核酸扩增判定方法以及核酸扩增判定装置.pdf

提供了一种扩增判定方法，其能够对经核酸扩增处理后的样品判断目标核酸是否被扩增。准备示出各温度下的核酸扩增处理后的样品熔解状态的信号值，并检索最大信号值(A)。另一方面，对上述各温度下的上述信号值进行连续的2点间的微分而得到微分值，再对上述微分值进行连续的4点间的微分而得到二次微分值。在上述二次微分值中，从包括上述扩增目标的核酸的Tm值在内的预定温度范围下的二次微分值中，选出最大的二次微分值(Dmax’)和最小的二次微分值(Dmin’)，根据式(B)＝(Dmax’)-(Dmin’)算得二次微分值的最大差(B)。进行式X＝(B)/(A)的运算，当上述X满足[X＞预定阈值]时，判断为扩增正常，当上述X满足[X≤预定阈值]时，判断为扩增不良。

1.  一种扩增判定方法，其是对经核酸扩增处理后的样品判定目标核酸是否被扩增的扩增判定方法，其包括：
信号值准备工序，该工序准备示出各温度下的上述处理后样品的熔解状态的信号值；
最大值(A)检索工序，该工序从上述各温度下的上述信号值中检索最大值(A)；
微分运算工序，该工序对上述各温度下的上述信号值进行连续的信号值间的微分，得到微分值；
二次微分运算工序，该工序对上述工序得到的微分值进行连续的微分值间的微分，得到二次微分值；
最大差(B)运算工序，该工序从上述工序得到的二次微分值内，从包括上述目标核酸的Tm值在内的预定温度范围下的二次微分值中，选出最大的二次微分值(D_max’)和最小的二次微分值(D_min’)，根据下式算得二次微分值的最大差(B)：
B＝(D_max’)-(D_min’)；
运算工序，该工序用上述最大值(A)以及上述最大差(B)进行下式的运算：
X＝(B)/(A)；
以及
判定工序，该工序将上述X满足[X＞预定阈值]的情况判断为扩增正常，将上述X满足[X≤预定阈值]的情况判断为扩增不良。

2.  根据权利要求1所述的扩增判定方法，上述微分运算工序中，进行连续的2点间的微分而得到微分值。

3.  根据权利要求1所述的扩增判定方法，上述二次微分运算工序中，进行连续的4点间的微分而得到二次微分值。

4.  根据权利要求1所述的扩增判定方法，上述目标核酸是靶位点具有多态性的核酸。

5.  根据权利要求4所述的扩增判定方法，上述目标核酸的Tm值是由上述靶位点具有多态性的核酸和能够与上述靶位点杂交的核酸构成的双链核酸的Tm值。

6.  根据权利要求5所述的扩增判定方法，
在能与上述靶位点杂交的核酸是野生型的能与上述靶位点杂交的核酸的情况下，
上述目标核酸的Tm值是：由上述靶位点为野生型的核酸和能与上述野生型的靶位点杂交的核酸构成的双链核酸的Tm_H值、以及由上述靶位点为突变型的核酸和能与上述野生型的靶位点杂交的核酸构成的双链核酸的Tm_L值；
在能与上述靶位点杂交的核酸是突变型的能与上述靶位点杂交的核酸的情况下，
上述目标核酸的Tm值是：由上述靶位点为突变型的核酸和能与上述突变型的靶位点杂交的核酸构成的双链核酸的Tm_H值、以及由上述靶位点为野生型的核酸和能与上述突变型的靶位点杂交的核酸构成的双链核酸的Tm_L值。

7.  根据权利要求6所述的扩增判定方法，在上述最大差(B)运算工序中，包括上述目标核酸的Tm值在内的预定温度范围的下限是比Tm_L值低1～20℃的温度，上限是比Tm_H值高1～20℃的温度。

8.  根据权利要求7所述的扩增判定方法，上述温度范围是[Tm_L值-5]℃～[Tm_H值+5]℃。

9.  根据权利要求1所述的扩增判定方法，在上述信号值准备工序之前，还具有：
温度变化工序，该工序改变上述核酸扩增处理后的样品的温度；
以及
检测工序，该工序连续或断续地检测示出温度变化时上述处理后的样品的熔解状态的信号值。

10.  根据权利要求9所述的扩增判定方法，
上述目标核酸是靶位点具有多态性的核酸，
在上述温度变化工序之前，具有向上述样品中添加能与上述靶位点杂交的核酸的添加工序。

11.  一种扩增判定系统，其是对经核酸扩增处理后的样品判定目标核酸是否被扩增的扩增判定系统，其包括：
信号值输入部，其输入示出各温度下的上述处理后样品的熔解状态的信号值；
最大值(A)检索部，其从通过上述信号值输入工序输入的、上述各温度下的上述信号值中检索最大值(A)；
微分运算部，其对上述各温度下的上述信号值进行连续的信号值间的微分，得到微分值；
二次微分运算部，其对由上述微分运算部得到的微分值进行连续的微分值间的微分，得到二次微分值；
最大差(B)运算部，其在由上述二次微分运算部得到的二次微分值内，从包括上述目标核酸的Tm值在内的预定温度范围下的二次微分值中，选出最大的二次微分值(D_max’)与最小的二次微分值(D_min’)，根据下式得到二次微分值的最大差(B)，
B＝(D_max’)-(D_min’)；
运算部，其用上述最大值(A)和上述最大差(B)进行下式的运算，
X＝(B)/(A)；
以及
判定部，其将上述X满足[X＞预定阈值]的情况判断为扩增正常，将上述X满足[X≤预定阈值]的情况判断为扩增不良。

12.  根据权利要求11所述的扩增判定系统，上述微分运算部中，进行连续的2点间的微分，得到二次微分值。

13.  根据权利要求11所述的扩增判定系统，上述二次微分运算部中，进行连续的4点间的微分，得到二次微分值。

14.  根据权利要求11所述的扩增判定系统，上述目标核酸是靶位点具有多态性的核酸。

15.  根据权利要求14所述的扩增判定系统，上述目标核酸的Tm值是由上述靶位点具有多态性的核酸和能与上述靶位点杂交的核酸构成的双链核酸的Tm值。

16.  根据权利要求15所述的扩增判定系统，
在能与上述靶位点杂交的核酸是野生型的能与上述靶位点杂交的核酸的情况下，
上述目标核酸的Tm值是：由上述靶位点为野生型的核酸和能与上述野生型的靶位点杂交的核酸构成的双链核酸的Tm_H值、以及由上述靶位点为突变型的核酸和能与上述野生型的靶位点杂交的核酸构成的双链核酸的Tm_L值；
在能与上述靶位点杂交的核酸是突变型的能与上述靶位点杂交的核酸的情况下，
上述目标核酸的Tm值是：由上述靶位点为突变型的核酸和能与上述突变型的靶位点杂交的核酸构成的双链核酸的Tm_H值、以及由上述靶位点为野生型的核酸和能与上述突变型的靶位点杂交的核酸构成的双链核酸的Tm_L值。

17.  根据权利要求16所述的扩增判定系统，在上述最大差(B)运算部中，包括上述目标核酸的Tm值在内的预定温度范围的下限是比Tm_L值低1～20℃的温度，上限是比Tm_H值高1～20℃的温度。

18.  根据权利要求17所述的扩增判定系统，上述温度范围是[Tm_L值-5]℃～[Tm_H值+5]℃。

19.  一种扩增判定装置，其是对经核酸扩增处理后的样品判定目标核酸是否被扩增的扩增判定装置，
其包括权利要求11所述的扩增判定系统。

核酸扩增判定方法以及核酸扩增判定装置
技术领域
本发明涉及核酸扩增判定方法、核酸扩增判定系统、核酸扩增判定装置、能在计算机上执行上述判定方法的计算机程序以及存储该程序的电子介质。
背景技术
近年来，作为检测基因多态性及突变等的方法，广泛采用解析由靶核酸和探针形成的双链核酸的熔解曲线的方法(熔解曲线解析方法)。根据上述熔解曲线解析方法，通过对上述熔解曲线解析上述双链的熔解温度(Tm：melting temperature)处有无峰，能够判断基因的多态性(基因型)以及检测有无突变。
通常Tm如下进行定义。持续加热含双链核酸的溶液，260nm处吸光度将上升。其原因是双链核酸中的双链间的氢键由于加热而解开，解离成单链核酸(双链核酸的熔解)。并且，全部双链核酸解离成单链核酸时，其吸光度显示为加热开始时的吸光度(只有双链核酸时的吸光度)的大约1.5倍左右，由此可判断熔解完成。基于此种现象，熔解温度Tm(℃)通常被定义为吸光度到达吸光度总上升量的50％时的温度。
利用双链核酸的这种特性，例如，可如下所述检测靶位点的多态性及突变。即，用与包含突变型靶位点的靶核酸序列互补的突变型检测用探针，使分析对象的单链核酸与上述探针形成双链核酸，对形成的双链核酸实施加热处理，通过测定吸光度等信号来检测伴随温度上升的双链的解离，基于该检测结果，根据Tm值处的上述信号的行为来判断靶位点有无突变的方法(参见非专利文献1、专利文献1)。双链核酸的同源性越高，则Tm值越高，同源性越低则Tm值越低。因而，可事先分别对由包含突变型靶位点的靶核酸序列以及与其100％互补的突变型检测用探针构成的双链DNA、以及由上述靶位点为野生型的核酸序列与上述突变型检测用探针构成的双链DNA，求出作为评价基准的Tm值。如上所述，由于同源性越高Tm值也越高，因此前者即靶位点为突变型时的Tm值(以下也称为“Tm_m值”)相对较高，后者即靶位点为野生型时的Tm值(以下也称为“Tm_w值”)相对较低。然后制作出由分析对象的单链核酸与上述突变型检测用探针形成的双链核酸的熔解曲线，确认在预先求得的Tm_m值和Tm_w值中哪个值处存在信号峰。其结果，在Tm_m值附近存在峰的情况下，由于与上述突变型检测用探针100％匹配，因此可判断分析对象的单链核酸为突变型的多态性。另一方面，在Tm_w值附近存在峰的情况下，由于上述突变型检测用探针有1个碱基错配，因此可判断分析对象的单链核酸为野生型的多态性。此外，还可判断多态性是纯合型还是杂合型。即，分析一对等位基因时，当Tm_m值附近和Tm_w值附近双方均存在峰时可判断为杂合型，另一方面，当仅在Tm_m值附近存在峰时可判断为突变型的纯合型，当仅在Tm_w值附近存在峰时可判断为野生型的纯合型。
在进行这种熔解曲线解析时，通常对含RNA、DNA的样品进行上述靶核酸序列的扩增处理，对得到的扩增产物，使其与如上所述的探针形成双链并加热进行解离。然而，扩增处理中，无法充分扩增上述靶核酸序列时，将出现误判断多态性的问题。因此在现有方法中，对上述扩增处理后的样品，制作示出各温度与表示上述各温度下的样品熔解状态的信号值或信号值的微分值(以下称为“信号微分值”)的关系的熔解曲线图，目视判断上述靶核酸序列的Tm_m值或Tm_w值附近是否存在峰。但是在这种基因解析的判断中必须具备专业知识，例如难以很简单地判断出是否存在峰。此外，目视判断时，判断基准存在个体差异，这也是一个问题。因此，在现有的方法中，即使对没有正常进行核酸扩增的样品也一直进行到最终的熔解曲线解析，存在费力的问题。此外，由于这种原因，导致在一般的分析和诊断现场利用熔解曲线解析进行基因分析、基因诊断的用途难以推广。此外，由于其专业性等，一次性分析多个受试体也是相当困难的。
非专利文献1：クリニカル·ケミストリ一，2000年，第46号，第5号，p631-635；
专利文献1：日本特开2005-58107号公报
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种扩增判定方法，其能够对经核酸扩增处理后的样品判断目标核酸是否被扩增。此外，本发明的目的是提供用于实施这种扩增判定方法的扩增判定系统、扩增判定装置、程序以及电子介质。
为了实现上述目的，本发明的扩增判定方法，其特征在于，其是能够对经核酸扩增处理后的样品判断目标核酸是否被扩增的扩增判定方法，其包括：
信号值准备工序，该工序准备示出各温度下的上述处理后样品的熔解状态的信号值；
最大值(A)检索工序，该工序从上述各温度下的上述信号值中检索最大值(A)；
微分运算工序，该工序对上述各温度下的上述信号值进行连续的信号值间的微分，得到微分值；
二次微分运算工序，该工序对上述工序得到的微分值进行连续的微分值间的微分，得到二次微分值；
最大差(B)运算工序，该工序从上述工序得到的二次微分值内，从包括上述目标核酸的Tm值在内的预定温度范围下的二次微分值中，选出最大的二次微分值(D_max’)和最小的二次微分值(D_min’)，根据下式算得二次微分值的最大差(B)：
B＝(D_max’)-(D_min’)；
运算工序，该工序用上述最大值(A)以及上述最大差(B)进行下式的运算：
X＝(B)/(A)；
以及
判定工序，该工序将上述X满足[X＞预定阈值]的情况判断为扩增正常；将上述X满足[X≤预定阈值]的情况判断为扩增不良。
依据本发明，利用如上所述的二次微分等运算，可容易地判定目标核酸是否被扩增。因此，可避免例如像以前那样进行判定的个人的判定基准的不同、以及必须具有专业知识的问题。此外，由于能够容易地判断目标核酸有无扩增，因此例如对将导致基因型判断错误的、显示扩增不良的样品，能够中止此后的熔解曲线解析。因而，最终能更容易地以高可靠性进行熔解曲线解析。特别是，通过在现有的基因解析装置等中组装本发明的系统，例如当然能确认有无扩增，还能全自动化地进行从核酸的扩增至基因型的判断。因此，本发明例如在一般的分析和诊断现场也能使用，扩大了用途，能容易地进行大量受试体的解析，可以说尤其在基因解析领域中是极为有用的技术。
附图说明
图1是使用了本发明的系统的单机型装置的一个例子的总结构图。
图2是使用了本发明的系统的联网利用型装置的一个例子的总结构图。
图3是示出上述单机型装置的机器结构的一个例子的框图。
图4是示出上述联网型装置的机器结构的一个例子的框图。
图5是用于实施本发明的系统的流程图的一个例子。
图6是示出本发明的实施方式中的熔解曲线的图表。
图7是示出本发明的实施方式中的微分曲线的图表。
图8是示出本发明的实施方式中的二次微分曲线的图表。
图9是示出本发明的实施方式中的X＝(B)/(A)的图表。
具体实施方式
在本发明中，表示样品熔解状态的信号，例如可以是由上述样品的非熔解而产生、由上述样品的熔解而产生受到抑制的信号，相反也可以是由上述样品的非熔解而产生受到抑制、由上述样品的熔解而产生的信号。在本发明中，信号微分值例如可以用[dF/dT]表示，也可以用[-dF/dT]表示。dF表示信号值的变化量，dT表示温度的变化量。当信号的产生由于样品熔解而被抑制时，在用[dF/dT]表示信号微分值的熔解曲线中，峰是谷型的；在用[-dF/dT]表示信号微分值的熔解曲线中，峰是山型的。此外，当由于上述样品熔解而产生信号时，在用[dF/dT]表示信号微分值的熔解曲线中，峰是山型的；在用[-dF/dT]表示信号微分值的熔解曲线中，峰是谷型的。予以说明，无论在样品的熔解和非熔解的任一状态下产生信号，以及用任一个式子表示信号微分值的情况下，都可通过信号微分值的绝对值的大小来评价峰的大小。
在本发明中，信号值的种类没有特别限制，例如可举出吸光度(吸收强度)、荧光强度等。上述信号的具体例子可举出例如是如上所述的由于双链熔解而增加的260nm下的吸光度。此外，当使用荧光物时，上述信号值还可以是由于与上述荧光物相应的激发光而发出的荧光的强度。如上所述，上述荧光物可以是由于双链形成(非熔解)而发出荧光的物质，也可以是由于双链熔解而发出荧光的物质。作为荧光物的具体例子，可举出溴乙锭及如SYBR(注册商标)Green那样的嵌入剂。这些物质通常由于双链形成(非熔解)而发出荧光，由于双链熔解而抑制荧光产生。此外，上述荧光物例如可以与构成双链核酸的至少一个单链核酸结合。作为上述的结合了荧光物的单链核酸，可举出例如作为鸟嘌呤猝灭探针而已知的QProbe(注册商标)那样的荧光猝灭探针。上述荧光猝灭探针通常因双链形成而荧光消失，且由于双链熔解而产生荧光。予以说明，本发明的特征在于信号值的处理，而信号的种类等没有任何限制。
<扩增判定方法>
对本发明的扩增判定方法列举一个例子进行说明，该例中，扩增的目标核酸(以下称为“靶核酸”)是靶位点具有多态性的核酸，上述目标核酸的Tm值是由上述靶位点具有多态性的核酸和能够与上述靶位点杂交的核酸(以下称为“检测用核酸”)构成的双链核酸的Tm值。予以说明，本发明不限于此。
信号值准备工序
首先，准备表示各温度下的上述处理后样品的熔解状态的信号值。
上述信号值的温度间隔没有特别限制，例如是0.1～5℃的间隔，优选为0.2～3℃的间隔，更优选为0.8～1.2℃的间隔。此外，上述温度间隔例如虽然可以不同，但优选为等间隔。
信号值例如优选是对包括Tm值在内的温度范围进行准备。在上述靶位点具有多态性的情况下，如后所述，作为由上述靶核酸与上述检测用核酸构成的双链核酸的Tm值，假定一个相对较高温度的Tm_H值和相对较低温度的Tm_L值。因此，信号值例如优选对包括Tm_H值和Tm_L值两者在内的较宽的温度范围进行准备。上述温度范围例如下限优选是比Tm_L值低1～20℃的温度、更优选比Tm_L值低1～10℃的温度；上限优选是比Tm_H值高1～20℃的温度、更优选比Tm_H值高1～10℃的温度。作为具体例子，上述温度范围优选为[Tm_L值-5]℃～[Tm_H值+5]℃。
在上述靶位点具有多态性的情况下，上述靶核酸可以考虑上述靶位点为野生型的靶核酸(以下称为“野生型靶核酸”)以及上述靶位点为突变型的靶核酸(以下称为“突变型靶核酸”)。通常上述野生型靶核酸与突变型靶核酸仅在上述靶位点有一个碱基不同，因此上述双链核酸的Tm值可举出例如与上述检测用核酸100％匹配的双链的Tm_H值以及与上述检测用核酸有1个碱基错配的双链的Tm_L值。由于Tm值会随着双链的同源性的相对升高而变高、相对降低而变低，因此，前者即Tm_H值比后者即Tm_L值的温度更高。作为具体例子，例如在使用能与突变型的靶位点杂交的检测用核酸(以下称为“突变型检测用核酸”)的情况时，可举出突变型靶核酸与上述突变型检测用核酸构成的双链核酸的Tm值以及野生型靶核酸与上述突变型检测核酸构成的双链核酸的Tm值。在这种情况中，前者的Tm值成为Tm_H值，后者的Tm值成为Tm_L值。相反，在使用能与野生型靶位点杂交的检测用核酸(以下称为“野生型检测用核酸”)的情况中，可举出野生型靶核酸与上述野生型检测用核酸构成的双链核酸的Tm值以及突变型的靶核酸与上述野生型检测用核酸构成的双链核酸的Tm值。在这种情况中，前者的Tm值成为Tm_H值，后者的Tm值成为Tm_L值。且，上述Tm值可根据上述靶核酸的序列及上述检测用核酸的序列等适当确定，更具体地，例如可用目前公知的MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com/)等算出，或可由毗邻法(Nearest Neighbor Method)确定(如下相同)。在本实施方式中，表示上述处理后样品的熔解状态的信号值，例如也可以说是表示上述处理后的样品中上述靶核酸的扩增物和能与上述靶核酸杂交的检测用核酸构成的双链核酸的熔解状态的信号值。
最大值(A)检索工序
接着，从上述各温度下的上述信号值中检索最大值(A)。这时，当无法检索最大值(A)时，可判断为扩增不良。
微分运算工序
接着，对上述各温度下的上述信号值进行连续的信号值间的微分而得到微分值。上述微分没有特别限制，但优选例如连续的2点间～10点间的微分，更优选连续的2点间～5点间的，特别优选连续的2点间的微分。例如在进行2点间的微分的情况下，任意点(p)的微分值(D_p)可以是任意点(p)的信号值(S_p)与相邻近的点(p+1)的信号值(S_p+1)间的微分值，也可以是任意点(p)的信号值(S_p)与相邻近的点(p-1)的信号值(S_p-1)间的微分值，但优选各点以相同方式求得微分值。在前者的情况下，p为正整数，在后者的情况下，p为2以上的正整数。
二次微分运算工序
此外，对上述工序得到的微分值进行连续的多点间的微分而得到二次微分值。上述微分值的微分例如优选在连续的2～10点间，更优选在3～7点间，进一步优选在3～5点间，特别优选在4点间进行。作为具体的例子，在进行4点间的微分的情况下，任意点(p)的二次微分值(D_p’)例如可以是下述例1～例3中的任一个，但优选各点以相同方式求得二次微分值。例1中，任意点(p)的二次微分值(D_p’)例如可根据点(p)、(p+1)、(p+2)、(p+3)总共4点间的微分算出，例2中根据点(p-1)、(p)、(p+1)、(p+2)总共4点间的微分算出，例3中根据点(p-2)、(p-1)、(p)、(p+1)总共4点间的微分算出。在上述例1的情况中上述p是正整数，在上述例2的情况中p是2以上的正整数，在上述例3的情况中，p是3以上的正整数。
最大差(B)运算工序
在上述工序得到的二次微分值内，从包括上述扩增目标核酸的Tm值在内的预定温度范围中的二次微分值中，选出最大的二次微分值(D_max’)与最小的二次微分值(D_min’)，根据下式得到最大差(B)：
(B)＝(D_max’)-(D_min’)。
上述预定温度范围只要包含上述扩增目标核酸的Tm值在内即可，但在本实施方式中，例如，如上所述是包含Tm_H值以及Tm_L值两者的温度范围。具体的例子是，上述温度范围的下限优选为比Tm_L值低1～20℃的温度，更优选为比Tm_L值低1～10℃的温度，进一步优选为[Tm_L值-5]℃。上述温度范围的上限优选为比Tm_H值高1～20℃的温度，更优选为比Tm_H值高1～10℃的温度，进一步优选为[Tm_H值+5]℃。在本工序中，可以从上述预定温度范围中的二次微分值中选出上述最大值和最小值。因此，例如在上述二次微分运算工序中，仅获得上述预定温度范围的二次微分值也是足够的。而且，在上述微分运算工序中，仅在可得到上述预定温度范围的二次微分值的范围下获得微分值也是足够的。
X运算工序
用上述最大值(A)及上述最大差(B)进行下式的运算：
X＝(B)/(A)。
判定工序
当上述X满足[X＞预定阈值]时，判断为扩增正常，当上述X满足[X≤预定阈值]时，判断为扩增不良。且，在本发明中，扩增正常意味着例如靶核酸被扩增、认为可进行可靠的基因解析的状态；扩增不良意味着例如没有被扩增、几乎没有被扩增或其它核酸被扩增等情况，无法进行可靠的基因解析，或有无法进行可靠的基因解析的担忧的状态。
上述阈值可根据例如信号的种类、信号的检测波长、发出信号(荧光)的荧光物的种类、扩增目标的核酸及上述核酸的靶位点的多态性的种类、检测用核酸的序列、形成双链核酸时的反应溶液组成等进行适宜的设定。本发明的特征不是阈值的具体的值及其设定方法，也不受其任何限定。此外，阈值的设定方法的一个例子如后所述。
本发明的扩增判定方法例如优选还具有将得到的判定结果的信息进行输出的输出工序。上述判定结果例如可举出扩增正常与否的项目。输出时例如可以仅输出判定结果，也可以将上述X值、温度与微分值作图而得到的熔解曲线的图、温度与二次微分值作图而得到的图表等与上述判定结果一起输出。
另外，上述信号值准备工序中的信号值可以使用例如通过预先检测而得到的数据，但也可以在信号值准备工序之前通过信号值的检测来进行准备。具体而言，在上述信号值准备工序之前，进一步还可以具有改变扩增处理后的样品(例如双链核酸)的温度的温度变化工序、以及连续或断续地检测示出温度变化时上述样品的熔解状态的信号值的检测工序。上述温度变化工序例如可以是加热上述样品的加热工序，也可以是使已被加热的样品冷却的冷却工序，但优选上述加热工序。
此外，在上述温度变化工序之前，可包含对样品进行核酸扩增处理的核酸扩增工序。这时，上述检测用核酸例如可以添加至核酸扩增处理后的样品中，但优选在核酸扩增处理之前将前述检测用核酸添加至处理前的样品中，因为这样能够连续进行处理。
更具体地，以图6～8所示的图表为例，说明本发明的扩增判定方法。图6是示出温度与信号值的关系的图表(熔解曲线)；图7是示出温度与信号微分值的关系的图表(微分曲线)；图8是示出温度与二次微分值的关系的图表(二次微分曲线)。在图6中，Y轴是信号值；在图7中，Y轴是信号微分值；在图8中，Y轴是二次微分值；在各图中X轴均为温度。此外，相对较低的Tm_L值为50℃，相对较高的Tm_H值为56℃，上述最大差(B)运算工序中的温度范围设定为45℃(Tm_L值-5℃)～61℃(Tm_H值+5℃)。然而，它们仅是例示，并不对本发明构成限制。
如图6所示，准备示出温度与各温度下的信号值的关系的图表，检索最大值(A)。另一方面，如图7所示，对上述信号值进行微分，制作示出温度与各温度下的微分值的关系的图表。接着，如图8所示，对上述微分值进行微分，制作示出上述温度范围45～61℃与各温度下的二次微分值的关系的图表。接着，在上述图8的图表中，选出最大的二次微分值(D_max’)与最小的二次微分值(D_min’)，根据式(B)＝(D_max’)-(D_min’)算出二次微分值的最大差(B)。然后，用上述最大值(A)与上述最大差(B)进行式[X＝(B)/(A)]的运算。当得到的X满足[X＞预定阈值]时，判断为扩增正常，当满足[X≤预定阈值]时，判断为扩增不良。可以仅对判断为扩增正常的上述核酸扩增处理后的样品进行例如如后所述的熔解曲线解析，进行多态性的判定。
此外，上述图6～8是伴随着温度上升所引起的双链核酸解离而信号值增加的例子，但在伴随着温度上升所引起的双链核酸解离而信号值减少的情况下，同样也可求得信号值的最大值(A)、二次微分值的最大差(B)，通过上述X的运算，能判断扩增是正常还是不良。而且，在这个例子中，虽然例示出了3种图表，但在本发明中各种图表的制作不是必须的。
在本发明中，如上所述，上述X的阈值没有任何限制，可根据靶核酸(基因)的种类及多态性的种类等适宜确定。下文中例示出了阈值的设定方法，但本发明不受其限制。
X的阈值例如可如下所述确定。首先，对多个核酸受试体进行核酸扩增处理，确认目标靶核酸的扩增是正常还是不良。接着，对由各核酸受试体得到的扩增物与检测用核酸构成的双链，检测各温度下的信号值，与上述同样地，确定上述最大值(A)及上述最大差(B)，以及进行X＝(B)/(A)的运算。随后，制作对各核酸受试体的X作图而成的图表。图9中示出了这种图表的一个例子。如该图所示，扩增正常的核酸受试体(■)与扩增不良的核酸受试体(◆)的上述X值明显不同。因此，从该图表求出扩增正常及扩增不良的X的临界值，将其确定为上述阈值。
在本发明的扩增判定方法中，上述目标核酸不限于如上所述的假定了2个Tm值的上述靶位点具有多态性的靶核酸。在1个Tm值的情况下，在上述最大差(B)运算工序中的包括Tm值在内的温度范围的下限例如优选为比Tm值低1～20℃的温度，更优选为比Tm值低1～10℃的温度，进一步优选为[Tm值-5]℃。上述温度范围的上限优选为比Tm值高1～20℃的温度，更优选为比Tm值高1～10℃的温度，进一步优选为[Tm值+5]℃。
本发明的扩增判定方法还可进一步包括解析上述核酸扩增处理后的样品的熔解曲线以判定预定温度范围内是否存在峰的熔解曲线解析工序。由此，可以仅对判断为扩增正常的样品进行熔解曲线解析，例如可进行多态性的解析(基因型的解析)。这样，依据本发明的方法，能排除对扩增不良的样品进行熔解曲线解析，因此与现有技术相比能更为迅速和高效地进行熔解曲线解析。而且，本发明通过包括熔解曲线解析工序，例如能连续进行从核酸扩增的判定至对判定为扩增正常的样品进行的熔解曲线解析以及多态性(基因型)的判定。因此，本发明的扩增判定方法例如还可称为熔解曲线解析方法或多态性解析方法(或基因型解析方法)。
本发明的扩增判定方法可由例如下述本发明的扩增判定系统、本发明的扩增判定装置、本发明的计算机程序的运行等来实现。
<扩增判定系统>
本发明的扩增判定系统，其特征在于，其是对经核酸扩增处理后的样品判断目标核酸是否被扩增的扩增判定系统，其包括：
信号值输入部，其输入表示各温度下的上述处理后样品的熔解状态的信号值；
最大值(A)检索部，其从通过上述信号值输入部中输入的、上述各温度下的上述信号值中检索最大值(A)；
微分运算部，其对上述各温度下的上述信号值进行连续的信号值间的微分，得到微分值；
二次微分运算部，其对由上述微分运算部得到的微分值进行连续的微分值间的微分，得到二次微分值；
最大差(B)运算部，其在由上述二次微分运算部得到的二次微分值内，从包括上述扩增目标的核酸的Tm值在内的预定温度范围下的二次微分值中，选出最大的二次微分值(D_max’)与最小的二次微分值(D_min’)，根据下式得到二次微分值的最大差(B)，
B＝(D_max’)-(D_min’)；
运算部，其用上述最大值(A)和上述最大差(B)进行下式的运算，
X＝(B)/(A)；
以及
判定部，其将上述X满足[X＞预定阈值]的情况判断为扩增正常，将上述X满足[X≤预定阈值]的情况判断为扩增不良。而且，只要没有特别示出，与上述本发明的扩增判定方法相同。
本发明的扩增判定系统中，上述微分运算部优选例如进行连续的2点间的微分而得到微分值，此外，上述二次微分值运算部优选例如进行连续的4点间的微分而得到二次微分值。
在本发明的扩增判定系统中，上述目标核酸优选为靶位点具有多态性的核酸。而且，上述目标核酸的Tm值优选为由上述靶位点具有多态性的核酸(靶核酸)与上述检测用核酸构成的双链核酸的Tm值。在上述检测用核酸为野生型检测用核酸的情况下，上述扩增目标的核酸的Tm值是例如由上述野生型靶核酸与上述野生型检测用核酸构成的双链核酸的Tm_H值以及由上述突变型靶核酸与上述野生型检测用核酸构成的双链核酸的Tm_L值。此外，在上述检测用核酸为突变型检测用核酸的情况下，上述扩增目标的核酸的Tm值是例如由上述突变型靶核酸与上述突变型检测用核酸构成的双链核酸的Tm_H值以及由上述野生型靶核酸与上述突变型检测用核酸构成的双链核酸的Tm_L值。
在上述最大差(B)运算部中，包括上述扩增目标的核酸的Tm值在内的预定温度范围的下限例如是比Tm_L值低1～20℃的温度，上限是比Tm_H值高1～20℃的温度，优选[Tm_L值-5]℃～[Tm_H值+5]℃的温度范围。
本发明的扩增判定系统还可具有改变上述核酸扩增处理后的样品的温度的温度变化部、以及连续或断续地检测示出温度变化时上述样品的熔解状态的信号值的检测部。上述温度变化部例如可以是加热样品的加热部，也可以是将已被加热的样品进行冷却的冷却部。上述温度变化部可举出例如能调节温度的温度调节器、加热器、热循环仪等，上述检测部可举出例如分光光度计及荧光光度计等。此外，装配两者的部分可举出例如实时PCR中使用的测定器等。上述信号例如是荧光，上述检测部优选检测荧光。
本发明的扩增判定系统还可包括对样品核酸进行扩增处理的核酸扩增部。
当上述目标核酸是靶位点具有多态性的核酸时，本发明的扩增判定系统还可具有向上述样品中添加能与上述靶位点杂交的核酸的添加部。
本发明的扩增判定系统还可包括解析上述核酸扩增处理后的样品的熔解曲线以解析预定温度范围中是否存在峰的熔解曲线解析部。
本发明的扩增判定系统优选例如还具有将得到的判定结果的信息进行输出的输出部。上述判定结果例如可举出扩增是否正常的项目。输出时，例如，可以仅输出判定结果，也可将上述X值、温度与微分值作图而得到的熔解曲线的图表、温度与二次微分值作图而得到的图表等与上述判定结果一起输出。
<联网型扩增判定系统以及用于该系统的终端>
本发明的扩增判定系统还可以是具有以下所示的终端和服务器的联网型系统。此外，只要没有特别示出，与上述扩增判定系统相同。即，本发明的扩增判定系统，其特征在于，其是对经核酸扩增处理后的样品解析目标核酸是否被扩增的联网型扩增判定系统，
其具有终端和服务器，
上述终端和上述服务器可经系统外的通信网络进行连接，
上述终端具有：
信号值输入部，其输入示出各温度下的上述处理后样品的熔解状态的信号值；
终端侧发送部，其经上述通信网络将上述终端内的信息发送至上述服务器；以及
终端侧接收部，其经上述通信网络接收从上述服务器发出的信息；
上述服务器包括：
服务器侧发送部，其经上述通信网络将上述服务器内的信息发送至上述终端；
服务器侧接收部，其经上述通信网络接收从上述终端发出的信息；
最大值(A)检索部，其从上述服务器侧接收部接收的上述各温度下的上述信号值中检索最大值(A)；
微分运算部，其对上述各温度下的上述信号值进行连续的信号值间的微分，得到微分值；
二次微分运算部，其对由上述微分运算部得到的微分值进行连续的微分值间的微分，得到二次微分值；
最大差(B)运算部，其在由上述二次微分运算部得到的二次微分值内，从包括上述扩增目标的核酸的Tm值在内的预定温度范围下的二次微分值中，选出最大的二次微分值(D_max’)与最小的二次微分值(D_min’)，根据下式得到二次微分值的最大差(B)，
(B)＝(D_max’)-(D_min’)；
运算部，其用上述最大值(A)和上述最大差(B)进行下式的运算，
X＝(B)/(A)；
以及
判定部，其将上述X满足[X＞预定阈值]的情况判断为扩增正常，将上述X满足[X≤预定阈值]的情况判断为扩增不良；
至少上述各温度下的上述信号值从上述终端侧发送部被发送至上述服务器侧接收部，并且，上述扩增正常或扩增不良的判定结果的信息从上述服务器侧发送部被发送至上述终端侧接收部。
本发明的终端的特征在于，其是用于本发明的联网型扩增判定系统的终端，
上述终端具有：
微分值输入部，其输入示出各温度下的样品的熔解状态的信号值；
终端侧发送部，其经上述通信网络将上述终端内的信息发送至上述服务器；
以及
终端侧接收部，其经上述通信网络接收上述服务器发出的信息；
至少上述各温度下的上述信号值从上述终端侧发送部被发送至上述服务器侧接收部，并且，上述扩增正常或扩增不良的判定结果的信息从上述服务器侧发送部被发送至上述终端侧接收部。
<扩增判定装置>
本发明的扩增判定装置的特征在于，其是对经核酸扩增处理后的样品判定目标核酸是否被扩增的扩增判定装置，其包括本发明的扩增判定系统。
<程序>
本发明的程序是可在计算机上执行本发明的扩增判定方法的计算机程序。
<电子介质>
本发明的电子介质是储存了本发明的计算机程序的电子介质。
接着，对本发明的实施例进行说明。
第一个系统结构的例子
图1示出了作为本发明的系统的结构的一个例子的单机型总结构图。图1示出的系统由本发明的扩增判定系统11构成，扩增判定系统11由数据输入输出部12以及扩增判定计算部13构成。图3示出了单机型扩增判定装置的硬件结构的一个例子。如图所示，扩增判定系统11由数据输入输出部12、扩增判定计算部13以及存储装置37构成。上述数据输入输出部12由具有执行程序的CPU31、输入输出I/F(接口)32、输入数据的输入装置33、输出数据的输出装置34的计算机构成。输入装置33可举出例如键盘及鼠标等，输出装置34可举出例如打印机及LED或液晶显示器等。扩增判定计算部由具有存储了程序的程序存储部36以及执行程序的CPU35的计算机构成。存储装置37中以能够调用的状态存储有例如各温度下的信号值、信号微分值、二次微分值、Tm值(Tm_H值、Tm_L值)、包括Tm值在内的预定温度范围、检测用探针的序列与种类(野生型检测用或突变型检测用)等数据。存储装置37可举出例如ROM、HDD、HD等，在CPU的控制下控制读取/写入，存储数据。且，数据输入输出部12、扩增判定计算部13、存储装置37是纯功能性的，例如可以一体化构成在1台计算机上，也可在多台计算机上分别构成。
此外，本发明的系统还可具有改变样品温度的温度变化部(例如进行加热处理的加热处理部)、连续或断续地检测示出温度变化时的样品的熔解状态的信号值的检测部。而且，可将上述检测部检出的信号值通过上述数据输入输出部进行输入。温度变化部可举出例如加热装置等。上述检测部可举出例如光学光度计及荧光光度计。上述加热处理部及上述检测部各自例如既可以是一体化构成在1台计算机上，也可以是在多台计算机上分别分别构成。
此外，本发明的系统还可进一步具有用于解析上述核酸扩增处理后的样品的熔解曲线以解析预定温度范围内是否存在峰的熔解曲线解析部。因此，根据本发明的系统，不仅可判断扩增是正常还是不良，还可对判断为正常的上述样品进一步进行熔解曲线解析，例如根据有无存在峰可判断出靶核酸的多态性(基因型)。而且，除此之外，还可配备用于从生物样品中提取核酸的核酸提取部、进行核酸扩增反应的扩增处理部等。通过以这种结构，例如可提供一种在一个系统中自动进行从核酸扩增到扩增的判定、或者由核酸的扩增直至多态性(基因型)的判定的核酸扩增系统。
第二个系统结构的例子
图2示出了用服务器处理的联网型系统的总结构图。如图2所示，本实施方式的系统由本发明的扩增判定系统21、以及扩增判定计算部23构成的服务器系统24构成。扩增判定系统21由数据输入输出部22构成。扩增判定系统21与服务器系统24可通过例如作为基于TCP(传输控制协议)/IP(因特网协议)的因特网而起作用的公用网及专用线等通信线路100进行连接。图4示出了上述联网型系统的装置的结构的一个例子。扩增判定系统21由数据输入输出部22及通信I/F(接口)47构成，经通信I/F47与通信线路100连接。服务器系统24由扩增判定计算部23及通信I/F48构成，通过通信I/F48与通信线路100连接。数据输入输出部22由执行程序的CPU41、输入输出I/F42、输入数据的输入装置43以及输出数据的输出装置44构成。上述数据输入输出部22及通信I/F47是纯功能性的，例如可以是一体化构成在一台计算机上，也可以在多台计算机上分别构成。扩增判定计算部23由执行程序的CPU45以及存储程序的程序存储部46构成。扩增判定计算部23及通信I/F48是纯功能性的，例如可以是一体化构成在一台计算机上，也可以在多台计算机上分别构成。
系统的基本处理的例子
图5的流程图示出了本发明的扩增判定系统的基本处理的例子。以下按照该图说明处理的流程。而且，本发明的系统中的各处理步骤，可通过适当利用例如CPU、主存储器、总线、或二次存储装置、打印机及显示器、其它外部周边装置等硬件结构部、以及其它外部周边仪器用输入输出(I/O)端口、用于控制这些硬件的驱动程序以及其它应用程序等来执行。
[1]输入各温度下的信号值。
[2]检索最大值(A)。
[3]对各温度下的信号值进行微分。
[4]对信号微分值再次进行微分。
[5]从上述二次微分值中检索最大的二次微分值与最小的二次微分值。
[6]得到上述最大二次微分值与最小二次微分值的差，即最大差(B)。
[7]判断经上述最大值(A)与最大差(B)运算而得到的X是否满足[X＞阈值]。
[8：YES]当上述[7]为YES时，判断为扩增正常。
[9：NO]当上述[7]为NO时，判断为扩增不良。
产业上的可利用性
如上所述，依据本发明，可通过利用如上所述的二次微分等运算很容易地判定目标核酸是否被扩增。因此，例如，可避免以往进行判定的个人的判定基准的不同、以及必须具有专业知识那样的问题。这样，由于能够容易地判断出目标核酸有无扩增，因此例如对导致基因型判断错误的、显示扩增不良的样品，能终止其后的熔解曲线解析。因而，最终可更容易地以高可靠性进行熔解曲线解析。更特别地，通过在现有的基因解析装置等中组合本发明的系统，例如当然能确认扩增的有无，还能全自动化进行从核酸的扩增至基因型的判断的操作。因此，本发明还可用于例如一般的分析和诊断现场，由于可容易地进行多个受试体的解析，因而可以说尤其在基因解析领域中是极为有用的技术。