称    含蜡％    含胶％空白原油    20.2    19.8HP    14.3    14.7
5、原油中芳烃的变化
取步骤1中发酵5天后的原油按常规方法进行GC-MS，分析原油芳烃中菲系列的相对含量，结果如表4所示，表明该菌株选择性地降解了菲系列中的不同组分，引起MPI、DPI指数的变化。原油中的菲系列一般认为是来自甾萜化合物的裂解。由于烷基在菲环上位置不同，稳定性也有差异，一般处在β位的甲基，如3-甲基和2-甲基菲较稳定，在α位的1-甲基、4-甲基菲以及处于中位的9-甲基菲比较活跃，二甲基菲也有相似规律，从αα型、αβ型至ββ型，稳定性依次增高，该菌株作用后，原油的MPI和DPI指数均有一定的提高，说明菲系列中化学性质较为活跃的组分易被该菌株降解。其总离子流图如图6和图7所示。
          表4.菌株HP作用前后原油中芳烃GC-MS分析结果
序号        样品名称     菲系列含量(％)     MPI           DPI
1           空白油       7.26               0.67          0.87
2           HP油         6.54               0.89          1.02
备注：MPI＝1.5×(2-甲基菲+3-甲基菲)/(菲+1-甲基菲+9-甲基菲)
      DPI＝4×(二甲基菲①+二甲基菲②+二甲基菲③+二甲基菲④)/(菲+二甲基菲⑤+
      二甲基菲⑥+二甲基菲⑦)
6、原油中非烃的变化
取步骤1中发酵5天后的原油采用显微-红外法分析该菌株作用前后原油中非烃成分和结构的变化，结果如图8a和图8b所示，图8a表明2924cm^-1和2853cm^-1处的吸收峰分别代表甲基和亚甲基的C-H不对称和对称伸缩振动，亚甲基占优，因为一般甲基的C-H伸缩振动峰在2960cm^-1和2870cm^-1处，被亚甲基峰覆盖，加上722cm^-1峰为长碳链(n＞4)中亚甲基的吸收峰，说明原油非烃以长碳饱和链为主，而且支链程度不大；1461cm^-1和1376cm^-1处甲基、亚甲基的C-H弯曲振动峰是以上推断的旁证。1601cm^-1处的吸收峰可能是C＝N、C＝C双键伸缩振动引起的，但根据指纹区910cm^-1以下的不明显红外吸收峰(与苯环的取代位置有关)，可以推断原油非烃中含有一定量的芳烃成分。1650-1900cm^-1范围内的吸收峰主要表现为羰基化合物，如醛、酮、酸、酯、酸酐以及酰胺等的C-O伸缩振动，从红外光谱上看，该范围内峰的吸收强度弱，且成宽带形，可能是因为原油非烃中含有少量带羰基的混合化合物。图8b表明该菌株作用后与微生物作用前相比主要区别是在3303cm^-1处出现新的红外吸收峰，峰形宽而钝，这是由于羟基在分子间或分子内形成氢键而产生的，但在1603cm^-1处没有明显的红外吸收峰，说明氢键不是因为样品中含有水而引起。根据峰形特征和化学位移的偏移规律，推断该菌株作用后原油菲烃中有一定量的羧酸生成，羧酸内由于羰基和羟基的强烈缔合，依据羧酸含量的不同红外吸收峰可从3300cm^-1延续到2500cm^-1以下。
为了进一步证实，测定了该菌株作用前后原油非烃的酸值，结果如表5所示，表明该菌株作用以后，原油非烃的酸值增加到原来的8倍，说明该菌株在对原油不同组分的降解过程中发生了生物氧化反应，生成了高碳有机酸，提高了原油的酸值。
             表5.HP菌株作用前后原油非烃酸值分析结果
序号         样品名称      非烃酸值(％)      酸值增加(倍)
1            空白油        0.1037
2            HP油          0.8362            8.06
7、原油中饱和烃生物降解机理分析
从以上的研究可以看出，该菌株对原油的降解以氧化降解为主要途径。大多数微生物对烷烃的主要氧化途径都可以用图9概括，首先是对烷烃进行末端氧化(或β-氧化)生成脂肪酸，再按β-氧化途径降解烷烃，并伴生酰基-CoA参与微生物的代谢活动。一般地，对于一特定的烷烃，微生物降解产物脂肪酸是一彼此相差两个碳的混合酸，只是降解条件和碳数的不同，混合酸的碳数分布各异。该菌株对原油降解的成分分析结果表明，混合肪酸酸的碳数集中在C₂-C₂₀范围内。这说明该菌株对原油的生物氧化可能从一较为特殊的途径——次末端氧化(subterminal oxidation)开始(如图10)。原油中高碳链饱和烃首先经次末端氧化生成两种中碳链的脂肪酸，再进行末端氧化和β-氧化。
实施例3、菌株发酵液的分析
1、发酵液的有机酸定性和定量分析
(1)有机酸的定性分析结果
利用6890N/5973N气-质联用仪(美国Agilent公司)，FFAP石英毛细管柱(0.25mm×30m)，载气为高纯氦气，流量1ml/min，汽化室温度250℃，柱温采用程序升温，开始温度为160℃，速率为2℃/min，最终温度为180℃，进样量0.5μl，按照常规方法进行有机酸的定性测定，有机酸标样的色谱图如图11a，在色谱条件下的保留时间如表6所示。
HP样品的有机酸气相色谱图如图11b。经质谱检测和与有机酸标样对照，HP样品中含有四种有机酸即乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸，有机酸质谱检测图如图12a、12b、12c和12d所示。
                 表6.有机酸标样的保留时间
                   乙酸      丙酸      丁酸       异戊酸
保留时间(min)      2.16      2.50      2.99       3.26
(2)有机酸的定量分析结果
①水样蒸馏效果试验
该提取方法(量取预处理后的样品100ml，置于蒸馏烧瓶中，加7ml磷酸酸化，蒸馏。当蒸馏烧瓶剩下少量溶液时，稍冷，再分两次各加20ml蒸馏水继续蒸馏。用NaOH溶液中和馏出液，用酸度计控制PH为8-9。用旋转蒸发仪浓缩至5ml左右后，将试样转入10ml容量瓶中，用盐酸酸化至PH≤3，定容，待测有机酸)能充分地提取出各种有机酸，做了蒸馏效果试验。即各取100ml五份HP发酵液，经上述方法处理进行测定，结果如表7所示：
                     表7.有机酸蒸馏效果试验
                    测定值                           变异系
有机酸                                标准偏
                    (五次平均：                      数
                    mg/L)                            (％)
乙酸                24.35             1.02           4.2
丙酸                20.41             0.73           3.6
丁酸                3.082             0.16           5.3
异戊酸              1.269             0.37           1.6
表7表明：同一样品五次测定结果重现性较好，说明采用蒸馏的方法可以充分地将水样中的低分子量有机酸蒸出。
②HP样品的有机酸定量分析
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP菌种在含有K₂HPO₄ 0.1％，NaH₂PO₄ 0.2％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，CaCl₂·2H₂O 0.001％，FeSO₄·7H₂O 0.001％，酵母0.1％，PH 7.0-7.2，碳源为10％原油的培养基中，45℃，分别在120rpm摇床培养5天后的培养液分别做三个平行样，按6890N/5973N气-质联用仪(美国Agilent公司)，FFAP石英毛细管柱(0.25mm×30m)，载气为高纯氦气，流量1ml/min，汽化室温度250℃，柱温采用程序升温，开始温度为160℃，速率为2℃/min，最终温度为180℃，进样量0.5μl分别进行测定，得到有机酸浓度平均值，结果如表8所示，表明HP样品中乙酸含量较大，以乙酸为主。
计算公式：
标样浓度(mg/L)＝20/50×ρ×1000＝400ρ(ρ为标样密度，g/ml)


              表8.HP样品中有机酸的定量分析结果
            浓度(mg/L)    标准偏差      变异系数(％)    摩尔浓度(mmol/L)
乙酸        23.22         1.49          6.4             0.3870
丙酸        21.12         1.18          5.6             0.2854
丁酸        2.932         0.12          4.1             0.0333
异戊酸      7.201         0.47          3.6             0.07060
总酸量                    0.7763mmol/L
2、发酵液的有机醇定性和定量分析
利用6890N/5973N气-质联用仪(美国Agilent公司)，FFAP石英毛细管柱(0.25mm×30m)，载气为高纯氦气，流量1ml/min，汽化室温度200℃，柱温采用程序升温，开始温度为80℃，保留1分钟，速率为4℃/min，最终温度110℃，进样量1.0μl，按照常规方法进行有机醇的定性测定，有机醇标样的色谱图如图13a所示，表明在该色谱条件下，四种有机醇分离效果很好；在色谱条件下的保留时间如表9所示。
HP样品的有机醇气相色谱图如图13b所示。经质谱检测，HP样品中未检测到有机醇。
                      表9.有机醇标样的保留时间
                   乙醇        丙醇        丁醇        戊醇
保留时间(min)      1.93        2.47        3.51        5.00
3、生物表面活性剂的鉴定
(1)生物表面活性剂的初步鉴定
①脂肽类生物表面活性剂的鉴定
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP在含有K₂HPO₄ 0.1％，NaH₂PO₄ 0.2％，NH₄)₂SO₄ 0.2％，CaCl₂·2H₂O 0.001％，FeSO₄·7H₂O 0.001％，酵母0.1％，PH 7.0-7.2，碳源为10％原油的培养基中，45℃，分别在120rpm摇床培养5天后的培养液50ml，用浓盐酸调PH值至2，4℃静置过夜，观察是否有沉淀产生。结果表明该发酵液无沉淀产生，由此证明该发酵液中不含有脂肽类生物表面活性剂。
②紫外吸收鉴定
对按常规方法提纯后的生物表面活性剂做了紫外吸收测定，它们在紫外范围内均无吸收。可以初步判断不含有芳香族化合物。
(2)生物表面活性剂的元素分析
对按常规方法提纯得到的两种生物表面活性剂进行了C、H、N含量的测定，数据如表10所示：
                    表10.生物表面活性剂的元素分析结果
                       C(％)      H(％)      N(％)
HP中提取的B物质         73.26        12.23        3.01
HP中提取的C物质         73.64        10.82        3.15
表10表明这两种生物表面活性剂N的含量都在3.5％以下，而文献上报道的氨基酸中N的含量都在10％以上，可见，这两种生物表面活性剂不是氨基酸和脂肽类。并且用茚三酮溶液检测，没有出现氨基酸的特征反应，进一步确定了上述结论。
(3)生物表面活性剂的红外光谱分析
HP样品提纯后得到的B物质的红外谱图分别如图14所示，表明2924--2853cm^-1、1456cm^-1是甲基、亚甲基的C-H振动峰，没有其它生物表面活性剂的特征峰。
HP样品提纯后得到的C物质的红外谱图如图15所示，表明2872cm^-1、1455cm^-1是甲基、亚甲基的C-H振动峰；在1724cm^-1附近的峰为C＝O的伸缩振动；在1103cm^-1附近为C-O-C的对称伸缩振动，表明有酯的存在。在3400cm^-1有明显的O-H的伸缩振动峰，表明化合物中有羟基。
从紫外和红外谱图分析，HP样品提纯后得到的C物质为脂类表面活性剂。但用对糖类的定性方法即蒽酮试剂法测定，又不显糖类的特征反应。因此C物质应是一种新型脂类表面活性剂。
4、HP菌株发酵液的界面张力分析
利用德国LAUDA公司生产的滴体积界面张力仪，在45℃动态情况下对蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HP在含有K₂HPO₄ 0.1％，NaH₂PO₄ 0.2％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，CaCl₂·2H₂O 0.001％，FeSO₄·7H₂O 0.001％，酵母0.1％，PH 7.0-7.2，碳源为10％原油的培养基中，45℃，分别在120rpm摇床培养5天后的培养液与原油间界面张力进行了检测，检测结果如表11所示，表明HP菌株可以很好的代谢生物表面活性剂。细菌的代谢产物中生物表面活性剂具有亲水和疏水基团，在油水界面上定向排列，改善界面活性，降低界面张力。
表11.HP菌株发酵液的界面张力测定数据    样品名称    界面张力(mN/m)    地层水    30.24    HP    11.57