魏氏家藏方续断散在制备治疗老年性脑痴呆药物中的应用.pdf

本发明公开了魏氏家藏方续断散在制备治疗老年性脑痴呆药物中的应用，其中，说明了该续断散在制备治疗老年性脑痴呆、骨质疏松、降血脂、增强学习及记忆能力及治疗妇女更年期综合症的药物中的应用，使该古方医药用途得到充分的发掘，满足了临床应用的需要。

1.  续断散在制备治疗老年性脑痴呆的药物中的应用。

2.  续断散在制备增强学习和记忆能力的药物中的应用。

3.  续断散在制备降血脂的药物中的应用。

4.  续断散在制备治疗妇女更年期综合症的药物中的应用。

5.  续断散在制备治疗骨质疏松的药物中的应用。

6.  根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的骨质疏松为由性激素水平下降导致的骨质疏松。

7.  根据权利要求1、2、3、4或5所述的应用，其特征在于所述的续断散由续断和牛膝两味中药制成；续断为盐炙续断、酒炙续断或生品续断；牛膝为盐炙牛膝、酒炙牛膝或生品牛膝。

8.  根据权利要求1、2、3、4或5所述的应用，其特征在于所述的续断散的原料为重量比为1:1的盐炙续断与盐炙牛膝，或者重量比为1:1的生品续断与生品牛膝，或者重量比为1:1的酒炙续断与酒炙牛膝。

9.  根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的续断散是通过以下方法制备得到的：将原料混合后加入乙醇加热回流提取，过滤，得到的提取液浓缩至无醇味即得。

10.  根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的乙醇浓度为60%-70%。

魏氏家藏方续断散在制备治疗老年性脑痴呆药物中的应用
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及《魏氏家藏方》续断散在制备治疗老年性脑痴呆、骨质疏松、降血脂、增强学习及记忆能力及治疗妇女更年期综合症的药物中应用。
背景技术
作为常用的中药方剂，续断散仅被用于逐痹痛，其医药用途并没有得到充分的发掘和应用。
本发明具体针对由续断和牛膝两味中药组成的《魏氏家藏方》续断散的新应用进行进一步探索。
发明内容
本发明的目的在于公开续断散在制备治疗多种疾病的药物中的应用，以满足临床应用的需要。
以补充外源性雌激素为主的激素替代疗法(Hormone Replacement Treatment,HRT)是近50年来预防医学的重要进展，目前对长期使用HRT仍存在争议。HRT的益处主要有：①缓解并根除更年期症状；②减少或防止骨质疏松症及其相关骨折的发生率；③降低缺血性心血管疾病发生的危险度和致死率；④预防和降低老年性痴呆发生的危险性和改善痴呆的严重程度；⑤减少大肠癌发病的危险性；⑥改善尿失禁。HRT的弊端主要有：①增加子宫内膜癌、乳腺癌、卵巢癌和肺癌的发病风险；②提高深部静脉血栓和肺静脉栓的危险性；③增加心肌梗死的危险冠心病和脑卒中的几率增加，2002年7月美国国立卫生院(NIH)下属心肺血液研究所发布最新实验结果，与安慰剂组相比，HRT组的冠心病相对风险竟增加29%，脑卒中的相对风险增加41%；④增加胆囊炎的发病率；⑤增加体重及不规律出血的风险。
依据发明人的实验，本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
《魏氏家藏方》续断散在制备治疗老年性脑痴呆的药物中应用。
《魏氏家藏方》续断散在制备增强学习和记忆能力的药物中应用。
《魏氏家藏方》续断散在制备治疗骨质疏松药物中应用；所述的骨质疏松可为由性激素水平下降导致的骨质疏松。
《魏氏家藏方》续断散在制备降血脂的药物中应用。
《魏氏家藏方》续断散在制备治疗妇女更年期综合症的药物中应用。
所述的续断散由续断和牛膝两味中药制成。续断可为盐炙续断、酒炙续断或生品续断；牛膝为盐炙牛膝、酒炙牛膝或生品牛膝。
所述的续断散的原料为重量比为1:1的盐炙续断与盐炙牛膝，或者重量比为1:1的生品续断与生品牛膝，或者重量比为1:1的酒炙续断与酒炙牛膝。
本发明所述的续断散为盐炙续断和盐炙牛膝按照1：1的重量比例关系混合提取得到的醇提取物，或生品续断和生品牛膝按照1：1的重量比例关系混合提取得到的醇提取物，或者酒炙续断和酒炙牛膝按照1：1的重量比例关系混合提取得到的醇提取物。
上述续断散具体是通过以下方法制备得到的：将原料混合后加入乙醇加热回流提取，过滤，得到的提取液浓缩至无醇味即得；所述的乙醇浓度为60%-70%，优选乙醇浓度为60%。所述的乙醇用量为原料总重的8-12倍量，优选乙醇体积用量为原料总重的10倍量，乙醇提取次数为2-3次。
所述的续断散可包括治疗有效量的原料药和医药学上可接受的载体制成丸剂、散剂、胶囊、片剂、颗粒剂、注射剂、复方制剂或其他口服剂型。
生品续断和生品牛膝即市售续断和牛膝药材，酒炙牛膝、盐炙牛膝、盐炙续断、酒炙续断均为市售可得，也可以将牛膝和续断药材按照常规酒炙和盐炙方法炮制得到。
根据上述应用，所述的续断散服用剂量可根据服用方式、病人年龄、病情严重程度等因素而改变，成人口服剂量为20-60g（生药）/日。
与现有技术比较本发明的有益效果：药效试验证明，《魏氏家藏方》续断散能显著抑制由于大鼠去卵巢造模引起的大鼠血清中碱性磷酸酶、羟脯氨酸的含量；可以显著提高骨密度、骨重系数、骨钙和骨磷，具有显著性治疗骨质疏松的活性，尤其是由性激素水平下降导致的骨质疏松，在制备治疗骨质疏松的药物中 具有很好的应用前景。《魏氏家藏方》续断散能使雌激素E2水平得到提高、子宫和乳腺中雌激素受体ER量得到提高，显示续断散具有植物激素样作用，可减轻妇女更年期阴虚的表现，可制备治疗妇女更年期综合症的药物。而甘油三酯TG、胆固醇TC水平的下调，显示《魏氏家藏方》续断散具有降血脂作用。另外，药效试验还说明了《魏氏家藏方》续断散可治疗老年性脑痴呆，同时具有增强学习和记忆能力的作用。
具体实施方式
以下通过具体试验例对本发明进一步解释说明。
主要药品：
仙灵骨葆胶囊(贵州同济堂制药有限公司，批号：111043)；羧甲基纤维素钠(CMC-Na，天津市科密欧化学试剂开发中心，批号：20070429)；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号：30037517)；注射用青霉素钠(80万单位/支，山东鲁抗医药股份有限公司，批号：B111106)；碘伏(武汉市联华卫生消毒用品厂)；续断、牛膝(购于南京市先声药店)。ER(MC-20)抗体(美国antaCruz公司，)；血清碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20120521)；血清磷(P)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20120607)；血清钙(Ca)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20120607)；羟脯氨酸(HOP)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20120427)；钙(Ca)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20120607)；磷(P)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20120607)；大鼠血清雌二醇试剂盒(E2，美国R&D公司，批号：20120601A)；血清总胆固醇(TC)试剂盒(北京北化康泰临床试剂有限公司，批号：20120514)；血清甘油三酯(TG)试剂盒(北京北化康泰临床试剂有限公司，批号：20120514)；血清低密度脂蛋白(LDL-C)试剂盒(北京北化康泰临床试剂有限公司，批号：20120514)；血清高密度脂蛋白(HDL-C)试剂盒(北京北化康泰临床试剂有限公司，批号：20120514)，Aβ1-42（invitrogen，批号：73450114A），盐酸多奈哌齐片（安理申，规格10mg/片，卫材（中国）药业有限公司，批号120814A），银杏叶提取物（徐州恒凯银杏制品有限公司，批号：N0111210），水合氯醛（分析纯，国药集团），大鼠脑立体定位仪（江湾Ⅰ型C），微量注射器（上海精密激光仪器厂），牙科钻及手术器械等，Morris水迷宫系统（包括大鼠迷宫自动程序记录仪，中国药科大学药学院），KD-160型鼠称（TANITA公司），MILLI-Q Biocel型超纯水装置（Millipore，USA）。
实验动物：雌性，280±20g，清洁级SD大鼠(南通大学实验动物中心)，实验 动物生产许可证号：SCXK(苏)2008-0010。
试剂配制：0.5%CMC-Na：称取15g CMC-Na，加入3000mL蒸馏水，混合均匀，使其充分溶胀，放置过夜，搅拌均匀，即得。
3%水合氯醛：精密称取水合氯醛15g，加入500mL蒸馏水，使其充分溶解，即得到3%水合氯醛麻醉液，在使用前现用现配。
75%乙醇溶液：移取95%乙醇789.5mL，加入210.5mL蒸馏水，混合均匀，即得到1000mL的75%乙醇溶液。
0.9%生理盐水溶液：称取4.5g NaCl，加入500mL蒸馏水，混合均匀，使其充分溶解，即得。
10%的中性甲醛溶液：移取37%～40%甲醛溶液100mL，加入900mL的PBS缓冲溶液，混合均匀，即得到1000mL的10%中性甲醛溶液。
仙灵骨葆胶囊混悬液：取仙灵骨葆胶囊内容物，用研钵研碎，精密称取5.0g，置于100mL容量瓶中，加入0.5%CMC-Na溶液定容至刻度，超声使其形成混悬液。仙灵骨葆大鼠给药体积为10mL/kg·d^-1；给药量为0.50g/kg^[1]。
17β-雌二醇混悬液：精密称取17β-雌二醇1.5mg，置于250mL容量瓶中，加入0.5%CMC-Na溶液定容至刻度，超声使其形成混悬液。17β-雌二醇给药体积为10mL/kg·d^-1大鼠，给药剂量为60μg/kg^[2]。
续断散（盐炙品）的制备方法：精密称取盐炙续断及盐炙牛膝粗粉(粉碎，过2号筛)各250g(共500g)，置5L圆底烧瓶中，加入5L浓度为60%的乙醇，浸泡1h，水浴回流提取三次，提取时间分别为1.5h、1h、0.5h，三次提取使用的60%乙醇用量分别为5L、4L、4L，合并三次滤液，减压回收乙醇部位，浓缩至无醇味，浓缩后的药液置于真空减压干燥箱中(-0.08MPa，60℃)，干燥，研细得续断散提取物，得率为39.83%，备用。续断散（生品）的原料为按照1：1重量比例混配的生品续断和生品牛膝；续断散（酒炙品）的原料为按照1：1重量比例混配的酒炙续断和酒炙牛膝，制备方法同续断散（盐炙品）。
续断散提取物高剂量组药液：续断散提取物适量，用0.5%CMC-Na溶解制成0.24g/mL的混悬液。给药体积为0.01mL/g大鼠；高剂量组给药剂量为2.4g/kg（6g生药/kg）大鼠。
续断散提取物低剂量组药液：续断散提取物适量，用0.5%CMC-Na溶解制成0.08g/mL的混悬液。给药体积为0.01mL/g大鼠；低剂量组给药剂量为0.8g/kg （2g生药/kg）大鼠。
试验一：
1.实验目的
通过采用大鼠去卵巢的骨质疏松模型，以大鼠血清中羟脯氨酸(HOP)、血清中碱性磷酸酶含量；股骨骨密度；股骨骨灰重系数；骨钙和骨磷含量作为考察指标，证明续断散治疗去卵巢大鼠骨质疏松的在体药理活性。
2.实验方法
2.1动物模型的制备
取体重280±20g的6月龄清洁级雌性SD大鼠80只。随机分组，禁食24小时(不禁水)后，其中8只在相应部位只作手术切口，不摘除卵巢作为正常对照组（假手术对照组）；其余72只按文献法进行卵巢摘除术，大鼠用3%水合氯醛麻醉(3g水合氯醛/100mL，给药剂量100g动物/mL，腹腔注射)，背位固定，于距最末肋骨下约1cm和脊柱外测约2cm处，剪毛，然后切开约1.5-2cm皮肤和背肌，切口视野中可见一团白色发亮的脂肪，卵巢即包埋在其中，用小镊子轻夹住脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，便可见到粉红色菜花状的卵巢，将其余子宫连接处用4号手术缝合线结扎后，再摘除卵巢，同法摘除另一侧卵巢，术后顺势将子宫送回原位，皮肤切口处给予少许青霉素粉剂，缝合切口。
各组大鼠术后分笼饲养，大鼠术后活动正常，可自行饮水摄食，术后大鼠伤口愈合正常，没有红肿、渗出、化脓等现象。各组大鼠再分笼饲养，术后每日腹腔注射青霉素注射液(生理盐水配制，10万单位/mL，给药体积0.01mL/1g，80万单位/瓶)，连续3天。手术2周后开始给药，连续给药12周。
2.2动物分组及给药
将去卵巢大鼠分别按体重随机分为6组：假手术组、模型对照组(OVX)、两组阳性对照组、续断散的高剂量组和低剂量组。假手术对照组(SHAM)和模型对照组(OVX)，给予蒸馏水；两组阳性对照组，分别给予仙灵骨葆胶囊0.5g/kg(中阳)和17β-雌二醇60μg/kg(西阳)；续断散的高、低剂量组分别为2.4g/kg(6g生药/kg)、和0.08g/kg(2g生药/kg)。
灌胃给药，给药体积为0.01mL/g大鼠，每周给药6次(周日休息一天)，均于每天晚上18:00-20:00左右给药，连续给药12周，于给药过程中，每周称一次体重，根据体重调整给药量。
2.3样品采集
末次给药后禁食24小时(不禁水)后，先对大鼠进行称重，然后3%水合氯醛麻醉(3g水合氯醛/100mL，给药剂量100g动物/mL，腹腔注射)，大鼠颈总动脉插管取血，至10mL的离心管中并处死大鼠。
血液室温静置15min，3500rpm离心10min后，分离血清及血浆，血清标号后，-20℃保存，用于各指标含量测定。
总动脉插管取血后处死大鼠，分离双侧股骨，取右侧股骨测定以下指标：①将标本用10%的中性甲醛溶液固定，用双能X射线骨密度测定仪测定股骨骨密度；②再将测完骨密度之后的右侧股骨干燥并碳化后置于800℃马福炉中灰化制成骨灰，测定骨灰重系数(mg/g体重)；⑦称取一定量骨灰，用血清磷测定试剂盒测定骨磷；另取一定量的骨灰用钙试剂盒测定骨钙含量，将所测结果折算成每克骨重所含骨钙或骨磷的量。
2.4实验各项指标测定及实验结果
2.4.1羟脯氨酸(HOP)的含量测定
(1).基本原理：羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色，根据其呈色的深浅可推算出其含量。
(2).测定方法：按试剂盒要求测定。在550nm处，测各孔的吸光度OD值。
(3).样品中HOP浓度的测定结果：羟脯氨酸含量(μg/mL)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准管含量(5μg/mL)×水解液总体积(mL)/取样量(mL)。实验结果见下表1所示。
2.4.2血清中碱性磷酸酶(ALP)的含量测定
(1).基本原理：碱性磷酸酶分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物，根据红色深浅可以测定酶活力的高低。
(2).测定方法：按试剂盒要求测定。在450nm处，测各孔的吸光度OD值。
(3).样品中碱性磷酸酶的测定结果：碱性磷酸酶(金氏单位/100mL)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×酚标准品浓度(0.1mg/mL)×100mL×样本测定前稀释倍数。实验结果如下表2所示。
2.4.3股骨骨灰重系数测定
大鼠右侧股骨在进行骨密度测定后，先置坩锅内于120℃干烤2h，取出，置 干燥器中保存，放置过夜。隔日，将烤干的股骨盛于坩锅内，置箱式电阻炉(马弗炉)中，分别在250℃，400℃，600℃各加热0.5h，最后于800℃灰化1h，取出，置干燥器冷却0.5h，对骨灰称重，实验结果见下表3。
电子天平称量，骨灰重系数=股灰重(g)×1000/大鼠体重(g)。
2.4.4骨钙测定
(1).基本原理：钙离子在碱性溶液中与甲基百里香酚蓝(MTB)结合，生成蓝色络合物。通过比色与同样处理的钙标准进行比较，可计算出钙的含量。
(2).测定方法：按试剂盒要求测定。
(3).样品中骨钙的测定结果：实验结果如下表4所示。骨灰中钙的含量(mmol/g)＝(测定孔吸光度－空白孔吸光度)÷(标准孔吸光度－空白孔吸光度)×标准品浓度(1mmol/L)÷待测样本的重量(0.1g)。
2.4.5骨磷测定
(1).基本原理：样品中的无机磷与钼酸作用生成磷钼酸，后者被还原成钼蓝，在660nm处有最大吸收峰，通过比色法可以计算出无机磷的含量。
(2).测定方法：按试剂盒要求测定。
(3).样品中骨磷的测定结果：实验结果如下表5所示。磷含量(mmol/g)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准管浓度(0.5mmol/L)×测试前稀释倍数(5)÷骨灰浓度(0.1g/mL)。
2.4.6股骨骨密度的测定
分离出大鼠右侧股骨后，股骨标本经10%甲醛溶液固定，用双能X射线骨密度测定仪测定股骨的骨密度。股骨骨密度测定结果如下表6。
2.5统计学处理
实验数据均采用均数±标准差(SD)来表示，组间差异显著性用t-test比较，p<0.05为有显著性差异。不同亚组之间采用SPSS15.0统计软件进行数据处理。
3.实验结果及结论
3.1实验结果
表1大鼠去卵巢的骨质疏松模型实验中续断散对羟脯氨酸含量的影响


注：与空白组比较，^#表示p＜0.05，^##表示p＜0.01；与模型组比较，^＊表示p＜
0.05，^＊＊表示p＜0.01。
表2大鼠去卵巢的骨质疏松模型实验中续断散对碱性磷酸酶含量的影响
注：与空白组比较，^#表示p＜0.05，^##表示p＜0.01；与模型组比较，^＊表示p＜
0.05，^＊＊表示p＜0.01。
表3大鼠去卵巢的骨质疏松模型实验中续断散对骨重系数的影响


注：与空白组比较，^#表示p＜0.05，^##表示p＜0.01；与模型组比较，^＊表示p＜
0.05，^＊＊表示p＜0.01。
表4大鼠去卵巢的骨质疏松模型实验中续断散对骨钙含量的影响

注：与空白组比较，^#表示p＜0.05，^##表示p＜0.01；与模型组比较，^＊表示p＜
0.05，^＊＊表示p＜0.01。
表5大鼠去卵巢的骨质疏松模型实验中续断散对骨磷含量的影响


注：与空白组比较，^#表示p＜0.05，^##表示p＜0.01；与模型组比较，^＊表示p＜0.05，^＊＊表示p＜0.01。
表6大鼠去卵巢的骨质疏松模型实验中续断散对骨密度的影响

注：与空白组比较，^#表示p＜0.05，^##表示p＜0.01；与模型组比较，^＊表示p＜0.05，^＊＊表示p＜0.01。
4.2结论
本实验采用大鼠去卵巢的骨质疏松模型，以血清中羟脯氨酸(HOP)、血清中碱性磷酸酶含量、股骨骨密度、骨灰重系数、骨钙含量、骨磷含量指标，验证续断散治疗去卵巢大鼠骨质疏松的在体药理活性。
实验结果表明：模型组与空白组相比，大鼠血清中ALP含量显著增加，实验结果与文献报道一致，表明大鼠去卵巢的骨质疏松模型组造模成功。大鼠灌胃 给药续断散提取物、仙灵骨葆胶囊和17β-雌二醇12周后，与模型组相比，能显著抑制由于大鼠去卵巢造模引起的大鼠血清中碱性磷酸酶、羟脯氨酸的含量，实验结果表明续断散可以改善骨质疏松大鼠血清的相关指标，可能是通过抑制骨吸收、促进骨生成、降低骨钙的流失以及促进骨胶原的生成作用来实现的。
对大鼠的股骨进行了骨密度检测，实验结果表明：与模型组相比，续断散给药12周后可以显著提高大鼠股骨的骨密度，并呈现一定的剂量依赖性，表明续断散可以提高骨密度。
对大鼠的股骨进行了骨灰重系数、骨钙、骨磷测定，结果表明：与模型组相比，续断散给药12周后可以显著提高大鼠股骨的骨重系数、骨钙、骨磷。
综上所述，续断散具有显著性治疗骨质疏松的活性，在制备治疗骨质疏松的药物中具有很好的应用前景，特别是由性激素水平下降导致的骨质疏松。
羟脯氨酸(HOP)：
羟脯氨酸(HOP)是Ⅰ型胶原分解后产物，主要来源于骨骼和皮肤，其中约50%来自骨组织。尿HOP约50％来源于骨胶原，在没有明显皮肤病和结缔组织病变时，尿HOP基本上能反映骨吸收和骨转换程度。因此HOP在很大程度上能反映骨吸收分解状况，尿HOP排泄可反映机体的胶原代谢状况，是常用的反映骨吸收指标。
骨密度(bone mineral den续断散ity)是判断骨量依据，采用双能X线骨密度(EDXA)精确定量测定BMD能判断骨量水平，是研究骨质疏松和评价药物抗骨质疏松药效的重要指标。骨质疏松发生时，机体骨组织BMD低于正常，妇女绝经后初期，小梁骨受到的影响要比皮质骨所受影响更大，发生快速骨丢失，极易发生骨质疏松性骨折。去卵巢大鼠股骨的BMD显著下降，经续断散和17β-雌二醇干预后，股骨的BMD逐步达到正常水平，提示续断散能增加去卵巢大鼠骨量。
试验二：
1实验目的
测定实验动物子宫湿重、血清中雌二醇(E2)含量、大鼠子宫和乳腺组织中ER受体的表达，考察续断散是否具有一定的植物雌激素样作用，考察续断散具有抗骨质疏松的药理活性是通过发挥植物雌激素样的作用实现的；由此可以推论续断散也同样具有治疗妇女更年期的作用。
2实验方法
2.1动物模型的制备：同试验一。
2.2样品采集
对大鼠进行称重，然后3%水合氯醛麻醉(3g水合氯醛/100mL，给药剂量100g动物/mL，腹腔注射)，大鼠颈总动脉插管取血，至10mL的离心管中并处死大鼠。
血液室温静置15min，3500rpm离心10min后，分离血清及血浆，血清标号后，-20℃保存，用于各指标含量测定。
处死动物后，取子宫和乳腺，然后子宫称重，记录动物的子宫重量；对子宫和乳腺进行ER免疫组化染色。
2.3实验各项指标测定
血清中雌二醇(E2)含量测定
标准品(E2)浓度依次为：0、4、8、16、32、64pmol/L。
以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按照曲线方程计算各样本浓度值。测定结果如表7所示。
表7E2含量测定标准曲线绘制

以标准品浓度(pmol/L)为横坐标(x)，吸光度OD值为纵坐标(y)，建立回归方程，得到回归方程为：y=0.021x+0.152，r=0.9970。
样品中雌二醇(E2)的测定结果见表8.
表8在体实验检测指标结果表
表8血清中E2、子宫内膜厚、子宫ER免疫组化和乳腺ER免疫组化各指标检测结果

注：与假手术组续断散ham组相比，^#p＜0.05，^##p＜0.01；与模型组model组 相比，^*p＜0.05,^**p＜0.01。
结论：
实验结果表明：续断散在给药12周后，与模型组相比，大鼠的子宫湿重(p＜0.01)和大鼠血清中E2（雌二醇）的含量有明显的提高(p＜0.01)；并且大鼠子宫和乳腺的ER免疫组化染色结果表明，同模型组相比，续断散可以明显提高的大鼠子宫和乳腺组织中ER受体的表达(p＜0.05)；实验结果说明续断散具有一定的植物雌激素样作用，续断散具有抗骨质疏松的药理活性是通过发挥植物雌激素样的作用实验的，或者至少是部分通过植物雌激素样作用来实现的。
在体实验相关检测指标的确定：本研究观察子宫湿重的变化，发现切除卵巢后大鼠子宫湿重明显降低，体重明显增加，子宫重量明显降低，证实造模是有效的；由于去势后认为制造了一个雌激素突然降低的环境，雌激素可以促进子宫肌细胞的增生和肥大，使肌层增厚，促进子宫内膜腺体及间质增生，大鼠体内雌激素水平降低，对其子宫肌层及子宫内膜的刺激作用下降，故模型组的大鼠子宫湿重均较正常组明显下降。
雌激素主要是由卵巢分泌的一种激素，其可直接作用于成骨细胞雌激素受体，提高成骨细胞功能，增加骨量；其可通过成骨细胞和破骨细胞雌激素受体来限制骨转换，维持骨吸收与骨形成平衡。绝经后由于卵巢功能衰退，雌激素分泌减少，骨转换加快，产生快速骨丢失。如果去除卵巢雌鼠血清中的E2明显下降，表明造模成功，在应用17β-雌二醇、不同剂量续断散部位和续断散药物进行干预，可提高血清中的E2水平，进而对抗去卵巢后骨质疏松症的发生。
试验三：
1.实验目的：测定实验动物血清中甘油三酯(TG)、血清中胆固醇（TC）的含量变化，评价续断散是否具有降血脂的作用。
2.实验方法与实验结果
动物模型的制备及动物分组及给药：同试验一。
样品采集：同试验一。
实验各项指标测定：
大鼠血清中总胆固醇(TC)的检测：采用试剂盒测测定方法。波长：500nm；光径：10nm；温度：37℃。
计算公式：TC(mmol/L)=A样/A校×校准品浓度(5.17mmol/L)，TC的测定 结果见表9。
大鼠血清中甘油三酯(TG)的检测：采用试剂盒测测定方法。波长：500nm；光径：10nm；温度：37℃。
计算公式：TG(mmol/L)=A样/A校×校准品浓度(0.0226mmol/L)大鼠血清中甘油三酯(TG)的测定结果见表9。
表9TC、TG各指标检测结果

注：与假手术组续断散ham组相比，^#p＜0.05，^##p＜0.01；与模型组model组相比，^*p＜0.05,^**p＜0.01。
生品续断散的制备方法同试验一。
3.结论：续断散具有降血脂的作用。
试验四：
1.实验目的：研究续断散是否具有提高学习记忆能力，治疗神经退行性疾病老年性脑痴呆的作用。
2.实验方法
采用脑室定位注射Aβ1-42法诱导大鼠AD模型：大鼠适应性饲养1周，经10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔麻醉后，于大鼠脑立体定位仪上固定头部，常规消毒皮肤，在颅顶线切开皮肤，暴露头骨及前囟，选定海马注射位点，于前囟后3.3mm（AP=-3.3mm）中线旁2.0mm（ML=2.0mm）处用牙科钻钻开颅骨，微量注射器吸取5μl Aβ1-42（用生理盐水配制成2μg/ml，37℃孵育4天），垂直进针，达蛛网膜下2.5mm（DV=2.5mm）处缓慢注射，5min内注射完成，留针5min后取出，大鼠大脑对侧进行相同的操作。清洁创面后缝合皮下组织、头皮，强力碘消毒。假手术组按上述方法注射同等剂量的生理盐水。
动物分组与给药：造模次日，随机分成10组，每组12只，分组后于第1天同时开始灌胃给药，连续30天，每日一次。组别分别是假手术对照组，纯水灌胃，体积为0.01mL/g大鼠；模型组，纯水灌胃，体积为0.01mL/g大鼠；西药阳性对照组，用纯化水配成多奈哌齐浓度为0.05mg/ml，给药剂量为0.5mg/kg/d； 中药阳性对照组，用纯水配成银杏叶提取物浓度为2.5mg/ml，给药剂量为为25mg/kg/d；续断散-盐H，用水溶解制成0.24g/mL的混悬液，给药体积为0.01mL/g大鼠，高剂量组给药剂量为2.4g/kg（6g生药/kg）大鼠；续断散-盐L，用水溶解制成0.08g/mL的混悬液，给药体积为0.01mL/g大鼠，低剂量组给药剂量为0.8g/kg（2g生药/kg）大鼠；续断散-生H，用水溶解制成0.24g/mL的混悬液，给药体积为0.01mL/g大鼠，高剂量组给药剂量为2.4g/kg（6g生药/kg）大鼠；续断散-生L，用水溶解制成0.08g/mL的混悬液，给药体积为0.01mL/g大鼠，低剂量组给药剂量为0.8g/kg（2g生药/kg）大鼠；续断散-酒H，用水溶解制成0.24g/mL的混悬液，给药体积为0.01mL/g大鼠，高剂量组给药剂量为2.4g/kg（6g生药/kg）大鼠；续断散-酒L，用水溶解制成0.08g/mL的混悬液，给药体积为0.01mL/g大鼠，低剂量组给药剂量为0.8g/kg（2g生药/kg）大鼠。灌胃给药。
3.学习和记忆力指标的测定与结果
记忆减退、判断能力减退、行为情绪失常等是老年性痴呆主要的临床特征，而空间识别能力和学习记忆行为是其中最基本的要素。因此，对学习记忆进行评价是观察老年性痴呆动物模型及药物治疗效果的重要指标之一。Morris水迷宫实验主要应用于检测大鼠空间学习记忆功能，已被广泛用于研究药物提高记忆能力的疗效评价。
参照Morris水迷宫实验方法，测量大鼠学习和记忆能力。所用水迷宫为一直径120cm、高50cm的圆形水池，水池内壁被漆为黑色，水深30cm，距池壁35cm处放置一高29cm，直径10cm圆台，水一般加至超过平台高度1cm。实验历时5日（给药第79天至给药第83天），实验前1日让大鼠自由游泳2min，从给药第24天起，每天训练2次。训练时随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠寻找并爬上平台所需时间（即逃避潜伏期）和游泳总路程。如果大鼠在90s内末找到平台，须将其引至平台，这时潜伏期记为90s。在给药第28天最后一次训练后撤除水下平台，在同一入水点将大鼠面向池壁放入水中，测其在90s内在原平台象限（第四象限）游泳路程及跨过原平台相应位置的次数。
Moriss水迷宫实验结果与分析：在隐蔽平台试验中，从大鼠入水开始到找到隐藏在水面下的平台的时间称为逃避潜伏期，以逃避潜伏期时间的长短代表大鼠的学习能力。逃避潜伏期越短，表明大鼠的学习能力越强。
空间搜索实验是对实验大鼠记忆能力的直接检测，撤掉平台，大鼠根据记忆对平台的反复寻找，即记忆的保持能力。实验中以目的象限游泳路程越长、穿越平台次数越多，表明大鼠对平台的寻找能力越强，即记忆的保持能力越强。
表10各组大鼠在隐藏平台试验中逃避潜伏期成绩
注：与对照组比较，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01，^▲▲▲P<0.001；与模型组比较，^*P<0.05， ^**P<0.01，^***P<0.001。
表11各组大鼠在在隐藏平台试验中平均游泳长度
注：与对照组比较，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01，^▲▲▲P<0.001；与模型组比较，^*P<0.05， ^**P<0.01，^***P<0.001。
表12各组大鼠在第四象限路程及站台穿越次数
注：与对照组比较，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01，^▲▲▲P<0.001；与模型组比较，^*P<0.05， ^**P<0.01，^***P<0.001。
从表10、11的结果分析可知：各组大鼠随着训练时间的增长，训练次数的增多，逃避潜伏期和平均游泳长度逐渐缩短，说明学习训练可以增强记忆，但各组大鼠的学习记忆能力不同。实验显示各给药组对改善实验大鼠的学习记忆能力无显著性差异（P>0.05）。
从表12的分析结果可见：与假手术组比较，模型组的第四象限路程显著减少（P<0.01），穿台次数呈减少趋势，具有显著性差异（P<0.05），表明模型鼠空间探索能力下降；与模型组比较，各给药组的第四象限路程呈延长趋势，有显著性差异（P<0.05），说明各给药组对改善实验大鼠的学习记忆能力无显著性差异（P>0.05）。
其中，续断散-盐为原料为重量比为1：1的盐炙续断和盐炙牛膝的续断散提取物，续断散-生为原料为重量比为1：1的生品续断和生品牛膝的续断散提取物，续断散-酒指原料为重量比为1：1的酒炙续断和酒炙牛膝的续断散提取物，H指续断散提取物高剂量组，L指续断散提取物低剂量组。续断散样品的具体制备步骤同试验一。
制剂实施例1
片剂：取按照试验一续断散（生品）的制备方法制备得到的提取物加入淀粉 混匀，打片，即得片剂。
制剂实施例2
胶囊：取按照试验一续断散（盐炙品）的制备方法制备得到的的提取物加入辅料淀粉，湿法制粒，灌注胶囊，即得胶囊剂。