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1、10申请公布号CN104055760A43申请公布日20140924CN104055760A21申请号201310087144022申请日20130318A61K31/216200601A61K31/343200601A61P9/0020060171申请人中国科学院上海药物研究所地址201203上海市浦东新区张江祖冲之路555号72发明人果德安姜宝红74专利代理机构北京金信立方知识产权代理有限公司11225代理人朱梅师杨54发明名称多聚体丹酚酸在制备用于抑制主动脉瘤或主动脉夹层的发生或发展的药物中的用途57摘要本发明涉及多聚体丹酚酸在制备用于抑制主动脉瘤或主动脉夹层发生的药物中的用途；以及一种。
2、药物组合物，包括作为药学活性物质的多聚体丹酚酸，以及相关所需的辅剂等，该药物组合物可以用于抑制主动脉瘤或主动脉夹层的发生。所述多聚体丹酚酸为二聚体丹酚酸、三聚体丹酚酸或四聚体丹酚酸，其中，所述二聚体丹酚酸为迷迭香酸，所述三聚体丹酚酸为丹酚酸C、紫草酸或丹酚酸A，所述四聚体丹酚酸为丹酚酸B。51INTCL权利要求书1页说明书6页附图9页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图9页10申请公布号CN104055760ACN104055760A1/1页21多聚体丹酚酸在制备用于抑制主动脉瘤或主动脉夹层的发生的药物中的用途。2根据权利要求1所述的用途，其中，所述多聚。
3、体丹酚酸为二聚体丹酚酸、三聚体丹酚酸或四聚体丹酚酸。3根据权利要求2所述的用途，其中，所述二聚体丹酚酸为迷迭香酸，所述三聚体丹酚酸为丹酚酸C、紫草酸或丹酚酸A，所述四聚体丹酚酸为丹酚酸B。4根据权利要求1所述的用途，其中，所述多聚体丹酚酸为丹酚酸A或丹酚酸B。5一种药物组合物，包括作为药学活性物质的多聚体丹酚酸，以及相关所需的辅剂等，该药物组合物可以用于抑制主动脉瘤或主动脉夹层的发生。6根据权利要求5所述的药物组合物，其中，所述多聚体丹酚酸为二聚体丹酚酸、三聚体丹酚酸或四聚体丹酚酸。7根据权利要求6所述的用途，其中，所述二聚体丹酚酸为迷迭香酸，所述三聚体丹酚酸为丹酚酸C、紫草酸或丹酚酸A，所述。
4、四聚体丹酚酸为丹酚酸B。8根据权利要求5所述的用途，其中，所述多聚体丹酚酸为丹酚酸A或丹酚酸B。权利要求书CN104055760A1/6页3多聚体丹酚酸在制备用于抑制主动脉瘤或主动脉夹层的发生或发展的药物中的用途技术领域0001本发明涉及药物领域，具体而言涉及多聚体丹酚酸，尤其是二聚体丹酚酸、三聚体丹酚酸、四聚体丹酚酸在制备用于抑制主动脉瘤或主动脉夹层的发生的药物中的用途。背景技术0002众所周之，丹参多酚酸以下简称丹酚酸是提取于唇形科植物丹参SALVIAMILTIORRHIZABUNGE的一类水溶性化合物，根据结构中苯环的数量可分为一聚体、二聚体、三聚体和四聚体。其中，丹参素、原儿茶醛为一聚。
5、体的代表；迷迭香酸为二聚体的代表；紫草酸、丹酚酸A、丹酚酸C为三聚体的代表；丹酚酸B为四聚体的代表。这些代表性的化合物的结构如图1所示。0003主动脉瘤和主动脉夹层是主动脉病变的两类重要疾病。主动脉瘤是主动脉壁出现明显的扩大，当发展到一定阶段可破裂出血。主动脉夹层是主动脉内血液沿血管内膜撕裂处流动，造成主动脉内膜和中膜的分裂状态，如不及时医治可危及生命。主动脉瘤和主动脉夹层的病因非常复杂，吸烟、高血压和动脉粥样硬化等是最常见的诱发因素。表现为中层和外膜的细胞外基质降解，动脉壁变薄及炎症细胞的侵入。基质金属蛋白酶MMPS可降解细胞外基质，在主动脉瘤或主动脉夹层的形成过程中发挥重要作用。0004丹。
6、酚酸A是已知的对心血管保护有重要作用的化合物，溶于乙醇、乙醚,熔点为315323。对心绞痛及急性心肌梗塞、脑血栓形成的后遗症、硬皮病、视网膜中央动脉栓塞、神经性耳聋、白噻氏综合征及结节性红斑等有一定效果，但尚未见丹酚酸A或其他丹酚酸用于主动脉瘤或主动脉夹层治疗的研究报道。发明内容0005本申请提供了一种多聚体丹酚酸，尤其是二聚体丹酚酸、三聚体丹酚酸、四聚体丹酚酸在制备用于抑制主动脉瘤或主动脉夹层的发生或发展的药物中的用途。0006优选地，所述多聚体丹酚酸为二聚体丹酚酸、三聚体丹酚酸或四聚体丹酚酸。更优选地，所述二聚体丹酚酸为迷迭香酸，所述三聚体丹酚酸为丹酚酸C，紫草酸或丹酚酸A，所述四聚体丹酚。
7、酸为丹酚酸B。进一步优选地，所述多聚体丹酚酸为丹酚酸A或丹酚酸B。0007一种药物组合物，包括作为药学活性物质的多聚体丹酚酸，以及相关所需的辅剂等，该药物组合物可以用于抑制主动脉瘤或主动脉夹层的发生。0008优选地，所述多聚体丹酚酸为二聚体丹酚酸、三聚体丹酚酸或四聚体丹酚酸。更优选地，所述二聚体丹酚酸为迷迭香酸，所述三聚体丹酚酸为丹酚酸C，紫草酸或丹酚酸A，所述四聚体丹酚酸为丹酚酸B。进一步优选地，所述多聚体丹酚酸为丹酚酸A或丹酚酸B。附图说明0009图1为代表性多聚体丹酚酸的化学结构图；说明书CN104055760A2/6页40010图2为BIACORE检测数据图；0011图3为酶动力学实验。
8、结果图；0012图4为主动脉瘤或主动脉夹层动物实验结果的图；0013图5为收缩压测定和血脂测定、血管病变程度的实验结果图；0014图6为采用620MDMT微血管张力测定的曲线图；0015图7为丹酚酸A改善损伤血管的组织学结构图；0016图8为明胶酶谱的方法评价丹酚酸A的酶抑制活性的实验结果图；0017图9为对肝脏组织采用HE染色进行组织学评价的照片；0018图10为小鼠粪便菌群培养的照片；0019图11为小鼠主动脉血管结构的电镜照片。具体实施方式0020实验实施例00211、多聚体丹酚酸与MMP9蛋白直接结合的BIACORE检测0022通过蛋白重组技术获得MMP9催化域蛋白，并验证该蛋白具有降。
9、解胶原等底物的能力，然后利用表面等离子共振技术（BIACORE3000仪器）考察评价多聚体丹酚酸中代表性酚酸与MMP9催化域蛋白的直接结合能力。00232、酶动力学筛选试验0024采用荧光多肽THIOPEPTOLIDE购自BACHEMBIOSCIENC作为MMP9的荧光底物，考察不同浓度丹酚酸（丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、紫草酸、原儿茶醛、丹参素和迷迭香酸）对MMP9的抑制活性，并利用双倒数法进行数据分析，并计算KI值评价多聚体丹酚酸对MMP9的抑制能力。00253、主动脉瘤或主动脉夹层动物模型的制备和化合物处理0026SPF级8周龄APOE/小鼠57只，C57小鼠10只。APOE/小鼠持续。
10、喂食高脂饲料，采用异氟烷麻醉，皮下埋置ALZET缓释泵MICROOSMOTICPUMPMODEL1004,LOT1022109,DURECTCORPORATION，维持血管紧张素II的释放速度为11G/HOUR，埋泵1周后进行腹腔注射给药，埋泵4周后进行化合物药效评价。试验分为以下六组C57小鼠给予生理盐水作为正常动物对照组C57，N10，APOE/小鼠给予生理盐水作为疾病模型鼠N12，APOE/小鼠每天给予10MG/KG丹酚酸AN11，APOE/小鼠每天给予20MG/KGSALAN12，APOE/小鼠每天给予10MG/KG强力霉素N11，APOE/小鼠每天给予20MG/KG强力霉素N11。埋。
11、泵28天后进行小鼠眼眶取血，脏器称重，组织冻存，组织固定包埋等。动物实验均通过上海药物所动物学会兽医护理、伦理福利专业委员会准许。实验人员具备实验动物与动物实验培训合格证书。00274、收缩压测定和血脂测定0028于皮下埋置微量注射泵的第0周，第2周进行血压检测。收缩压测定采用尾套法，采用NIBP鼠尾无创血压测量分析系统上海奥尔科生物科技有限公司将小鼠置于37C动物保温毯上预热10MIN，测量小鼠在安静、清醒状态下的尾动脉压5次，取其平均值。血脂的测定于取材前18小时禁食，采用眼眶取血，3000R/MIN离心分离血清，采用甘油三脂TG和总胆固醇TCH测定试剂盒浙江东瓯生物工程有限公司测定血清中。
12、甘油说明书CN104055760A3/6页5三脂和总胆固醇的水平。00295、血管病变程度的评价0030血管紧张素II处理28天后，小鼠进行取材。主动脉直径与C57对照小鼠相比扩张150即血管直径大于12MM便认为是主动脉瘤模型成立，并计算动脉瘤的发生率。通过动物解剖和组织切片评价主动脉夹层的发生率。00316、组织学分析0032主动脉取出后进行体式显微镜拍照，用4多聚甲醛进行固定48H，而后进行石蜡包埋。主动脉石蜡切片3MM用于HE染色，天狼猩红染色。00337、DMT微血管张力测定实验0034采用620MDMT微血管张力测定系统DANISHMYOTECHNOLOGYA/S,AARHUS,D。
13、ENMARK。将两根不锈钢金属丝穿过肾下动脉内腔，两根金属丝分别固定于固定架两端从而将肾下动脉固定于固定架上。固定架的一端与微定位器相连，控制肾下动脉周长；另一端与张力转换器相连，用于测量血管张力变化。肾下动脉浸没于充有95O2和5CO2的混合气和KREBS溶液的浴槽中，浴槽可加热至37，肾下动脉可维持活性数小时。肾下动脉被固定及平衡后，通过血管标准化程序测定微血管的长度张力关系从而确定肾下动脉最佳初始张力。每个血管环先用105M苯肾上腺素收缩稳定至平台期，然后给予109105M乙酰胆碱测量各血管的舒张力。00358、血清MMP2、MMP9的检测0036明胶酶谱法检测血清中MMP2、MMP9的。
14、活性。小鼠取血后于4C，3000R/MIN，15分钟离心,取上清用于明胶酶谱实验，上样量含0375L血清。电泳后，用含有25TWEEN20，10MMOLCACL2，1MOLZNCL2和50MMOLTRISCLPH75的洗脱液洗三次，以洗去十二烷基硫酸钠。然后用含1TWEEN20，10MMOLCACL2，1MOLZNCL2和50MMOLTRISCLPH75的孵育液于37C孵育18小时，然后用考马斯亮蓝染液进行染色30分钟，而后用含5冰醋酸和10甲醇进行脱色，直到显出底色，可显示出分子量92KDA的MMP9酶原，分子量83KDA的活性MMP9，72KDA的MMP2酶原，64KDA的活性MMP2，I。
15、MAGEPROPLUS410版本的专业图像分析软件进行图像分析，记录积分光密度IOD。00379、肝肾毒性检测0038取适当大小的肝脏、肾脏组织迅速放入4多聚甲醛中固定，48小时后进行脱水，而后进行石蜡包埋、切片，HE染色，光学显微镜下采集图像。003910、小鼠粪便大肠杆菌检测0040该部分实验均使用C57小鼠，给药8周后采用无菌容器留取新鲜粪便，将新鲜粪便溶于无菌的生理盐水，各组取相同重量的粪便于血平皿上均匀涂布，37C培养18小时后对大肠杆菌的菌落数目进行统计。004111、透射电镜检测丹酚酸B对主动脉结构的保护作用0042主动脉瘤或主动脉夹层制备方法同上，丹酚酸B的给药剂量为每天25M。
16、G/KG、50MG/KG，给药时程为一个月。试验结束后，主动脉血管经过戊二醛及四氧化锇固定，LX1112包埋，透射电镜（TECNAI12BIOTWIN）观察血管结构。004312、统计学方法0044以上各组实验检测数据经整理后用均值标准差表示,用T检验作统计学处理。说明书CN104055760A4/6页60045测试结果00461、多聚体丹酚酸可与MMP9直接结合0047表面等离子共振技术（BIACORE）可以用来检测小分子与蛋白的直接结合。KD为平衡解离常数，用于评价结合能力。KD值依次为08MOL/L（丹酚酸A）,329MOL/L丹酚酸B,113MOL/L丹酚酸C,107MOL/L迷迭香酸。
17、，662MOL/L（紫草酸），丹参素和原儿茶醛未见明显的结合活性（图2）。图2中数据显示代表性的二聚体丹酚酸、三聚体丹酚酸和四聚体丹酚酸与MMP9可直接结合，而一聚体丹酚酸对MMP9无结合能力。00482、多聚体丹酚酸对MMP9的抑制类型为竞争性抑制。0049采用酶动力学实验检测多聚体丹酚酸对MMP9的抑制活性和抑制类型。图3为酶动力学实验结果图，其中双倒数曲线（图3A）的分析显示多聚体丹酚酸的抑制类型为竞争型。KI值用于评价酶抑制活力（图3B），分别为574115MOL/L丹酚酸A,64683844MOL/L丹酚酸B,110433306MOL/L丹酚酸C,12578873MOL/L迷迭香酸A。
18、ND3242513215MOL/L紫草酸，说明二聚体、三聚体、四聚体丹酚酸的MMP9抑制活性显著。实验结果表明多聚体丹酚酸对MMP9有非常好的抑制活性，其中三聚体、四聚体活性最明显，一聚体丹酚酸无抑制活性。00503、丹酚酸A对小鼠血脂、血压无影响0051APOE/小鼠皮下埋泵ANGII28天用于研究丹酚酸A的保护作用。图4A显示各组体重在给药前后无变化。图4为主动脉瘤或主动脉夹层动物实验结果的图，其中图4B显示APOE/小鼠收缩压在ANGII埋泵后2周收缩压较0周明显升高1224106MMHG比148814MMHG，且有显著性差异P005，C57小鼠血压在整个实验阶段无明显波动。图4C和4D。
19、显示APOE/小鼠较C57小鼠总胆固醇10235116MMOL/L比642802099MMOL/L，P005和总甘油三脂2854679MMOL/L比47371507MMOL/L，P005明显升高且有显著性差异。但丹酚酸A在检测期间对血压、血脂均无明显影响。该实验结果表明丹酚酸A对主动脉瘤或主动脉夹层模型动物的基本情况的影响（A）丹酚酸A对动物体重无明显影响，（B）丹酚酸A对动物血压无明显影响，（C）丹酚酸A对动物总胆固醇无明显影响，（D）丹酚酸A对甘油三酯无明显影响。研究结果用均值标准差表示，代表与对照相比P005。00524、丹酚酸A降低主动脉瘤及主动脉夹层的发生率且减轻其严重性0053图5。
20、表明丹酚酸A给药后明显降低APOE/小鼠动脉瘤的发生率图5A，6667比9167，也显示抑制动脉夹层发生的趋势图5B，25比333，最大外直径较对照组比明显降低图5C，190MM比155MM，P005。按主动脉损伤的严重程度，将动脉瘤按如下标准分成五个级别（图5D）0型，没有动脉瘤发生；I型，主动脉肾上动脉部位扩张但没有血栓形成；II型，肾上动脉部位有重构现象且经常伴有血栓的存在；III型，在II型的基础上有明显的球状膨胀且含有血栓；IV型，在肾上动脉区域有多个动脉瘤存在且含有血栓。APOE/对照小鼠多发生在II型、III型、IV型，与之相比丹酚酸A给药组多为I型，表明丹酚酸A降低ANGII诱。
21、导的主动脉损伤的严重程度（图5E）。丹酚酸A显著降低主动脉瘤、主动脉夹层的发生和主动脉的损伤程度。图5的实验数据证明丹酚酸A对主动脉损伤的改善作用。其中图5A表明丹酚酸A能够抑制主动脉瘤的形成；图5B表明丹酚酸A能够抑制主动脉夹层的形成；图5C表明丹酚酸A可以降低主动脉最大外直径，且有显著性差说明书CN104055760A5/6页7异；图5D为主动脉损伤严重程度分型的代表动脉图，从0型到IV型严重程度逐级提高；图5E说明丹酚酸A降低主动脉损伤的严重程度。研究结果用均值标准差表示，代表P005。00545、丹酚酸A给药后明显改善肾下动脉的舒张作用0055肾下动脉被固定及平衡后，每个血管环先用10。
22、5M苯肾上腺素收缩稳定至平台期，然后给予109105M乙酰胆碱测量各血管的舒张能力，图6为采用620MDMT微血管张力测定的曲线图；该曲线图数据显示丹酚酸A给药组及强力霉素给药组对血管的舒张作用均高于对照组，丹酚酸A20MG/KG组于106105M浓度乙酰胆碱时体现较对照组有更好的舒张作用，与C57组相当。由此可见，丹酚酸A对血管的舒张功能有一定的保护作用。00566、丹酚酸A明显改善主动脉组织结构的完整性0057图7为丹酚酸A改善损伤血管的组织学结构图。主动脉瘤或主动脉夹层表现为中层和外膜的细胞外基质降解，血管中层细胞增殖，动脉壁变薄及炎症细胞的浸入。基质金属蛋白酶MMPS可降解细胞外基质，。
23、在主动脉瘤或主动脉夹层的形成过程中发挥重要作用。本实验将主动脉切片后用于HE染色图7A，模型动物组血管细胞排列凌乱，相互间的距离参差不齐，且细胞核大小不均，核染色深浅不一。丹酚酸A给药组，特别是20MG/KG丹酚酸A给药组的血管细胞排列相对整齐，细胞大小均匀，染色深浅相对一致，说明血管的结构完整，丹酚酸A明显改善血管内外三层结构的完整性，细胞排列相对规则。天狼星红用于对胶原进行染色（图7B），可见胶原明显深染，模型动物的血管各层之间间隔距离大小不一，有多处出现断裂现象，而丹酚酸A给药组可见血管各层相对均匀一致，各层之间距离基本维持稳定，基本未见明显的断裂之处，说明丹酚酸A处理组的血管外膜结构较。
24、为完整，各层结构均匀整齐。00587、图8为明胶酶谱的方法评价丹酚酸A的酶抑制活性的实验结果图；丹酚酸A明显抑制主动脉瘤或主动脉夹层小鼠血清中MMP9活性。采用明胶酶谱对血清中MMP2，MMP9的活性进行检测和评价。如图8所示，丹酚酸A对MMP9有明显的抑制作用。00598、丹酚酸A无明显肝毒性0060图9为对肝脏组织采用HE染色进行组织学评价的照片，由图9可见，正常对照组肝组织染色均匀，细胞排列整齐有序。与C57正常对照组相比，强力霉素20MG/KG组明显可见肝细胞肿胀、肝血窦挤压、小叶结构改变。而高、低丹酚酸A给药组无明显肝脏毒性。可见，丹酚酸A对肝组织无明显毒性，而阳性MMP抑制剂强力霉。
25、素呈现明显肝毒性。00619、丹酚酸A未见明显菌群失调副作用0062对各组小鼠的粪便进行菌群培养发现，强力霉素20MG/KG组小鼠肠道内小肠细菌的数量明显减少，肠道内正常菌群的平衡遭到破坏，出现明显菌群失调，而丹酚酸A无此副作用。具体测试结果示于图10，实验结果表明丹酚酸A无诱导菌群失调的副作用，而广谱MMP抑制剂强力霉素则导致明显的菌群失调。006310、丹酚酸B对主动脉瘤或主动脉夹层具有防治作用0064采用电镜对小鼠的主动脉血管的结构进行细致评价（图11），图11的电镜照片显示丹酚酸B可明显改善损伤小鼠主动脉的细胞结构保护平滑肌细胞、内皮细胞，改善胶原和弹力蛋白层的结构完整性。动物模型的制。
26、备方法如前所诉，检测方法为电镜。丹酚酸说明书CN104055760A6/6页8B明显改善主动脉内皮细胞、中间层、外膜的组织结构的完整性。006511、结论0066基质金属蛋白酶，特别是基质金属蛋白酶9在主动脉瘤或主动脉夹层的发生中起到非常关键的作用。多聚体丹酚酸表现出明显的MMP9抑制活性，代表性三聚体化合物丹酚酸A、四聚体化合物丹酚酸B皆在动物模型上表现出明显的疾病防治效果,说明多聚体丹酚可用于主动脉瘤或主动脉夹层的预防和治疗。说明书CN104055760A1/9页9图1图2说明书附图CN104055760A2/9页10图3说明书附图CN104055760A103/9页11图4说明书附图CN104055760A114/9页12图5说明书附图CN104055760A125/9页13图6图7A说明书附图CN104055760A136/9页14图7B图8说明书附图CN104055760A147/9页15图9说明书附图CN104055760A158/9页16图10说明书附图CN104055760A169/9页17图11说明书附图CN104055760A17。